KR102313054B1 - 혈소판 농축물로부터 유도될 수 있는 생물활성 조성물, 및 이를 제조하는 방법 및 사용 방법 - Google Patents

혈소판 농축물로부터 유도될 수 있는 생물활성 조성물, 및 이를 제조하는 방법 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 혈소판 농축물로부터 유도된 생물활성 분획을 포함하는 조성물, 상기 생물활성 분획을 만드는 방법, 그리고 상기 생물활성 분획이 보강된 배양 배지를 제시한다. 바람직한 생물활성 분획은 원상태 성장 인자들은 유익한 양 및 비율로 유지되면서, 비교적 낮은 피브리노겐 농도를 갖는다.

Description

혈소판 농축물로부터 유도될 수 있는 생물활성 조성물, 및 이를 제조하는 방법 및 사용 방법{BIOACTIVE COMPOSITIONS DERIVABLE FROM PLATELET CONCENTRATES, AND METHODS FOR PREPARING AND USING SAME}
본 발명은 동물 혈소판 생성물로부터 유도된 생물활성 물질, 및 그것의 제조 방법 및 그것의 용도 분야에 일반적으로 관계된다.
치료적 처치용으로 세포 또는 세포를 포함하는 조성물의 투여는 점점 더 대중적인 치료 양식이 되고 있다. 그와 같은 치료들로는 예를 들면, 골, 지방, 연골, 및 근육이 포함된 간엽 계통 세포로 분화되는 잠재적인을 보유한 간엽 줄기세포 (MSCs)의 투여가 포함될 수 있다(Doucet et al., J Cell Phys, (2005), 205: 228-236 및 Lange et al., J Cell Physiol, (2007), 213: 18-26).
이식을 위한 치료량의 세포를 얻기 위하여, 초기 집단으로부터 세포 집단을 확장할 필요성은 흔히 있다. 상기 세포 집단을 확장하는데 이용된 배양 배지는 세포 대사, 성장, 및 증식을 위한 필수 영양소를 공급한다. 우태 혈청 (FBS)은 집단 팽창을 조장하기 위한 보충물로 흔히 사용된다. FBS는 낮은 수준 항체로 인하여, 그리고 세포 성장 및 증식을 자극하는 많은 성장 인자를 포함하고 있으며, 상대적으로 저렴한 제작 비용으로 인하여 바람직한 보충물이었다. 그러나, FBS는 병원체 예컨대 소 해면상뇌병증의 전염 위험과 같은 약점이 인지되었다(Selvaggi et al., Blood, (1997), 89(3): 776-9).
인간 혈소판 용해물 (hPL)은 FBS에 대한 잠재적인 비-이종 대안으로 부각되었다. hPL은 다양한 성장 인자를 포함하는 것으로 공지된 혈소판으로부터 유도된다(Sanchez et al., Int J Oral Maxillofac Implants, (2003), 18(1): 93-103). 성장 인자에 부가하여, 현행 hPL 단리 기술은 통상적으로 응혈 형성에 관여된 당단백질인 고농도의 피브리노겐을 포함하는 조성물을 만든다. 피브리노겐 함량 및 응혈되는 경향으로 인하여, 현행 상업적 hPL 조성물은 하나 이상의 항응고제 첨가제, 전형적으로 헤파린과 대개 병용 사용된다(Schallmoser et al., Tissue Eng Part C Methods, (2008), 14(3): 185-96). hPL 안에 항응고제 첨가제는 hPL 생산 및/또는 사용 비용을 증가시키며, 그리고 상기 헤파린의 생물활성이 해로운 상황에서 문제의 소지가 될 수 있다. 또한, hPL 생산을 위한 다양한 공정들이 제안되고 있으며, hPL 생성물에 관한 표적 조성 프로파일 또는 생물활성을 얻으려는 시도들은 공정 복합성 및/또는 집중적인 장비 요구와 대개 연계되었다. FBS의 대체제로써 hPL의 유의미한 채택은 경제적으로 실행가능하지만, 그럼에도 불구하고 바람직한 그리고 효과적인 조성물을 산출하는 공정들을 요구할 것이다.
이러한 배경적 관점에서, 피브리노겐이 없으며, 세포 증식에 유익한 성장 인자를 포함하고, 그리고 쉽게, 경제적으로 제조될 수 있는 인간 혈소판 용해물 조성물의 필요성이 있다.
요약
본 개시내용의 어떤 측면에서, 혈액-유도된 혈소판 농축물, 바람직하게는 인간의 유리한 생물활성 분획은 상기 농축물로부터 독특하게 가공될 수 있다는 사실이 발견되었다. 상기 생물활성 분획은 개시 농축물에 존재하는 성장 인자 및/또는 다른 물질의 새로운 조성 프로파일을 보유할 수 있으며, 그리고 공정 방법은 상기 농축물의 분획을 응고하고 분리하기 위한 새로운 기술 및/또는 농축물로부터 유도된 액체 분획을 정제하기 위한 새로운 심층 여과 운용법과 관련될 수 있다.
일 측면에서, 혈소판 용해물 조성물을 가공하는 방법은 용해된 혈소판 제조물(preparation)을 만들기 위하여 혈소판 및 혈장이 포함된 인간 혈액-유도된 농축물의 혈소판을 용해하는 단계, 상기 용해된 혈소판 제조물에서 피브리노겐을 피브린으로 전환시킴으로써 응혈 겔이 형성되는 단계, 그리고 상기 응혈 겔로부터 액체를 표출시키기(express) 위하여 상기 응혈 겔을 압착시키는 단계를 포함한다.
또 하나의 측면에서, 방법은 피브리노겐, 알부민, 글로불린, 그리고 TGF-β1, EGF, FGF-베타, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1α, 및 VEGF 중 적어도 하나 그리고 임의로 이들 모두가 포함된 혈소판 농축물의 원상태 성분이 포함된 혈액-유도된 혈소판 농축물의 액체 생물활성 분획을 적어도 제1 심층 필터를 통하여 통과시켜, 상기 생물활성 분획으로부터 현탁된 고형물을 제거하는 것을 포함하며, 여기서 상기 피브리노겐은 20,000 ng/mL 미만 수준으로 존재한다. 상기 혈소판 농축물은 바람직하게는 인간 혈소판 농축물이다. 바람직한 방식들에 있어서, 상기 액체 생물활성 분획은 제1 심층 필터와 또한 제2 심층 필터를 통하여 통과되며, 이때 상기 제2 심층 필터는 임의로 상기 제1 심층 필터보다 더 작은 명목 마이크론 등급(rating)을 갖는다.
또 하나의 측면에서, 인간 혈액-유도된 혈소판 농축물의 생물활성 분획이 포함된 조성물이 제공되며, 상기 혈소판 농축물은 인간 혈소판 및 인간 혈장을 보유하며, 상기 생물활성 분획은 피브리노겐, 알부민, 글로불린, TGF-β1, EGF, FGF-베타, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1α, 및 VEGF가 포함된 혈소판 농축물의 원상태 성분을 포함한다. 상기 생물활성 분획은 약 20,000 ng/mL 미만 수준, 예를 들면 약 500 ng/mL 내지 약 20,000 ng/mL 범위로 존재하는 피브리노겐을 보유할 수 있고, 및/또는 이를 포함하는 생물활성 분획, 또는 세포 배양 배지에는 부가된 헤파린 (즉, 혈소판 농축물 개시 물질에 대하여 원상태가 아닌 헤파린)이 없거나 또는 본질적으로 없을 수 있다. 상기 생물활성 분획은 본원에서 개시된 바와 같은 수준 또는 비(ratios)의 성장 인자를 보유할 수 있다. 어떤 구현예에서, 상기 생물활성 분획은 액체 생물활성 분획이며, 상기 원상태 성분들은 하기를 포함한다:
상기 액체 생물활성 분획의 20,000 ng/mL 미만 수준, 예를 들면 약 500 ng/mL 내지 약 20,000 ng/mL 수준에서 피브리노겐;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 2 mg/dL 수준에서 알부민;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 1 g/dL 수준에서 글루불린;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 5000 피코그램/mL (“pg/mL’) 수준에서 TGF-β1;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 20 pg/mL 수준에서 EGF;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 5 pg/mL 수준에서 FGF-베타;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 200 pg/mL에서 수준에서PDGF-AA;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 50 pg/mL 수준에서 PDGF-BB;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 100 pg/mL 수준에서 SDF-1α; 및
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 10 pg/mL 수준에서 VEGF.
본 개시내용은 생물활성 조성물을 제조하는 방법을 또한 제공하는데, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다: 응고 물질을 혈소판 용해물 조성물에 첨가하여 응고된 물질이 형성되는 단계, 상기 응고된 물질 안의 액체로부터 응고된 고형물을 분리시키는 단계, 그리고 상기 액체을 멸균된 심부 여과를 거치는 단계. 일부 형태에서, 상기 방법은 멸균된 용기 안에 상기 생물활성 조성물을 패키징하는 것을 또한 포함한다.
어떤 구현예에서, 상기 생물활성 분획은 액체 생물활성 분획이며, 그리고 상기 원상태 성분은 하기를 포함한다:
약 200 pg/mL 내지 약 350 pg/mL 수준에서 FGF-2;
약 1800 pg/mL 내지 약 3100 pg/mL 수준에서 EGF;
약 24,000 pg/mL 내지 약 28,000 pg/mL 수준에서 PDGF-AA;
약 50 ng/mL 내지 약 80 ng/mL 수준에서 PDGF-BB;
약 500 pg/mL 내지 약 800 pg/mL 수준에서 VEGF;
약 60 ng/mL 내지 약 90 ng/mL 수준에서 TGF-b; 및
2.5㎍/mL 미만 수준에서 피브리노겐.
본 명세서에서 개시된 추가의 구현예는 본원에서 기재된 생물활성 분획 또는 조성물을 세포 배양, 냉동보존, 또는 치료적 목적으로 사용하는 것에 관계한다.
또 추가의 구현예, 뿐만 아니라 특징 및 이점은 본원 명세서의 설명으로부터 당해분야의 숙련가에게 분명한 것이 될 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 인간 혈소판 농축물 조성물의 액체 생물활성 분획을 준비하는 방법을 설명한다.
도 2는 멸균된 패키지 안에 본 개시내용의 약체 생물활성 분획의 하나의 구현예의 투시도이다.
도 3은 점적기 병 안에 본 개시내용의 약체 생물활성 분획의 하나의 구현예의 투시도이다.
상세한 설명
본 발명의 원리 이해를 촉진시키는 목적으로, 지금부터 어떤 구현예를 언급할 것이며, 이를 설명하기 위하여 특정 언어가 사용될 것이다. 그럼에도 불구하고, 이렇게 하는 것이 본 발명의 범위를 제한시키려는 의도는 없는 것으로 이해될 것이다. 기재된 구현예에서 임의의 변경 및 추가 변형, 및 본 발명 본원에 기재된 바와 같은 원리의 임의의 추가 적용은 본 발명이 관련된 당해분야의 숙련가에 통상적으로 발생되는 것으로 간주된다.
일반적으로, 본 개시내용은 생물활성 조성물, 및 생물활성 조성물을 만드는 방법을 제시하는데, 이들은 예를 들면, 세포 배양 보충물 및/또는 치료제로 사용될 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 인간 공급원으로부터 유도된 조성물을 포함하며, 따라서 이종 조성물, 예컨대 FBS와 관련된 문제는 극복된다. 더욱이, 본 개시내용의 바람직한 조성물은 중요한 성장 인자 및 다른 화학적 물질을 보유하는 한편, 낮은 피브리노겐 함량을 보유하고, 및 사용하는 동안 문제의 응고를 방지하기 위하여 항응고제, 예컨대 헤파린의 부가를 요구하지 않는다.
도 1을 다시 참고하면, 혈소판 농축물 조성물로부터 생물활성 분획을 준비하는 한 가지 예증적인 방법(100)을 보여준다. 이 방법은 다음의 단계들을 포함한다: 혈소판 농축물을 획득하는 단계(01), 상기 혈소판 농축물을 냉동시키는 단계(02), 상기 혈소판 농축물을 해동시키는 단계(03), 응고 물질을 상기 혈소판 농축물에 추가하는 단계(04), 액체로부터 응혈 고형물을 분리시키는 단계(05), 상기 액체를 제1 심층 필터로 여과시키는 단계(06), 상기 액체를 제2 심층 필터로 여과시키는 단계(07), 상기 액체를 멸균 필터로 여과시키는 단계(08), 및 상기 액체를 패키지하는 단계(09). 하기 일부 점에서 이들 묘사된 이들의 일반적인 각각 단계의 선택사항들에 있어서 논의가 확장된다; 그러나, 본 개시내용의 모든 구현예에 있어서 묘사된 모든 일반적인 단계가 필요한 것은 아니며, 묘사된 하나의 단계, 일부 또는 모든 단계에 상응하는 특징들을 포함하는 새로운 방법들이 본 개시내용의 구현예로 고려된다는 점을 인지할 것이다.
상기 개시된 방법 및 생물활성 분획을 위한 원료 물질로써 사용된 혈소판 농축물 조성물은 임의의 적합한 방법으로 수득될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 혈소판 농축물은 혈액 공급원으로부터 농축된 혈소판이 포함된 액체 조성물을 지칭한다. 상기 혈액 공급원은 바람직하게는 인간 혈액, 예컨대 인간 말초 전체 혈액이다. 상기 혈소판 농축물은 바람직하게는 혈소판 및 혈장 단백질을 모두 포함하며, 인간 공여자의 말초 전체 혈액으로부터 성분채집술(apheresis)에 의해 수득된 혈소판 유닛(units)으로 제공될 수 있다. 다른 종, 예를 들면 포유동물 종에서 얻은 전혈 역시 본원에 기재된 바와 같이 가공되는 혈소판 농축물의 공급원으로 사용될 수 있다고 생각된다. 어떤 구현예에서, 상이한 인간 또는 다른 공여체로부터 얻은 혈소판 유닛은 상기 생물활성 분획을 획득하기 위한 공정중 일부 시점에서 풀링(pooling)될 수 있다. 현재 전형적인 관행에 있어서, 각 인간 공여자 성분채집된 혈소판 유닛은 약 100 내지 약 500 mL, 더욱 전형적으로 약 100 내지 400 mL의 용적을 갖고, 그리고 상기 성분채집 절차 동안 상기 혈소판과 함께 단리된 혈장과 약 100 내지 500 x 109 혈소판을 포함한다. 공여된 인간 성분채집 혈소판 유닛은 건강 관리 시설에서 사용시 상대적으로 짧은 유통 기한, 전형적으로 약 5 일을 가진다. 본원에 개시된 방법에 사용된 혈소판 유닛은 건강 관리 시설에서 구한 최근 유효기간이 만료된 인간의 성분채집된 혈소된 유닛일 수 있고, 그리고 본원에 기재된 바와 같이 생물학적 분획을 준비하기 위하여 사용 전, 임의의 적합한 온도, 예를 들면 약 -20℃에서 임의로 냉동 보관될 수 있다.
상기 생물활성 분획을 준비함에 있어서. 상기 혈소판 내용물(content)은 적합한 방법에 의해 방출될 수 있다. 일부 방식들에 있어서, 상기 혈소판 내용물을 방출시키기 위하여 적어도 하나의 냉동-해동 사이클을 거치게 함으로써, 상기 혈소판은 용해되고, 그리고 임의로 다중 냉동-해동 사이클 (예를 들면 2 또는 3회 냉동-해동 사이클)을 거치게 된다. 냉동-해동 사이클, 상기 혈소판 농축물은 임의의 적합한 온도에서 냉동될 수 있다. 일부 측면에서, 상기 혈소판 농축물은 약 -10℃내지 약 -80℃의 온도에서 냉동된다. 특정 바람직한 구현예에서, 상기 혈소판 농축물은 약 -20℃에서 냉동된다. 상기 혈소판을 용해시키기 위하여, 상기 냉동된 혈소판 농축물은 예를 들면 37 ℃ 수조 또는 다른 효과적인 수단에 의해 해동되어, "미가공(raw)" 혈소판 용해물 조성물이 형성된다. 상기 미가공 혈소판 용해물은 상기 용해된 혈소판 막, 성장 인자 그리고 상기 용해된 혈소판으로부터 방출된 다른 물질들을 포함한다. 해동되는 상기 혈소판 농축물이 혈소판과 함께 혈장을 포함할 경우, 상기 혈소판 용해물은 그 안에 있는 혈장 단백질이 포함된 혈장을 또한 포함할 것이다. 혈소판 내용물을 방출시키기 위한 다른 기술, 예를 들면 트롬빈을 이용한 활성화가 본 기재내용의 일부 측면에서 사용될 수 있다. 그러나, 상기 혈소판을 용해시키기 위한 냉동-해동 또는 다른 기계적 기술은 비-고유상태 단백질 (예를 들면, 트롬빈)을 상기 혈소판 농축물에 부가할 필요가 없는데, 이러한 부가에 의해 비용이 증가되며, 다운스트림 가공된 물질에서 트롬빈의 적어도 일부가 존재할 수 있기 때문에 유리한 것으로 간주된다.
상기 미가공 혈소판 용해물은 상기 혈소판 농축물 개시 물질의 다중 성장 인자를 포함한다. 이들은 예를 들면, 형질전환 성장 인자 배터 1, 표피 성장 인자, 염기성섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자 AA, 혈소판 유도된 성장 인자 BB, 기질 세포-유도된 인자-1α, 및 혈관 내피 성장 인자를 포함할 수 있다.
형질전환 성장 인자 배터 1 (TGF-β1)는 많은 세포 유형에서 증식, 분화 및 다른 기능을 조절하는 다작용성 펩타이드이다. 표피 성장 인자 (EGF)는 세포성 증식, 분화, 및 생존을 촉진시킨다. 염기성섬유아세포 성장 인자 (FGF-b)는 신생혈관형성을 촉진시키고, 그리고 다양한 세포를 자극하는 헤파린에 결합한다. 혈소판 유도된 성장 인자 AA (PDGF-AA)는 세포 성장 및 분할을 조절하고, 그리고 신생혈관형성을 촉진시키는 이량체 당단백질이다. 혈소판 유도된 성장 인자 BB (PDGF-BB)는 세포 성장 및 분할을 조절하고, 그리고 신생혈관형성을 촉진시키는 이량체 당단백질이다. 기질 세포-유도된 인자-1α (SDF-1α)는 백혈구를 활성화시키고, 그리고 신생혈관형성을 촉진시킨다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 맥관형성 및 신생혈관형성에 기여한다.
어떤 구현예에서, 상기 미가공 혈소판 용해물은 다음의 명시된 양(최초, 희석안된 혈소판 농축물의 용적에 근거하여)의 하기 성장 인자들을 포함한다:
약 50,000 내지 약 150,000 pg/ml TGF-β1, 바람직하게는 약 70,000 내지 약 120,000 pg/ml TGF-β1; 및/또는
약 100 내지 600 pg/ml EGF, 바람직하게는 약 200 내지 약 600 pg/ml EGF; 및/또는
약 5 내지 약 250 pg/ml FGF-b, 바람직하게는 약 50 내지 200 pg/ml FGF-b; 및/또는
약 500 내지 약 20,000 pg/ml PDGF-AA, 바람직하게는 약 5000 내지 약 15000 pg/ml PDGF-AA; 및/또는
약 1000 내지 약 20,000 pg/ml PDGF-BB, 바람직하게는 약 2000 내지 약 15000 pg/ml PDGF-BB; 및/또는
약 400 내지 1100 pg/ml SDF-1α, 바람직하게는 약 500 내지 약 1000 pg/ml SDF-1α; 및/또는
약 10 내지 약 800 pg/ml VEGF, 바람직하게는 약 100 내지 약 600 pg/ml VEGF.
바람직한 형태에 있어서, 상기 미가공 혈소판 용해물은 상기 혈소판 농축물 개시 물질 안 혈장으로부터 유도된 하나 이상의 성분, 예를 들면 피브리노겐, 글로불린, 알부멘, 트리글리세라이드, 글루코오스, 나트륨, 칼슘, 및/또는 콜레스테롤을 또한 포함한다. 바람직한 형태에 있어서, 상기 미가공 혈소판 용해물은 하기 성분 및 이의 양을 포함한다:
약 0.5 내지 2.5 g/dL의 글로불린, 바람직하게는 약 1.5 내지 2.5 g/dL의 글로불린;
약 2 내지 5 g/dL의 알부민, 바람직하게는 약 3 내지 4 g/dL의 알부민;
약 100 내지 200 mmol/L의 나트륨, 바람직하게는 약 120 내지 약 160 mmol/L의 나트륨;
약 40 내지 200 mg/dL의 트리글리세라이드, 바람직하게는 약 50 내지 120 mg/dL의 트리글리세라이드;
약 150 내지 300 mg/dL의 글루코오스, 바람직하게는 약 150 내지 250 mg/dL의 글루코오스;
약 5 내지 12 mg/dL 칼슘, 바람직하게는 약 6 내지 10 mg/dL 칼슘; 및/또는
약 1 내지 3.5 백만 ng/mL 피브리노겐, 바람직하게는 약 1.5 내지 2.5 백만 ng/mL 피브리노겐.
상기 미가공 혈소판 용해물은 다른 생물활성 물질, 예를 들면 하나 이상의 인터루킨, 인터페론, 및/또는 종양 괴사 인자를 또한 포함할 수 있다. 이들 인터루킨(들), 인터페론(들) 및/또는 종양 괴사 인자(들)은 예를 들면, 인터루킨 (IL)-1b, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-17, 인터페론-감마 (IFN-감마), 및 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파)중 하나, 일부 또는 이들 전부를 포함할 수 있다.
본원의 어떤 구현예에서, 상기 미가공 혈소판 용해물은 미립자 물질을 제거하기 위하여 가공되는데, 예를 들면 혈소판 용해물 생성물로써 사용하기 위하여 원심분리 및 멸균된다. 이와 같은 멸균은 예를 들면, 미립자들이 감소된 상기 미가공 혈소판 용해물을 멸균 필터를 통하여 통과시키는 것을 포함할 수 있다.
본원의 일부 구현예에서, 상기 미가공 혈소판 용해물은 이의 분획을 회수하기 위하여 감소된 농도의 피브리노겐으로 처리된다. 피브리노겐은 임의의 적합한 기술에 의해 제거될 수 있는데, 예를 들면 피브린으로 전환시키고, 이로써 고형 응형 물질이 형성되고, 이것은 액체 생물활성 분획으로부터 분리될 수 있는 기술이 포함된다. 이와 같이 피브린으로의 전환은 응고 물질의 부가에 의해 유도될 수 있다. 개시된 방법을 실행하는 일부 형태에 따라, 응고 물질, 예를 들면 염화칼슘 염이 상기 미가공 혈소판 용해물에 부가될 수 있다. 예증적으로, 염화칼슘 염은 미가공 혈소판 용해물 리터당 약 0.1g 내지 2g의 양으로 상기 미가공 혈소판 용해물에 부가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 미가공 혈소판 용해물 리터당 약 0.4g 내지 약 0.75g의 염화칼슘 염이 부가된다. 상기 조합된 혈소판 용해물 및 염화칼슘 또는 다른 응고 물질을 진탕기 안에 넣거나, 또는 그렇지 않으면 상기 응고 물질과 상기 농축물이 완전하게 혼합될 수 있도록 진탕된다. 그 다음 수득한 혼합물은 어떤 구현예에서 적어도 약 8 시간, 또는 적어도 약 12 시간의 기간 동안, 그리고 전형적으로 약 8 시간 내지 약 36 시간의 기간 동안 고형 응혈 물질이 형성될 수 있도록 한다. 바람직한 형태에 있어서, 수득한 응고된 물질의 적어도 상당한 양 (50%이상) 그리고 잠재적으로 적어도 80% 또는 적어도 90%는 실질적으로 균질한 응혈 겔로 구성된다. 그와 같은 실질적으로 균질한 응혈 겔은 연속적 피브린 매트릭스 안에 비말동반된 액체를 갖는, 전체적으로 균일한 겔 상태를 나타낼 수 있다. 이들 바람직한 형태의 응고된 물질은 다수의 개별 응혈 입자들이 액체 상태로 현탁되어 있어, 후속 원심분리-기반 분리 기술이 요구되는 응고된 혈소판 농축물 물질과는 뚜렷이 구별된다.
응혈이 형성된 후, 액체 물질은 고형 응혈 물질로부터 분리될 수 있다. 임의의 적합한 기술이 이러한 목적을 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 형태에 있어서, 상기 응고된 물질은 액체로부터 응고된 고형물이 분리되도록 2개 이상의 표면 사이에서 압박된다(press). 상기 응고된 물질이 본원에서 논의된 바와 같이 실질적으로 균질한 응혈 겔을 형성하는 사례들에서, 그와 같은 압박으로 상기 겔의 피브린 매트릭스가 압착(compressing) 및 압축되는(condensing) 동안, 겔 물질로부터 상기 액체를 짜낼 수 있다. 일부 형태에서 상기 응고된 물질의 압박은 가요성 용기 예컨대 플라스틱 주머니에서 수행될 수 있다. 상기 응혈 겔은 예를 들면, 손으로 또는 기구의 힘을 가하여 상기 주머니의 한 영역(예를 들면, 단부)으로, 또는 다른 가요성 용기로 압박될 수 있고, 그리고 상기 고형 섬유소 매트릭스로부터 짜낸 액체는 상기 주머니의 또 하나의 영역(예를 들면 단부)으로 모으거나 또는 다른 가요성 용기에 모을 수 있다. 압박 동안 또는 압박이 일어난 후, 제2 주머니 또는 다른 용기는 압박이 일어나는 제 1 주머니에 연결될 수 있고, 상기 액체 물질은 제 2 주머니 또는 다른 용기로 이동될 수 있다. 다른 방식에서 상기 응혈 겔은 단단한 용기, 예컨대 버켓(bucket) 안에 있을 수 있으며, 그리고 상기 고형 피브린 매트릭스로부터 상기 액체를 짜내고, 그리고 상기 피브린 매트릭스를 압착 및 압축시키기 위하여 손으로 또는 기구의 힘을 가하여 압박될 수 있다.
상기 응고된 혈소판 농축물의 액체 및 고형 물질의 응고 및 분리 후, 상기 분리된 액체는 응고 전, 상기 미가공 혈소판 용매물과 비교하여 감소된 농도의 피브리노겐을 갖는다. 바람직한 형태에 있어서, 상기 미가공 혈소판 용해물은 적어도 1,000,000 ng/mL, 전형적으로 약 1,500,000 내지 3,500,000 (1.5 내지 3.5 백만) ng/mL의 피브리노겐 내용물을 보유하며, 그리고 응고 및 분리 후 상기 액체는 약 50,000 ng/mL 미만, 바람직하게는 약 20,000 ng/mL 미만의, 그리고 더 바람직하게는 약 10,000 ng/mL 미만의 피브리노겐 내용물을 보유한다. 예증적으로, 이 분리된 액체는 약 500 ng/mL 내지 약 20,000 ng/mL 범위, 또는 약 500 ng/mL 내지 약 10,000 ng/mL 범위의 피브리노겐 내용물을 보유할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 이 분리된 액체는 응고 전 상기 혈소판 농축물 안에 존재하는 피브리노겐의 약 5% 미만, 바람직하게는 약 2% 미만, 그리고 더 바람직하게는 약 1% 미만을 포함할 수 있다. 또한, 이 분리된 액체는 상기 미가공 혈소판 용해물의 용적의 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 그리고 전형적으로 약 75% 내지 약 90% 범위의 용적을 구성할 수 있다.
상기 미가공 혈소판 용해물의 응고와 상기 액체 고형/분리 분리 후 회수된 피브리노겐-감손된 액체 생물활성 분획은 상기 미가공 혈소판 용해물로부터 다중 성장 인자를 포함한다. 이들 인자는 TGF-β1, EGF, FGF-베타, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1α, 및 VEGF를 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 이 피브리노겐-감손된 액체 생물활성 분획은 상기 미가공 혈소판 용해물로부터 하기의 성장 인자 및 이의 양을 포함한다:
약 50,000 내지 약 150,000 pg/ml TGF-β1, 바람직하게는 약 70,000 내지 약 120,000 pg/ml TGF-β1;
약 20 내지 800 pg/ml EGF, 바람직하게는 약 400 내지 약 800 pg/ml EGF; 및/또는
약 5 내지 약 250 pg/ml FGF-b, 바람직하게는 약 50 내지 250 pg/ml FGF-b; 및/또는
약 500 내지 약 25,000 pg/ml PDGF-AA, 바람직하게는 약 5000 내지 약 18000 pg/ml PDGF-AA; 및/또는
약 1000 내지 약 25,000 pg/ml PDGF-BB, 바람직하게는 약 2000 내지 약 18000 pg/ml PDGF-BB; 및/또는
약 400 내지 1000 pg/ml SDF-1α, 바람직하게는 약 500 내지 약 900 pg/ml SDF-1α; 및/또는
약 10 내지 약 600 pg/ml VEGF, 바람직하게는 약 150 내지 약 450 pg/ml VEGF.
다른 구현예에서, 이 피브리노겐-감손된 액체 생물활성 분획은 상기 미가공 혈소판 용해물로부터 하기 성장 인자 및 이의 양을 포함한다:
약 200 pg/mL 내지 약 350 pg/mL 수준에서 FGF-2 (즉 FGF-b); 및/또는
약 1800 pg/mL 내지 약 3100 pg/mL의 수준에서 EGF; 및/또는
약 24,000 pg/mL 내지 약 28,000 pg/mL 수준에서 PDGF-AA; 및/또는
약 50 ng/mL 내지 약 80 ng/mL 수준에서 PDGF-BB; 및/또는
약 500 pg/mL 내지 약 800 pg/mL 수준에서 VEGF; 및/또는
약 60 ng/mL 내지 약 90 ng/mL 수준에서 TGF-b.
일부 형태에서, 상기 피브리노겐-감손된 액체 생물활성 분획은 또한 3 ㎍/mL 미만, 바람직하게는 2.5 ㎍/mL 미만의 피브리노겐 내용물을 보유한다.
바람직한 형태에 있어서, 이 피브리노겐-감손된 액체 생물활성 분획은 상기 혈소판 농축물 개시 물질 안의 혈장으로부터 유도된 하나 이상의 성분, 예를 들면 글로불린, 알부멘, 트리글리세라이드, 글루코오스, 나트륨, 및/또는 칼슘을 또한 포함한다. 응혈 상기 미가공 혈소판 용해물을 응혈시키기 위하여 염화칼슘 염이 이용되는 경우, 분리된 액체 생물활성제 안에 존재하는 칼슘은 상기 용해물과 부가된 칼슘 염 모두로부터 기인될 수 있다. 어떤 구현예에서, 이 분리된 액체 생물활성 분획는 상기 미가공 혈소판 용해물로부터 하기 성분 및 이의 양을 포함한다:
약 0.5 내지 2.5 g/dL의 글로불린, 바람직하게는 약 1 내지 2 g/dL의 글로불린;
약 2 내지 5 g/dL의 알부민, 바람직하게는 약 3 내지 4 g/dL의 알부민;
약 100 내지 200 mmol/L의 나트륨, 바람직하게는 약 120 내지 약 160 mmol/L의 나트륨;
약 40 내지 70 mg/dL의 트리글리세라이드, 바람직하게는 약 50 내지 65 mg/dL의 트리글리세라이드; 및/또는
약 150 내지 300 mg/dL의 글루코오스, 바람직하게는 약 150 내지 250 mg/dL의 글루코오스.
또한, 상기 미가공 혈소판 용해물의 응고물질로 영화칼슘 염이 사용되는 경우, 이 분리된 액체 생물활성 분획은 일부 형태에서 약 15 내지 35 mg/dL 수준, 그리고 바람직하게는 약 15 내지 25 mg/dL 수준에서 칼슘을 포함할 수 있다.
본 발명을 실시하는 일부 방법들에 따르면, 상기 액체 생물활성 분획은 멸균 필터를 통과한다. 바람직한 구현예에서 상기 멸균 필터는 0.2㎛ 멸균 필터를 포함한다. 상기 멸균 필터를 통과한 후, 상기 액체 생물활성 분획은 멸균된 용기 안에 밀봉될 수 있다.
본원 발명의 어떤 구현예는 상기 응고 및 액체/고형 분리 단계 후, 예를 들면 현탁된 고형물, 예컨대 임의 잔류 혈소판 잔해, 세포성 잔해, 및 응혈 고형물을 제거하기 위하여 회수된 액체 생물활성 분획의 필터링을 포함한다. 바람직한 방식에서, 그와 같은 필터링은 적어도 하나의 심층 필터, 그리고 바람직하게는 다중 심층 필터, 예컨대 2 또는 3개의, 잠재적 마이크론 등급(ratings)이 상이한 심층 필터를 통하여 상기 액체 생물활성 분획을 진행시키는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 공지된 그리고 본원에서 사용된 바와 같이, "심층 필터" 또는 "심층 여과"는 매질의 오익 표면 상에서 보다는 매질 전체를 통하여 입자를 유지시키는 다공성 여과 매질을 이용하는 필터와 여과를 차례로 지칭한다. 게다가, 공지된 그리고 본원에서 사용된 바와 같이, 필터에 적용되는 "명목 마이크론 등급(nominal micron rating)"이란 현탁된 모든 고형물의 98% 이상이 이 필터의 등급 수용력을 통하여 제거되는 입자 크기를 의미한다. 발명의 어떤 변형은 적어도 하나의 심층 필터에 이어, 그 다음 적어도 하나의 멸균 필터를 통한 여과를 포함한다. 본 발명의 추가 변형은 적어도 2 심층 필터에 이어, 그 다음 적어도 하나의 멸균 필터를 통한 여과를 포함한다. 바람직한 형태에 있어서, 사용된 상기 심층 필터 또는 심층 필터들은 양성 표면 전하를 가진 필터 매질을 가진다.
어떤 구현예에서, 제1 및 제2 심층 필터는 상기 액체 생물활성 분획의 심층 여과에 사용된다. 상기 제1 심층 필터는 제2 심층 필터보다 더 큰 명목 마이크론 등급을 갖는다. 일부 형태에 있어서, 상기 제1 심층 필터는 약 10 내지 0.1 마이크론 범위의 명목 마이크론 등급을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 상기 제1 심층 필터는 5 내지 0.1 마이크론, 더욱더 바람직하게는 약 3 내지 0.2 마이크론 범위의 명목 마이크론 등급을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 제1 심층 필터는 셀룰로오스 막, 그리고 셀룰로오스 섬유 및 무기 여과 보조제, 예컨대 양성 표면 전하를 갖는 규조토를 포함하는 필터 매질을 갖는다.
어떤 구현예에서, 제2 심층 필터는 제1 심층 필터 보다 적은 명목 마이크론 등급을 갖는데, 예를 들면 일부 경우에 약 0.5 마이크론 미만의 명목 마이크론 등급을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 제2 심층 필터는 0.5 내지 0.001 마이크론, 그리고 더 바람직하게는 약 0.1 내지 0.001 마이크론의 명목 마이크론 등급을 갖는다. 어떤 구현예에서, 상기 제1 심층 필터는 셀룰로오스 막, 그리고 셀룰로오스 섬유 및 무기 여과 보조제, 예컨대 양성 표면 전하를 가진 규조토를 포함하는 필터 매질을 갖는다.
바람직한 형태에 있어서, 현탁된 고형물을 제거하기 위한 심층 여과 또는 다른 여과 후, 상기 액체 생물활성 분획은 상기 미가공 혈소판 용해물로부터 기인된 다중 성장 인자를 여전히 포함한다. 이들은 TGF-β1, EGF, FGF-베타, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1α, 및 VEGF를 포함할 수 있다. 어떤 구현예에서, 이 여과된 액체 생물활성 분획은 상기 미가공 혈소판 용해물로부터 하기 성장 인자 및 이의 양을 포함한다:
약 5000 내지 약 75,000 pg/ml TGF-β1, 바람직하게는 약 5000 내지 약 60,000 pg/ml TGF-β1;
약 20 내지 300 pg/ml EGF, 바람직하게는 약 50 내지 약 250 pg/ml EGF;
약 5 내지 약 150 pg/ml FGF-베타, 바람직하게는 약 30 내지 130 pg/ml FGF-b;
약 200 내지 약 4000 pg/ml PDGF-AA, 바람직하게는 약 1000 내지 약 3000 pg/ml PDGF-AA;
약 50 내지 약 1000 pg/ml PDGF-BB, 바람직하게는 약 100 내지 약 500 pg/ml PDGF-BB;
약 100 내지 700 pg/ml SDF-1α, 바람직하게는 약 300 내지 약 600 pg/ml SDF-1α; 및/또는
약 10 내지 400 pg/ml VEGF, 바람직하게는 약 40 내지 약 200 pg/ml VEGF.
바람직한 형태에 있어서, 이 심층 여과된 또는 다른 여과된 액체 생물활성 분획은 상기 혈소판 농축물 개시 물질 안의 혈장으로부터 유도된 하나 이상의 성분, 예를 들면 글로불린, 알부멘, 트리글리세라이드, 글루코오스, 나트륨, 및/또는 칼슘을 포함한 성분을 여전히 또한 포함한다. 다시, 상기 미가공 혈소판 용해물을 응혈하기 위하여 염화칼슘 염이 사용되는 경우, 여과된 액체 생물활성제 안에 존재하는 칼슘은 상기 용해물과 부가된 칼슘 염으로부터 유래된 것일 수 있다. 어떤 구현예에서, 이 여과된 생물활성 액체 분획은 상기 미가공 혈소판 용해물로부터 유도된 하기 성분 및 그 양을 포함한다:
약 0.5 내지 2.5 g/dL의 글로불린, 바람직하게는 약 1 내지 2 g/dL의 글로불린;
약 2 내지 5 g/dL의 알부민, 바람직하게는 약 3 내지 4 g/dL의 알부민;
약 100 내지 200 mmol/L의 나트륨, 바람직하게는 약 120 내지 약 160 mmol/L의 나트륨;
약 50 내지 120 mg/dL의 트리글리세라이드, 바람직하게는 약 60 내지 110 mg/dL의 트리글리세라이드; 및/또는
약 150 내지 300 mg/dL의 글루코오스, 바람직하게는 약 150 내지 250 mg/dL의 글루코오스.
또한, 상기 미가공 혈소판 용해물의 응고 물질로 염화칼슘 염이 사용되는 경우, 분리된 이 생물활성 액체 분획은 일부 형태의 경우 약 15 내지 60 mg/dL, 그리고 바람직하게는 약 20 내지 50 mg/dL 수준에서 칼슘을 포함할 수 있다.
상기 생물활성 액체 분획은 다른 생물활성 물질, 예를 들면 하나 이상의 인터루킨, 인터페론, 및/또는 종양 괴사 인자. 이들 인터루킨(들), 인터페론(들)을 또한 포함할 수 있고, 및/또는 종양 괴사 인자(들)은 예를 들면, 인터루킨 (IL)-1b, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-17, 인터페론-감마 (IFN-감마), 및 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파)중 하나, 일부 또는 이들 모두를 포함할 수 있다.
상기 바와 같이, 본 개시내용의 방법의 일부 구현예에서, 상기 액체 생물활성 분획은 상기에서 논의된 바와 같이, 현탁된 고형물을 제거하기 위하여, 바람직하게는 심층 필터(들) 또는 다른 필터(들)을 통과한 후, 적어도 하나의 멸균 필터를 통과한다. 다양한 멸균 필터 및 관련된 방법은 공지되어 있고, 그리고 사용될 수 있다. 상기 멸균된필터(들)에 의해 제거되는 예시적인 오염물질은 예를 들면 하기를 포함한다: 스타필로코커스 아우레스(staphyloccus aureus), 슈도모나스 에어루기노사(pseudomonas aeruginosa), 클로스트리듐 스포로게네스(clostridium sporogenes), 칸디다 알비칸스(candida albicans), 아스페르길루스 니게르(aspergillus niger), 마이코플라스마(mycoplasma), 및/또는 바실러스 서브틸리스(bacillus subtilis). 상기 멸균 필터(들)은 비교적 낮은 단백질 결합을 나타내도록 선택될 수 있다. 멸균된 여과 후, 바람직한 형태에 있어서, 상기 멸균, 여과된 액체 생물활성 분획은 상기 심층 여과된 또는 다른 여과된 액체 생물활성 분획에 대하여 상기에서 명시된 것과 동일한 성분을 포함할 수 있고, 그리고 심층 또는 다른 여과된 액체 생물활성 분획에 대하여 상기 명시된 범위의 성분 수준을 또한 포함할 수 있다. 그러나, 멸균 여과 동안 상기 성분들의 일부 수준 또는 모두의 수준에서 어느 정도의 감소가 있을 수 있음을 인지할 것이다.
어떤 바람직한 구현예에서, 상기-기재된 혈소판 용해 단계, 피브리노겐 고갈 단계, 그리고 현탁된 미립자를 제거하기 위한 심층 또는 다른 여과 단계에 의해 수득될 수 있는 멸균된 액체 생물활성 분획 조성물은 다음을 포함한다:
상기 액체 생물활성 분획의 20,000 ng/mL 미만 수준, 예를 들면 약 500 ng/mL 내지 약 20,000 ng/mL 수준에서 피브리노겐;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 2 mg/dL 수준에서 알부민;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 1 g/dL 수준에서 글로불린;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 5000 pg/mL 수준에서 TGF-β1;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 20 pg/mL 수준에서 EGF;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 5 pg/mL 수준에서 FGF-베타;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 200 pg/mL 수준에서 PDGF-AA;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 50 pg/mL 수준에서 PDGF-BB;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 100 pg/mL 수준에서 SDF-1α; 그리고
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 10 pg/mL 수준에서 VEGF.
일부 형태에서, 본 개시내용의 액체 생물활성 분획 조성물은 하기 특성을 갖는다:
약 10 EU/ml 미만의의 내독소 수준;
약 25mg/dL 미만의 헤모글로빈;
약 4 내지 6g/dL 총 단백질;
약 260 내지 340 mmol/kg의 오스몰농도; 및/또는
6.8 내지 7.8 범위의 pH.
이들 특성은 상기 미가공 혈소판 용해물 조성물 (원심분리 또는 그렇지 않으면 멸균에 의한 고형물 제거 후에도 또한 잠재적으로), 상기에서 기재된 바와 같이 상기 응고 및 액체/고형 분리 (그리고 잠재적으로 멸균) 후 회수된 피브리노겐-감손된 액체 생물활성 분획, 또는 현탁된 고형물을 제거하기 위한 심층 여과 및/또는 다른 여과 (그리고 잠재적으로 멸균) 후 피브리노겐-감손된 액체 생물활성 분획 안에 존재할 수 있다. 또한, 바람직한 형태의 가공은 가공제로써 세재를 이용할 필요가 없기 때문에, 이들 조성물은 세제 잔류물이 없거나 또는 본질적으로 없을 수 있다.
일부 작업 방식들에서, 본 개시내용의 피브리노겐-감손된, 여과된 (예를 들면 심층-여과된) 액체 생물활성 분획 조성물을 만드는데 이용된 절차는 이 안에서 확인된 성장 인자, 인터루킨, 인터페론 및/또는 종양 괴사 인자 수준의 감소를 초래한다. 예로써, 어떤 구현예에서, 현탁된 고형물을 제거하기 위하여 수행된 피브리노겐-감손된 분획의 심층 또는 다른 여과는 다음을 초래한다:
TGF-베타-1, EGF, FGF-b, PDGF-AA, PDGF-BB, SDF-1α, 및 VEGF 중 하나, 일부 또는 이들 모두의 수준(예를 들면 pg/mL)에서 적어도 20% 감소; 및/또는
TGF-베타-1의 수준 (예를 들면 pg/mL)에서 적어도 50% 감소; 및/또는
EGF의 수준 (예를 들면 pg/mL)에서 적어도 30% 감소; 및/또는
FGF-b의 수준 (예를 들면 pg/mL)에서 적어도 20% 감소; 및/또는
PDGF-AA의 수준 (예를 들면 pg/mL)에서 적어도 50% 감소; 및/또는
PDGF-BB의 수준 (예를 들면 pg/mL)에서 적어도 50% 감소; 및/또는
SDF-1α의 수준 (예를 들면 pg/mL)에서 적어도 20% 감소; 및/또는
VEGF의 수준 (예를 들면 pg/mL)에서 적어도 30% 감소.
부가 또는 대안적으로, 심층 여과 또는 다른 여과는 인터루킨-17 (IL-17)의 매우 유의미한 수준의 제거를 초래할 수 있다. 어떤 구현예에서, 미립자를 제거하기 위하여 심층 여과 또는 다른 여과 후, IL-17의 수준, 그리고 최종, 멸균된 액체 생물활성 분획 생성물 안에서의 수준은 약 1 피코그램/ml 미만, 더 바람직하게는 약 0.75 피코그램/ml 미만, 그리고 더욱더 바람직하게는 약 0.5 피코그램/ml 미만이다. IL-17은 다른 염증성 사이토카인 방출 촉발에서 단계적으로 늘어나는 염증성 사이토카인이다. 본 명세서에서 확인된 바와 같이, 낮은 수준의 IL-17을 보유한 바람직한 생성물은 IL-17의 존재로부터 기인되는 염증성 활성이 없거나 또는 거의 없이 이용될 수 있다.
부가 또는 대안적으로, 현탁된 고형물을 제거하기 위한 피브리노겐-감손된 분획의 심층 여과 또는 다른 여과는 1000 pg/mL 미만 농도의 PDGF-BB, 3000 pg/mL 미만 농도의 PDGF-AA, 적어도 5000 pg/mL 농도의 TGF-β1, 및/또는 미만 300 pg/mL 미만 농도의 VEGF를 갖는 생물활성 분획 생성물을 만들 것이다. 이들 값은 현탁된 고형물을 제거하기 위하여 심층 여과 또는 다른 여과 후 준비된 멸균된 생성물(예를 들면, 멸균 여과에 의해) 안에 또한 존재할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 일부 방식에 따르면, 본 명세서에서 기재된 상기 액체 생물활성 분획은 혈장 성분이 유익하게 유지되도록 가공될 수 있다. 상기 액체 생물활성 분획에 의해 유지될 수 있는 혈장 성분은 하기를 포함한다: 글로불린, 알부민, 트리글리세라이드, 글루코오스, 나트륨, 및/또는 칼슘. 일부 형태에서, 상기 액체 생물활성 분획은 그와 같은 혈장 성분중 하나 이상의, 그리고 잠재적으로 그것들 모두를 포함하며, 또한 하기 특성을 갖는다:
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 200 pg/mL 수준에서 FGF-2;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 1800 pg/mL 수준에서 EGF;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 24,000 pg/mL 수준에서 PDGF-AA;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 50 ng/mL 수준에서 PDGF-BB;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 500 pg/mL 수준에서 VEGF;
상기 액체 생물활성 분획의 적어도 60 ng/mL 수준에서 TGF-β1; 및
상기 액체 생물활성 분획의 2.5 ㎍/mL 미만 수준에서 피브리노겐.
일부 형태에서, 본 개시내용의 액체 생물활성 분획 조성물은 보관 또는 운반을 위한 멸균된 패키지 안에 포장될 수 있다. 상기 액체 생물활성 분획은이의 회수된 온전한 농도로 포장될 수 있거나, 또는 패키징 및 추후 사용을 위하여 물 또는 수성 매질로 희석될 수 있는데, 예를 들면 상기 액체 생물활성 분획의 최초 농도의 90% 내지 10%까지 희석물로 준비되고, 그 안에 명시된 성분 수준은 상응하게 감소되며, 본 명세서에서 개시된 추가 구현예가 된다. 그와 같은 패키징의 한 가지 구현예는 도 2에서 실증된다. 상기 개시내용을 실시하는 일부 형태에 따르면, 조성물(200)은 멸균된 매질 병(210) 안에 보관된다. 멸균된 매질 병은 예를 들면, 50 mL 내지 5000 mL 범위의 용적 용량을 가질 수 있다. 예로써, 60mL, 125mL, 250mL, 500mL, 1000mL, 또는 2000mL 병이 사용될 수 있다. 일부 형태에 있어서, 멸균된 매질 병(210)의 뚜껑(220)은 수축포장(shrink wrap)(230)에 의해 보호된다. 일부 형태에서, 상기 병은 수축포장된다. 어떤 구현예에서, 상기 병은 생성물 최종 라벨(240)로 표지된다. 일부 형태에서, 상기 병은 드라이아이스가 든 상품 상자 안데 위치된다.
어떤 구현예에서, 본 개시내용의 상기 액체 생물활성 분획 조성물은 다른 성분과 복합되어 세포 배양 배지가 형성될 수 있다. 그와 같은 세포 배양 배지는 세포 배양용 다른 영양소 또는 배지, 예를 들면 공지된 세포 배양 배지에서 볼 수 있는 것들이 포함된 배지, 예컨대 최소 필수 배지 (MEM), 또는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)와 혼합된 본 개시내용의 상기 액체 생물활성 분획을 포함한다. 본 개시내용에 따른 세포 배양 배지는 예를 들면, 줄기 세포 및/또는 선조 세포, 예컨대 간엽 줄기세포가 포함된 세포의 성장 또는 유지에 필요한 영양소(예를 들면, 성장 인자 등)을 제공하도록 제형화된다. 바람직한 형태에 있어서, 그와 같은 세포 배양 배지는 부가된 헤파린이 없고, 그리고 그럼에도 불구하고 임의의 응고된 물질도 없다 (예를 들면 확대하지 않고, 육안으로도 볼 수 있는 응혈 입자의 존재로써 증명될 수 있다).
다른 구현예에서, 본 개시내용의 상기 액체 생물활성 분획 조성물, 또는 이의 분획은 치료적 물질로 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 조성물은 병든 또는 손상된 조직 예컨대 신경, 힘줄, 골, 근육, 피부 (예를 들면 상처 치유), 연결 조직, 안구 조직 및/또는 심혈관 (예를 들면 심장 또는 대동맥)의 치료를 포함하는 의료 치료용 치료적 물질로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 상기 액체 생물활성 분획 또는 이를 포함하는 조성물은 예를 들면 주사 또는 다른 수술적 이식을 포함한 임의의 적당한 수준에 의해 이들 조직 또는 다른 조직으로 전달될 수 있다. 어떤 용도에서, 안구 조직의 시료에 있어서, 상기 액체 생물활성 조성물 또는 이를 포함하는 조성물은 예를 들면, 안구 표면 결함 또는 질환, 예컨대 안구 이식편 대 숙주 질환 (안구 GVHD), 각막 궤양, 안구 건조 (건성각결막염), 또는 수술 또는 손상 후 각막 보수 치료에서 눈의 표면에 제공된다(예를 들면, 액체 액적 형태로).
다른 구현예에서, 본 개시내용의 상기 액체 생물활성 분획 조성물, 또는 이의 분획은 치료적 물질로 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 조성물은 병든 또는 손상된 조직 예컨대 신경, 힘줄, 골, 근육, 피부 (예를 들면 상처 치유), 연결 조직, 안구 조직 및/또는 심혈관 (예를 들면 심장 또는 대동맥)의 치료를 포함하는 의료 치료용 치료적 물질로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 상기 액체 생물활성 분획 또는 이를 포함하는 조성물은 예를 들면 주사 또는 다른 수술적 이식을 포함한 임의의 적당한 수준에 의해 이들 조직 또는 다른 조직으로 전달될 수 있다. 어떤 용도에서, 안구 조직의 시료에 있어서, 상기 액체 생물활성 조성물 또는 이를 포함하는 조성물은 예를 들면, 안구 표면 결함 또는 질환, 예컨대 안구 이식편 대 숙주 질환 (안구 GVHD), 각막 궤양, 안구 건조 (건성각결막염), 또는 수술 또는 손상 후 각막 보수 치료에서 눈의 표면에 제공된다(예를 들면, 액체 액적 형태로).
본 발명의 어떤 변형에 따르면, 본 개시내용의 상기 액체 생물활성 분획은 포유동물 환자 (예를 들면 인간, 갯과, 고양이, 말, 등)를 치료하는데 사용된다. 어떤 구현예에서 상기 액체 생물활성 분획은 표적 환자에 대하여 동종이계(allogeneic)이며, 다른 구현예에서 상기 액체 생물활성 분획은 표적 환자에 대하여 이종(xenogenic)이다. 예를 들면, 어떤 구현예에서, 인간 혈소판으로부터 유도된 혈소판 용해물 조성물은 갯과 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 갯과 혈소판으로부터 유도된 혈소판 용해물 조성물을 갯과 환자 치료에 사용할 수 있고, 그리고 인간 환자로부터 유도된 혈소판 용해물 조성물은 인간 환자의 치료에 사용될 수 있는 것으로 또한 구상된다. 일부 형태에서, 상기 환자는 건성각결막염을 앓고 있다. 어떤 본 발명의 어떤 변형에 따르면, 본 개시내용의 상기 액체 생물활성 분획은 건성각결막염을 앓고 있는 갯과 환자를 치료하는데 사용된다. 상기 갯과 환자는 임의의 갯과 품종일 수 있으며, 그리고 건성각결막염에 흔하게 걸리는 품중은 하기를 포함한다: 카바리에 킹 찰스 스파니엘 (cavalier king charles spaniel), 불독, 차이니즈 샤-페이(Chinese shar-pei), 라사 압소(lhasa apso), 시츄(shih tzu), 웨스트 하일랜드 화이트 테리어(west highland white terrier), 퍼그(pug), 블러드하운드(bloodhound), 코커 스패니얼(cocker spaniel), 페키니즈(Pekingese), 보스톤 테리어(boston terrier), 미니츄어 쉬나우처(miniature schnauzer), 그리고 사모에드(Samoyed).
어떤 구현예에서, 액체 생물활성 분획이 포함된 인간 혈소판 용해물은 환자의 눈에 상기 액체 생물활성 분획을 전달하도록 형태를 갖춘 액체 전달 장치 안에 보관된다. 일부 형태에서, 상기 액체 전달 장치는 멸균된 용기다. 도 3은 액체 전달 장치의 한 가지 구현예를 설명한다. 실증된 구현예에서, 상기 액체 생물활성 분획은 디바이스(300)안에 보관된다. 디바이스(300)는 보관 부분(310) 및 분산 부분(320)을 갖는다. 실증된 구현예에서, 분산 부분(320)은 임의로 뚜껑(322)으로 덮힐 수 있다. 분산 부분(320)은 액체 생물활성 분획의 부분이 분배되도록 (예를 들면 개별 액적) 구성될 수 있다. 일부 형태에서, 보관 부분(310)은 사용자에 의해 눌러 짜일 수 있는 변형가능한 플라스틱 재료를 포함한다. 다른 적합한 액체 전달 장치는 점안기, 및 피펫을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 액체 생물활성 분획은 연고로 제형화된다. 일부 형태에서, hPL 함유 연고는 병든 부위(예를 들면, 환자의 눈)에 국소적으로 제공된다.
상기 액체 생물활성 조성물은 다른 목적, 예를 들면 세포의 냉동보존제와 같은 것이 포함된, 다른 목적으로 또한 사용될 수 있다. 그와 같은 냉동보존제 사용에서, 상기 액체 생물활성 조성물은 세포성 현탁 조성물 안에 혼입될 수 있고, 상기 세포성 현탁 조성물은 세포의 생존력을 보존하기 위하여 냉동보존될 수 있다. 상기 세포는 줄기세포, 예컨대 간엽 줄기세포, 선조 세포, 또는 기타 세포가 포함된 다양한 세포중 임의의 것이 될 수 있다. 상기 냉동보존은 적합한 용기, 예컨대 주머니 또는 바이알 안에서 실행될 수 있다.
용해된 혈소판 농축물로부터 회수된 액체 생물활성 분획으로부터 생성물을 유도하는 것에 추가적으로, 상기 응고 및 액체-고형 분리 동안 형성된 고형 응혈 물질로부터 고부가 생성물이 또한 만들어질 수 있다. 어떤 방식에서, 상기 분리된 고형 응혈 물질에는 성장 인자들이 또한 풍부하다는 것이 발견되었고, 그리고 예를 들면 생물학적 접착제에서 응고성 비히클로 기능을 하는, 및/또는 의료용 지혈 물질로 기능을 하는 충분한 양의 피브리노겐과 응고인자들이 포함되어 있다는 것이 발견되었다. 이들 목적 또는 다른 목적용으로, 회수된 고형 응혈 물질은 냉장 또는 냉동 조건에서 보관될 수 있고 및/또는 냉동건조되어 건조 물질을 만들 수 있고, 이 건조물질은 임의로 분말 형태 만들 수도 있다. 의료, 진단, 조사, 또는 기타 응용을 위하여, 상기 고형 응혈 물질 또는 이로부터 유도된 분획은 임의의 적당한 수단 예를 들면, 방사선에 노출 또는 화학적 살균제 (예를 들면, 에틸렌 옥사이드)를 포함한 임의의 적당한 수단에 의해 멸균될 수 있다.
또한, 상기에서 논의된, 상기 액체 생물활성 분획의 회수, 및 상기 응고 및 액체-고형 분리 동안 형성된 고형 응혈 물질로부터 만들어진 잠재적 생성물에 추가하여, 생물활성 물질 예컨대 성장 인자 또는 다른 단백질은 상기 혈소판 용해물을 가공하는데 사용된 필터 또는 필터들로부터 개별적으로, 또는 혼합물 형태로 회수될 수 있다. 이로써 상기 최초 개시 물질로부터 부가 가치를 얻을 수 있다. 예증적으로, 상기 혈소판 용해물 조성물의 여과에 사용된 심층 필터 (예를 들면 상기에서 기재된 바와 같이 심층 필터)는 추후 처리되어 필터 안에 붙잡혀있는 하나 이상의 성장 인자 또는 다른 생활성 물질을 회수할 수 있다. 이것은 임의의 적합한 방식으로 실현될 수 있다. 예증적으로, 하나 이상의 단백질, 예컨대 성장 인자는 필터 매체에 대한 단백질(들)의 인력을 이겨내도록 필터를 통하여 용리 액체를 통과시키고, 그렇게 함으로써 상기 단백질(들)이 포함된 용리 기류가 생성됨으로써, 필터로부터 용출될 수 있다. 충전된 (예를 들면 양으로 하전된) 심층 필터가 사용된 경우, 그리고 필터가는 단백질(들)과 상기 충전된 필터 매질 사이의 전하에 최소한 일부분 의존하여 단백질을 보유하고 있는 경우, 상기 단백질(들)은 염 용액(들), 용출 액체의 pH 변화(초기 여과 동안 사용된 것과 비교하여), 또는 친화성 용출 매질 (용출되는 단백질(들)에 대한 리간드(들)이 포함된)을 이용한 용출에 의해 필터 매질로부터 회수될 수 있다. 특정 단백질 또는 관심 단백질에 대해 정제된 또는 농축된 분획을 순차적으로 용리시키기 위하여 구배 용출 (예를 들면 염 또는 pH 구배)이 사용될 수 있다. 상기 회수된 단백질 또는 단백질(들)은 예를 들면, 본 명세서에서 확인된 임의의 것들, 바람직하게는 본 명세서에서 확인된 하나 이상 성장 인자, 인터루킨, 인터페론, 및/또는 종양 괴사 인자일 수 있다. 이들은 예를 들면 치료제, 진단 또는 조사 목적으로 사용될 수 있다. 여과 매질로부터 회수된 후, 이들 목적 또는 다른 목적을 위하여 임의의 정제 및/또는 멸균될 수 있다.
본 개시내용의 측면 및 그것의 특징 및 이점의 추가 이해를 돕기 위한 목적으로, 하기 구체적인 예들이 제공된다. 이들 예는 본 개시내용 의 구현예의 예증을 위한 것이며, 이에 국한되지 않음을 인지할 것이다.
실시예들
실시예 1
인간 혈소판 용해물 조성물의 조제물
5-일 유통 기한을 막 넘긴 질환-스크리닝된 성분채집된 인간 혈소판 유닛 (말초 혈액으로부터 수득)이 수집되었고, 사용할 때까지 냉동고 안 -20℃에서 냉동되었다. 많은 유닛 (예를 들면 약 10 유닛)을 냉동고로부터 꺼내고, 실온에서 해동시킨 후, 상기 혈소판을 용해시켜, "미가공 hPL" 조성물을 만든다. 선택된 유닛으로부터 얻은 상기 미가공 hPL은 주머니 안에 모은다(풀링). 상기 풀링된 미가공 hPL에 염화칼슘이 0.7 그램/L 수준(대략 6 mM CaCl2)에서 부가되고, 그 다음 상기 미가공 hPL과 함께 진탕기에서 실온에서 2 시간 동안 철저하게 혼합된다. 혼합 후, CaCl2-처리된 미가공 hPL은 실온에서 밤새 응고되도록 두고, 그 동안 미가공 hPL의 용적으로부터 단단하고, 실질적으로 균질한 응고된 겔 덩어리가 형성된다.
미가공 hPL의 겔 응고가 포함되고, 닫힌 상태로 유지된 주머니를 손으로 압박하여 상기 겔 응고로부터 액체를 짜낸다. 이러한 압박은 철저히 이루어지고, 주머니의 한쪽 단부에는 고형 응고 덩어리가 있고, 유출 주둥이에 인접해 있는 이 주머니의 다른 단부에는 분리된 액체 용적이 있게 된다. 상기 분리된 액체는 최초, 풀링된 미가공 hPL 용적의 대략 75-80%가 되며, 그 나머지는 상기 고형 응고 물질이다. 상기 액체는 주머니에서 100L 용적을 갖는 제2의 냉장된 주머니로 이용된다. 이러한 해동-풀링-압박 과정은 충분한 횟수로 실행되어 냉장된 100L 냉장 주머니는 액체로 채워진다.
100L 주머니 안에 액체는 양성 표면 전하 및 3 내지 0.2 마이크론의 명목 마이크론 등급을 가진 필터 매질을 갖는 제 1 심층 필터와 0.1 내지 .001 마이크론의 명목 마이크론 등급을 가진 필터 매질을 갖는 제 2 심층 필터로 구성된 필터 트레인에 무균적으로 연결되고, 이를 통하여 가공된다. 상기 여과는 시간당 필터 표면적 제곱 미터당 약 100리터("LMH")의 여과액 유량으로 실행된다. 상기 제1 심층 필터로는 Millistack Pod Filter, Grade C0 Series HC Depth Filter가 제공되며, 그리고 제2 심층 필터로는 Millistack Pod Filter, Grade XO Series HC Depth Filter로 제공되며, 이둘 모두 Millipore Corporation로부터 상업적으로 구입가능하다. 각각의 이들 필터는 셀룰로오스의 혼합된 에스테르로 구성된 막과 무기 여과 보조제 (규조토)와 함께 셀룰로오스 섬유로 구성된 필터 매질을 갖는다. 상기 100L 주머니 물질을 처리하기에 앞서, 상기 필터 트레인은 멸균된, 증류수로 감작된다(primed). 상기 필터 트레인을 빠져나오는 hPL 액체는 제2 100L 주머니로 모인다.
제2 100L hPL 주머니는 멸균 필터에 무균 연결되고, 그리고 이 멸균 필터를 통하여 더 작은 용기, 예를 들면 100 mL 또는 500 mL 병 (예를 들면 Nalgene jars)로 펌핑된다. 이것은 멸균 충전 조건하에서 실행될 수 있다. 상기 병들은 뚜껑덮힌 단부를 감싸도록 수축 포장되고, 그리고 라벨로 표지될 수 있다.
본 실시예에 따라 생산된 hPL 생성물은 본 명세서에서 명시된 조성 프로파일을 보유하고, 그리고 응고 형성을 방지하기 위하여 헤파린을 부가해야하는 조건 없이 세포 배양 배지에 보충물로 사용될 수 있다. 세포 배양 배지에 이러한 hPL 생성물을 부가하면 헤파린을 부가하지 않더라도 본질적으로 응고-없는 매질이 된다. 이렇게 생산된 세포 배양 배지는 골수 간엽 세포, 지방세포 줄기세포, 태반 유도된 간엽 줄기세포, 및 근육-유도된 줄기 세포 또는 선조 세포가 포함되나, 이에 국한되지 않는 세포 배양물에서 바람직한 사용시 획득될 수 있는 주어진 배양 기간 후 상대적으로 높은 세포 수 또는 퍼센트 밀집도를 가지는, 탁월한 특징을 나타낸다.
실시예 2
인간 혈소판 용해물 조성물의 제조물
5-일 유통 기한을 막 넘긴 질환-스크리닝된 성분채집된 인간 혈소판 유닛 (말초 혈액으로부터 수득)이 수집되었고, 사용할 때까지 냉동고 안 -20℃에서 냉동되었다. 많은 유닛 (예를 들면 약 23 유닛)을 냉동고로부터 꺼내고, 실온에서 해동시킨 후, 상기 혈소판을 용해시켜, "미가공 hPL" 조성물을 만든다. 선택된 유닛으로부터 얻은 상기 미가공 hPL은 주머니 안에 모은다(풀링). 상기 풀링된 미가공 hPL에 염화칼슘이 0.75 그램/L 수준(대략 6 mM CaCl2)에서 부가되고, 그 다음 상기 미가공 hPL과 함께 진탕기에서 실온에서 2 시간 동안 철저하게 혼합된다. 혼합 후, CaCl2-처리된 미가공 hPL은 실온에서 밤새 응고되도록 두고, 그 동안 미가공 hPL의 용적으로부터 단단하고, 실질적으로 균질한 응고된 겔 덩어리가 형성된다.
미가공 hPL의 겔 응고가 포함되고, 닫힌 상태로 유지된 주머니를 압박하여 상기 겔 응고로부터 액체를 짜낸다. 이러한 압박은 철저히 이루어지고, 주머니의 한쪽 단부에는 고형 응고 덩어리가 있고, 유출 주둥이에 인접해 있는 이 주머니의 다른 단부에는 분리된 액체 용적이 있게 된다. 상기 분리된 액체는 최초, 풀링된 미가공 hPL 용적의 대략 75-80%가 되며, 그 나머지는 상기 고형 응고 물질이다. 상기 액체는 주머니에서 25L 용적을 갖는 제2의 충전 주머니로 이용된다. 이러한 해동-풀링-압박 과정은 충분한 횟수로 실행되어 25L 충전 주머니는 액체로 채워진다.
상기 25L 충전 주머니는 4℃, 실험실 냉장고 안에서 밤새 보관된다. 25L 충전 주머니로부터, 사전-필터 (25㎛) 및 멸균 필터 (0.2㎛)로 유체를 이동시키는데 연동 펌프가 사용된다. 상기 여과된 액체는 수집 주머니로 모인다. 그 다음 여과된 액체 (hPL)는 멸균된 용기 (예로써, 100 mL 또는 500 mL Nalgene jars)로 분주된다. 이것은 멸균 충전 조건하에서 실행될 수 있다. 상기 병들은 뚜껑덮힌 단부를 감싸도록 수축 포장되고, 그리고 라벨로 표지될 수 있다.
본 실시예에 따라 생산된 hPL 생성물은 본 명세서에서 명시된 조성 프로파일을 보유하고, 그리고 응고 형성을 방지하기 위하여 헤파린을 추가해야하는 조건 없이 세포 배양 배지에 보충물로 사용될 수 있고, 그리고 액체 생물활성 분획에 대하여 본원 명세서에서 확인된 기타 용도에 또한 사용될 수 있다. 세포 배양 배지에 이러한 hPL 생성물을 부가하면 헤파린을 추가하지 않더라도 본질적으로 응고-없는 매질이 된다. 이렇게 생산된 세포 배양 배지는 골수 간엽 세포, 지방세포 줄기세포, 태반 유도된 간엽 줄기세포, 및 근육-유도된 줄기 세포 또는 선조 세포가 포함되나, 이에 국한되지 않는 세포 배양물에서 바람직한 사용시 획득될 수 있는 주어진 배양 기간 후 상대적으로 높은 세포 수 또는 퍼센트 밀집도를 가지는, 탁월한 특징을 나타낸다.
실시예 3
갯과 혈소판 용해물 조성물의 제조물
갯과 혈소판 용해물 (CPL) 조성물은 상기에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 일반적으로, CPL 조성물의 제조는 말초 혈액으로부터 수득된 질환-스크리닝된 성분채집된 갯과 혈소판 유닛의 제조로 시작된다. 상기에서 상세하게 설명된 바와 같이, 그와 같은 혈소판 유닛은 새로 준비되거나 또는 유통기한을 넘긴 혈소판 유잇으로부터 수득될 수 있다. 상기 혈소판 유닛은 냉동고 안 -20℃에서 냉동되었다. 많은 유닛 (예를 들면 약 10 유닛)을 냉동고로부터 꺼내고, 실온에서 해동시킨 후, 상기 혈소판을 용해시켜, "미가공 CPL" 조성물을 만든다. 선택된 유닛으로부터 얻은 상기 미가공 CPL은 주머니 안에 모은다(풀링). 상기 풀링된 미가공 CPL에 염화칼슘이 0.7 그램/L 수준(대략 6 mM CaCl2)에서 부가되고, 그 다음 상기 미가공 CPL과 함께 진탕기에서 실온에서 2 시간 동안 철저하게 혼합된다. 혼합 후, CaCl2-처리된 미가공 CPL은 실온에서 밤새 응고되도록 두고, 그 동안 미가공 CPL의 용적으로부터 단단하고, 실질적으로 균질한 응고된 겔 덩어리가 형성된다.
미가공 CPL의 겔 응고가 포함되고, 닫힌 상태로 유지된 주머니를 손으로 압박하여 상기 겔 응고로부터 액체를 짜낸다. 이러한 압박은 철저히 이루어지고, 주머니의 한쪽 단부에는 고형 응고 덩어리가 있고, 유출 주둥이에 인접해 있는 이 주머니의 다른 단부에는 분리된 액체 용적이 있게 된다. 상기 분리된 액체는 최초, 풀링된 미가공 CPL 용적의 대략 75-80%가 되며, 그 나머지는 상기 고형 응고 물질이다. 상기 액체는 주머니에서 100L 용적을 갖는 제2의 냉장된 주머니로 이용된다. 이러한 해동-풀링-압박 과정은 충분한 횟수로 실행되어 냉장된 100L 냉장 주머니는 액체로 채워진다.
상기 수집된 액체 (예를 들면, 액체 생물활성 분획)는 그 다음 멸균 필터를 통하여 통과된다. 일부 형태에서, 상기 수집된 액체는 실시예 1에 기재된 바와 같이 일련의 심층 필터를 통하여 통과된다. 그 다음 여과된 액체 (cPL)는 멸균된 용기 (예를 들면 100 mL 또는 500 mL Nalgene jars) 안으로 분주된다. 이것은 멸균 충전 조건하에서 실행될 수 있다. 상기 병들은 뚜껑덮힌 단부를 감싸도록 수축 포장되고, 그리고 라벨로 표지될 수 있다.
본 실시예에 따라 생산된 CPL생성물은 본 명세서에서 명시된 조성 프로파일을 보유하고, 그리고 응고 형성을 방지하기 위하여 헤파린을 추가해야하는 조건 없이 세포 배양 배지에 보충물로 사용될 수 있고, 그리고 액체 생물활성 분획에 대하여 본원 명세서에서 확인된 기타 용도에 또한 사용될 수 있다. 세포 배양 배지에 이러한 CPL 생성물을 부가하면 헤파린을 추가하지 않더라도 본질적으로 응고-없는 매질이 된다. 이렇게 생산된 세포 배양 배지는 골수 간엽 세포, 지방세포 줄기세포, 태반 유도된 간엽 줄기세포, 및 근육-유도된 줄기 세포 또는 선조 세포가 포함되나, 이에 국한되지 않는 세포 배양물에서 바람직한 사용시 획득될 수 있는 주어진 배양 기간 후 상대적으로 높은 세포 수 또는 퍼센트 밀집도를 가지는, 탁월한 특징을 나타낸다. 상기 CPL 용액은 본원에 기재된 바와 같이 치료제로 또한 사용될 수 있다.
본 발명을 설명하는 내용에서, 특히 다음의 청구범위 내용에서) 용어들 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 지시대상의 사용은 본원에서 다른 지적이 없는 한, 그리고 맥락에 의해 명확하게 부정되지 않는 한, 단수와 복수를 모두 포용하는 것으로 해석된다. 본원 명세서에서 값 범위 언급은 다른 지적이 없는 한, 해당 범위 안에 속하는 각 별개의 값을 개별적으로 언급하기 위한 속기 방법으로 나타내는 것을 의도한 것이며, 그리고 각 별도의 값은 본원 명세서에서 이들이 마치 개별적으로 인용되는 것 처럼 본 명세서 안에 편입된다. 본원 명세서에서 다른 지적이 없는 한 그리고 맥락에 의해 명확하게 부정되지 않는 한, 본원에서 기재된 방법 모든 방법들은 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원 명세서에서 제공된 임의의 그리고 모든 예시들, 또는 예시적인 언어 (예를 들면, "예컨대")은 다른 청구가 없는 한, 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 의도이며, 본 발명의 범위에 제한을 두는 의도는 없다. 명세서에서 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어야 하는 언어는 없다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허 출원들은 각 개별적인 공보 또는 특허 출원이 참고문헌으로 특이적으로 그리고 개별적으로 명시적으로 편입된 것 처럼, 본 명세서에 편입된다. 게다가, 본 명세서에서 언급된 임의의 이론, 작업 기전, 증거, 또는 발견은 본 발명의 이해를 더 강화시키려는 의미이며, 어떤 식으로든 이와 같은 이론, 작업 기전, 증거 또는 발견에 본 발명을 국한시키려는 의도는 없다. 본 발명은 도면 및 이전의 설명에서 실증되며, 상세하게 설명되었지만, 이는 예증적인 것으로 간주되어야 하며, 특징을 제한하는 것이 아니며, 오직 선택된 구현예는 보여주고, 설명한 것이며, 본 발명 본원에서 정의된 바와 같이 또는 청구범위의 사상 내에 있는 모든 등가물, 변화, 및 변형은 보호받고자 하는 것임을 인지할 것이다.

Claims (72)

  1. 생물활성(bioactive) 조성물의 제조 방법으로서, 상기 방법이:
    혈소판 및 혈장을 포함하는 인간 혈액-유래된 농축물의 혈소판을 용해시켜 용해된 혈소판 제제(preparation)를 형성하는 단계;
    상기 용해된 혈소판 제제에서 피브리노겐을 피브린으로 전환시키는 응고제를 첨가하여 상기 용해된 혈소판 제제로부터 응고 겔(gel clot)을 형성하는 단계;
    상기 응고 겔을 압축(compress)하여 응고 겔로부터 액체를 짜내고(express) 상기 응고 겔의 고체로부터 액체를 분리하는 단계를 포함하고, 상기 압축 단계는 2개 이상의 표면 사이에서 응고 겔을 압박(press)하는 단계를 포함하고;
    상기 생물활성 조성물의 제조 동안 헤파린이 첨가되지 않고;
    상기 생물활성 조성물이 20,000 ng/mL 미만의 수준으로 피브리노겐을 포함하는, 생물활성 조성물의 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 생물활성 조성물을 세포성 현탁 조성물 안에 혼입시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법,
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 세포성 현탁 조성물을 냉동보존시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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