KR102656373B1 - 난소 조직 이식용 하이드로겔 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 난소 조직 이식용 하이드로겔, 키트 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔은 난소 조직 이식 시 발생하는 허혈성 손상을 최소화 할 수 있으며, 보다 안정된 혈관을 형성시킬 수 있고, 난소 기능 관련 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
Description
본 명세서에는 난소 조직 이식용 하이드로겔, 키트 및 이의 제조 방법이 개시된다.
국제적으로 암 발생률이 꾸준히 증가함과 동시에 현대 의학 및 과학 기술의 발달로 암 환자의 생존율 또한 증가하는 추세를 보이고 있다. 암 치료 과정에서 받게 되는 화학 및 방사선 치료요법으로 인해 환자의 가임력이 저하되며, 이는 암 치료 이후의 암 생존자들의 삶의 질을 크게 저하시키는 요인이 되고 있다. 또한, 가임력 저하는 국가적으로도 심각한 저출산 문제와도 직결되어 있다. 저출산 문제 해결과 국민의 삶의 질 향상을 위해 가임력 보존 치료 기술의 개발과 확립이 시급한 실정이다.
암 환자들을 대상으로 시행되는 가임력 보존 치료에는 항암요법 이전에 시행하는 난자동결, 배아 동결 등이 있다. 그러나 이 방법은 과배란 유도가 불가능한 소아 환자 혹은 항암 치료가 시급한 환자 등에서는 적용할 수 없는 방법이며, 적용가능한 환자군에 있어서도 제한된 수의 생식세포 획득만 가능할 뿐 호르몬 기능 자체를 회복시킬 수 없는 한계가 있다. 그 대안으로 항암 치료 전 난소조직을 동결해두었다가 치료 후 재이식하여 가임력을 회복시키는 방법이 제시되었으며, 전 세계적으로 성공적인 임신, 출산이 보고된 바 있다.
이러한 난소조직 동결-해동 재이식 치료법의 가장 큰 문제점은 재이식 시 허혈성 손상이 발생하는 것이다. 이는 난소 조직 내 남아있는 난포가 소실되는 가장 큰 원인이 된다.
Valerie Luyckx et al., "First step in developing a 3D biodegradable fibrin scaffold for an artificial ovary." Journal of Ovarian Research (2013), Vol. 6:83, pp. 1-10.
전술한 문제를 해결하고자, 본 발명자들은 적합한 생체 재료를 이용한 융합 연구를 진행하여 난소 조직의 이식 효율을 극대화하고, 허혈성 손상으로부터 난포를 보호함으로써 현 가임력 보존 기술의 한계를 극복할 수 있는 신기술에 대해 예의 연구하여 본 발명에 이르렀다.
일 측면에서, 본 발명은 난소 조직 이식용 하이드로겔을 제공하고자 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 난소 조직 이식용 하이드로겔의 제조 방법을 제공하고자 한다.
일 측면에서, 본 발명은, 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP) 및 피브린을 포함하는 난소 조직 이식용 하이드로겔을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 하이드로겔; 또는 상기 하이드로겔을 제조하기 위한 혼합물을 포함하는 키트로서, 상기 혼합물은 혈소판 풍부 혈장, 피브리노겐 및 트롬빈을 포함하는 것인, 난소 조직 이식용 키트를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 혈소판 풍부 혈장 및 피브리노겐을 혼합하여 제1제를 준비하는 단계; (b) 염화칼슘(CaCl2), 글루콘산칼슘 또는 이들의 조합을 트롬빈과 혼합하여 제2제를 준비하는 단계; 및 (c) 상기 제1제 및 제2제를 혼합하는 단계;를 포함하는, 난소 조직 이식용 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 혈소판 풍부 혈장 및 피브리노겐을 혼합하여 제1제를 준비하는 단계; (b) 염화칼슘(CaCl2), 글루콘산칼슘 또는 이들의 조합을 트롬빈과 혼합하여 제2제를 준비하는 단계; 및 (c) 상기 제1제에 난소 조직을 담지하고 상기 제2제를 첨가하여 혼합하는 단계;를 포함하는, 난소 조직의 코팅 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔은 난소 조직 이식 시 발생하는 허혈성 손상을 방지 내지 최소화하여 허혈성 손상으로부터 난포를 보호할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔은 난소 조직 이식 시 보다 안정된 혈관을 형성시킬 수 있으며 난소 기능 관련 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔은 합성 물질이나 화학적으로 개량된 물질이 아닌 자가 혈액과 체내 유래물질을 사용함으로써 체내 적용 시 거부 반응과 같은 부작용을 방지할 수 있고, 비침습적으로 난소 조직만을 표적하여 특이적으로 처리됨으로써 직접 주입에 의한 난소 조직 손상이나 전신투여로 인한 다른 체내 기관에 원치 않는 영향을 방지할 수 있어 매우 안전하다.
도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 연구 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔의 기전 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 측면에 따라, 혈소판 풍부 혈장 내 생체 인자를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 측면에 따라, 혈소판 풍부 혈장의 혈관 형성능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔의 미세 구조 및 기계적 물성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직의 호르몬에 대한 반응 회복 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직으로부터 얻은 난자의 수, 성숙 난자 비율, 수정률 및 배 발달율을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직의 잔존 난포 수 및 질을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직에서의 신혈관 형성 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직에서의 세포자멸사 비율을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직에서의 유전자 발현을 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔의 기전 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 측면에 따라, 혈소판 풍부 혈장 내 생체 인자를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 측면에 따라, 혈소판 풍부 혈장의 혈관 형성능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔의 미세 구조 및 기계적 물성을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직의 호르몬에 대한 반응 회복 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직으로부터 얻은 난자의 수, 성숙 난자 비율, 수정률 및 배 발달율을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직의 잔존 난포 수 및 질을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직에서의 신혈관 형성 효과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직에서의 세포자멸사 비율을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔을 적용한 난소 조직에서의 유전자 발현을 분석한 결과이다.
본 명세서에서 "이식"은 조직이나 장기를 떼어 내어 같은 개체의 다른 부분 또는 다른 개체에 옮겨 붙이는 것뿐만 아니라, 예컨대 항암 치료 등과 같은 특정 치료 전 조직이나 장기를 떼어 내어 동결해두었다가, 치료 후 해동하여 같은 개체에 재이식하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에 "동결-해동 난소 조직"은 가임력보존 등을 위해 동결보존 시킨 난소 조직을 이식 등에 사용하기 위해 해동시킨 것을 의미할 수 있다.
이하, 본 발명의 예시적인 구현예들을 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 연구 모식도이고, 도 2는 본 발명의 일 측면에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔의 기전 모식도이다.
난소 조식은 무혈관성 조직으로, 이식 시 난소 조직은 혈액이 공급되지 않는 상태에 있다. 따라서, 난조 조직 이식 시 허혈성 손상으로 인한 기질 조직의 파괴 및 잔존 난포의 소실이 발생하게 된다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은, 도 1에 도시된 것과 같이, 휴지기의 혈소판이 혈소판 활성화 인자인 피브리노겐, 트롬빈, Ca2+, ECM 등에 의해 활성화되어 성장인자, 사이토카인, 케모카인을 방출하는 것에 착안해 난소 조직을 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP) 및 피브린(fibrin)을 포함하는 하이드로겔로 캡슐화함으로써 난소 조직을 복구하고, 세포자멸사를 방지하며, 혈관형성을 촉진하도록 하였다.
따라서, 일 측면에서, 본 발명의 예시적인 구현예들에서는 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma; PRP) 및 피브린을 포함하는 난소 조직 이식용 하이드로겔을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 난소 조직은 바람직하게는 동결-해동 난소 조직일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 혈소판 풍부 혈장은 자가 혈액 유래의 혈소판 풍부 혈장일 수 있다.
도 2에 도시된 것과 같이, 본 발명의 일 구현예에 따른 난소 조직 이식용 하이드로겔은 이식 시 혈액이 공급되지 않은 난소 조직을 코팅 등과 같은 방법으로 캡슐화함으로써 국소적으로 혈액 유래의 인자들을 효과적으로 난소 조직에 전달할 수 있다.
난소 조직을 캡슐화하고 있는 난소 조직 이식용 하이드로겔로부터 혈소판 풍부 혈장이 활성화 되면서 방출된 인자들이 난소 조직을 보호 및 회복시키고, 세포자멸사를 방지하며, 신혈관을 빠르게 형성시키고, 난포의 성장 및 생존에 도움을 줄 수 있다(도 2의 intrinsic effect 참조).
또한, 해당 난소 조직 이식용 하이드로겔은 이식을 받은 개체의 체내로 혈액 유래의 성장인자들을 방출하여 다른 세포들을 화학적으로 이동시키고, 난소 조직의 회복에 이로운 면역반응을 도모하며 염증 반응을 최소화하고, 혈관의 형성을 촉진할 수 있다(도 2의 extrinsic effect 참조).
이에 따라, 본 발명의 구현예들의 난소 조직 이식용 하이드로겔은 난소 소직의 중요한 기능인 호르몬 생산과 성숙 난자의 생산의 효율을 이식된 난소 조직에서 현저히 증가시킬 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 하이드로겔은 다공성일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 하이드로겔은 아프로티닌(aprotinin), CaCl2 및 글루콘산칼슘(Calcium gluconate)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 하이드로겔은 난소 조직의 허혈성 손상을 방지 내지 최소화하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 하이드로겔은 난소 조직 이식 시 특히 동결-해동 난소 조직의 재이식시 난소 조직의 허혈성 손상을 방지 내지 최소화하고 난포를 보호할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 하이드로겔은 난소 조직을 코팅하는 것일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 혈소판 풍부 혈장 및 피브린을 포함하는 하이드로겔을 포함하는 난소 조직 이식용 키트를 제공한다. 상기 혈소판 풍부 혈장, 피브린, 난소 조직, 하이드로겔 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 혈소판 풍부 혈장 및 피브리노겐을 혼합하여 제1제를 준비하는 단계; (b) 염화칼슘(CaCl2), 글루콘산칼슘 또는 이들의 조합을 트롬빈과 혼합하여 제2제를 준비하는 단계; 및 (c) 상기 제1제 및 제2제를 혼합하는 단계;를 포함하는, 난소 조직 이식용 하이드로겔의 제조 방법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 상기 (a) 단계의 혈소판 풍부 혈장은, 혈소판 풍부 혈장을 혈장에 1/10 내지 1/2로 희석한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 (a) 단계의 혈소판 풍부 혈장은, 혈소판 풍부 혈장을 혈장에 1/10 내지 1/2, 1/5 내지 1/2 또는 1/5 내지 2/5, 바람직하게는 1/4로 희석한 것일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 (a) 단계의 피브리노겐의 농도는 20 내지 80 mg/mL일 수 있다. 구체적으로, 상기 (a) 단계의 피브리노겐의 농도는 20 mg/mL 이상, 21 mg/mL 이상, 22 mg/mL 이상, 23 mg/mL 이상, 24 mg/mL 이상, 25 mg/mL 이상, 26 mg/mL 이상, 27 mg/mL 이상, 28 mg/mL 이상, 29 mg/mL 이상, 30 mg/mL 이상, 31 mg/mL 이상, 32 mg/mL 이상, 33 mg/mL 이상, 34 mg/mL 이상, 35 mg/mL 이상, 36 mg/mL 이상, 37 mg/mL 이상, 38 mg/mL 이상, 39 mg/mL 이상, 40 mg/mL 이상, 41 mg/mL 이상, 42 mg/mL 이상, 43 mg/mL 이상, 44 mg/mL 이상 또는 45 mg/mL 이상이면서, 80 mg/mL 이하, 79 mg/mL 이하, 78 mg/mL 이하, 77 mg/mL 이하, 76 mg/mL 이하, 75 mg/mL 이하, 74 mg/mL 이하, 73 mg/mL 이하, 72 mg/mL 이하, 71 mg/mL 이하, 70 mg/mL 이하, 69 mg/mL 이하, 68 mg/mL 이하, 67 mg/mL 이하, 66 mg/mL 이하, 65 mg/mL 이하, 64 mg/mL 이하, 63 mg/mL 이하, 62 mg/mL 이하, 61 mg/mL 이하, 60 mg/mL 이하, 59 mg/mL 이하, 58 mg/mL 이하, 57 mg/mL 이하, 56 mg/mL 이하 또는 55 mg/mL 이하일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 (a) 단계의 제1제는 아프로티닌을 더 포함할 수 있다.
일 구현예에 있어서, (c) 단계에서 제1제 및 제2제가 혼합되게 되면 젤리 형태의 하이드로겔이 형성된다. 이 때, 제1제에 난소 조직을 담지한 후 이를 제2제와 혼합할 수 있다.
일 구현예에 있어서, 상기 난소 조직은 동결-해동 난소 조직일 수 있다.
일 구현예에 있어서, (c) 단계에서 제1제 및 제2제를 1: 0.5 내지 2의 중량비로 혼합할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1제 및 제2제는 1: 0.5 내지 2, 1: 0.7 내지 2, 1: 0.7 내지 1.7, 1: 1 내지 1.5 또는 1:1의 중량비로 혼합될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 혈소판 풍부 혈장 및 피브리노겐을 혼합하여 제1제를 준비하는 단계; (b) 염화칼슘(CaCl2), 글루콘산칼슘 또는 이들의 조합을 트롬빈과 혼합하여 제2제를 준비하는 단계; 및 (c) 상기 제1제에 난소 조직을 담지하고 상기 제2제를 첨가하여 혼합하는 단계;를 포함하는, 난소 조직의 코팅 방법을 제공한다. 상기 혈소판 풍부 혈장, 제1제, 제2제, 난소 조직 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
이상과 같이, 종래에 난소 조직 이식 시 허혈성 손상을 보완하기 위해 적용한 생체재료의 경우, 본래 체내 성분이 아닌 합성 성분을 사용하거나 화학적으로 개량한 물질을 사용하기 때문에 체내 적용시 거부 반응 발생과 같은 위험성이 상존했다. 또한, 허혈성 손상을 보완하기 위해 기존에는 처리 물질을 난소 조직에 직접 주사하거나, 전신 투여를 하는 방법을 사용하였는데, 이는 난소 조직을 오히려 더 손상시킬 수 있고, 다른 체내 기관에도 작용하여 원치 않는 영향을 미칠 위험이 있었다.
이와 달리 본 발명의 구현예들에 의하면 난소 처리 방법이 비침습적이며, 자가 혈액과 체내 유래물질을 사용하고, 본래 혈액이 응고되는 기전을 활용하기 때문에 매우 안전하다는 장점이 있다. 아울러 전신 투여/처리가 아닌 국소적 투여/처리가 가능하다는 장점이 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 혈소판 풍부 혈장(PRP) 제조
1 ml 주사기에 100 ul의 항응고제 (ACD 주사제)를 미리 loading해두고, 마우스 1 마리의 전신 혈액을 채취하였다. 이와 같은 방법으로 총 25마리의 마우스 혈액을 채취하여 혈액 제제 25 ml을 PRS kit (Prodizen, Korea)에 모았다. 혈액과 항응고제가 섞인 혈액 제제가 들어있는 PRS kit를 kit 설명에 따라 윗 부분 뚜껑을 살짝 열어주고, 상온에서 3,500 rpm 조건으로 5분 간 원심분리하였다. 원심분리 후 3층으로 나뉘어진 혈액 제제의 buffy coat 부분이 키트의 가운데 부분에 모이도록 아래 노즐을 회전하여 조절하였다. 윗 부분 노즐을 꽉 잠가준 후, 약간의 적혈구가 포함될 정도로 아래 노즐을 회전하여 PRP 채취 구간에 채워지도록 조절하였다. 멸균된 1ml 주사기를 이용하여 (바늘 제거) 채취 입구를 통해 PRP를 채취하였다. 채취된 PRP를 100% PRP로 사용하였다. 또한, 혈장 추출구를 통해 5ml 주사기를 이용하여 (바늘 제거) 약 2ml의 혈장을 얻은 후, PRS kit 내에 동봉된 syringe connector를 이용하여 상기 혈장에 채취된 PRP를 1/4로 희석하여 25% PRP를 제조하였다.
[실시예 2] 혈소판 풍부 혈장(PRP)의 농도에 따른 생체 인자 및 혈관 형성능 분석
상기 실시예 1의 100% PRP 및 25% PRP이 생체 인자(bioactive molecules)에 미치는 영향을 분석하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 구체적으로 Proteome prolifer cytokine array kit(R&D systems 社)를 사용하여 실시예 1의 100% PRP 및 25% PRP에 포함된 혈관형성(Angiogenesis)과 관련된 사이토카인(cytokine), 케모카인(chemokine), 성장 인자(growth factor)를 제조사의 프로토콜에 따라 확인하였다.
도 3의 결과를 통해, 혈관 형성과 관련된 핵심 인자가 다량 검출됨을 확인할 수 있다.
이를 바탕으로 PRP 농도에 따른 실제 혈관 형성의 효과를 확인하고자, in vitro, ex vivo 실험을 진행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 구체적으로, 인간 제대정맥혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell)를 마트리겔(matrigel) 위에 분주한 후 배양액으로 상기 실시예 1의 100% PRP 및 25% PRP을 사용하여 배양한 후 혈관 세포의 성장과 튜브 형성 정도를 확인하였다. 또한, ex vivo의 경우, 쥐의 복부 대동맥 조직을 얻어 1mm 로 자른 후, 마트리겔에 포매하고 배양액으로 상기 실시예 1의 100% PRP 및 25% PRP을 사용하여 배양하였다. 그 후, 혈관 세포의 뻗어나오는 가지의 수를 세어 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 것과 같이, 대조군과 비교하여 혈소판 풍부 혈장(100% PRP, 25% PRP) 처리군에서 혈관 세포가 더욱 잘 성장하는 것을 확인하였으며, 특히 25% PRP에서 효과가 더 뛰어남을 확인하였다.
[실시예 3] PPR-피브린(fibrin) 하이드로겔의 제조
상기 실시예 1의 100% PRP 및 25% PRP 각각을 피브리노겐(Fibrinogen) 50 mg/ml, 아프로티닌(aprotinin) 혼합하여 제1제를 제조하고, 트롬빈(Thrombin) 50 IU/ml과 CaCl2 10 mM을 혼합하여 제2제를 제조하였다. 상기 제1제 및 제2제를 혼합하여 혈소판 풍부 혈장-피브린(PRP-FH) 하이드로겔을 제조 하였다. 이와 같이 제조된 PRP-FH 하이드드로겔의 미세 구조를 주사전자현미경(Scanning electron microscope; SME) 통해 분석하여 그 결과를 도 5 (A)에 나타내었다. 도 5(B)는 혈소판 풍부 혈장-피브린 및 난소 캡슐화의 제작을 나타낸 것이다. 또한, PRP-FH 하이드드로겔의 기계적 물성을 storage modulus로 측정하여 그 결과를 도 5 (C)에 나타내었다(도 5의 FH-only는 PRP를 사용하지 않은 점을 제외하고는 PRP-FH 하이드로겔과 동일하게 제조된 하이드로겔을 나타낸다).
도 5 (A)에 나타난 것과 같이, 대조군에 비해 25% PRP-FH 하이드로겔 및 100% PRP-FH 하이드로겔에서 적절한 다공성 구조를 확인할 수 있었으며, 100% PRP-FH 하이드로겔에서는 25% PRP-FH 하이드로겔에 비해 밀도가 높은 다공성 구조를 확인할 수 있었다. 도 5 (C)에서 확인할 수 있듯이, 25% PRP-FH 하이드로겔에 비해 100% PRP-FH 하이드로겔이 기계적 물성이 상대적으로 높은 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] PRP-FH 하이드로겔의 난소 조직 기능 회복 평가
실시예 3의 25% PRP-FH, 100% PRP-FH, FH-only 제1제 20 ul 각각에 마우스에서 적출한 난소를 넣고 20초 처리 후, 제2제 20 ul을 넣고 20 처리하는 과정을 2번 반복하여 PRP-FH 하이드로겔로 코팅된 난소를 준비하였다. 이와 같이 코팅된 난소를 마우스에 이식하고, 이식한 마우스에 난포 성장 주사 (Pregnant mare serum gonadotropin; PMSG)를 주사한 후 이식한 난소를 적출하였다. 대조군으로는 코팅되지 않은 난소를 사용하였다. 적출된 난소를 관찰하고 무게를 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다(도 6(A)는 이식된 후 21일 차의 난소를 나타낸 것이고, 도 6(B)는 PMSG를 주사한 난소를 나타낸 것이고, 도 6(C)는 적출된 난소의 무게를 나타낸 그래프(P<0.001)이다).
도 6에 나타난 것과 같이, 대조군 및 FH-only군에 비해 PRP-FH 하이드로겔군에서 적출된 난소의 무게가 유의하게 높아짐을 확인하였다. 난소 조직이 잘 회복 되면 호르몬에 대한 반응성이 높아져 난포가 잘 자라게 되므로, PRP-FH 하이드로겔로 코팅된 난소를 이식하는 경우 호르몬에 대한 반응성이 우수하다는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기에서 이식한 난소에 Pregnant mare serum gonadotropin과 human chorionic gonadotropin을 주사하여 과배란을 유도한 후, 배란 직전인 10시간 정도 후에 난소를 적출하여 현미경 하에서 성장한 난포들을 주사기 바늘로 하나하나 터뜨려 난자를 얻었다. 난자들을 모아서 성숙시키기 위해 in vitro maturation 배양액에서 배양한 뒤, 전체 얻은 난자 대비 성숙된 난자의 비율을 구하고, 성숙 난자들을 대상으로 수컷 생쥐의 정자를 주입(insemination)하여 체외수정을 하였다. 체외수정 다음 날, 수정이 된 배아의 경우 2-cell stage이기 때문에 성숙난자 대비 2-cell stage배아의 비율을 계산하여 수정률을 계산하였고, 이후 3일 뒤에 배반포로 발달한 비율을 계산하여 2-cell stage 배아 대비 배반포의 비율인 배 발달율을 계산하였다. 이와 같이 확인된 총 난자 수, 성숙 난자 비율, 수정률 및 배 발달율을 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 것과 같이, 대조군 및 FH-only군에 비해 PRP-FH 하이드로겔군에서 총 난자 수, 성숙 난자 비율, 수정률 및 배 발달율이 유의하게 증가하였으며, 특히 25% PRP-FH 하이드로겔군에서 크게 증가하였다.
[실시예 5] 이식한 난소 조직의 병리학적 분석
상기 실시예 4에서 적출된 난소에서 난포의 수와 등급을 측정하여 그 결과를 도 8a 및 8b에 나타내었다. 구체적으로, 난소를 파라핀 블록에 포매(embedding)하여 처음부터 끝까지 4 μm의 두께로 섹션하고, 100um의 간격을 두고 한 컷씩 슬라이드를 골라내어 모든 난포의 갯수와 등급을 매겼다. 등급 기준은 다음과 같다: Grade 1 (양호: 온전한 구형 난포 및 난모세포), Grade 2 (보통: 단층 과립세포가 난포 가장자리에서 멀어지지만 온전한 난모세포), Grade 3 (나쁨: 과립막 및 난포막 세포의 파괴 및 손실, 농축성 핵(pyknotic nuclei), 난모세포 손실).
도 8a 및 8b에 나타난 것과 같이, 대조군 및 FH-only군에 비해 PRP-FH 하이드로겔군에서 난포의 수가 유의하게 높았으며, 특히, 25% PRP-FH 하이드로겔군 난포의 수가 가장 높았고, 최상급 난포의 수도 가장 높음을 확인할 수 있었다.
상기 적출된 난소에서 IHC (CD31) 염색을 통해 신혈관 형성 정도를 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다. 구체적으로 적출된 난소에 항원 회수를 위해 표적 회수 용액(pH 6.0)을 마이크로웨이브에서 20분 동안 처리하였다. 그 후, 과산화효소 차단 용액으로 10분 동안 처리한 후 항-CD31 항체(1:50 희석; Abcam, Cambridge, MA, USA)와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 세척한 후, 시편을 EnVision + HRP로 1시간 동안 처리한 후 액체 DAB + Substrate (Dako, Copenhagen, Denmark)로 실온에서 10 내지 15 분 동안 처리하고 헤마톡실린으로 역염색하였다. 그 후, 시편을 Mounting Medium (Dako, Copenhagen, Denmark)으로 마운팅하고 100배 배율의 광학현미경으로 CD31(+) micro vessel을 image J 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 측정하였다.
또한, 상기 적출된 난소에 TUNEL 염색을 수행하여 조직 내 세포자멸사(apoptosis) 비율을 측정하고 그 결과를 도 10에 나타내었다. 구체적으로, 적출된 난소를 0.8% proteinase K (Dako, Copenhagen, Denmark)로 실온에서 20분동안 처리하고 TUNEL 반응 혼합물(Roche, Penzberg, Germany)과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 D-PBS(Nuaille, France)로 세척하고 시편을 현미경(Zeiss AX10, Carl Zeiss AG, Germany)으로 관찰하여 전체 조직 대비 염색이 된 부분의 비율을 AxioVision 4.8.2.0 소프트웨어(Carl Zeiss MicroImaging, Oberkochen, Germany)를 이용해 계산하였다.
도 9 및 도 10에 나타난 것과 같이, 25% PRP-FH 하이드로겔군에서 신혈관 형성 정도가 가장 높았으며 난소 조직 내 세포자멸사 비율은 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 이식한 난소 조직의 분자생물학적 분석
상기 실시예 4에서 적출된 난소에서 유전자 FSHr, LHCGr, Bax, VEGF C, VEGF D 의 발현을 real time PCR을 이용해 분석하고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 것과 같이, 난소 기능과 관련된 유전자인 FSHr, LHCGr의 발현이 PRP-FH 하이드로겔군에서 유의하게 증가된 반면, 난소 내 세포자멸사와 관련된 유전자인 Bax의 발현은 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 혈관 형성과 관련된 유전자는 FH-only군에서 과발현되었으나, 25% PRP-FH 하이드로겔군에서는 안정화가 되어 적절한 발현을 나타냈으며, 혈관 형성 이후 안정화 단계에서 발현되는 림프관 형성관련 인자인 VEGF C, VEGF D의 발현이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
Claims (16)
- 자가 혈액 유래의 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma) 및 피브리노겐을 포함하는 제1제와 염화칼슘(CaCl2), 글루콘산칼슘 또는 이들의 조합; 및 트롬빈;을 포함하는 제2제를 1: 0.7 내지 1.7의 중량비로 포함하고,
상기 혈소판 풍부 혈장을 혈장에 1/5 내지 2/5로 희석하여 혈장:혈장 및 혈소판 풍부 혈장의 부피비가 1:2.5 내지 1:5이며,
상기 피브리노겐의 농도는 40 내지 80 mg/mL인, 난소 조직 코팅 및 이식용 하이드로겔. - 제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은 다공성인 하이드로겔. - 제1항에 있어서,
상기 제1제는 아프로티닌(aprotinin)을 더 포함하는 하이드로겔. - 제1항에 있어서,
상기 난소 조직은 동결-해동 난소 조직인 하이드로겔. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은 난소 조직의 허혈성 손상을 방지하는 것인 하이드로겔. - 제1항 내지 제4항 및 제7항 중 어느 한 항의 하이드로겔; 또는 상기 하이드로겔을 제조하기 위한 혼합물을 포함하는 키트로서,
상기 혼합물은 제1제와 제2제를 1: 0.7 내지 1.7의 중량비로 포함하고,
상기 제1제는 자가 혈액 유래의 혈소판 풍부 혈장 및 피브리노겐을 포함하고,
상기 제2제는 염화칼슘(CaCl2), 글루콘산칼슘 또는 이들의 조합; 및 트롬빈;을 포함하며,
상기 혈소판 풍부 혈장을 혈장에 1/5 내지 2/5로 희석하여 혈장:혈장 및 혈소판 풍부 혈장의 부피비가 1:2.5 내지 1:5이며,
상기 피브리노겐의 농도는 40 내지 80 mg/mL인, 난소 조직 코팅 및 이식용 키트. - (a) 자가 혈액 유래의 혈소판 풍부 혈장 및 피브리노겐을 혼합하여 제1제를 준비하는 단계;
상기 (a) 단계의 혈소판 풍부 혈장은, 혈소판 풍부 혈장을 혈장에 1/5 내지 2/5로 희석하여 혈장:혈장 및 혈소판 풍부 혈장의 부피비가 1:2.5 내지 1:5이며, 상기 피브리노겐의 농도는 40 내지 80 mg/mL이고,
(b) 염화칼슘(CaCl2), 글루콘산칼슘 또는 이들의 조합을 트롬빈과 혼합하여 제2제를 준비하는 단계; 및
(c) 상기 제1제 및 제2제를 1: 0.7 내지 1.7의 중량비로 혼합하는 단계;를 포함하는, 난소 조직 코팅 및 이식용 하이드로겔의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제9항에 있어서,
(a) 단계의 제1제는 아프로티닌을 더 포함하는, 방법. - 삭제
- (a) 자가 혈액 유래의 혈소판 풍부 혈장 및 피브리노겐을 혼합하여 제1제를 준비하는 단계;
상기 (a) 단계의 혈소판 풍부 혈장은, 혈소판 풍부 혈장을 혈장에 1/5 내지 2/5로 희석하여 혈장:혈장 및 혈소판 풍부 혈장의 부피비가 1:2.5 내지 1:5이며, 상기 피브리노겐의 농도는 40 내지 80 mg/mL이고,
(b) 염화칼슘(CaCl2), 글루콘산칼슘 또는 이들의 조합을 트롬빈과 혼합하여 제2제를 준비하는 단계; 및
(c) 상기 제1제에 난소 조직을 담지하고 상기 제2제를 첨가하여 1: 0.7 내지 1.7의 중량비로 혼합하는 단계;를 포함하는, 난소 조직의 코팅 방법.
- 삭제
- 삭제
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