KR20200098600A - 정제된 엑소좀 생성물, 제조 방법 및 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
정제된 엑소좀 생성물은 250 nm 이하의 직경을 갖는 구형 또는 회전타원형 엑소좀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제된 엑소좀 생성물은 10 % 이하의 수분 함량을 갖는다. 정제된 엑소좀 생성물은 인공 혈액 생성물을 제조하기 위해 재구성될 수 있다.
Description
[관련 출원의 상호-참조]
본 출원은 2017년 12월 14일자 U.S. 특허 가출원 제62/598,765호에 대하여 우선권을 주장하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[발명의 개요]
일 측면에서, 본 개시내용은 정제된 엑소좀 생성물을 기술한다. 일부 실시양태에서, 상기 정제된 엑소좀 생성물은 300 nm 이하의 직경을 갖는 구형 또는 회전타원형 엑소좀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 정제된 엑소좀 생성물은 엑소좀의 적어도 95 %가 100 nm의 분포 범위 내에 속하는 직경을 갖는 엑소좀 집단을 포함한다. 이러한 실시양태들 중 일부에서, 정제된 엑소좀 생성물은 엑소좀의 적어도 90 %가 60 nm의 분포 범위 내에 속하는 직경을 갖는 엑소좀 집단을 포함한다.
일부 실시양태에서, 정제된 엑소좀 생성물은 10 % 이하의 수분 함량을 갖는다.
일부 실시양태에서, 정제된 엑소좀 생성물은 냉장 없이 적어도 6개월의 저장 수명을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상기에서 요약된 정제된 엑소좀 생성물의 임의 실시양태가 수중 재구성된 재구성 생성물을 기술한다. 일부 실시양태에서, 정제된 엑소좀 생성물은 30 % 이하의 농도로 제공된다.
일부 실시양태에서, 정제된 엑소좀 생성물은 CD63+ 엑소좀과 CD63- 엑소좀의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 실시양태들 중 일부에서, 정제된 엑소좀 생성물은 적어도 50 %의 CD63- 엑소좀을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 정제된 엑소좀 생성물은 1 % 내지 20 %의 CD63- 엑소좀 및 80 % 내지 99 %의 CD63+ 엑소좀을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 일반적으로 생체적합성 매트릭스, 그리고 상기에서 요약된 정제된 엑소좀 생성물의 임의 실시양태를 포함하는 조성물을 기술한다. 일부 실시양태에서, 상기 생체적합성 매트릭스는 콜라겐, 트롬빈, 젤라틴, 알기네이트, 또는 또 다른 자연-발생 기저막(basement membrane) 생성물을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 정제된 엑소좀 생성물의 제조 방법을 기술한다. 일반적으로, 상기 방법은 출발 재료를 수득하는 것, 출발 재료를 여과하는 것, 여과된 재료를 풀링하는 것, 풀링된 재료를 교반하는 것, 및 교반된 풀링된 재료를 냉동건조하는 것을 포함한다. 상기 출발 재료에는 혈액, 혈액 생성물 또는 소정의 비-혈액 생성물이 포함될 수 있다. 적합한 비-혈액 생성물에는 예를 들어 제대 와튼 젤리(Wharton's jelly), 지방의 간질 혈관 분획, 성분채집술 골수 생성물, 윤활액, 뇌척수액, 또는 중간엽 줄기 세포가 포함된다.
일부 실시양태에서, 출발 재료는 연령 30세 미만의 사람, 수술-후 공여자, 폐경-전 여성, 분만전후 여성 또는 태반으로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 교반된 풀링된 재료를 냉동건조하기 전에 교반된 풀링된 재료를 냉동하는 것, 및 냉동된 교반 풀링된 재료를 해동하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재료는 적어도 5시간 동안 냉동건조된다. 이러한 실시양태들 중 일부에서, 교반된 풀링된 재료는 170시간 동안 냉동건조된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 인공 혈액 생성물의 제조 방법을 기술하며, 상기 방법은 일반적으로 상기에서 요약된 정제된 엑소좀 생성물의 임의 실시양태를 제약상 허용되는 캐리어 중에 재구성하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 재구성 혈액 생성물은 정제된 엑소좀 생성물, 생분해성 중합체 스캐폴드(scaffold), 비-생분해성 중합체 스캐폴드 또는 나노튜브를 혼합하는 것에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상처 치유의 촉진 방법을 기술한다. 일반적으로, 상기 방법은 상처가 치료되지 않고 치유되는 것에 비해 더 적은 시간 이내에 상처를 치유하기에 효과적인 양으로 상기에서 요약된 인공 혈액 생성물의 임의 실시양태를 상처에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상처 베드(wound bed)의 혈관화 증가 방법을 기술한다. 일반적으로, 상기 방법은 상처가 치료되지 않고 치유되는 것에 비해 더 적은 시간 이내에 상처를 치유하기에 효과적인 양으로 상기에서 요약된 인공 혈액 생성물의 임의 실시양태를 상처에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상처의 상피화 증가 방법을 기술한다. 일반적으로, 상기 방법은 상처가 치료되지 않고 치유되는 것에 비해 더 적은 시간 이내에 상처를 치유하기에 효과적인 양으로 상기에서 요약된 인공 혈액 생성물의 임의 실시양태를 상처에 투여하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 조직에서의 신생물 억제 방법을 기술한다. 일반적으로, 상기 방법은 적어도 50 %의 CD63- 엑소좀을 함유하는 인공 혈액 생성물의 실시양태를 신생물을 나타내는 조직에 투여하는 것을 포함한다.
상기 개요가 본 발명의 개시되는 각 실시양태 또는 모든 구현을 기술하고자 하는 것은 아니다. 하기하는 상세한 설명으로서 예시적인 실시양태들을 더 구체적으로 예시한다. 출원 전체에 걸친 몇 곳에서는, 예들의 목록을 통하여 지침이 제공되며, 해당 예들은 다양한 조합으로서 사용될 수 있다. 매 경우, 언급되는 목록은 대표적인 그룹으로만 사용되는 것으로서, 배제적인 목록으로 해석되어서는 안 된다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 요청 및 필요 요금의 지불시, 사무국에 의해 컬러 도면(들)을 포함하는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본이 제공될 것이다.
도 1. 정제된 엑소좀 생성물 (PEP)의 이미지. (A) PEP 및 콜라겐 생체-스캐폴드 겔 제조. (B) 콜라겐 섬유는 PEP 미세-소포의 캐리어 용기로 작용한다.
도 2. 상이한 농도의 정제된 엑소좀 생성물 (PEP)을 포함하는 콜라겐 스캐폴드의 전계 방출-스캐닝 전자 현미경법 (Fe-SEM). (A) 콜라겐 단독; (B) 5 % PEP를 포함하는 콜라겐; (C) 10 % PEP를 포함하는 콜라겐; (D) 20 % PEP를 포함하는 콜라겐.
도 3. 상이한 배율하의 혈소판 풍부 혈장 (PRP) (A, B) 및 상이한 배율하의 정제된 엑소좀 (PEP) (C, D)을 보여주는 원자력 현미경법 영상화.
도 4. 시험관 내 세포 이동 긁힘 검정. (A) 0시간, 12시간, 24시간 및 48시간에서의 PEP-처리, PRP-처리 및 미처리 (FBS)의 인간 피부 섬유모세포 (HDF) 분석은 PEP 처리에서의 증가된 이동 속도를 표시하는데; 분홍색 가장자리는 긁힘 영역을 나타낸다. (B) (A)에서 영상화된 데이터의 선 그래프 표시. (C) 인큐사이트 에쎈 바이오사이언스(IncuCyte Essen BioScience)에 의한 상처 융합 백분율의 정량을 나타내며, 생체-스캐폴드-처리된 HDF에서의 더 큰 세포 성장 비를 입증하고 있다.
도 5. 시험관 내에서의 혈관형성의 PEP 자극. (A) NHDF와 HUVEC 세포의 공동-배양물을 0일차 및 8일차에 PEP, PRP 또는 FBS 중에 시딩하였다. (B) 8일 후의 자극된 혈관형성 네트워크의 대표적인 마스크화 이미지. 데이터는 평균±SEM (n=8)로 표시되는 2회 별도 실험을 나타낸다. 척도 막대는 800 ㎛이다.
도 6. 상처 봉합에 대한 PEP의 효과. (A) 28-일 생체 내 토끼 허혈성 귀 실험에서의 0일차 및 28일차의 상처 봉합의 대표적인 이미지. (B) 각 처리 군에 대한 생체 내에서의 28일 동안의 상처 베드 봉합 추적. (C) 이러한 데이터는 평균±s.t.d.로 나타내었다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행하였다 (***=p<0.0001 및 **=p<0.01). (D) 상처 크기의 정량은 바이오-겔 처리된 상처가 콜라겐-처리 및 미처리 상처에 비해 더 빠른 봉합을 나타내었음을 입증하고 있다.
도 7. 수술후 2주차에서의 허혈성 상처 치유의 조직학적 분석. (A 및 B) 각 처리에 있어서의 대표적인 H&E 이미지를 나타내었음: 비-허혈성 대조군, 허혈성 미처리 대조군, 허혈성 상처 더하기 콜라겐, 및 허혈성 상처 더하기 PEP. 척도 막대: 1 mm; 20X. (C 및 D) 토끼 귀 허혈성 상처는 상처 가장자리에서의 현저한 세포 침윤 및 증가된 표피 두께를 입증하고 있다. H&E, 헤마톡실린 및 에오신.
도 8. 수술후 28일차의 상처 베드에서의 세포의 ∝-SMA 면역조직화학 염색. 근섬유모세포로 분화된 섬유모세포를 화살표로 나타내었다. 새로 형성된 혈관 부근의 ∝-SMA 양성 세포는 화살표 머리로 표시하였다. *=p-값<0.01.
도 9. PEP-유도 골격근 성장. PEP는 근모세포 전구체 (MyoD+ 위성/근모세포)의 빠른 증식을 유도한다. PEP를 사용하여 배양 조건을 변경하는 것은 배양물에서 근관 형성을 유도하였다 (액티닌).
도 10. PEP-유도 골격근 성장. PEP는 표준 배양 조건 (FBS)에 대비하여 24시간 및 48시간 후에 (우측 패널) 근모세포 전구체의 빠른 증식을 유도한다. PEP를 사용하는 대안적인 배양 조건은 배양물에서 근관 형성을 유도하였다 (PEP 48시간).
도 11. PEP-유도 손상 복구. (A) 근육 손상 환경에서의 피하 공간 내에서의 PEP의 사용은 2-주 기간에 걸쳐 콜라겐 스캐폴드 단독에서는 관찰되지 않는 수술용 콜라겐 스캐폴드 내에서의 세포성의 대규모 증가를 유도하였다. (B) 4-주 관찰 기간 후, 전구체는 (선호 조직에 대한 근접도에 따라) 모든 지방 조직 골격근의 PEP 적재된 스캐폴드에서 분화된 반면, 콜라겐-단독 스캐폴드는 세포화되지 않고 남아있었다.
도 12. 산화성 스트레스를 억제하는 활성을 갖는 PEP 제제에 함유되어 있는 단백질을 검출하는 웨스턴 블럿 분석. 3종의 상이한 PEP 배치 (B2, B3, B4)를 20 % 용액 (PEP 바이알 중 5 mL 식염수)으로 용해시키고, 0.2 마이크로미터 필터로 여과한 후, BCA 검정 키트 (피어스, 서모 피셔 사이언티픽(Pierce, Thermo Fisher Scientific), 인크. 사, 매사추세츠 왈탐 소재)를 사용하여 단백질 농도를 정량하였다. 이로부터, 각 샘플 1.5 μL를 23.5 μL의 용해 완충제에 용해시키고, 85 ℃로 3분 동안 가열하였다. 20 g의 단백질을 12.5 % 폴리아크릴아미드 겔 (크리테리온, 바이오-래드 라보래토리즈(CRITERION, Bio-Rad Laboratories), 인크. 사, 캘리포니아 허큘리스 소재)상에 적재하였다.
도 13. 표시되어 있는 양의 저장된 CD63+ PEP 엑소좀 또는 표시되어 있는 양의 CD63- PEP 엑소좀을 사용한 처리 후의 시간의 함수로서의 세포 성장의 분석. CD63+ PEP 엑소좀은 시험된 시간 동안 음성 대조군 (무혈청 배지)에 비해 세포 성장을 계속적으로 촉진하였다. CD63+ PEP 엑소좀은 또한 약 30시간 후 계속적인 성장을 촉진한 반면, 양성 대조군은 20시간 동안 빠른 성장을 나타낸 다음, 편평하거나 느린 이후 성장을 나타내었다. CD63- PEP 엑소좀은 음성 대조군에 비해 세포 성장을 억제하였다. PEP에서의 이들 집단 모두의 존재는 치유를 위한 세포 성장의 적절한 유도를 가능하게 하나, 조절되지 않는 성장은 방지한다.
도 14. PEP 대 대안적인 통상적 방법으로 유도되는 세포외 소포 (EV) 또는 엑소좀의 분석. 한외원심분리 및 접선 유동 여과(tangential flow filtration)는 용액으로부터 엑소좀 또는 EV를 농축하기 위한 두 가지 확립되어 있는 방법이다. 여기서, 엑소좀 크기 및 양의 나노사이트(NanoSight)-기반 분석은 >200 nm의 크기 범위로 해당 방법론이 사용되는 경우, 고도로 비균질한 EV 집단을 나타내며, 입자가 1×1010개/ml 훨씬 미만으로 계수된다. 대안적으로, 유도 PEP 방법론은 매우 좁은 엑소좀 크기 범위 (<100 nm)를 달성하며, 1×1010개를 초과하는 입자 수율을 제공한다.
도 15. 세포에의 PEP 진입. 적색 형광 태그화 PEP 엑소좀을 사용하는 면역형광은 세포에의 이와 같은 엑소좀 생성물의 빠른 흡수를 입증한다.
도 16. 허혈성 재관류 영역으로의 형광 표지된 PEP의 전달은 모세관 누출로 인한 빠른 흡수를 나타낸다. 원적외 형광 염료로 표지된 PEP를 좌측 전방 하행 동맥 90-분 폐색의 해제 10분 후에 돼지 심장에 전달하였다. 제노젠(Xenogen) 시스템을 통한 돼지 심장의 전체적인 분석은 경색된 영역에서의 원적외 형광의 존재를 나타낸다. 조직학적 분석은 경색 영역에서의 p-셀렉틴(selectin) (엑소좀 마커)의 존재 대 비-경색 영역에서의 p-셀렉틴 없음을 나타낸다. 이는 PEP가 심근과 같은 조직에 매립되기 위해 손상 후 모세관 누출을 활용하는 능력을 가지고 있다는 것을 입증하고 있다.
도 17. 제노젠 시스템에 의해 가시화되어 있는 바와 같이, 원적외 형광 염료로 표지된 PEP의 생체분포는 IV로 제공되는 경우 간을, 그리고 IP로 제공되는 경우 GI 관로를 표적화하는 것으로 나타난다.
도 1. 정제된 엑소좀 생성물 (PEP)의 이미지. (A) PEP 및 콜라겐 생체-스캐폴드 겔 제조. (B) 콜라겐 섬유는 PEP 미세-소포의 캐리어 용기로 작용한다.
도 2. 상이한 농도의 정제된 엑소좀 생성물 (PEP)을 포함하는 콜라겐 스캐폴드의 전계 방출-스캐닝 전자 현미경법 (Fe-SEM). (A) 콜라겐 단독; (B) 5 % PEP를 포함하는 콜라겐; (C) 10 % PEP를 포함하는 콜라겐; (D) 20 % PEP를 포함하는 콜라겐.
도 3. 상이한 배율하의 혈소판 풍부 혈장 (PRP) (A, B) 및 상이한 배율하의 정제된 엑소좀 (PEP) (C, D)을 보여주는 원자력 현미경법 영상화.
도 4. 시험관 내 세포 이동 긁힘 검정. (A) 0시간, 12시간, 24시간 및 48시간에서의 PEP-처리, PRP-처리 및 미처리 (FBS)의 인간 피부 섬유모세포 (HDF) 분석은 PEP 처리에서의 증가된 이동 속도를 표시하는데; 분홍색 가장자리는 긁힘 영역을 나타낸다. (B) (A)에서 영상화된 데이터의 선 그래프 표시. (C) 인큐사이트 에쎈 바이오사이언스(IncuCyte Essen BioScience)에 의한 상처 융합 백분율의 정량을 나타내며, 생체-스캐폴드-처리된 HDF에서의 더 큰 세포 성장 비를 입증하고 있다.
도 5. 시험관 내에서의 혈관형성의 PEP 자극. (A) NHDF와 HUVEC 세포의 공동-배양물을 0일차 및 8일차에 PEP, PRP 또는 FBS 중에 시딩하였다. (B) 8일 후의 자극된 혈관형성 네트워크의 대표적인 마스크화 이미지. 데이터는 평균±SEM (n=8)로 표시되는 2회 별도 실험을 나타낸다. 척도 막대는 800 ㎛이다.
도 6. 상처 봉합에 대한 PEP의 효과. (A) 28-일 생체 내 토끼 허혈성 귀 실험에서의 0일차 및 28일차의 상처 봉합의 대표적인 이미지. (B) 각 처리 군에 대한 생체 내에서의 28일 동안의 상처 베드 봉합 추적. (C) 이러한 데이터는 평균±s.t.d.로 나타내었다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행하였다 (***=p<0.0001 및 **=p<0.01). (D) 상처 크기의 정량은 바이오-겔 처리된 상처가 콜라겐-처리 및 미처리 상처에 비해 더 빠른 봉합을 나타내었음을 입증하고 있다.
도 7. 수술후 2주차에서의 허혈성 상처 치유의 조직학적 분석. (A 및 B) 각 처리에 있어서의 대표적인 H&E 이미지를 나타내었음: 비-허혈성 대조군, 허혈성 미처리 대조군, 허혈성 상처 더하기 콜라겐, 및 허혈성 상처 더하기 PEP. 척도 막대: 1 mm; 20X. (C 및 D) 토끼 귀 허혈성 상처는 상처 가장자리에서의 현저한 세포 침윤 및 증가된 표피 두께를 입증하고 있다. H&E, 헤마톡실린 및 에오신.
도 8. 수술후 28일차의 상처 베드에서의 세포의 ∝-SMA 면역조직화학 염색. 근섬유모세포로 분화된 섬유모세포를 화살표로 나타내었다. 새로 형성된 혈관 부근의 ∝-SMA 양성 세포는 화살표 머리로 표시하였다. *=p-값<0.01.
도 9. PEP-유도 골격근 성장. PEP는 근모세포 전구체 (MyoD+ 위성/근모세포)의 빠른 증식을 유도한다. PEP를 사용하여 배양 조건을 변경하는 것은 배양물에서 근관 형성을 유도하였다 (액티닌).
도 10. PEP-유도 골격근 성장. PEP는 표준 배양 조건 (FBS)에 대비하여 24시간 및 48시간 후에 (우측 패널) 근모세포 전구체의 빠른 증식을 유도한다. PEP를 사용하는 대안적인 배양 조건은 배양물에서 근관 형성을 유도하였다 (PEP 48시간).
도 11. PEP-유도 손상 복구. (A) 근육 손상 환경에서의 피하 공간 내에서의 PEP의 사용은 2-주 기간에 걸쳐 콜라겐 스캐폴드 단독에서는 관찰되지 않는 수술용 콜라겐 스캐폴드 내에서의 세포성의 대규모 증가를 유도하였다. (B) 4-주 관찰 기간 후, 전구체는 (선호 조직에 대한 근접도에 따라) 모든 지방 조직 골격근의 PEP 적재된 스캐폴드에서 분화된 반면, 콜라겐-단독 스캐폴드는 세포화되지 않고 남아있었다.
도 12. 산화성 스트레스를 억제하는 활성을 갖는 PEP 제제에 함유되어 있는 단백질을 검출하는 웨스턴 블럿 분석. 3종의 상이한 PEP 배치 (B2, B3, B4)를 20 % 용액 (PEP 바이알 중 5 mL 식염수)으로 용해시키고, 0.2 마이크로미터 필터로 여과한 후, BCA 검정 키트 (피어스, 서모 피셔 사이언티픽(Pierce, Thermo Fisher Scientific), 인크. 사, 매사추세츠 왈탐 소재)를 사용하여 단백질 농도를 정량하였다. 이로부터, 각 샘플 1.5 μL를 23.5 μL의 용해 완충제에 용해시키고, 85 ℃로 3분 동안 가열하였다. 20 g의 단백질을 12.5 % 폴리아크릴아미드 겔 (크리테리온, 바이오-래드 라보래토리즈(CRITERION, Bio-Rad Laboratories), 인크. 사, 캘리포니아 허큘리스 소재)상에 적재하였다.
도 13. 표시되어 있는 양의 저장된 CD63+ PEP 엑소좀 또는 표시되어 있는 양의 CD63- PEP 엑소좀을 사용한 처리 후의 시간의 함수로서의 세포 성장의 분석. CD63+ PEP 엑소좀은 시험된 시간 동안 음성 대조군 (무혈청 배지)에 비해 세포 성장을 계속적으로 촉진하였다. CD63+ PEP 엑소좀은 또한 약 30시간 후 계속적인 성장을 촉진한 반면, 양성 대조군은 20시간 동안 빠른 성장을 나타낸 다음, 편평하거나 느린 이후 성장을 나타내었다. CD63- PEP 엑소좀은 음성 대조군에 비해 세포 성장을 억제하였다. PEP에서의 이들 집단 모두의 존재는 치유를 위한 세포 성장의 적절한 유도를 가능하게 하나, 조절되지 않는 성장은 방지한다.
도 14. PEP 대 대안적인 통상적 방법으로 유도되는 세포외 소포 (EV) 또는 엑소좀의 분석. 한외원심분리 및 접선 유동 여과(tangential flow filtration)는 용액으로부터 엑소좀 또는 EV를 농축하기 위한 두 가지 확립되어 있는 방법이다. 여기서, 엑소좀 크기 및 양의 나노사이트(NanoSight)-기반 분석은 >200 nm의 크기 범위로 해당 방법론이 사용되는 경우, 고도로 비균질한 EV 집단을 나타내며, 입자가 1×1010개/ml 훨씬 미만으로 계수된다. 대안적으로, 유도 PEP 방법론은 매우 좁은 엑소좀 크기 범위 (<100 nm)를 달성하며, 1×1010개를 초과하는 입자 수율을 제공한다.
도 15. 세포에의 PEP 진입. 적색 형광 태그화 PEP 엑소좀을 사용하는 면역형광은 세포에의 이와 같은 엑소좀 생성물의 빠른 흡수를 입증한다.
도 16. 허혈성 재관류 영역으로의 형광 표지된 PEP의 전달은 모세관 누출로 인한 빠른 흡수를 나타낸다. 원적외 형광 염료로 표지된 PEP를 좌측 전방 하행 동맥 90-분 폐색의 해제 10분 후에 돼지 심장에 전달하였다. 제노젠(Xenogen) 시스템을 통한 돼지 심장의 전체적인 분석은 경색된 영역에서의 원적외 형광의 존재를 나타낸다. 조직학적 분석은 경색 영역에서의 p-셀렉틴(selectin) (엑소좀 마커)의 존재 대 비-경색 영역에서의 p-셀렉틴 없음을 나타낸다. 이는 PEP가 심근과 같은 조직에 매립되기 위해 손상 후 모세관 누출을 활용하는 능력을 가지고 있다는 것을 입증하고 있다.
도 17. 제노젠 시스템에 의해 가시화되어 있는 바와 같이, 원적외 형광 염료로 표지된 PEP의 생체분포는 IV로 제공되는 경우 간을, 그리고 IP로 제공되는 경우 GI 관로를 표적화하는 것으로 나타난다.
본 개시내용은 고유 구조를 갖는 신규한 정제된 엑소좀 생성물 (PEP), 상기 PEP를 포함하는 조성물, 상기 PEP의 제조 방법, 및 상기 PEP의 사용 방법을 기술한다. 상기 사용 방법은 상처 치유와 관련된 다양한 적용을 포함한다. 적정한 양의 PEP는 그렇지 않았을 경우 손상되었을 상처 복구를 복원할 수 있다.
PEP (정제된 엑소좀 생성물)이라는 명칭에도 불구하고, 본원에서 기술되는 생성물은 세포외 소포 및/또는 엑소미어로부터 제조될 수 있다. 따라서, 구체적인 맥락에서 달리 상술되지 않는 한, 본 개시내용 전체에 걸쳐 "엑소좀"이라는 용어는 엑소좀뿐만 아니라 엑소미어 및 세포외 소포도 포함하며, 생성물 자체가 PEP에 대하여 기술되는 물리적, 구조적 및/또는 기능적 특징을 가지고 있음을 전제로 한다.
당뇨병, 말초 혈관 질환 또는 감염과 같은 병태생리학적 결함이 있는 환자에서의 미-치유 상처는 세계적으로 상당한 의료 문제가 되고 있다. 상처 치유의 복잡한 과정은 염증, 증식 및 세포외 매트릭스 침착 동안 발생하는 다수의 생물학적 기작 및 분자 기작에 의해 좌우된다.
일반적인 상처에서는, 염증 세포, 각질세포, 섬유모세포, 성장 인자 생성, 세포 증식 및 혈관신생이 치유 과정의 진행을 조율한다. 부적정한 성장 인자 생성, 감소된 혈관형성 및 손상된 세포 이동은 상처에서의 정상적인 복구 과정을 방해하는 인자이다. 실제로, 근위 동맥 폐쇄, 혈관 압박, 또는 미세혈관 폐색 또는 혈전증으로 인한 손상된 피부 관류는 미-치유 상처의 핵심 위험 인자로 남아 있다.
미-치유 상처의 현행 임상 관리는 죽은조직제거 및 적정한 상처 드레싱을 사용한 국소적 관리를 포함한다. 상처 치유의 보조물로는 음압 상처 치료법 (NPWT) 및 고압 산소 치료법 (HBO)가 포함될 수 있다. 혈관형성의 복원은 상처 치유 주기의 붕괴를 반전시켜 지속적이고 측정가능한 속도로 복구하는 데에 기여할 수 있다. 또한, 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 적용하는 것에 의한 필수 상처 치유 성장 인자의 국소적 적용은 다양한 조직 복구 모델에서 정상적인 복구를 하는 데에 기여한다.
또한, 세포-유래 엑소좀을 사용하면, 당뇨병성 상처의 개선 및 강화가 달성될 수 있다. 상처 치유 및 혈관형성을 촉진하는 엑소좀-기반 치료법의 효과는 체액-유래 엑소좀을 사용하는 것에 의해 입증되어 있다.
엑소좀은 모든 상이한 세포 유형에서 분비되어 세포-대-세포 소통 신호를 제공하는 미세소포 (직경 40 nm-100 nm)이다. miRNA 및 단백질을 포함한 다양한 서로 다른 적재물 분자가 엑소좀을 통하여 세포 사이로 수송될 수 있다. 상처 치유에서의 엑소좀 기능에 대한 현재의 지식은 아직 제한되어 있다.
본 개시내용은 신규한 엑소좀 조성물, 그의 제조, 그리고 그의 사용을 위한 다양한 적용을 기술한다. 본원에서 기술되는 연구에서는, 다수의 엑소좀 제제를 평가하여 초-구조 수준을 확인하였다. 그와 같은 접근법을 사용하여, 고유의 초-구조를 갖는 신규한 정제된 엑소좀 생성물 (PEP)을 제조하였다.
상기 PEP를 제조하기 위한 출발 재료는 비제한적으로 전혈 또는 임의의 적합한 성분채집술 혈액 생성물 (백혈구채취술 생성물, 혈장채취술 생성물, 냉동 결핍성 혈장, 신선 냉동 혈장, 성분채취술 혈소판 생성물, 혈소판 풍부 혈장, 혈소판 희박 혈장, 또는 임의의 적혈구 고갈 및 백혈구 고갈 생성물 포함)을 포함한 임의의 적합한 혈액 생성물일 수 있다. 혈액 또는 혈액 생성물은 비제한적으로 일반 집단, 일반 집단 연령 30세 이하, 일반 집단 연령 40세 이하, 수술-후 집단, 폐경-전 여성, 분만전후 여성, 태반, 제대혈을 포함한 임의의 적합한 공급원으로부터 입수될 수 있다. PEP를 제조하기 위한 출발 재료는 대안적으로는 예를 들어 제대 와튼 젤리, 지방의 간질 혈관 분획, 성분채집술 골수 생성물, 윤활액, 뇌척수액, 또는 중간엽 줄기 세포, 내피 세포, 신경 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 또는 이들 또는 임의의 다른 세포 공급원의 컨디셔닝된 배지와 같은 적합한 비-혈액 공급원일 수도 있다.
필요할 경우, 출발 재료는 PEP 제조에 필요할 때까지 냉동 저장될 수 있다. 통상적으로, 출발 재료는 -20 ℃ 또는 -80 ℃에서, 그리고 바람직하게는 현행 우수 제조 관리기준 (CGMP) 설비 내에서 저장될 수 있다.
PEP의 제조 과정은 여과 단계로 개시된다. 필요에 따라서는, 여과 전에 출발 재료 - 예를 들어 2-30 유닛 (통상적으로 5-15)의 혈액 생성물 -가 해동된다. 중력-기반 여과면 충분하지만, 어떠한 적합한 여과 절차도 수행될 수 있다. 여과 생성물은 수회의 교반 단계를 동반하여 합쳐진 생성물로서 풀링된다. 샘플을 적정하게 혼합하는 데에 사용되는 어떠한 교반 방법도 사용될 수 있다. 교반에는 예를 들어 5분의 수동 교반 및/또는 5-15분 동안의 기계 교반이 포함될 수 있으나, 이러한 선택사항으로 제한되는 것은 아니다. 풀링된 여과 생성물은 원할 경우 -20 ℃ 내지 -80 ℃로 냉동되어 추가 처리를 위해 준비가 될 때까지 저장될 수 있다. 냉동 저장되는 경우, 재료는 조절되는 조건하에서 - 예를 들어 분 당 0.1 ℃ 내지 5 ℃의 속도로 가온함으로써 - 해동될 수 있다.
원할 경우, 여과 생성물은 예를 들어 유리 바이알로 분취될 수 있다. 원하는 수분 함량의 수준에 따라, 적게는 0.1 ml에서 10 ml까지의 부피가 작게는 1 ml에서 크게는 50 ml까지의 바이알 중에서 사용될 수 있다. 분취된 생성물은 이후 균일한 냉동건조 프로파일을 보장하기 위해 조절되는 온도 변화에 적용된다.
냉동건조는 냉동건조가 수행되는 주변 압력 (자연 또는 인공 중 어느 하나)에서 물이 어는 것 미만인 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 냉동건조는 -180 ℃ 이상, -160 ℃ 이상, -140 ℃ 이상, -120 ℃ 이상, -100 ℃ 이상, -90 ℃ 이상, -80 ℃ 이상, -70 ℃ 이상, -60 ℃ 이상, -50 ℃ 이상, -40 ℃ 이상, -30 ℃ 이상 또는 -20 ℃ 이상의 최소 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 냉동건조는 0 ℃ 이하, -5 ℃ 이하, -10 ℃ 이하, -15 ℃ 이하, -20 ℃ 이하, -25 ℃ 이하, -30 ℃ 이하, -35 ℃ 이하, -40 ℃ 이하, -45 ℃ 이하, -50 ℃ 이하, -55 ℃ 이하, -60 ℃ 이하, -65 ℃ 이하, -70 ℃ 이하 또는 -75 ℃ 이하의 최대 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 냉동건조는 상기에서 제시된 임의의 최소 온도와 최소 온도에 비해 더 높은 상기에서 제시된 임의의 최대 온도에 의해 한정되는 종료점에 의해 규정되는 온도 범위 이내에서 수행될 수 있다. 이에 따라, 예를 들어 일부 실시양태에서, 냉동건조는 -10 ℃ 내지 -100 ℃의 온도에서 수행될 수 있다. 최초 냉동 단계에서, 온도는 빠르게는 분 당 2 도 내지 느리게는 분 당 0.1 도로 감소되어 원하는 최종 온도를 달성할 수 있다.
일단 원하는 최종 온도에 도달하고 나면, 최초 건조를 위해 진공 압력이 적용된다. 상기 진공 압력은 임의의 적합한 진공 압력일 수 있다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, 적용되는 최소 진공 압력은 1 mTorr 이상, 예를 들어 5 mTorr 이상, 10 mTorr 이상, 15 mTorr 이상, 20 mTorr 이상, 25 mTorr 이상, 50 mTorr 이상, 75 mTorr 이상, 100 mTorr 이상, 150 mTorr 이상 또는 200 mTorr 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적용되는 최대 진공 압력은 500 mTorr 이하 예를 들어 400 mTorr 이하, 300 mTorr 이하, 200 mTorr 이하, 100 mTorr 이하, 90 mTorr 이하, 80 mTorr 이하, 70 mTorr 이하, 60 mTorr 이하 또는 50 mTorr 이하일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적용되는 진공 압력은 상기에서 제시된 임의의 최소 진공 압력과 최소 진공 압력에 비해 더 높은 상기에서 제시된 임의의 최대 진공 압력에 의해 한정되는 종료점을 갖는 범위로 규정될 수 있다. 이에 따라, 예를 들어 적용되는 진공 압력은 10 mTorr 내지 300 mTorr 범위일 수 있다.
이와 같은 초기 단계는 적어도 15분 예를 들어 적어도 20분, 적어도 30분, 적어도 40분, 적어도 50분, 적어도 60분, 적어도 70분, 적어도 80분, 적어도 90분, 적어도 100분, 적어도 120분, 적어도 140분, 적어도 160분, 적어도 180분, 적어도 200분, 적어도 220분 또는 적어도 240분의 최소 유지 시간 동안 유지될 수 있다. 초기 단계는 30일 이하 예를 들어 15일 이하, 10일 이하, 5일 이하, 1일 이하, 1200분 이하, 900분 이하, 600분 이하, 300분 이하, 270분 이하, 240분 이하, 210분 이하, 180분 이하, 150분 이하, 120분 이하, 90분 이하, 75분 이하, 60분 이하 또는 45분 이하의 최대 유지 시간 동안 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 초기 단계는 상기에서 제시된 임의의 최소 기간과 최소 기간에 비해 더 긴 상기에서 제시된 임의의 최대 기간에 의해 한정되는 종료점을 갖는 범위로 규정되는 유지 시간 동안 유지될 수 있다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 초기 단계는 30분 내지 300분의 유지 시간 동안 유지될 수 있다.
출발 부피에 따라서는, 추가적인 건조 단계 및 최종 온도의 변경이 요구될 수 있다. 임의의 추가적인 건조 단계의 경우, 최종 온도는 냉동건조가 수행되는 주변 압력 (자연 또는 인공 중 어느 하나)에서 물이 어는 것 미만인 임의의 온도일 수 있다. 적합한 최종 온도는 최초 건조 단계에 대하여 상기에서 제시된 것과 동일하다. 1회를 초과하는 건조 단계가 냉동건조 과정에 포함되는 경우, 각 건조 단계의 최종 온도는 최초 건조 단계의 최종 온도와 관계없이, 및/또는 임의의 추가적인 건조 단계와 관계없이 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가적인 건조 단계는 -10 ℃ 내지 -100 ℃의 온도에서 수행될 수 있다. 다른 실시양태에서, 추가적인 건조 단계는 -20 ℃ 내지 -140 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.
1회를 초과하는 건조 단계가 냉동건조 과정에 포함되는 경우, 각 건조 단계의 진공 압력은 최초 건조 단계의 진공 압력과 관계없이, 및/또는 임의의 추가적인 건조 단계와 관계없이 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가적인 건조 단계의 진공 압력은 10 mTorr 내지 300 mTorr의 범위일 수 있다. 다른 실시양태에서, 추가적인 건조 단계의 진공 압력은 50 mTorr 내지 400 mTorr의 범위일 수 있다.
1회를 초과하는 건조 단계가 냉동건조 과정에 포함되는 경우, 각 건조 단계의 유지 시간은 최초 건조 단계의 유지 시간과 관계없이, 및/또는 임의의 추가적인 건조 단계와 관계없이 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가적인 건조 단계의 유지 시간은 30분 내지 300분의 범위일 수 있다. 다른 실시양태에서, 추가적인 건조 단계에서 사용되는 유지 시간은 200분 내지 7,200분의 범위일 수 있다.
일부 실시양태에서는, 더 고온에서의 건조 단계가 추가로 요구될 수 있다. 더 고온에서의 이와 같은 건조 단계는 진공하에 0 ℃ 내지 42 ℃ 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 진공 압력은 임의의 추가적인 건조 단계에 대하여 바로 위에서 기술된 것과 같을 수 있다. 더 고온에서의 건조 단계는 10 % 이하의 수분 농도를 달성하는 데에 적합한 임의의 시간 동안 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그와 같은 수분 농도를 달성하는 데에는 온도 및 진공 압력 조건에 따라 30분 내지 7,200분이 걸릴 수 있다. 따라서, 최적의 냉동건조 파라미터는 적어도 부분적으로는 이용되는 장치의 용량, 출발 재료의 수분 함량, 출발 부피 및 출발 재료의 밀도 (예컨대 혈청학적 재료 대 배양 배지)를 기반으로 한다.
동결건조된 생성물을 달성하기 위해 특정 적용분야에서는 케이크화제(caking agent)가 사용될 수도 있으나, PEP를 유도하는 데에 필수적인 것은 아니다. 적합한 케이크화제에는 폴리비닐피롤리돈 (PVP), 덱스트로스, 글리신 및 비정질 당 (예컨대 수크로스, 트레할로스, 만니톨)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 냉동건조 과정은 짧게는 5시간, 그리고 길게는 170시간이 걸릴 수 있다. 이와 같은 절차 후의 최종 생성물은 시각적으로 케이크화된 펠렛의 형성을 기준으로 방출되는데, 방출 기준은 제조되는 로트(lot) 당 95 %를 초과하는 적절한 케이크화를 필요로 한다. 이러한 측정기준이 충족되지 않는 경우에는, 전체 로트가 사용중지된다.
상기 PEP는 통상적인 기술을 사용하여 제조되는 통상적인 엑소좀의 구조와는 다른 구조를 보유한다. 도 3A 및 도 3B에 나타낸 바와 같이, 통상적인 농축 엑소좀은 (동결건조 상태와 관계없이) 눈송이를 닮은 구조를 나타낸다. 반면, 본원에서 기술되는 PEP의 엑소좀은 도 3C 및 도 3D에 나타낸 바와 같이 더 작으며, 더 구형이다. 원자력 현미경법 및 SEM상에서, 유도되는 PEP 생성물은 소정의 전단력, 여과 또는 원심분리를 포함하는 과정에서 보이는 "눈송이" 유사 응집 엑소좀 구조에 대비하여 상당히 구형이며 엑소좀 클럼핑이 없는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 일부 실시양태에서, 상기 PEP는 구조상 결정질이기 보다는 구형 또는 회전타원형이며 300 nm 이하의 직경을 갖는 것에 의해 통상적인 엑소좀 생성물로부터 구별가능하다. 이에 따라, PEP 엑소좀은 300 nm 이하, 예를 들어 250 nm 이하, 200 nm 이하, 175 nm 이하, 150 nm 이하, 125 nm 이하, 100 nm 이하, 95 nm 이하, 90 nm 이하, 85 nm 이하, 80 nm 이하, 75 nm 이하인 최대 직경을 가질 수 있다. PEP 엑소좀은 적어도 20 nm, 적어도 25 nm, 적어도 30 nm, 적어도 35 nm, 적어도 40 nm, 적어도 45 nm, 적어도 50 nm, 적어도 55 nm, 적어도 60 nm, 적어도 65 nm, 적어도 70 nm, 적어도 75 nm 또는 적어도 80 nm의 최소 직경을 가질 수 있다. 일부 경우에서, PEP 엑소좀의 직경은 상기에서 제시된 임의의 최소 직경과 최소 직경에 비해 더 큰 상기에서 제시된 임의의 최대 직경에 의해 한정되는 종료점을 갖는 범위로 표현될 수 있다. 이에 따라, 일부 실시양태에서, PEP는 50 nm 내지 200 nm, 예를 들어 100 nm 내지 200 nm의 직경을 갖는 것으로 규정될 수 있다.
또한, 하기에서 더 상세하게 설명되는 바와 같이, 도 14는 본원에서 기술되는 PEP 제제가 통상적인 엑소좀 제제에 비해 더 좁은 직경 분포를 가질 수 있다는 것을 보여주는 데이터를 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, PEP 제제 중 엑소좀의 직경은 300 nm 미만의 분포 - 즉 최대 직경과 더 작은 직경 사이의 차이 -를 가질 수 있다. 도 14는 600 nm 이상의 직경 분포를 갖는 통상적인 엑소좀 제제를 보여준다. 도 14는 95 %를 초과하는 엑소좀이 직경 100 nm와 직경 200 nm 사이의 100-nm 분포 내에 속하는 직경을 가지며, 90 %의 엑소좀이 60-nm 분포 (132 nm +/- 30 nm) 내에 속하는 직경을 갖는 PEP 제제를 보여준다.
일부 실시양태에서, PEP는 낮은 수분 함량, 예를 들어 10 % 이하, 9 % 이하, 8 % 이하, 7 % 이하, 6 % 이하, 5 % 이하, 4 % 이하, 3 % 이하, 2 % 이하 또는 1 % 이하의 수분 함량을 보유할 수 있다.
PEP는 제약상 허용되는 캐리어를 사용하여 제제화 및/또는 재구성됨으로써, 치료 조성물을 형성할 수 있다. 본원에서 사용될 때, "캐리어"에는 임의의 용매, 분산 매체, 비히클, 희석제, 등장화제, 생리학적 완충제, 캐리어 용액, 현탁액, 콜로이드, 물 등이 포함된다. 제약상 활성인 물질에의 그와 같은 매체 및/또는 작용제의 사용에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 어떠한 통상적인 매체 또는 작용제도 활성 성분과 부적합성인 경우를 제외하고는 치료 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 성분 역시 조성물에 혼입될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "제약상 허용되는"은 생물학적으로, 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 재료, 즉 재료가 소정의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 그것이 함유되는 치료 조성물 중 다른 성분 중 어느 것과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 PEP와 함께 개체에게 투여될 수 있다는 것을 말한다. 대표적인 제약상 허용되는 캐리어에는 예를 들어 임의의 적합한 농도의 생리학적 완충제, 증류수, 생분해성 중합체, 인공 중합체 또는 기저막 용액이 포함된다. PEP용의 추가적인 적합한 캐리어로는 액체로부터 고체로 상태를 변화시키는 온도, 압력 또는 기타 환경 변화하에서의 능력을 갖는 임의의 물질이 포함된다. 캐리어가 콜라겐인 대표적인 실시양태의 맥락인 도 2 및 도 3에 도시되어 있는 바와 같이, 이와 같은 상황에서, PEP는 액체 상인 그와 같은 물질에 용해되게 되며, 일단 고화되고 나면 재료에 통합(포획)되게 된다.
이에 따라, PEP는 치료 조성물로 제제화될 수 있다. 상기 치료 조성물은 바람직한 투여 경로에 적합화된 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 예컨대, 치료 조성물은 예를 들어 경구, 비경구 (예컨대 피내, 경피, 피하, 근육내, 동맥내, 관상동맥내, 정맥내, 복막내 등), 또는 국소 (예컨대 비내, 폐내, 유방내, 질내, 자궁내, 피내, 경피, 직장 등)를 포함한 알려져 있는 경로를 통하여 투여될 수 있다. 치료 조성물은 예를 들어 비 점막 또는 호흡 점막에의 투여 (예컨대 스프레이 또는 에어로졸에 의함)에 의한 것과 같이 점막 표면에 투여될 수 있다. 조성물은 또한 지속 또는 지연 방출을 통하여 투여될 수 있다. 또한, 용액 형태 또는 상기한 매트릭스/겔과의 조합 중 어느 하나인 PEP는 다른 기관 또는 신체 공강 내에 수술적으로 이식될 수도 있다. 재건, 치과 또는 화장품 적용분야의 경우, PEP는 액체 형태로, 또는 매트릭스와의 조합으로서 예를 들어 피하, 점막하 또는 심근막 평면에 전달될 수 있다.
예컨대, PEP는 비제한적으로 용액, 현탁액, 에멀션, 스프레이, 에어로졸 또는 임의의 혼합물 형태를 포함하는 어떠한 적합한 형태로도 제공될 수 있다. 조성물은 임의의 제약상 허용되는 부형제, 캐리어 또는 비히클과의 제제로서 전달될 수 있다. 예를 들어, 상기 제제는 통상적인 국소 투약 형태 예를 들어 크림, 연고, 에어로졸 제제, 비-에어로졸 스프레이, 겔, 로션 등으로 전달될 수 있다. 제제는 또한 예를 들어 아주반트, 피부 침투 강화제, 증점제 등을 포함한 1종 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 또한, PEP의 사용은 미세피부연마, 미세바늘, 레이저 박리, 화학적 박리, 또는 기타 피부-연마 플랫폼과 같은 연마 시술과의 조합으로서 적용될 수 있다. 이러한 환경에서, PEP는 용액, 기제 또는 매트릭스/겔 중 어느 하나로 전달될 수 있다. 또한, 모발 복원시, PEP는 상기한 바와 같이, 또는 피하 전달을 통하여 전달될 수 있다.
제제는 통상적으로 단위 투약 형태로 존재할 수 있으며, 약학 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 캐리어를 사용하여 조성물을 제조하는 방법은 PEP를 1종 이상의 보조 성분을 구성하는 캐리어와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 화합물을 액체 캐리어, 미분할된 고체 캐리어 또는 둘 모두와 균일하게 및/또는 친화성으로 회합시킨 다음, 필요할 경우 생성물을 원하는 제제로 성형하는 것에 의해 제조될 수 있다.
PEP는 재구성/재수화 엑소좀 생성물의 구조적 거동을 조절할 수 있는 다른 부형제와 조합될 수도 있다. 적합한 부형제에는 예를 들어 콜라겐, 트롬빈, 젤라틴, 알기네이트, 또는 혼합물 또는 정제된 형태 (탈세포화된 조직 스캐폴드 포함) 중 어느 하나로 적용되는 임의의 기타 자연 발생 기저막 생성물을 포함하는 생물학적 매트릭스가 포함된다. 적합한 부형제에는 또한 예를 들어 수술 또는 누공형성 결함을 메우기 위한 빠른 응집을 촉진하는 히아루론산 또는 트롬빈 접착제가 포함된다. PEP는 액체로부터 고체로 상태를 변화시키는 온도, 압력 또는 기타 환경 변화하에서의 능력을 갖는 어떠한 첨가제 또는 부형제와도 상용성이다.
상기에서 주지된 바와 같이, PEP는 저수분 제제로 제공될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, PEP 제제는 냉장 없이 적어도 6개월은 물론, 길게는 4년의 저장-수명을 가질 수 있다. 이에 따라, PEP 제제는 상처 치유가 요구되지만 냉장은 불가능하거나, 여의치 않거나, 또는 비용이 드는 지역, 예를 들어 저개발 지역에서, 또는 군용으로 사용하기에 특히 적합할 수 있다. 저-수분 PEP 제제는 용이하게 재용해되어 재구성 PEP 생성물을 형성한다. 예를 들어, 건조된 PEP 제제는 5분 미만 이내에 20 %까지의 용액으로 재용해될 수 있다. 재구성 PEP의 20 % 용액은 37 ℃에서 1시간의 기간에 걸쳐 겔을 형성할 수 있다. 예를 들어, 겔 제제는 대상체에게 투여된 후 PEP의 국소화를 촉진하고/거나, 복구를 필요로 하는 조직에서의 PEP의 재생 효과를 촉진하는 구조적 요소를 창출할 수 있다. PEP를 콜라겐과 조합하는 것은 재구성 PEP가 37 ℃에서 겔을 형성하는 속도를 증가시킬 수 있다. 실제로, 재구성 PEP가 콜라겐의 존재하에서 겔화되는 속도는 적어도 부분적으로 콜라겐의 농도에 의해 영향을 받는다. 겔화의 속도를 증가시키는 것은 더 높은 콜라겐 농도를 사용하여 달성될 수 있는데, 최대 농도는 10 mg/ml이다. 일부 실시양태에서, PEP는 약 5 mg/ml의 콜라겐 농도로 콜라겐과 조합되어 사용된다. 다른 겔화 재료와의 조합은 트롬빈 접착제 (예컨대 티씰(TISSEEL), 일리노이 디어필드 소재 박스터 헬스케어(Baxter Healthcare) Corp. 사), 히아루론산, 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) 등을 포함한다. PEP가 콜라겐을 포함하는 겔로 제제화되는 경우, PEP 엑소좀은 콜라겐 피브릴에 부착되어 "줄 상 비드" 외관을 창출할 수 있다. 이에 더하여, 용해 용액의 오스몰농도에 따라 PEP에서 다른 SEM 특징이 보이는데, 줄 상에 적층된 엑소좀, 줄 상 스파이크 또는 줄 상 개화 패턴이 포함된다. 적어도 부분적으로는 콜라겐의 유형 및 정제된 콜라겐 용액의 농도에 따라 예를 들어 약 5 % 내지 약 30 %의 농도를 갖는 PEP 용액을 사용하면, 이와 같은 효과가 더 통상적이다.
콜라겐과 회합되는지 또는 용액 중에 회합되는지에 관계없이, PEP 엑소좀은 10 %-20 %를 초과하는 PEP 엑소좀 이차 응집의 증거를 나타내지 않는다. 또한, 3개를 초과하는 엑소좀을 포함하는 응집체의 증거는 존재하지 않는다. 상기에서 언급된 바와 같이, 이의 유일한 예외는 PEP가 티씰용 CaCl2 용액과 같은 높은 오스몰 농도의 용액 중에서 재수화되는 경우이다.
투여되는 PEP의 양은 비제한적으로 대상체의 체중, 신체 조건 및/또는 연령, 및/또는 투여 경로를 포함한 다양한 인자에 따라 가변적일 수 있다. 예컨대, 주어진 단위 투약 형태에 포함되는 PEP의 절대적인 양은 광범위하게, 그리고 대상체의 종, 연령, 체중 및 신체 조건과 같은 인자, 및/또는 투여 방법에 따라 가변적일 수 있다. 따라서, 모든 가능한 적용분야에 효과적인 PEP의 양을 구성하는 양을 일반적으로 제시하는 것은 현실적이지 않다. 그러나, 관련 기술분야 통상의 기술자라면, 그와 같은 인자의 충분한 고려하에 적절한 양을 용이하게 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 예를 들어 적어도 0.5 % 내지 100 % 이하의 PEP 농도를 갖는 용액 중으로 PEP 엑소좀을 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. PEP 엑소좀은 적어도 1 %, 예컨대 예를 들어 적어도 2 %, 적어도 3 %, 적어도 4 %, 적어도 5 %, 적어도 6 %, 적어도 7 %, 적어도 8 %, 적어도 9 %, 적어도 10 %, 적어도 15 %, 적어도 20 %, 적어도 25 %, 적어도 30 %, 적어도 40 % 또는 적어도 50 %의 최소 농도로 대상체에게 투여될 수 있다. PEP 엑소좀은 100 % 이하 예를 들어 75 % 이하, 50 % 이하, 25 % 이하, 20 % 이하, 19 % 이하, 18 % 이하, 17 % 이하, 16 % 이하, 15 % 이하, 14 % 이하, 13 % 이하, 12 % 이하, 11 % 이하, 10 % 이하, 9 % 이하, 8 % 이하, 7 % 이하, 6 % 이하, 5 % 이하, 4 % 이하, 3 % 이하 또는 2 % 이하의 최대 농도로 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, PEP 엑소좀은 상기에서 제시된 임의의 최소 농도와 최소 농도에 비해 더 높은 상기에서 제시된 임의의 최대 농도에 의해 한정되는 종료점을 갖는 범위 내의 투여량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 이에 따라, 예를 들어 PEP 엑소좀은 적어도 1 % 내지 30 % 이하, 예를 들어 적어도 5 % 내지 20 % 이하의 농도로 대상체에게 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서는 PEP가 예를 들어 주 당 단일 투여분 내지 다수 투여분으로 투여될 수 있지만, 일부 실시양태에서는 이와 같은 범위 밖의 빈도로 PEP를 투여하는 것에 의해 상기 방법이 수행될 수 있다. PEP 조성물을 투여하는 것이 유용한 적용분야의 넓은 범위는 각 적용분야에 있어서의 투여 처방계획을 확인하는 것을 비실제적이게 한다. 특정 실시양태에서, PEP는 개월 당 약 1회 내지 주 당 약 5회 투여될 수 있다. 예를 들어, 단일 투여가 예를 들어 심근 경색증을 치료하는 데에 충분할 수 있다. 다른 적용분야 - 예를 들어 상처 치유, 화장품 적용분야, 모발 재생 -의 경우에는, 매주 또는 매일 투여가 바람직할 수 있다.
본원에서 기술되는 PEP 조성물 및 제제는 많은 적용분야를 갖는다. PEP는 예를 들어 통상적인 치료 (예컨대 혈소판 용해물) 또는 소 태아 혈청에 비해 더 큰 정도로 중간엽 줄기 세포 (MSC) 및/또는 피부 섬유모세포의 성장을 증대시킬 수 있다. 마찬가지로, PEP는 통상적인 치료 (예컨대 혈소판 용해물) 또는 소 태아 혈청에 비해 더 큰 정도로 골 분화, 연골 분화 및/또는 지방 분화를 유도할 수 있다. PEP는 또한 통상적인 치료 (예컨대 혈소판 용해물) 또는 소 태아 혈청에 비해 더 큰 정도로 근모세포의 성장을 유지할 수 있다. PEP는 비제한적으로 CAR-T, TRuC-T, NK-CAR 및 조혈 줄기 세포와 같은 면역치료법에 사용되는 세포에서 성장 프로파일을 강화하는 데에 사용될 수 있다.
예를 들어, PEP 조성물 및 제제는 주로 증식, 항-세포자멸사, 면역 조절 및 새로운 혈관 형성에 초점을 맞추고 있는 광범위한 일련의 세포 반응을 유도할 수 있다. 손상된 조직은 PEP의 존재하에서 재생의 경향을 갖는다. 이와 같은 반응은 전환 성장 인자 베타 (TGF-β, 예컨대 용액 중 PEP 엑소좀 농도에 따라 50 pg/ml 내지 200 ng/ml), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF, 예컨대 용액 중 PEP 엑소좀 농도에 따라 10 pg/ml 내지 2 ng/ml), 표피 성장 인자 (EFG, 예컨대 용액 중 엑소좀 농도에 따라 500 pg/ml 내지 50 ng/ml), 섬유모세포 성장 인자 (FGF, 예컨대 용액 중 PEP 엑소좀 농도에 따라 5 pg/ml 내지 1 ng/ml), HGF (용액 중 엑소좀 농도에 따라 50 pg/ml 내지 200 ng/ml) 및 PDGF (용액 중 엑소좀 농도에 따라 5 pg/ml 및 300 ng/ml 사이의 농도에 걸쳐 AA, BB, AB를 포함한 모든 아형)의 증대된 발현을 입증하는 관찰에 의해 예시된다. 반응이 이러한 인자로 제한되는 것은 아니며, 오히려 이러한 인자가 다른 조직에서 유도된다는 관찰이 PEP 재생 영향성의 구현이다.
PEP 처리는 시험관내 긁힘 검정 후 상처 융합을 증가시킴
세포 이동을 연구하기 위한 최적 표준으로 지금까지 기술되고 있는 시험관내 긁힘 검정 (문헌 [Liang et al., 2007. Nat Protoc 2:329-333])을 사용하여, 인간 피부 섬유모세포 (HDF) 이동에 대한 PEP의 효과와 혈소판-풍부 혈장 (PRP) 치료를 비교하였다. PEP를 사용한 처리는 대조군 및 PRP-처리 섬유모세포에 비해 증가된 HDF 이동 속도를 산출하였다 (도 4). 마찬가지로, 긁힘 검정의 정량 측정은 48시간에 대조군 및 PRP-처리 HDF에 비해 PEP-처리 HDF 조건에서 더 높은 상처 침습 (도 4B) 및 상처 융합 (도 4C) 둘 모두의 백분율을 나타내었다. 긁힘 검정 후, PEP 처리 HDF의 상처 융합은 24시간에 57 %, 그리고 48시간에 81 %였던 대조군 HDF에 비해, 24시간에 98 %, 그리고 48시간에 100 % 초과였다.
PEP 처리는 관 길이를 증가시킴
기저막 매트릭스 관 형성 검정이 혈관형성의 신호전달 경로를 연구하는 데에 사용될 수 있다. 실제로, PEP-처리된 인간 제정맥 내피 세포 (HUVEC)는 빠른 기본 수준의 관 형성을 나타냄으로써, 상처 베드 혈관형성을 위한 최적의 조건을 시사하였다 (도 5). 총 네트워크 길이의 정량은 대조군에서의 5000 마이크로미터에 비해, PEP 성장 조건에서 >15,000 마이크로미터 (p-값 p<0.001)를 산출하였다 (도 5B). 흥미롭게도, PRP 처리 역시 10,000 마이크로미터 (p-값 <0.001)로 관 형성을 중간 정도로 증가시켰다. 합쳐 보면, 이러한 결과는 PEP 처리가 생체 내 재-상피화 및 혈관 밀도의 알려져 있는 표준과 상관되는 시험관 내 이동, 증식 및 관 형성의 속도를 증가시킨다는 것을 표시하고 있다.
허혈성 상처의 수술후 외관 및 상처-치유 시간
혈관 결찰을 확인하는 데에는 허혈성 상처 치유의 최소-침습성 토끼 귀 모델 (문헌 [Chien, S. & Wilhelmi, B. J., 2012. J Vis Exp, e3341]; [Chien, S., 2007. Wound Repair Regen 15:928-935])을 사용하였다. 허혈성 상처를 PEP 또는 콜라겐 중 어느 하나의 단독으로 4주 (1회 처리/주) 동안 처리하고, 상처 치유의 정도를 비-허혈성 상처 및 미처리 허혈성 상처와 비교하였다 (도 6A). 상처 크기의 정량은 PEP-처리 상처가 콜라겐-처리 및 미처리 허혈성 상처에 비해 더 빠른 봉합을 나타낸다는 것을 입증하였다 (도 6A, 6B). 구체적으로, 28일차에 0.67 mm로 감소된 콜라겐-처리 상처; 28일차에 0.06 mm로 감소된 비-허혈성 상처; 및 28일차에 1.3 mm로 감소된 미처리 허혈성 상처와 비교할 때, 2-cm PEP-처리 상처는 28일차에 0.05 mm로 감소되었다 (도 6A, 6B). 콜라겐 또는 PEP 중 어느 하나를 사용한 처리는 4주차에 강화된 상피화를 초래하였다. 이는 케라틴-14 염색에 의해 확인되었다 (도 7A, 7B). 이에 따르면, PEP 처리는 생체 내 허혈 모델에서 상처 봉합 및 상피 세포 이동을 촉진한다.
상피 마커 vWF에 대한 형태측정 평가
양 다클론 vWF 항체로 염색된 상처 샘플은 미처리 대조군 및 콜라겐-처리 상처, 또는 건조 콜라겐 스캐폴드를 재수화하는 10-20 % 용액으로 재구성된 PEP와 비교하였을 때, 바이오-겔 (도 2에 나타낸 PEP-콜라겐 스캐폴드 포함)로 처리된 상처에서 더 높은 vWF 염색 세포를 나타낸다 (PEP 보강된 콜라겐 스캐폴드가 비-허혈성 상처에서 보이는 상태로 상처 치유를 향상시키는 도 6 및 7 참조). 정량 분석은 바이오-겔 처리된 군 (53.7 % 내피 세포/영역; n=3)과 미처리 군 (22.2 % 내피 세포/영역; n=3) 사이에 더 큰 혈관형성에 상응하는 통계적으로 유의성 있는 차이 (p<0.01)가 존재한다는 것을 확인해 주었다.
PEP로 처리된 상처 부위에서의 ∝-SMA 발현
도 8은 28일 동안의 PEP로 처리된 상처 부위에서의 ∝- SMA의 발현 수준을 나타낸다. PEP-처리된 상처 베드에 나타나 있는 방추체 형상 ∝- SMA-양성 세포는 근섬유모세포로 분화된 섬유모세포를 나타내고 있다 (도 8). 또한, 새로 형성되는 혈액 세포 주변 평활근 세포 (도 8, 화살표 머리)에서의 ∝- SMA 발현은 이러한 상처 베드에서의 혈관 형성의 개시를 표시한다. ∝-SMA 양성 세포의 정량 분석은 PEP-처리된 군과 콜라겐-처리 및 미처리 군 사이에 섬유모세포 분화 및 더 높은 성숙 혈관 밀도에 상응하는 통계적으로 유의성 있는 차이 (p<0.01)가 존재한다는 것을 확인해 주었다.
위성 세포로부터의 새로운 조직의 유도
도 9는 PEP의 존재하에서 성장하는 골격근 위성 세포의 상, 면역형광 및 그래픽 도시를 나타낸다. 여기서, 위성 세포의 낮은 융합은 근모세포, 근세포 (MyoD+)로의 증식 및 궁극적으로 기능성 근관 (액티닌+)으로 조직화되는 것을 위한 능력을 나타낸다. 도 10에서, 이러한 발견은 위성 세포가 기능성 조직을 산출하도록 유도될 수 없는 FBS (또는 도시되지 않은 PRP 및 혈소판 용해물)와 같은 다른 성장 조건과의 PEP의 근접 비교에 의해 추가로 뒷받침된다. 도 11에서는, 단독으로, 또는 PEP 보강 후 중 어느 하나에 생착된 콜라겐 매트릭스의 생체 내 시험으로 이와 같은 패러다임의 추가적인 입증이 제공되었다. 도 11A 및 도 11B는 PEP 보강 조건에서는 이르게는 2주에 골격근 생성의 강력한 증거가 존재하며 8주에는 근육 함량 전체 두께의 복원이 나타난다는 것을 입증하고 있다. 이와 같은 재생 반응은 대조군 (콜라겐 단독)에서는 보이지 않았다. 이러한 데이터는 피부, 골격근 (인두/후두, 요로 및 항문 조임근, 그리고 근골격계와 연관되어 있는 것을 동반하는 격막 포함)과 같이 전구체가 풍부한 조직, 위장관로, 질, 방광, 자궁 및 기타 구조 기관을 포함하여 평활근이 있는 조직의 재생을 유도하기 위한 PEP 보강 환경의 사용에 대한 근거를 제공한다.
도 12는 B2, B3 및 B4로 표지된 상이한 PEP 제제 3종의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. 각 샘플은 대표적인 엑소좀 단백질인 튜불린, 수퍼옥시드 디스뮤타제 1 (SOD1), 수퍼옥시드 디스뮤타제 2 (SOD2), 수퍼옥시드 디스뮤타제 3 (SOD3), CD63, 헴 옥시제나제 (HO-1) 및 프로그래밍된 사멸 리간드 1 (PD-L1)에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 프로빙되었다. 튜불린은 인간 세포의 편재성 단백질이다. SOD1, SOD2 및 SOD3는 반응성 산소 종 (ROS)에 의해 야기되는 손상을 제한하는 항-옥시다제이다. CD63은 엑소좀 막 표면 단백질이다. HO-1은 헴의 분해를 촉매촉진하는 효소로서, 산화성 스트레스에 의해 유도된다. PD-L1은 임신, 조직 동종이식, 자가면역 질환과 같은 특정 사건 동안 면역 시스템을 억제하는 것과 연관되어 있는 막횡단 단백질이다. 도 12는 3종의 별도-제조 PEP 제제에 걸친 대표적인 단백질의 밴드형성으로 입증되는 바와 같이, PEP를 제조하는 데에 사용되는 과정이 고도로 일관된 단백질 프로파일을 산출한다는 것을 보여준다.
도 13은 다양한 농도의 PEP 제제를 사용한 시간-의존성 세포 성장을 보여준다. 도 13은 또한 제제 중 엑소좀 표면에서의 CD63 발현을 기준으로 하여 PEP 제제를 선별하는 것의 효과를 보여준다. PEP 제제는 통상적으로 CD63+ 엑소좀과 CD63- 엑소좀의 혼합물을 포함한다. CD63+ 엑소좀은 막-결합 소포를 선별하는 데에 적합한 어떠한 방법에 의해서도 PEP 제제로부터 선별될 수 있다. CD63+ 엑소좀을 선별하기 위한 대표적인 방법에는 친화성 분리, 자기 비드 분리, 유동 분리 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 양성 대조군은 모의 소포로 처리되는 경우 세포 성장을 나타낸다. 세포 성장은 20시간차까지 빠르게 증가한 다음, 세포가 융합에 도달하면서 편평화된다. 반면, PEP 제제로 처리된 세포는 계속 성장한다 (예컨대 20시간차에서 60시간차까지). CD63+ 엑소좀을 포함하는 PEP를 사용하여 처리된 세포는 약 40시간 후 다소 일정한 속도로 계속되는 성장을 나타낸다. CD63- 엑소좀을 함유하는 PEP를 사용하여 처리된 세포 역시 약 40시간 후 다소 일정한 성장 속도를 나타내지만, 음성 대조군 (무혈청 배지에서 성장되는 세포)에 비해 더 느린 속도이다. 따라서, CD63+ 엑소좀을 함유하는 PEP는 상처 치유 및/또는 조직 재생과 연관되어 있는 적용분야에서 요구될 수 있는 바와 같은 세포 성장을 촉진할 수 있다. 그러나, 제한되지 않는 세포 성장은 신생물의 성장을 초래할 수 있다. CD63- 엑소좀을 포함하는 PEP는 - 예를 들어 융합 도달시 - 성장을 느리게 함으로써 CD63+ 엑소좀을 포함하는 PEP 제제가 제한되지 않는 세포 성장을 초래할 위험성을 제한하는 세포 기구에 관여할 수 있다.
비변형 PEP 제제 - 즉 제제 중 엑소좀의 집단을 선별하거나 분리하는 것에 의해 특징이 변화되지 않은 PEP 제제 -는 자연적으로 CD63+ 및 CD63- 엑소좀의 혼합물을 포함한다. CD63- 엑소좀은 제한되지 않는 세포 성장을 억제할 수 있기 때문에, 자연적으로 CD63+ 및 CD63- 엑소좀을 포함하는 비변형 PEP 제제는 상처 복구 및/또는 조직 재생을 위한 세포 성장을 자극하는 것, 및 제한되지 않는 세포 성장을 제한하는 것 모두를 할 수 있다. 또한, CD63- 엑소좀은 제한되지 않는 세포 성장을 억제할 수 있기 때문에, - 예를 들어 CD63+ 엑소좀의 적어도 일부를 선별하여 제거하는 것에 의해 - CD63- 엑소좀이 보강된 PEP 제제는 항-신생물 치료법으로 사용될 수 있다.
또한, CD63+ 엑소좀을 선별하는 것에 의하면, 자연-단리 PEP 제제로부터 CD63+ 엑소좀을 제거한 다음 다시 원하는 양의 CD63+ 엑소좀을 첨가하는 것에 의해 PEP 생성물에서의 CD63+ 엑소좀 대 CD63- 엑소좀의 비를 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, PEP 제제는 CD63- 엑소좀만을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, PEP 제제는 CD63+ 엑소좀 및 CD63- 엑소좀 모두를 포함할 수 있다. CD63+ 엑소좀 대 CD63- 엑소좀의 비는 적어도 부분적으로 구체적인 적용분야에서 요구되는 세포 성장의 양에 따라 가변적일 수 있다. 예를 들어, CD63+/CD63- 엑소좀 비는 CD63+ 엑소좀에 의해 유도되는 원하는 세포 성장, 그리고 세포-접촉 억제를 통하여 달성되는 CD63- 엑소좀에 의해 제공되는 세포 성장의 억제를 제공한다. 비-접착성 세포가 존재하는 조직 (예를 들어 혈액 유래 구성요소)에서와 같은 특정 시나리오에서, 이와 같은 비는 처리되는 조직에서 세포 성장 또는 세포 억제의 적절한 균형을 제공하도록 조정될 수 있다. 예컨대 비-접착성 세포를 포함하는 조직에서는 세포-대-세포 접촉이 신호가 되지 않기 때문에, 조절되지 않는 세포 성장을 방지하기 위해 CD63+ 엑소좀 비를 감소시킬 수 있다. 반대로, 동종이형 세포-기반 치료법 또는 면역치료법에서와 같이 세포의 클론 집단을 확장하려는 요구가 존재하는 경우, 매우 적은 공급원으로부터 대형 세포 집단이 유도될 수 있도록 보장하기 위해 CD63+ 엑소좀의 비를 증가시킬 수 있다.
이에 따라, 다양한 실시양태에서, PEP 제제 중 CD63+ 엑소좀 대 CD63- 엑소좀의 비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 25:1 또는 30:1일 수 있다. 특정 실시양태에서, PEP 생성물은 9:1 비의 CD63+ 엑소좀 대 CD63- 엑소좀을 함유하도록 제제화된다.
도 14는 PEP를 산출하는 본원에서 기술되는 방법에 대비하여 한외원심분리 및 접선 유동 여과 (TFF)와 같은 기술에서의 크기 분포 및 총 엑소좀 수율을 나타낸다. 이러한 개별 기술의 나노사이트 분석은 한외원심분리 또는 TFF 중 어느 하나를 사용한 엑소좀 (세포외 소포) 산출이 한외원심분리에서 41 nm 내지 776 nm, 그리고 TFF에서 56 nm 내지 829 nm 범위인 넓은 엑소좀 크기 분포를 초래한다는 것을 보여준다. 반대로, 특유의 PEP 유도는 65 nm 내지 280 nm의 더 좁은 엑소좀 (또는 세포외 소포) 크기 분포를 야기하며, 다량의 엑소좀이 100 nm와 200 nm 사이에 존재한다. 또한, 한외원심분리 및 TFF 둘 모두의 ml 당 입자 수율은 2×108개였던 반면, PEP 제제는 꾸준히 6×1011 입자/ml를 산출하였다.
도 15는 형광 염료를 사용하여 염색하였을 때, PEP가 빠르게 배양되는 세포로 진입하는 능력을 가지고 있음을 입증하고 있다. 도 16은 조직 환경으로 전달되었을 때에도, PEP가 빠르게 세포로 진입할 수 있다는 것을 보여준다. 여기서 PEP는 허혈성 재관류의 돼지 모델에서 관상동맥내 접근법을 통하여 전달된다. 이와 같은 심근 경색증 모델에서는, 적절한 크기의 혈관성형술 풍선을 사용하여 90분 동안 LAD가 폐색된다. 재관류 후에는, 원적외 형광 지질 염료로 표지된 PEP가 좌측 전방 하행에 주사된다. PEP 전달 30분 이내에 심장을 수확하여, 원적외 신호에 대해 전체적으로 평가한다. 생성된 제노젠 영상화에 나타나 있는 바와 같이, 전달된 모든 PEP가 심장의 경색된 영역 내에 포획된다 (상부 패널). 조직학적 분석은 p-셀렉틴 (엑소좀 마커)에 의해 추적하였을 때 경색된 곳의 심근 세포 내에는 PEP가 존재하지만 비-경색 조직에서는 그렇지 않다는 것을 입증하고 있다. 이는 PEP가 심근과 같은 조직의 세포로 빠르게 매립되기 위해 손상 후 모세관 누출을 활용하는 능력을 가지고 있다는 것을 나타낸다. 또한, 이는 손상 환경으로의 것 또는 기관 손상을 방지하기 위한 것 중 어느 하나인 PEP 동맥-내 전달의 근거를 제공한다.
도 17은 정맥내 (IV) 및 복막내 (IP)로 전달되었을 때의 PEP의 생체분포를 추적한다. IV 전달되는 경우, 10분 내지 6일에 걸친 관찰 기간 동안, 거의 모든 PEP가 간에 분포되었으며, 소량의 신호가 비장에서 발견되었다. IP 전달은 GI 관로로의 PEP를 봉쇄하며, 간 연관성은 없었고, 비장 연관성은 최소한이었다. 안와-후방 접근법 (RO)을 통한 IV 전달은 생체분포에 있어서 유의성 있는 차이를 나타내지 않았다. 이는 간 표적화가 요구되는 경우, 건강한 사람 및 질환자에서 PEP가 IV 전달될 수 있다는 것을 시사한다.
이에 따라, 본 개시내용은 신규한 엑소좀-기반 치료법 및 엑소좀-기반 치료 조성물을 기술한다. 기술되는 엑소좀-기반 조성물의 생체-효능은 통상적인 엑소좀 제제에 비해 더 높다. 통상적인 엑소좀 제제와 비교하였을 때의 본원에서 기술되는 엑소좀 조성물과의 작은 미세구조 차이는 세포 흡수 및 이용에 영향을 주며, 그에 따라 서로 다른 구조적 조성이 서로 다른 효과로 이어진다. 원자력 현미경법 (AFM)하에서의 검사시, 본 발명의 신규한 정제된 엑소좀 생성물 (PEP)이 클러스터 또는 응집물을 형성하지 않는다는 것을 볼 수 있다. 이는 눈송이 또는 꽃무늬 패턴을 형성하는 경향이 있는 혈소판 풍부 혈장 (PRP)에서는 해당하지 않았다 (도 3). 기능상, PEP는 상처 치유, 상처 베드의 혈관화 및 상처의 재-상피화에 있어서 소 태아 혈청 (FBS) 또는 다른 통상적인 정제된 엑소좀 제제에 비해 상당히 탁월하였다. 이에 따라, 본원에서 기술되는 바와 같이 엑소좀 생성물을 단리하고 정제하는 것 - 즉 3차 구조를 형성하는 것과 달리 균일한 단일 미세구조 조성을 보장하는 방식 -은 시험관 내에서 나타났던 바와 같이 생체-효능의 급격한 상향조절을 초래하였는데, 생체-강화 매트릭스 중에서 콜라겐과 복합체화되었을 때 정점을 이루었다. 이는 비-허혈성 상처에서 나타나는 것으로 다시 미-치유 상처 베드의 재생을 유도할 수 있다.
상처 치유 및/또는 조직 재생을 촉진하기 위한 통상적인 기술은 치료되는 조직의 크기에 의해 제한될 수 있다. 조직 위성은 대략 3 mm 내지 5 mm 이격된 재생성 조직의 극과 같이 위치되게 된다. 동부 조직 극은 대략 50 μm 내지 500 μm의 크기로서, 질환 또는 손상 영역에 인접한 소량의 절제된 건강한 조직의 물리적 절제에 의해 상측에서 제조될 수 있게 된다. 생체적합성 지지체 (예컨대 생체적합성 웹, 생체적합성 매트릭스, 생체적합성 스캐폴드 등)와의 조합으로서의 PEP 제제는 다수의 조직 성장 "위성" 핵을 제공하는 것에 의해 조직 재생의 이와 같은 한계를 극복할 수 있다. 각 위성 핵은 PEP 제제가 부착되거나, 흡착되거나, 또는 달리 부착되는 생체적합성 지지체를 포함할 수 있다. 위성 핵 (세포 또는 조직 클러스터)은 또한 추가적인 성장 인자를 포함할 수 있다. 다수의 위성 핵이 사용되는 경우, 각 위성 핵의 조성은 임의의 다른 위성 핵과 동일하도록 또는 상이하도록 독립적으로 설계될 수 있다. 사용시, 위성 핵은 조직 재생이 요구되는 위치 또는 위치들에 따라 손상된 조직 내에 위치될 수 있다. 위성 핵의 이격은 3 mm 내지 5 mm 간격일 수 있다. 위성 핵은 다양한 위성 핵으로부터 재생되는 조직이 합체하여 연속 재생 조직을 형성할 때까지 다양한 핵 사이에서 병행하여 이루어지는 조직 재생의 중심점으로 기능할 수 있다. 도 9는 어떻게 세포 또는 조직 위성이 PEP 환경에서 골격근 조직의 융합을 산출할 수 있는지에 대한 예를 보여준다.
상기 상세한 설명 및 하기 청구범위에서, "및/또는"이라는 용어는 열거되는 요소 중 하나 또는 모두, 또는 열거되는 요소 중 임의 2종 이상의 조합을 의미하며; "포함하다", "포함하는"이라는 용어 및 이들의 변종은 개방 종료형인 것으로 - 즉 추가적인 요소 또는 단계가 임의적이어서, 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있는 것으로 - 해석되어야 하고; 달리 상술되지 않는 한, "하나" 및 "적어도 하나"는 호환가능하게 사용되는 것으로서, 하나 또는 하나 초과를 의미하며; 종료점에 의한 숫자 범위의 열거는 그 범위 내에 포괄되는 모든 수를 포함한다 (예컨대 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).
상기 상세한 설명에서, 구체적인 실시양태는 명료성을 위해 별개로 기술될 수 있다. 특정 실시양태의 특징이 또 다른 실시양태의 특징과 부적합성이라고 명시적으로 달리 상술되지 않는 한, 소정의 실시양태는 하나 이상의 실시양태와 연계된 본원에서 기술되는 적합성 특징의 조합을 포함할 수 있다.
별개 단계를 포함하는 본원에서 개시되는 임의의 방법에 있어서, 상기 단계는 어떠한 실현가능한 순서로도 수행될 수 있다. 그리고, 해당될 경우, 어떠한 2종 이상 단계의 조합도 동시에 수행될 수 있다.
하기 실시예로서 본 발명을 예시한다. 구체적인 예, 재료, 양 및 절차는 본원에서 제시되는 바와 같은 본 발명의 영역 및 기술사상에 따라 광의로 해석되어야 한다는 것이 이해되어야 한다.
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실시예
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실시예 1
정제된 엑소좀 생성물 (PEP)의 제조
공인된 혈액 은행으로부터 성분채집술 혈액 생성물을 입수하여, 최고 임상 표준에 부합한다는 것을 확인하였다. 생성물 유닛은 -20 ℃ 또는 -80 ℃ 중 어느 하나로 냉동하고, 현행 우수 제조 기준 (CGMP) 설비 내에서 저장하였다.
제조 과정을 개시하기 위해, 2-30 유닛을 해동하고 (통상적으로 5-15), 20 μm-40 μm 필터를 사용한 중력-기반 여과 단계에 적용한 후, -20 ℃ 내지 -80 ℃로 냉동되기 전에 수회의 교반 단계를 동반하여 합쳐진 생성물로서 풀링하였다. 풀링된 생성물을 5분의 수동 교반에 의해, 그리고 이어서 5-15분의 기계 교반에 의해 교반하였다. 조절되는 조건하에서, 풀링된 생성물을 0.1 ℃ 내지 5 ℃의 속도로 해동하고, 특정 부피로 멸균 유리 바이알에 분할하였다. 원하는 수분 함량의 수준에 따라, 적게는 0.1 ml에서 10 ml까지의 부피가 작게는 1 ml에서 크게는 50 ml까지의 바이알 중에서 이용될 수 있다. 다음에, 분취된 생성물은 균일한 냉동건조 프로파일을 보장하기 위해 조절되는 온도 변화에 적용된다. 건조 과정은 짧게는 5시간, 그리고 길게는 170시간이 걸릴 수 있다. 이와 같은 절차 후의 최종 생성물은 시각적으로 케이크화된 펠렛의 형성을 기준으로 방출되는데, 방출 기준은 제조되는 로트 당 95 %를 초과하는 적절한 케이크화를 필요로 한다. 이러한 측정기준이 충족되지 않는 경우에는, 전체 로트가 사용중지된다.
콜라겐-PEP 스캐폴드의 제조
냉동된 엑소좀-풍부 용액을 48시간 동안 동결건조함으로써, 정제된 엑소좀 생성물 (PEP)을 수득하였다. 3 mg/ml 농도의 콜라겐을 동결건조된 PEP와 혼합함으로써, 20 % w/v의 최종 농도를 달성하였다. 상기 혼합 용액을 6-cm 페트리 접시에 조심스럽게 붓고, 37 ℃에서 인큐베이팅하였다. 도 1A는 PEP 제조 과정에서의 다양한 단계를 나타낸다. 도 1B는 PEP와 콜라겐 섬유 사이의 관계를 예시하는 개략도이다.
주사 전자 현미경법 (SEM)
전계 방출 - 주사 전자 현미경 (히타치(Hitachi) S-4700, 일본 도쿄 소재 히타치 하이-테크놀로지스(Hitachi High-Technologies) 사)을 사용하여, 콜라겐 (도 2A, 2B) 및 콜라겐-PEP (도 2C, 2D) 스캐폴드의 형태구조적 특징을 관찰하였다. 스캐폴드를 0.1 M 소듐 포스페이트 완충제 pH 7.2 중 2.5 % 글루타르알데히드 중에서 밤새 고정하였다. 이어서, 샘플을 1 % 오스뮴 테트록시드 중에서 1시간 동안 후-고정하고, 에탄올 중에서 탈수한 후, 임계점 건조하였다. 건조된 샘플을 주변 온도에서 스퍼터-코팅기를 통하여 금으로 코팅하였다. 스캐폴드의 현미경사진을 촬영하고, 0.01 mm 내지 1,000 mm 범위를 갖는 베크만 쿨터(Beckman Coulter) LS 32 장비를 사용하여, 세공 크기 분포를 결정하였다. 평균 세공 크기는 6개 SEM 사진 각각에서의 30개 세공의 세공 크기를 측정하는 것에 의해 계산하였다.
원자력 현미경법 (AFM)
원자력 현미경법을 사용하여 콜라겐 및 생체-강화 PEP의 형태구조를 조사하였다. 콜라겐 또는 PEP를 새로 절단된 운모 디스크의 표면상에 위치시키고, 37 ℃에서 대략 30분 동안 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 샘플을 물로 4-5회 세척한 다음, 질소 기체를 사용하여 건조하였다. 실온에서 나노스코프(Nanoscope) IV 피코포스(PicoFroce) 다중모드 AFM (브루커 코포레이션(Bruker Corporation) 사, 매사추세츠 빌레리카 소재)을 사용하여 태핑(tapping) 모드로 나노규모 AFM 이미지 (512×512 픽셀)를 수집하고, 나노스코브 분석 버전 1.40 소프트웨어 (문헌 [Park, S. & Terzic, A, 2010. J Struct Biol 169:243-251])를 사용하여 분석하였다. 대표적인 이미지를 도 3에 나타내었다.
인간 피부 섬유모세포 (HDF) 이동 검정:
HDF를 웰 당 2×104개 세포로 96-웰 인큐사이트 이미지록(INCUCYTE IMAGELOCK) 조직 배양 플레이트 (에쎈 바이오사이스(Essen BioScience) 인크. 사, 미시간 앤 아버 소재)의 플레이트에 시딩하고, 가습되는 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후, 인큐사이트 운드마커(INCUCYTE WOUNDMAKER)를 사용하여 96-웰 이미지록 플레이트의 모든 웰에서 정밀하고 재현가능한 상처를 생성시켰다. 상처생성 후; 각 웰로부터 배지를 흡인하고, 탈락된 세포가 침강하여 재부착하는 것을 방지하기 위해 웰을 배양 배지로 2회 조심스럽게 세척하였다. PBS 완충제를 사용한 세척 후에는, HDF 이동에 대한 PEP의 효과를 측정하기 위해, 100 μL의 배양 배지를 5 % w/v 농도로 DMEM (FBS 없음)을 사용하여 희석된 용액 중 PEP로 대체하였다. 이후 DMEM (FBS 포함)을 사용하여 배양된 세포를 대조군으로 간주하였다. 배양한 후, 검정 플레이트를 인큐사이트 줌(INCUCYTE ZOOM)에 위치시키고, 시스템을 5분 동안 평형화시켰다. 줌 소프트웨어에서의 반복 스캐닝 (48시간 동안 3시간마다) 일정으로 이미지를 촬영하고 기록하였다. 시간상 첫 번째 스캔을 사용하여 최초 긁힘 상처 마스크 (이동하는 세포 및 비-상처생성 영역의 경계/선도연(leading edge)을 보여주는 디지털 중첩도)를 생성시켰다. 이와 같은 최초 긁힘 상처 마스크를 이후의 정량 과정에 사용하였다. 첫 번째 스캔 후 모든 차후 이미지 시점에서도 긁힘 상처 마스크를 컴퓨터계산하였다. 또한, HDF 이동 검정의 통계 분석을 수행한 바; 최초 긁힘 상처 마스크에 의존하여 이미지의 세포-점유 및 무-세포 영역 사이를 구분하는 상대적 상처 밀도 (RWD)를 측정하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
혈관형성 검정 (시험관 내 관 형성)
시험관 내 혈관형성 및 관 형성을 수행하는 데에는, 프라임키트-크리요(PrimeKit-Cryo) (에쎈 바이오사이언스, 인크. 사, 미시간 앤 아버 소재)를 사용하였다. 0일차에, NHDF (정상 인간 섬유모세포)를 해동하여, 세정하고, 시딩 배지 중에서 코닝(Corning) 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음에, NHDF를 조직 배양 후드에서 1시간 동안 실온으로 인큐베이팅함으로써, 그것이 플레이트에 부착하도록 하였다. HUVEC 시토라이트 그린(CytoLight Green) 시딩 후, 영상화를 위해 인큐사이트에 위치시키기 전에 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 프라임키트를 위한 세포 밀도는 검정 수행을 위한 우리의 엄격한 품질 조절 지침에 부합하도록 최적화하였다. 시딩 후, 공동-배양물을 인큐사이트 S3에 위치시키고, 타일형 시야(Tiled Field of View) (FOV) 모자이크 영상화 모드를 사용하여 8일 동안 3시간마다 상 및 형광 둘 모두에서 자동으로 이미지를 획득하였다. 이와 같은 모드에서, 웰 당 총 6개의 이미지 (가로 3개의 이미지 × 세로 2개의 이미지)를 획득하고, 웰의 거의 50 %를 차지하는 하나의 더 큰 이미지로 융합하였다 (도 5A). 1일차에, 시딩 배지를 웰 당 150 μL의 성장 배지 (키트와 함께 제공)로 대체하였다. 2일차에는, 시험 반응물 (5 % PEP 또는 5 % PRP 또는 10 % FBS)을 검정 배지에 첨가하였다. 4일차 및 7일차에, 시험 반응물을 새로운 시험 반응물 배지로 대체하였다. 8일 동안 진행을 모니터링하면서; 통합 인큐사이트 알고리즘을 사용하여 동적으로 관 형성을 처리하였다.
동물 모델 및 토끼 수술
일반 마취하에, 그리고 무균 기술을 사용하여, 토끼의 귀를 준비하고, 수술용 클리퍼를 사용하여 모발을 잘라내었다. 이어서, 이전에 기술된 바와 같이 (문헌 [Ahn, S. T. & Mustoe, T. A, 1990. Ann Plast Surg 24:17-23]) 허혈성 상처를 생성시켰다. 간단하게 말하자면, 3개의 동맥 및 정맥 중 하나 이상의 선택적 분할을 사용하여 허혈성 기질을 생성시켰으며, 토끼 귀 바탕의 상처를 단속 3-0 나일론 봉합사로 봉합하였다. 허혈성 상처를 생성시키기 위해, 2-cm 펀치를 사용하여 배쪽 귀에 원형의 전체-두께 병변을 생성시켰다. 실험 군에서는 멸균 드레싱을 적용하기 전에 상처에 생체스캐폴드를 적용한 반면, 대조군에서는 상처를 멸균 드레싱으로 덮어놓기만 하였다.
조직학
피부 상처 부위에의 세포 침윤을 평가하기 위해, 원하는 시점에 군 당 3개 상처로부터의 샘플을 수집하였다. 생검 영역으로부터의 피부 샘플을 수득하기 위해, 토끼를 희생시키고, 절제에 의해 조직을 제거하였다. 이후 피부 조직의 상처생성 영역을 안정화용 필터 막 (니트로셀룰로스와 같이 유기 용매에 대하여 내성인 임의의 막)상에 위치시키고, 샘플을 정확하게 절반으로 절단하였다. 상처 절반을 바로 최적 절단 온도 (OCT) 조직 냉동 배지 (냉동-절편용)에 매립하거나, 또는 4 % 파라포름알데히드를 사용하여 밤새 고정한 후 파라핀에 매립함으로써 상처 중간에서 절제가 개시될 수 있도록 하였다. 포르말린-고정 샘플을 8 ㎛로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.
헤모톡실린 및 에오신 (H&E) 염색
피부 조직의 8-㎛ 파라핀 절편을 처리하여, 절단한 후, 왁스-제거하고, 크실렌 (2×3분), 50:50 크실렌/100 % 에탄올 (1×3분), 100 % 에탄올 (2×3분), 95 % 에탄올 (1×3분), 70 % 에탄올 (1×3분), 50 % 에탄올 (1×3분) 및 마지막으로 H2O (1×5분)에서의 연속 인큐베이션에 의해 재수화하였다. 실온에서 5분 동안 해리스(Harris) 헤마톡실린 용액 (HHS32, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 사, 미주리 세인트루이스 소재)을 사용하여 슬라이드를 염색한 후, 이어서 흐르는 수돗물하에 염색 자(jar)에서 물이 더 이상 컬러화되지 않을 때까지 (대략 5분) 세정하였다. 슬라이드를 절편이 분홍색이 될 때까지 2 또는 3회 산 알콜 (70 % EtOH 중 1 % HCl)에 침지하였다. 수돗물을 사용하여 3 내지 5분 동안 슬라이드를 세정한 다음, 절편이 눈에 띄게 어두워질 때까지 5 또는 6회 암모니아수 (1L H2O 중 1 mL NH4OH)에 침지하였다. 수돗물을 사용하여 3 내지 5분 동안 슬라이드를 세정한 후, 이어서 에오신 Y 수용액 (HT110232, 시그마-알드리치 사, 미주리 세인트루이스 소재)을 1분 동안 슬라이드에 첨가하였다. 슬라이드를 다시 3 내지 5분 동안 흐르는 수돗물하에 세정하였다. 다음에, 95 % 에탄올 (2×3분), 100 % 에탄올 (2×3분), 50:50 크실렌/100 % 에탄올 (1×3분) 및 크실렌 (2×3분)에서의 연속 인큐베이션에 의해 슬라이드를 탈수하였다. 퍼마운트(Permount) 또는 크실렌계 마운팅(mounting) 배지를 사용하여 거기에 커버슬립을 덮을 때까지 슬라이드를 크실렌 (1시간 이하) 중에서 유지하였다.
면역조직화학
피부 조직의 8-㎛ 파라핀 절편을 처리하여, 절단한 후, 왁스-제거하고, 크실렌 (2×3분), 크실렌:에탄올 (1×3분), 100 % 에탄올 (2×3분), 95 % 에탄올 (1×3분), 70 % 에탄올 (1×3분), 50 % 에탄올 (1×3분) 및 마지막으로 H2O (1×5분)에서의 연속 인큐베이션에 의해 재수화하였다. 이후, 마이크로파 (850 W)하에서 3분 동안 예-열된 트리스-EDTA 완충제 (10 mM 트리스, 1 mM EDTA pH 8) 또는 0.01 M 시트레이트 완충제 (pH 6)에 조직 절편을 침지하는 것에 의해, 항원 재생(antigen retrieval)을 수행하였다. 360 W에서 10분 동안 슬라이드를 가열하였다. 이후, 슬라이드를 실온 (RT)으로 30분 동안 냉각시킨 후, 1X PBS 중에서 세척하였다. PBS 중 0.1 % 트리톤(Triton)을 사용하여 5분 동안 절단된 것을 인큐베이팅한 다음, 세척 당 5분 동안 3회 PBS 중에서 세척하였다. 절편을 즉시 블로킹 단계로 전달하였다. 항체 인큐베이션 전에 절편을 10 % 염소 혈청, 1 % BSA, 0.01 % 트리톤과 함께 인큐베이팅하고, 실온에서 1시간 동안 PBS 중에 희석하는 것에 의해, 일차 항체의 비-특이적 결합을 블로킹하였다. 1시간의 블로킹 후, 슬라이드를 조심스럽게 블러팅 페이퍼상에 포획함으로써, 블로킹 용액을 제거하였다. 일차 항체를 PBS 중 0.5 % BSA에 희석하고, 습기 챔버에서 각 절편을 4 ℃로 밤새 120 μl의 일차 항체와 함께 인큐베이팅하였다. 음성 대조군은 일차 항체를 생략하고 0.5 % BSA/PBS 중에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 세척 당 3분 동안 3회 PBS 중에서 세척하는 것에 의해, 비결합 일차 항체를 제거하였다. 이후, 각 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 120 μl의 폴리-HRP-항-마우스/토끼/래트 IgG와 함께 인큐베이팅하였다.
PBS 중에서의 세척 (3×5분) 후, 모위 오일(Mowie Oil)을 사용하여 커버슬립을 마운팅하고, 실온에서 방치하여 경화시켰다. 공초점 레이카(Leica) 현미경에서 결과를 가시화하고 사진촬영하였다.
공초점 현미경법
모든 이미지는 레이카 TCS-SP5 공초점 현미경에서 40X 또는 20X 배율로 획득하였다. 매 실험에서 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트 (TRITC) 염료에 대하여 여기 레이저를 표준화하였으며, DAPI 염료는 필요한 대로 각 이미지에 대하여 육안으로 설정하였다. 이미지 처리는 포토샵(PHOTOSHOP) 7.0 영상화 소프트웨어 (어도비 시스템즈(Adobe Systems) 인크 사, 캘리포니아 산 호세 소재)를 사용하여 수행하였다.
실시예 2
3종의 서로 다른 PEP 배치 (B2, B3, B4)를 20 % 용액 (PEP 바이알 중 5 mL의 식염수)으로 용해시키고, 0.2 마이크로미터 필터를 사용하여 여과한 후, BCA 검정 키트 (피어스, 서모 피셔 사이언티픽, 인크. 사, 매사추세츠 왈탐 소재)를 사용하여 단백질의 농도를 정량하였다. 이로부터, 각 샘플 1.5 μL를 23.5 μL의 용해 완충제에 용해시키고, 85 ℃로 3분 동안 가열하였다. 20 g의 단백질을 12.5 % 폴리아크릴아미드 겔 (크리테리온, 바이오-래드 라보래토리즈, 인크. 사, 캘리포니아 허큘리스 소재)상에 적재하였다.
결과를 도 12에 나타내었다.
실시예 3
밀테니(Milteni) CD63 자기 비드를 이용하여 양성 및 음성 엑소좀 집단을 분리하였다. 배양-기반 평가를 위한 연속 희석 전에, 이들 집단을 펠렛화 완료하고 정량하였다. 인큐사이트 시스템에서, 배양된 HUVEC을 5 % PEP (양성 대조군), 무혈청 용액 (음성 대조군), 그리고 기술된 CD 63+/CD63- 농도 중에 위치시켰다. 결과를 도 13에 나타내었다.
실시예 4
PEP 유도 과정에 대한 16시간 동안의 30,000×g에서의 한외원심분리, 50 KDa 중량 한계 필터를 사용한 접선 유동 여과를 사용하여 엑소좀 집단을 정제하였다. 액체 형태인 한외원심분리 및 TFF-유도 샘플을 1000× 희석하고, 분석을 위해 나노사이트에 투입하였다. 동결건조된 PEP를 100 % 용액으로서 멸균수에 용해시키고, 크기 분포 및 정량을 위한 나노사이트 시스템 (EV 특성화를 위한 최적 표준)에서의 평가 전에 1000X로 희석하였다. 결과를 도 14에 나타내었다.
실시예 5
RFP 및 원적외 범위의 형광 지질 염료를 20 % PEP 제제에 첨가하고, 17,000×g에서 10분 동안 원심분리함으로써, 비결합 염료를 세척 제거하였다. 균질화를 위해 재현탁된 펠렛을 초음파처리하고, 0.2 ㎛ 필터를 통하여 여과하여 잔사를 제거한 후, 세포 배양 조건으로 전달하고 (도 15), 심근 경색증 후에 관상동맥내로 전달하고 (도 16), 생체분포 분석을 위해 IV 전달하였다 (도 17).
본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공개, 및 전자 가용 자료 (예를 들어 진뱅크(GenBank) 및 레프세크(RefSeq)에의 뉴클레오티드 서열 제출물, 및 예를 들어 스위스프롯(SwissProt), PIR, PRF, PDB에의 아미노산 서열 제출물, 그리고 진뱅크 및 레프세크에서 주해된 코딩 영역 번역물 포함)의 완전한 개시내용은 그 전체가 참조로 포함된다. 본 출원의 개시내용과 본원에 참조로 포함되는 임의 문서 개시내용(들) 사이에 소정의 불일치가 존재하는 경우, 본 출원의 개시내용이 우선해야 한다. 전기한 상세한 설명 및 실시예는 이해의 명료성만을 위해 제시된 것이다. 그로부터 불필요한 한정을 이해해서는 안 된다. 나타내어 기술한 정확한 세부사항으로 본 발명이 제한되는 것은 아닌데, 관련 기술분야 통상의 기술자에게 자명한 변이가 청구범위에 의해 정의되는 본 발명 내에 포함될 것이기 때문이다.
달리 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용되는 성분의 양, 분자량 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 반대로 표시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 제시되는 숫자 파라미터는 본 발명에 의해 수득될 것으로 생각되는 원하는 특성에 따라 가변적일 수 있는 개략치이다. 최소한, 그리고 청구범위 영역의 등가물에 대한 원칙을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 각 숫자 파라미터는 적어도 기록되는 유효 숫자의 수에 비추어, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 발명의 광의의 영역을 제시하는 숫자 범위 및 파라미터가 개략치이기는 하지만, 구체적인 실시예에서 제시된 숫자 값은 가능한 한 정밀하게 기록하였다. 그러나, 모든 숫자 값은 본질적으로 그의 각 시험 측정시 발견되는 표준 오차에 필연적으로 기인하는 범위를 품고 있다.
모든 표제는 독자의 편의를 위한 것으로서, 그러하다고 상술되지 않는 한 표제에 이어지는 본문의 의미를 제한하는 데에 사용되어서는 안 된다.
Claims (51)
- 300 nm 이하의 직경을 갖는 구형 또는 회전타원형 엑소좀을 포함하는 정제된 엑소좀 생성물.
- 제1항에 있어서, 10 % 이하의 수분 함량을 갖는 정제된 엑소좀 생성물.
- 제1항에 있어서, 냉장 없이 적어도 6개월의 저장 수명을 갖는 정제된 엑소좀 생성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조성이
1 % 내지 20 %의 CD63- 엑소좀; 및
80 % 내지 99 %의 CD63+ 엑소좀
을 포함하는 것인 정제된 엑소좀 생성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 50 %의 CD63- 엑소좀을 포함하는 정제된 엑소좀 생성물.
- 제5항에 있어서, 적어도 99 %의 CD63- 엑소좀을 포함하는 정제된 엑소좀 생성물.
- 수중 재구성된 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 정제된 엑소좀 생성물을 포함하는 조성물.
- 제7항에 있어서, 정제된 엑소좀 생성물이 30 % 이하의 농도로 제공되는 것인 조성물.
- 생체적합성 매트릭스; 및
생체적합성 매트릭스에 부착된 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 정제된 엑소좀 생성물
을 포함하는 조성물. - 제9항에 있어서, 생체적합성 매트릭스가 콜라겐, 트롬빈, 젤라틴, 알기네이트, 또는 또 다른 자연-발생 기저막 생성물을 포함하는 것인 조성물.
- 혈액,
혈액 생성물, 또는
제대 와튼 젤리, 지방의 간질 혈관 분획, 성분채집술 골수 생성물, 윤활액, 뇌척수액 또는 중간엽 줄기 세포를 포함하는 비-혈액 생성물
을 포함하는 출발 재료를 수득하는 것;
출발 재료를 여과 또는 성분채집하는 것;
여과된 재료를 풀링하는 것;
풀링된 재료를 교반하는 것; 및
교반된 풀링된 재료를 냉동건조하는 것
을 포함하는, 정제된 엑소좀 생성물의 제조 방법. - 제11항에 있어서, 출발 재료가 제대혈을 포함하는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 출발 재료가 연령 30세 미만의 사람, 수술-후 공여자, 폐경-전 여성, 분만전후 여성 또는 태반으로부터 수득되는 것인 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, -20 ℃ 이하의 온도에서 출발 재료를 냉동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료를 여과하는 것이 중력-기반 여과를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 교반된 풀링된 재료를 냉동건조하기 전에
교반된 풀링된 재료를 냉동시키는 것; 및
냉동된 교반 풀링된 재료를 해동하는 것
을 추가로 포함하는 방법. - 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 냉동건조되기 전에 풀링된 재료를 분할하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 교반된 풀링된 재료가 적어도 5시간 동안 냉동건조되는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 교반된 풀링된 재료가 170시간 이하 동안 냉동건조되는 것인 방법.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 폐경-전 여성으로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 분만전후 여성으로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 태반으로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 제대로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 제대 유래 젤리를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 정제된 엑소좀 생성물을 제약상 허용되는 캐리어 중에 재구성하는 것
을 포함하는 인공 혈액 생성물의 제조 방법. - 제25항에 있어서, 제약상 허용되는 캐리어가 생리학적 완충제, 증류수 또는 기저막 용액을 포함하는 것인 방법.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 재구성된 정제된 엑소좀 생성물을 생분해성 중합체 스캐폴드, 비-생분해성 중합체 스캐폴드 또는 나노튜브와 혼합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 폐경-전 여성으로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 분만전후 여성으로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 태반으로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 제대로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 제대 유래 젤리를 포함하는 것인 방법.
- 제6항에 따른 정제된 엑소좀 생성물을 제약상 허용되는 캐리어 중에 재구성하는 것
을 포함하는 인공 혈액 생성물의 제조 방법. - 제33항에 있어서, 제약상 허용되는 캐리어가 생리학적 완충제, 증류수 또는 기저막 용액을 포함하는 것인 방법.
- 제33항 또는 제34항에 있어서, 재구성된 정제된 엑소좀 생성물을 생분해성 중합체 스캐폴드, 비-생분해성 중합체 스캐폴드 또는 나노튜브와 혼합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 폐경-전 여성으로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 분만전후 여성으로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 태반으로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 제대로부터의 혈액을 포함하는 것인 방법.
- 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 출발 재료가 제대 유래 젤리를 포함하는 것인 방법.
- 상처가 치료되지 않고 치유되는 것에 비해 더 적은 시간 이내에 상처를 치유하기에 효과적인 양으로 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 인공 혈액 생성물을 상처에 투여하는 것
을 포함하는 상처 치유의 촉진 방법. - 상처가 치료되지 않고 치유되는 것에 비해 더 적은 시간 이내에 상처를 치유하기에 효과적인 양으로 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 인공 혈액 생성물을 상처에 투여하는 것
을 포함하는 상처 베드의 혈관화 증가 방법. - 상처가 치료되지 않고 치유되는 것에 비해 더 적은 시간 이내에 상처를 치유하기에 효과적인 양으로 제25항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 인공 혈액 생성물을 상처에 투여하는 것
을 포함하는 상처의 상피화 증가 방법. - 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 허혈성인 방법.
- 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 인공 혈액 생성물을 신생물을 나타내는 조직에 투여하는 것
을 포함하는, 조직에서의 신생물 억제 방법. - 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
인공 혈액 생성물이 생체적합성 매트릭스의 적어도 일부에 부착되어 물품을 형성하고;
인공 혈액 생성물을 투여하는 것이 상처 또는 조직을 다수의 물품과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법. - 제46항에 있어서, 생체적합성 매트릭스가 생분해성 중합체 스캐폴드, 비-생분해성 중합체 스캐폴드 또는 나노튜브를 포함하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 냉동건조된 생성물이 ml 당 적어도 1×1010 개의 엑소좀을 포함하는 것인 방법.
- 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 냉동건조된 생성물이 엑소좀 집단을 포함하며, 여기서 엑소좀의 적어도 95 %가 100 nm의 분포 범위 내에 속하는 직경을 갖는 것인 방법.
- 제49항에 있어서, 엑소좀의 적어도 90 %가 60 nm의 분포 범위 내에 속하는 직경을 갖는 것인 방법.
- ml 당 적어도 1×1010 개의 엑소좀을 포함하는 정제된 엑소좀 생성물.
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