CN116549719B - 负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶、制备与应用 - Google Patents

负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶、制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶、制备与应用，属于伤口敷料的制备技术领域。将丝素蛋白溶解，得到丝素蛋白溶液；然后将该丝素蛋白溶液与间充质干细胞外泌体溶液以及富血小板血浆溶液混合，得到混合溶液；将钙盐与凝血酶加入该混合溶液中进行孵育，得到负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶。本发明制备得到的双交联水凝胶对负载于富血小板血浆及间充质干细胞外泌体中的生长因子具有良好的缓释效果，通过血浆及外泌体中的转化生长因子β、血管内皮细胞生长因子的释放曲线可知，本发明的双交联水凝胶具有更持久稳定的生长因子释放能力。

Description

负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶、制备与应用
技术领域
本发明涉及伤口敷料的制备技术领域，更具体地，涉及负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶、制备与应用，尤其涉及一种间充质干细胞衍生外泌体的富血小板血浆/丝素蛋白双交联水凝胶糖尿病伤口敷料的生物活性糖尿病伤口敷料的制备方法。
背景技术
糖尿病会影响伤口愈合的所有典型阶段，并延缓伤口愈合过程。糖尿病伤口的死亡率高、发病率高，并对患者的生活质量都有着长期的不利影响。生长因子缺乏、微血管减少、促炎细胞因子和蛋白酶升高、细胞功能受损和微生物感染可能是糖尿病患者慢性和不愈合伤口的主要原因。因此，向伤口递送生长因子、诱导新生血管形成、抑制炎症和氧化应激、使用抗蛋白酶保护生长因子和细胞外基质、募集活性细胞和抑制细菌活性等治疗方法可用于糖尿病伤口管理。传统上，糖尿病伤口的临床管理通常包括移植物移植、手术清创、负压治疗和定期换药。然而，由于细胞活性受损和伤口微环境中缺乏生物活性因子，这些治疗措施对许多患者来说是不成功的。这种对传统治疗的限制需要开发一种新的治疗策略来加速糖尿病伤口的愈合。
发明内容
本发明开发了一种负载间充质干细胞外泌体的丝素蛋白/富血小板血浆双交联水凝胶的伤口敷料。使用钙离子和凝血酶的混合物作为丝素蛋白和富血小板血浆混合物溶液的凝胶化介质。在该系统中，通过Ca2+和凝血酶促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白，纤维蛋白通过凝血因子XIIIa催化的谷氨酰胺和赖氨酸残基的共价交联形成了一个机械和化学高度稳定的纤维蛋白网络，同时，由于丝素蛋白也含有谷氨酰胺和赖氨酸，这种共价交联也可以进一步将丝素蛋白整合进纤维蛋白网络形成双交联水凝胶系统，进一步提升水凝胶系统的化学和机械稳定性。富有生长因子的间充质干细胞外泌体负载于该双交联水凝胶中，由于外泌体和水凝胶的缓释作用，作为伤口敷料(特别是糖尿病伤口敷料)时外泌体及血浆中的生长因子可以缓慢并持续地作用于糖尿病伤口，促进伤口(糖尿病伤口)的血管化，抑制炎症反应，从而促进伤口愈合。
根据本发明第一方面，提供了负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将丝素蛋白溶液与间充质干细胞外泌体加入到富血小板血浆中，得到混合溶液；
(2)将钙盐与凝血酶加入到步骤(1)得到的混合溶液中进行孵育，使丝素蛋白与富血小板血浆形成双交联水凝胶系统，且所述间充质干细胞外泌体负载到所述双交联水凝胶系统中，形成负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶。
优选地，步骤(1)中所述混合溶液中丝素蛋白的浓度为30mg/mL-50mg/mL。
优选地，步骤(1)中所述混合溶液中间充质干细胞外泌体的浓度小于等于20mg/mL。
优选地，所述钙盐为氯化钙或葡萄糖酸钙。
优选地，步骤(2)中，加入到步骤(1)得到的混合溶液中进行孵育的还有交联剂京尼平。
优选地，步骤(1)中，将丝素蛋白在60℃-80℃下加热30min-180min，使得丝素蛋白溶解，得到所述丝素蛋白溶液。
根据本发明另一方面，提供了任意一项所述方法制备得到的负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶。
根据本发明另一方面，提供了所述的负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶用于制备伤口敷料的应用。
优选地，所述伤口敷料为糖尿病伤口敷料。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
(1)本发明使用间充质干细胞来源的外泌体有能力运输大量的GFs、mRNA和微小RNA，同时保护其成分免受降解化学物质或酶的影响。
(2)本发明使用的丝素蛋白聚合物具有蛋白酶抑制能力，能够减轻生长因子被糖尿病伤口高浓度的蛋白酶快速降解，延长生长因子作用半衰期。
(3)本发明使用自体血液提取的富血小板血浆，避免了异源血浆可能的免疫排斥反应。
(4)本发明对负载于富血小板血浆及间充质干细胞外泌体中的生长因子具有良好的缓释效果，通过血浆及外泌体中的转化生长因子β、血管内皮细胞生长因子的释放曲线可知，本发明的双交联水凝胶具有更持久稳定的生长因子释放能力。
(5)本发明优选地，对糖尿病伤口愈合具有良好的促进作用，负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶在小鼠糖尿病伤口模型上显示出更快的伤口愈合率。
(6)本发明优选地，在钙离子和凝血酶作为交联剂的基础上，使用京尼平作为交联剂。
附图说明
图1是按照本发明的制备富血小板血浆凝胶的步骤图。
图2是按照本发明的制备间充质干细胞外泌体的步骤图。
图3是按照本发明的制备丝素蛋白溶液的步骤图。
图4是按照本发明的制备负载间充质干细胞外泌体的富血小板血浆/丝素蛋白双交联水凝胶糖尿病伤口敷料的示意图。
图5是制备的负载间充质干细胞外泌体的富血小板血浆/丝素蛋白双交联水凝胶糖尿病伤口敷料的光镜及电镜照片。
图6是负载间充质干细胞外泌体的富血小板血浆/丝素蛋白双交联水凝胶中转化生长因子β随时间的释放曲线。
图7是负载间充质干细胞外泌体的富血小板血浆/丝素蛋白双交联水凝胶中血管内皮细胞生长因子随时间的释放曲线。
图8是负载间充质干细胞外泌体的富血小板血浆/丝素蛋白双交联水凝胶糖尿病伤口敷料用于大鼠糖尿病伤口修复图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明开发了一种负载间充质干细胞外泌体的丝素蛋白/富血小板血浆双交联水凝胶系统的伤口敷料。使用钙离子(优选为葡萄糖酸钙)和凝血酶的混合物作为丝素蛋白和富血小板血浆混合物溶液的凝胶化介质。在该系统中，通过Ca2+和凝血酶促进纤维蛋白原转化为纤维蛋白，纤维蛋白通过凝血因子XIIIa催化的谷氨酰胺和赖氨酸残基的共价交联形成了一个机械和化学高度稳定的纤维蛋白网络，同时，由于丝素蛋白也含有谷氨酰胺和赖氨酸，这种共价交联也可以进一步将丝素蛋白整合进纤维蛋白网络形成双交联水凝胶系统，进一步提升水凝胶系统的化学和机械稳定性。最后将富有生长因子的间充质干细胞外泌体负载于该双交联水凝胶中，由于外泌体和水凝胶的缓释作用，作为伤口敷料(糖尿病伤口敷料)时外泌体及血浆中的生长因子可以缓慢并持续地作用于伤口(糖尿病伤口)，促进伤口(糖尿病伤口)的血管化，抑制炎症反应，从而促进伤口愈合。
本发明中，富血小板血浆可以由自体全血或同血型供体全血离心制备。
本发明中，间充质干细胞衍生的外泌体可以由间充质干细胞体外培养分离制备。
本发明中，丝素蛋白可以由家蚕蚕茧脱胶制备。
本发明中，负载间充质干细胞外泌体的丝素蛋白/富血小板血浆双交联水凝胶由溶解共混凝胶的方法制备，通过将上述富血小板血浆溶液，丝素蛋白溶液及间充质干细胞溶液共混，并加入Ca2+和凝血酶催化交联形成凝胶。
以下为具体实施例
实施例1
间充质干细胞来源外泌体丝素蛋白/富血小板血浆双交联水凝胶糖尿病伤口的制备：
一、富血小板血浆的制备，如图1所示：
步骤1：静脉取血针通过自体左臂下静脉取血，全血立即投入至EDTA抗凝管中，4℃保存。
步骤2：将获得的血液离心两次，使用高速离心机将血小板与红细胞(RBCs)和白细胞分离。先将血液以900g低离心力离心5分钟，将两个顶层(血浆和血小板)转移到新鲜的试管中，并在1500g高离心力下离心5分钟，取下底部两层，并将将沉淀的血小板重悬在剩余的血浆中以产生富血小板血浆。
二、间充质干细胞衍生的外泌体的制备，如图2所示：
步骤1：骨髓源性间充质干细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中。
步骤2：在细胞培养至接近90％的融合度下，用PBS冲洗细胞3次，并用5mL无FBS的DMEM更换培养基。
步骤3：再次培养48小时后，收集培养基，然后将其进行加速的离心，并不断丢弃上清液，并最终在1000,00g离心力下取的最终的上清液获得外泌体。
步骤4：将外泌体在500μL无菌PBS中重悬，然后在100KD、14000g、4℃下离心20分钟。滤液在200μL含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物的无菌PBS中仔细重悬，并在-80℃下冷冻以供进一步使用。
三、丝素蛋白溶液的制备，如图3所示：
步骤1：将干燥的家蚕蚕茧切成小块，在Na2CO3水溶液(0.02M)中煮沸1小时，然后用蒸馏水洗涤，以去除丝绸纤维中的丝胶蛋白。
步骤2：脱胶的丝素蛋白(SF)在热空气烘箱中干燥过夜。接下来，通过在60℃下将脱胶的丝绸溶解在9.3M LiBr溶液(1:4)中4小时来获得丝素蛋白原液。
步骤3：将丝素蛋白原液在基于纤维素膜的透析盒(截止分子量12400)中用去离子水透析3天，每1小时、4小时、然后每6小时更换一次水。
步骤4：透析后，将丝素蛋白溶液在4℃下以9000rpm离心20分钟，然后冻干2-3天以除去所有水分。将冻干SF储存在4℃下以备将来使用。
四、负载间充质干细胞外泌体的丝素蛋白/富血小板血浆双交联水凝胶糖尿病伤口敷料的制备，如图4所示：
步骤1：将上述丝素蛋白在90℃下加热20分钟并在室温(RT)下冷却溶解获得2％的丝素蛋白溶液。
步骤2：在4℃下将2％间充质干细胞外泌体与上述丝素蛋白溶液、富血小板血浆溶液混合，在37℃下搅拌1小时获得负载间充质干细胞外泌体的混合溶液。
步骤3：然后将上述混合溶液与CaCl2和凝血酶混合，并在在37℃下孵育20分钟后，获得最终的负载间充质干细胞外泌体的丝素蛋白/富血小板血浆双交联水凝胶。
步骤4：上述双交联水凝胶体系中进一步加入京尼平交联剂(0.1％)交联30分钟以形成机械性能更好的水凝胶，图5为获得的双交联水凝胶的实物图片和扫描电子显微镜图片。
实施例2
负载间充质干细胞外泌体的丝素蛋白富血小板血浆双交联水凝胶的制备：
步骤1：丝素蛋白的纯化制备如前所述，脱胶后的丝素蛋白溶于去离子水中配置成2％的溶液备用。
步骤2：富血小板血浆的制备如前所示，新鲜的富血小板血浆溶于0.9％生理盐水备用，并加入前列腺素E1(100ng/mL)添加到血浆中，以阻止合成过程中的血小板活化。
步骤3：间充质干细胞外泌体加入500uL磷酸盐缓冲液中重悬，制备获得间充质干细胞外泌体混悬液。
步骤4：上述三种溶液按照表格1所示配方分别加入，于4℃下混合，期间小心搅拌混合均匀。
步骤5：混合溶液中加入0.2mL，10％浓度的葡萄酸钙/凝血酶溶液促进交联，诱导凝胶化并获得双重交联的水凝胶。
表1富血小板血浆丝素蛋白双交联水凝胶
实施例3
负载间充质干细胞外泌体的丝素蛋白富血小板血浆双交联水凝胶生长因子的释放：
步骤一：如实例1所述分别制备富血小板血浆水凝胶及富血小板血浆/丝素蛋白水凝胶。
步骤二：浸入不含抗生素和胎牛血清的5mL新鲜DMEM中，并在37℃下用5％CO2孵育30分钟至7天，以释放生长因子。
步骤三：在第30分钟、第1小时、第4小时、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天，从样本中取出5ml DMEM，并将其储存在-80℃的冰箱中以备将来使用，并用5ml新鲜DMEM代替。
步骤四：利用酶联免疫荧光标记法测试每个时间点所得溶液的吸光度并与标准曲线比较获得不同生长因子随时间的释放曲线，如图6和图7所示。
实施例4
负载间充质干细胞外泌体的丝素蛋白富血小板血浆双交联水凝胶对大鼠糖尿病伤口模型的治疗：
步骤一：如实例1所述分别制备富血小板血浆水凝胶、富血小板血浆/丝素蛋白水凝胶、负载间充质干细胞的富血小板血浆/丝素蛋白水凝胶。
步骤二：选用38只体重在200至250克之间的健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，禁食近16小时后，接受单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(50mg/kg)，以启动严重糖尿病实验模型。诱导后三天，用注射器从每只大鼠的尾静脉抽取0.2mL的血滴。使用血糖仪试剂盒对血液进行检测。糖尿病大鼠在注射STZ后第21天的血糖高于14mmol/L或>250mg/dL。
步骤三：在诊断为严重糖尿病后，所有大鼠均用3％戊巴比妥钠(0.26–0.3mL/100g)腹膜内麻醉。大鼠的背毛在受伤前用剪刀去除并用70％乙醇清洗。使用直径为10mm的活检冲头来产生标准的全厚度伤口。
步骤四：将建模成功的大鼠分为四个治疗组：对照组不进行额外处理仅作纱布包扎，富血小板血浆凝胶组、丝素蛋白富血小板血浆双交联水凝胶组、负载间充质干细胞外泌体的丝素蛋白富血小板血浆双交联水凝胶组分别用对应的凝胶完全覆盖伤口。
步骤五：在第0、3、7、10和14天对伤口进行宏观检查，并通过用数码相机拍摄伤口来估计伤口的恢复情况，如图8所示。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将丝素蛋白溶液与间充质干细胞外泌体加入到富血小板血浆中，得到混合溶液；所述间充质干细胞外泌体为骨髓源性间充质干细胞；
(2)将钙盐与凝血酶加入到步骤(1)得到的混合溶液中进行孵育，使丝素蛋白与富血小板血浆形成双交联水凝胶系统，且所述间充质干细胞外泌体负载到所述双交联水凝胶系统中，形成负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶；所述负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶具有持久稳定的生长因子释放能力。
2.如权利要求1所述的负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合溶液中丝素蛋白的浓度为30mg/mL-50mg/mL。
3.如权利要求1所述的负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合溶液中间充质干细胞外泌体的浓度小于等于20mg/mL。
4.如权利要求1-3任意一项所述的负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，所述钙盐为氯化钙或葡萄糖酸钙。
5.如权利要求1所述的负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，加入到步骤(1)得到的混合溶液中进行孵育的还有交联剂京尼平。
6.如权利要求1所述的负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将丝素蛋白在60℃-80℃下加热30min-180min，使得丝素蛋白溶解，得到所述丝素蛋白溶液。
7.如权利要求1-6任意一项所述方法制备得到的负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶。
8.如权利要求7所述的负载间充质干细胞外泌体的双交联水凝胶用于制备伤口敷料的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述伤口敷料为糖尿病伤口敷料。
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