CN114225113A - 一种双层结构可降解的人工硬脑膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双层结构可降解的人工硬脑膜及其制备方法，涉及生物医用材料技术领域。所述双层结构可降解的人工硬脑膜包括支架层和粘合层，厚度为0.5～1.0mm，所述支架层为重组类人胶原蛋白，所述粘合层为贻贝粘蛋白。本发明的双层结构可降解的人工硬脑膜以重组类人胶原蛋白和贻贝粘蛋白为主要原料，为非动物源性材料，能够避免免疫原性问题；本发明的人工硬脑膜具有双层结构、可降解性、良好的柔韧性、贴附性、力学性能以及生物相容性；同时，人工硬脑膜的制备方法，以重组类人胶原蛋白和贻贝粘蛋白为主要原料，通过溶解、交联、透析、混合、涂覆、干燥等工艺制备出双层结构可降解的人工硬脑膜，工艺操作简单、适合大规模生产。

Description

一种双层结构可降解的人工硬脑膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，特别是涉及一种双层结构可降解的人工硬脑膜及其制备方法。
背景技术
硬脑膜是脑组织表面的一层重要的组织结构，是保护脑组织的一道重要屏障。
开放性颅脑损伤、炎症、脑肿胀、肿瘤侵犯脑膜、过分电灼脑膜等因素均可能导致硬脑膜无法关闭，形成缺损。若不及时修复或经不适当的修复，常引起脑脊液渗漏、颅内感染等并发症。另外值得重视的是，当脑组织外缺失硬脑膜时，极易与周围的组织发生粘连，周围的新生的血管将会长入脑组织内而形成瘢痕。这就是临床上产生头痛、脑功能障碍(如癫痫)等的病理基础。因此，在神经外科中，硬脑膜的完整性对于颅脑手术患者十分重要。
目前，临床上主要应用的硬脑膜替代的材料有4种：自体组织、异种生物材料、同种异体材料、人工合成材料。
其中，自体组织的颅骨骨膜、筋膜作为硬脑膜修复材料，具有不发生免疫排斥反应、术后并发症低、不加重患者经济负担等优点；但是也存在着明显的缺点，如取材的尺寸和形状有限、不适合大面积硬脑膜缺损的修补，同时增加了患者的二次手术的创伤和痛苦。同种异体组织，如尸体来源的硬脑膜也曾被用于硬脑(脊)膜修复，尸体来源的硬脑膜材料具有引起病毒传染的高风险，比如克雅氏病(CJD)。1987年美国报道了第一例因为使用了人尸体来源的硬脑膜而患CJD致死的患者；截止2017年底，日本共发现154例CJD(超过了全世界报道总例数的60％)，且CJD的潜伏期可长达30年或者更长时间；鉴于此，美国食品药品监督管理局(FDA)对此类产品进行了严厉的处置，日本厚生省已明确禁止尸体来源的硬脑膜材料用于脑外科。异种来源的硬脑膜材料是目前国内外临床应用最为广泛的一大类材料；根据制备方法的不同，又分为动物组织细胞外基质和提取动物胶原重塑支架结构的膜形材料。前者利用猪小肠黏膜下层，牛心包等材料细胞外基质中纤维支架的基本结构，经脱细胞、冻干等制备成膜修补材料；后者利用牛、马等跟腱组织提取胶原蛋白，重塑膜形材料。虽然这些材料均由引起免疫反应较少的Ⅰ型胶原蛋白构成，但是在临床中，仍发生过类似不良事件。相比较，人工合成材料的优点在于，规格不受限制，且无潜在的CJD及病毒感染风险。
人工合成材料可以分为可降解和不可降解两类，不可降解的聚合物材料对于受体来说永远是异物，易导致炎症反应、结缔组织增生包裹、感染、出血；可降解材料可以改善上述问题。
随着对材料的深入研究，各国学者将仿生学制备方法应用于硬脑膜修补材料中，人工合成材料从单一成分向多成分发展，在保证密封性的同时，获得了较为理想的生物学功能以及可控的降解性。但是，对比以胶原蛋白为主要成分的其他类似材料，人工合成材料缺乏胶原所介导的能够促进细胞迁移与增殖、促进相关细胞因子分泌等生物学功能。
因此，本领域迫切需要开发一种能够避免产品的免疫原性问题、具有优异的生物相容性、生物降解性能和生物安全性的人工硬脑膜，同时还应保证其工艺操作简单、适合大规模生产。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种利用基因工程发酵，提取纯度高的重组类人胶原蛋白和贻贝粘蛋白，经过特殊加工重塑胶原蛋白支架，利用两种蛋白降解速度的差异，制备了双层结构可降解的人工硬脑膜，该制备方法工艺操作简单、适合大规模生产。
本发明还提供了一种双层结构可降解的人工硬脑膜，以重组类人胶原蛋白和贻贝粘蛋白为主要原料，为非动物源性材料，能够避免产品的免疫原性问题，具有双层结构、可降解性、良好的柔韧性、贴附性、力学性能以及生物相容性。
一种双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，依次包括以下步骤：
(1)支架层的制备：取纯化水溶解的重组类人胶原蛋白溶液A，加入交联剂进行搅拌交联，然后透析去除多余的交联剂，得到交联后的重组类人胶原蛋白A1；
另取纯化水溶解的重组类人胶原蛋白溶液B，与交联后的重组类人胶原蛋白A1混合、均质，再涂覆、成膜、干燥，得到重组类人胶原蛋白支架层；
(2)粘合层的制备：将纯化水溶解的贻贝粘蛋白溶液均匀涂覆到重组类人胶原蛋白支架层上，经干燥后得到双层结构可降解的人工硬脑膜。
优选的，步骤(1)中，所述的重组类人胶原蛋白选自重组Ⅰ型类人胶原蛋白或者重组Ⅲ型类人胶原蛋白中的一种。
优选的，步骤(1)中，所述重组类人胶原蛋白溶液A和重组类人胶原蛋白溶液B的质量浓度为0.5％～50％；重组类人胶原蛋白溶液A与重组类人胶原蛋白溶液B，两者中的重组类人胶原蛋白的质量比为1：0.5～1：3。
优选的，步骤(1)中，所述的交联剂选自EDC、BDDE、PEGDE、PEG中的至少一种；所述交联剂在重组类人胶原蛋白溶液A的质量浓度为0.01％～0.5％。
优选的，步骤(1)中，所述的透析条件：透析液为pH 6～8的缓冲溶液，每1～2h换液一次，持续时间24～72h。
优选的，步骤(1)中，所述涂覆的厚度为1.0～1.5mm。
优选的，步骤(2)中，所述贻贝粘蛋白溶液的质量浓度为0.1％～50％。
优选的，步骤(2)中，所述贻贝粘蛋白溶液涂覆的厚度为0.1～0.5mm。
优选的，步骤(2)中，所述的干燥为冷冻干燥，冷冻干燥条件：温度-40℃～25℃，时间12～48h。
本发明还公开一种双层结构可降解的人工硬脑膜，采用上述的制备方法制备得到；所述人工硬脑膜包括支架层和粘合层，厚度为0.5～1.0mm，所述支架层为重组类人胶原蛋白，粘合层为贻贝粘蛋白。
有益效果：
(1)本发明的材料为非动物源性蛋白，从根源上避免了产品的免疫原性问题；同时，通过上述步骤制备的具有双层功能结构硬脑膜，结合了膜材料的韧性及柔软性，具备良好的粘附性、力学性能和止血性能；通过本发明制备的硬脑膜可免缝合，节省手术时间；本发明所制备的硬脑膜具有优异的生物相容性、生物降解性能和生物安全性；本发明制备硬脑膜的工艺方法简单，适合大规模生产。
(2)本发明使用的原材料重组类人胶原蛋白和贻贝粘蛋白都是通过微生物利用基因工程发酵而来，为高纯度重组蛋白。与动物来源蛋白相比，重组类人胶原蛋白、贻贝粘蛋白组分单一，安全性高，生产过程可控，最主要的是通过发酵获得的重组类人胶原蛋白及贻贝粘蛋白没有免疫源性，具有良好的生物安全性和生物相容性。
(3)重组类人胶原蛋白支架层特定的三维孔隙结构，有利于组织细胞的分化生长，可在脑水肿时缓冲对脑组织的挤压，不产生包裹性压缩现象。通过配制高浓度的重组类人胶原蛋白，部分交联后进行冷冻干燥，获得具有不同降解时间的胶原蛋白支架层；该支架层既能满足产品应有的力学性能，又具备优于胶原基质的柔软性，能够避免在手术过程中，由于材料不够柔软而损伤脑组织。
(4)粘合层是通过配制高浓度的贻贝粘蛋白溶液，将其铺展到胶原蛋白支架层，冷冻干燥后获得。贻贝粘蛋白具有优异的粘附性和止血性能，将其复合在多孔胶原支架层上，在硬脑膜修复过程中，可以迅速形成纤维蛋白凝块，严密封堵，防止脑脊液渗漏，促进整个基质的组织再生；同时，减免了手术过程中的缝合，一是为患者节约了修补时间，二是避免了缝合位点漏液的可能性。
(5)本发明制备的人工硬脑膜补片，其降解产物是氨基酸和水，最终可以通过代谢排出体外，具有良好的生物安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2的双层结构可降解的人工硬脑膜的示意图。
图2为本发明实施例2的双层结构可降解的人工硬脑膜的扫描电镜图。
图3为本发明实施例2与胶原蛋白膜(天新福)的力学性能对比图。
图4为本发明实施例2的人工硬脑膜细胞增殖情况对比图。
图5为HSF细胞在本发明实施例2的人工硬脑膜及培养板上的细胞的粘附数量对比图。
图6为本发明实施例实施例2与胶原蛋白膜(天新福)的体外降解情况对比图。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总质量计算的。除非另外指明，有关所列成分的所有质量均给予活性物质的含量，因此它们不包括在可商购获得的材料中可能包含的溶剂或副产物。本文术语“质量百分比含量”可用符号“％”表示。
除非另外指明，在本文中所有的分子量都是以道尔顿为单位表示的重均分子量。
除非另外指明，在本文中所有配制和测试发生在25℃的环境。
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。本文中术语“效能”、“性能”、“效果”、“功效”之间不作区分。
实施例1
(1)支架层的制备：用纯化水配制质量浓度30％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度0.2％的交联剂BDDE，将交联好的凝胶静置1h，然后装入透析袋中；将透析袋置于pH 7.4的缓冲溶液中，加入搅拌装置持续搅拌，每2h换液一次，至透析液中没有游离的BDDE时，停止搅拌。将透析袋中的溶液倒出，搅拌均匀，得交联胶原蛋白。
再用纯化水配制质量浓度20％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，与交联胶原蛋混合(按照质量浓度30％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液与质量浓度20％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，两者中的重组Ⅰ型类人胶原蛋白的质量比3:2进行混合)，然后水平喷涂或者涂覆在平板上，厚度1～1.5mm，室温晾2～4h，待厚度下降0.3～0.6mm时，获得支架层；将支架层放置在-20℃冰箱中冷冻，将得到的支架层备用。
(2)粘合层的制备：用纯化水配制质量浓度20％的贻贝粘蛋白溶液，搅拌至其完全溶解，然后将该溶液均匀地涂覆在步骤(1)获得的支架层上，涂覆厚度0.1～0.5mm，室温放置1～2h，将得到双层结构可降解的人工硬脑膜备用。
(3)干燥：步骤(2)得到的双层结构可降解的人工硬脑膜置于冷冻干燥机中，启动设定的程序进行干燥。待完全干燥后，进行裁切、然后装入医用包装袋内，低温环氧乙烷灭菌。
实施例2：
(1)支架层的制备：用纯化水配制质量浓度20％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度0.1％的交联剂BDDE，将交联好的凝胶静置1h，然后装入透析袋中；将透析袋置于pH 7.4的缓冲溶液中，加入搅拌装置持续搅拌，每2h换液一次，至透析液中没有游离的BDDE时，停止搅拌。将透析袋中的溶液倒出，搅拌均匀，得交联胶原蛋白。
再用纯化水配制质量浓度30％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，与交联胶原蛋白混合，然后水平喷涂或者涂覆在平板上，厚度1.0～1.5mm，室温晾2～4h，待厚度下降0.3～0.6mm时，获得支架层；将支架层放置在-20℃冰箱中冷冻，将得到的支架层备用。
(2)粘合层的制备：用纯化水配制质量浓度30％的贻贝粘蛋白溶液，搅拌至其完全溶解，然后将该溶液均匀地涂覆在步骤(1)获得的支架层上，涂覆厚度0.1～0.5mm，室温放置1～2h，将得到双层结构可降解的人工硬脑膜备用。
(3)干燥：步骤(2)得到的双层结构可降解的人工硬脑膜置于冷冻干燥机中，启动设定的程序进行干燥。待完全干燥后，进行裁切、然后装入医用包装袋内，低温环氧乙烷灭菌。
如附图1所示，本发明制备得到的双层结构可降解的人工硬脑膜(实施例2)膜片疏松、柔软、结构均一。
对本发明制备的人工硬脑膜的内层表面和外层表面分别进行真空镀膜喷金处理后，于扫描电子显微镜下观察形态。
如附图2所示，本发明的双层结构可降解的人工硬脑膜(实施例2)的扫描电子显镜图，可以看出，本发明的双层结构可降解的人工硬脑膜的粘合层蓬松，结构中存在不规则的网孔，它可以吸附渗血和体液形成凝胶，具有良好的粘附性，达到快速封闭创面；本发明的双层结构可降解的人工硬脑膜的支架层结构致密，网孔较小且均一，可以持久封闭创面，还可以促进纤维细胞的长入，有助于促进新生组织的形成。
实施例3：
(1)支架层的制备：用纯化水配制质量浓度40％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度0.1％的交联剂BDDE，将交联好的凝胶静置1h，然后装入透析袋中；将透析袋置于pH 7.4的缓冲溶液中，加入搅拌装置持续搅拌，每2h换液一次，至透析液中没有游离的BDDE时，停止搅拌。将透析袋中的溶液倒出，搅拌均匀，得交联胶原蛋白。
再用纯化水配制质量浓度20％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，与交联胶原蛋白混合，然后水平喷涂或者涂覆在平板上，厚度1～1.5mm，室温晾2～4h，待厚度下降0.3～0.6mm时，获得支架层；将支架层放置在-20℃冰箱中冷冻，将得到支架层备用。
(2)粘合层的制备：用纯化水配制质量浓度40％的贻贝粘蛋白溶液，搅拌至其完全溶解，然后将该溶液均匀地涂覆在步骤(1)获得的支架层上，涂覆厚度0.1～0.5mm，室温放置1～2h，将得到双层结构可降解的人工硬脑膜备用。
(3)干燥：步骤(2)得到的双层结构可降解的人工硬脑膜置于冷冻干燥机中，启动设定的程序进行干燥。待完全干燥后，进行裁切、然后装入医用包装袋内，低温环氧乙烷灭菌。
实施例4
(1)支架层的制备：用纯化水配制质量浓度20％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度0.1％的交联剂BDDE，将交联好的凝胶静置1h，然后装入透析袋中；将透析袋置于pH 7.4的缓冲溶液中，加入搅拌装置持续搅拌，每2h换液一次，至透析液中没有游离的BDDE时，停止搅拌。将透析袋中的溶液倒出，搅拌均匀，得交联胶原蛋白。
再用纯化水配制质量浓度40％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，与交联胶原蛋白混合，然后水平喷涂或者涂覆在平板上，厚度1～1.5mm，室温晾2～4h，待厚度下降0.3～0.6mm时，获得支架层；将支架层放置在-20℃冰箱中冷冻，将得到支架层备用。
(2)粘合层的制备：用纯化水配制质量浓度20％的贻贝粘蛋白溶液，搅拌至其完全溶解，然后将该溶液均匀地涂覆在步骤(1)获得的支架层上，涂覆厚度0.1～0.5mm，室温放置1～2h，将得到双层结构可降解的人工硬脑膜备用。
(3)干燥：步骤(2)得到的双层结构可降解的人工硬脑膜置于冷冻干燥机中，启动设定的程序进行干燥。待完全干燥后，进行裁切、然后装入医用包装袋内，低温环氧乙烷灭菌。
实施例5
(1)支架层的制备：用纯化水配制质量浓度30％的重组Ⅲ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度0.1％的交联剂EDC，将交联好的凝胶静置1h，然后装入透析袋中；将透析袋置于pH 7.4的缓冲溶液中，加入搅拌装置持续搅拌，每2h换液一次，至透析液中没有游离的EDC时，停止搅拌。将透析袋中的溶液倒出，搅拌均匀，得交联胶原蛋白。
再用纯化水配制质量浓度20％的重组Ⅲ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，与交联胶原蛋白混合，然后水平喷涂或者涂覆在平板上，厚度1～1.5mm，室温晾2～4h，待厚度下降0.3～0.6mm时，获得支架层；将支架层放置在-20℃冰箱中冷冻，将得到支架层备用。
(2)粘合层的制备：用纯化水配制质量浓度20％的贻贝粘蛋白溶液，搅拌至其完全溶解，然后将该溶液均匀地涂覆在步骤(1)获得的支架层上，涂覆厚度0.1～0.5mm，室温放置1～2h，将得到双层结构可降解的人工硬脑膜备用。
(3)干燥：步骤(2)得到的双层结构可降解的人工硬脑膜置于冷冻干燥机中，启动设定的程序进行干燥。待完全干燥后，进行裁切、然后装入医用包装袋内，低温环氧乙烷灭菌。
对比例1
(1)支架层的制备：用纯化水配制质量浓度20％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度为0.1％的交联剂BDDE，将交联好的凝胶静置1h，然后装入透析袋中；再将透析袋置于pH 7.4的缓冲溶液中，加入搅拌装置，让缓冲液持续搅拌，每2h换一次液，在24h后检测透析液中的游离BDDE，待透析液中没有游离的BDDE时，停止搅拌。将透析袋中的溶液倒出，搅拌均匀，然后水平喷涂或者涂覆在平板上，厚度控制在1.0～1.5mm，其次，室温晾2～4h，待厚度下降0.3～0.6mm时，放置在-20℃冰箱中冷冻，备用。
(2)粘合层的制备：用纯化水配制质量浓度30％的的贻贝粘蛋白溶液，搅拌至其完全溶解，然后将该溶液均匀地涂覆在支架层上，涂覆厚度控制在0.1～0.5mm，室温放置1～2h，备用。
(3)干燥：将步骤(2)得到的人工硬脑膜置于冷冻干燥机中，启动设定的程序进行干燥。待完全干燥后，进行裁切、然后装入医用包装袋内，低温环氧乙烷灭菌。
(与实施例2的不同之处在于，支架层的制备中重组Ⅰ型类人胶原蛋白仅交联一次、没有与不交联的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液混合。)
对比例2：
(1)支架层的制备：用纯化水配制质量浓度为20％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度0.1％的交联剂BDDE，将交联好的凝胶静置1h，然后装入透析袋中；再将透析袋置于pH 7.4的缓冲溶液中，加入搅拌装置，让缓冲液持续搅拌，每2h换一次液，在24h后检测透析液中的游离BDDE，待透析液中没有游离的BDDE时，停止搅拌。将透析袋中的溶液倒出，搅拌均匀，备用。
再用纯化水配制质量浓度为30％的重组Ⅰ型类人胶原蛋白溶液，待其溶解后，与交联后的胶原蛋白混合，然后水平喷涂或者涂覆在平板上，涂覆厚度控制在1.0～1.5mm，其次，室温晾2～4h，待厚度下降0.3～0.6mm时，获得支架层；将支架层放置在-20℃冰箱中冷冻，备用。
(2)粘合层的制备：将聚乙二醇-N-羟基丁二酰亚胺-戊二酸酯(常规粘合剂)均匀地涂覆在支架层上，厚度控制在0.1～0.5mm，室温放置1～2h，备用(常规粘合剂是直接涂覆的)。
(3)干燥：将步骤(2)得到的人工硬脑膜置于冷冻干燥机中，启动设定的程序进行干燥。待完全干燥后，进行裁切、然后装入医用包装袋内，低温环氧乙烷灭菌。
(与实施例2的不同之处在于，粘合层不同；粘合剂选为常规粘合剂——聚乙二醇-N-羟基丁二酰亚胺-戊二酸酯。)
力学性能测试
将本发明制备的人工硬脑膜(实施例2)和市售同类产品胶原蛋白膜(商品名“人工硬脑膜”，国械注准20163462200，天新福(北京)医疗器材股份有限公司)裁剪成1.0×4.0cm的长条状样品，于37℃生理盐水中浸泡1min，以5mm/min的拉伸速率，使用电子万能试验机测量样品的拉伸强度和断裂伸长率。
本发明制备的硬脑膜的力学性能和柔软度测试结果如附图3所示，与天新福产品相比，本发明制备的人工硬脑膜拥有最大的断裂伸长率与柔软度。同时，对比人体硬脑膜的拉伸强度和断裂伸长率可知，本发明制备的人工硬脑膜拥有更大的断裂伸长率，且具有一定的拉伸强度。
细胞毒性测试
将本发明制备的人工硬脑膜(实施例2)裁剪成1.0×1.0cm的正方形，消毒后分别贴于24孔细胞培养板的孔底。将每孔104的HSF细胞接种在材料上，置于37℃、5％CO2、95％湿度培养箱中分别静置培养1d、3d、5d，培养结束后每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，置于培养箱中继续培养4h。其中，阴性对照为MEM培养基，阳性对照为10％DMSO。
取出培养板，2000g离心5min，弃去上清液；每孔加入100μl DMSO终止反应，并溶解赞蓝紫色颗粒，震荡混匀10min。取走培养板底部的人工硬脑膜材料，用酶联免疫检测仪于490nm处检测各孔处的OD值。
计算细胞增殖率，结果如附图4所示。从细胞增殖率的检测结果可知，随着培养时间的延长，本发明制备的人工硬脑膜的各组中细胞均呈现逐渐增殖的趋势，且细胞增殖率达到了95％以上，说明本发明制备的人工硬脑膜没有细胞毒性，即本发明制备的人工硬脑膜具有良好的生物相容性。
细胞粘附测试
将本发明制备的人工硬脑膜(实施例2)裁剪成1.0×1.0cm的正方形，消毒后分别贴于24孔细胞培养板的孔底。
将培养瓶上培养的HSF细胞用0.25％胰酶消化5min，用吸管轻轻吹打成细胞悬液，用血细胞计数板精确计数、调整细胞接种密度为105～106个/ml，吹匀，每孔加入100μl细胞悬液。
置于37℃、5％CO2、95％湿度培养箱中分别静置培养1h、3h、5h、7h后，在每个时间点终止培养，吸弃培养液并用Hank’s液冲洗一遍，以除去未贴附的细胞，然后用180μl0.1％胰蛋白酶溶液将细胞从人工硬脑膜上消化下来，再用20μl血清终止消化，吹匀得到细胞悬液，用血细胞计数板精确计量细胞数，以细胞在细胞培养板上的粘附为对照组。
结果如附图5所示，从附图5中可以看出，HSF细胞分别在人工硬脑膜材料及培养板上的细胞粘附实验数据显示，随着时间的延长，细胞在人工硬脑膜上的粘附数量增加，5h之后在本发明制备的人工硬脑膜材料上的黏附数量，显著高于培养板上(对照组)。说明本发明制备的人工硬脑膜具有良好的细胞粘附性。
溶血测试
以无菌生理盐水为浸提介质，按3cm2/mL的浸提比例，37℃±1℃下浸提72h±2h，制备浸提液。按GB/T 16886.4与血液相互作用试验中规定的溶血试验方法进行测定，以兔血细胞悬液进行溶血试验。样品的浸提液与兔血细胞悬液按照100/2的比例进行混合，37℃孵育1h，然后将血细胞悬液在1000rpm下离心5min，并在545nm处测定上清液的吸光度值，纯化水作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，按照下列公式计算溶血率：
溶血率(％)＝(试样—阴性对照)/(阳性对照—阴性对照)×100％
具体检测结果如下1表所示。
表1本发明制备的人工硬脑膜的溶血率
Figure BDA0003424612050000111
溶血实验结果表明，本发明制备的人工硬脑膜的溶血率不超过5％，因此不会引起溶血；即本发明制备的人工硬脑膜不会引起红细胞破裂、溶解。
体外降解测试
将本发明制备的人工硬脑膜(实施例2)和胶原蛋白膜(天新福)裁剪成3.0×3.0cm的正方形备用。
配制人工脑脊液：依次称取145mM NaCl，2.5mM KCl，10mM HEPES，1mM MgCl2，2mMCaCl2，10mM glucose，0.002mM glycine，调节pH至7.2，配制之后，于37℃保温，备用。
将裁剪好的膜分组浸泡于人工脑脊液中，然后于2d、4d、8d、12d、16d、20d取样。
将浸泡完成后的膜取出，用蒸馏水冲洗，用滤纸吸干其表面上的液体，然后再置于真空干燥箱内12h，取出精确称量后计算失重率。结果如附图6所示，从结果可以看出，本发明制备的人工硬脑膜的降解速率与同类产品天新福相比，无显著差异；且本发明制备的人工硬脑膜的失重率随天数的增加而增大，在20d时达到40％，即本发明制备的人工硬脑膜可降解。
止血效果测试
取健康成年的新西兰兔4只，雌雄不限，重量为2.1～2.6kg。
将动物背部剪毛后，对实验兔施行麻醉，置于专用手术台上，腹卧位，以碘酒、酒精消毒，铺无菌巾。沿脊柱两侧对称性各剪开5个圆形切口，直径约为1.0cm，深度全层皮肤去除后，仔细避开皮下组织层较大的血管，分离至筋膜层。制造以渗血为主的伤口。
脊柱两侧分别敷本发明制备的人工硬脑膜(实施例2)和医用灭菌纱布止血，记录止血时间，观察与创面的粘合情况。2min后，对伤口停止止血，揭下敷料，放入预先配制好的氰化高铁血红蛋白试剂5ml中仔细清洗，以紫外分光光度计560nm波长光度比色，其中A值的高低代表出血量的多少。
实验数据均采用t检验进行分析，结构均以±标准差标示，P＜0.05为有统计学意义。本发明制备的人工硬脑膜组与医用灭菌纱布对照组的止血效果分析如下表2。
表2本发明制备的人工硬脑膜组与医用灭菌纱布对照组的止血效果分析
例数 出血时间(s) 吸收出血量(A)
医用灭菌纱布 20 54±3 0.64±0.32
实施例2 20 66±5 1.21±0.51
P / ＜0.01 ＜0.01
比较本发明制备的硬脑膜与医用灭菌纱布对照组的止血时间和出血量的吸光度值可知，两组之间的止血时间和吸收出血量均有显著性差异，虽然本发明制备的人工硬脑膜止血时间要比医用灭菌纱布慢10s，但是本发明制备的人工硬脑膜可吸收的出血量较医用灭菌纱布大，由此可以认为，本发明制备的人工硬脑膜也具有明显的止血作用。同时，本发明制备的人工硬脑膜与创面黏附性良好，具有优异的吸水溶胀性能，因此，在临床上可以用本发明制备的人工硬脑膜对渗血创面进行止血，可以有效的封闭出血创面。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims (10)

1.一种双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)支架层的制备：取纯化水溶解的重组类人胶原蛋白溶液A，加入交联剂进行搅拌交联，然后透析去除多余的交联剂，得到交联后的重组类人胶原蛋白A1；
另取纯化水溶解的重组类人胶原蛋白溶液B，与交联后的重组类人胶原蛋白A1混合、均质，再涂覆、成膜、干燥，得到重组类人胶原蛋白支架层；
(2)粘合层的制备：将纯化水溶解的贻贝粘蛋白溶液均匀涂覆到重组类人胶原蛋白支架层上，经干燥后得到双层结构可降解的人工硬脑膜。
2.根据权利要求1所述的双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的重组类人胶原蛋白选自重组Ⅰ型类人胶原蛋白或者重组Ⅲ型类人胶原蛋白中的一种。
3.根据权利要求1所述的双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述重组类人胶原蛋白溶液A和重组类人胶原蛋白溶液B的质量浓度为0.5％～50％；重组类人胶原蛋白溶液A与重组类人胶原蛋白溶液B，两者中的重组类人胶原蛋白的质量比为1：0.5～1：3。
4.根据权利要求1所述的双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的交联剂选自EDC、BDDE、PEGDE、PEG中的至少一种；所述交联剂在重组类人胶原蛋白溶液A的质量浓度为0.01％～0.5％。
5.根据权利要求1所述的双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的透析条件：透析液为pH6～8的缓冲溶液，每1～2h换液一次，持续时间24～72h。
6.根据权利要求1所述的双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述涂覆的厚度为1.0～1.5mm。
7.根据权利要求1所述的双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述贻贝粘蛋白溶液的质量浓度为0.1％～50％。
8.根据权利要求1所述的双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述贻贝粘蛋白溶液涂覆的厚度为0.1～0.5mm。
9.根据权利要求1所述的双层结构可降解的人工硬脑膜的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的干燥为冷冻干燥，冷冻干燥条件：温度-40℃～25℃，时间12～48h。
10.一种双层结构可降解的人工硬脑膜，其特征在于，所述人工硬脑膜采用权利要求1-9任意一项所述的制备方法制备得到；所述人工硬脑膜包括支架层和粘合层，厚度为0.5～1.0mm，所述支架层为重组类人胶原蛋白，粘合层为贻贝粘蛋白。
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