CN111388742A - 一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料及其制备方法，属于医用生物材料技术领域。所述方法的步骤包括：制备可溶性胶原、制备不溶性胶原纤维、制备胶原混合液、制备胶原‑抗生素复合敷料、等步骤。本发明提供的胶原敷料，(1)具有良好的机械强度和抗降解性能，能暂时替代受损组织起一定的支撑作用；(2)能够快速吸收自身重量40倍左右的伤口渗出液，并紧贴伤口床，为创面愈合提供良好的湿性环境，(3)能够缓控释放抗生素，起到持续抗菌消炎的作用；(4)可通过不同冻干模具的选择，制备不同形状的敷料，用于普外科、骨科、口腔科等各种科室。

Description

一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料及其制备方法，属于医用生物材料技术领域。
背景技术
胶原类敷料是创伤治疗产品市场上相对较新的敷料，作为细胞外基质的最主要成分，胶原具有生物相容性、可降解性、促细胞生长、交联度可控等优异的性能，在烧创伤和组织修复领域中均展现了很大的优势，具有巨大的应用价值。国内外大量的实验和临床研究均表明，胶原对皮肤创伤修复具有较强的促进作用。
胶原敷料开放性的孔结构可以快速吸收伤口渗出液，结合抑制伤口愈合的蛋白酶和细胞因子，保护促进伤口愈合的生长因子，刺激成纤维细胞迁移，加快肉芽组织的形成，促进表皮细胞再生。同时，胶原是一种强烈的血小板聚集激动剂，与创面接触后，血小板表面的胶原受体通过识别胶原三螺旋结构中的特异的氨基酸序列，粘附到胶原敷料上，从而活化血小板，形成血栓，促进创面止血。
复合抗生素的胶原敷料，具有缓控释放抗生素的作用，能够迅速止血并稳定持续释放抗生素，发挥抗菌止血的作用，尤其针对感染的慢性创面。
目前临床上应用的胶原敷料存在吸液性差，机械强度低，降解速度快等缺点，往往需要通过化学交联才能提高材料的机械强度和抗降解性能，这就避免不了化学交联剂残留引起的细胞毒性风险，如公开号为CN108721690A和CN108744014A的专利申请中分别提供了一种药物缓释型抗菌敷料，但它们使用的都是化学交联，存在细胞毒性的风险，且需要经过两次冷冻干燥，成本相对较高。此外，目前国内很少有复合抗生素的胶原敷料，材料不能应用于感染的创面，需要彻底清创以后才能使用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料及其制备方法。该胶原敷料，具有良好的吸液性，较高的机械强度，合适的降解周期，能够快速止血并持续抗菌，促进创面修复愈合。该胶原敷料可应用于各种急慢性创伤的治疗，尤其针对愈合速度慢、组织再生困难、血管化程度低的慢性创面，感染创面亦可使用。
本发明的技术方案如下：
一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备方法，所述方法的步骤如下：
(1)制备具有低免疫原性、高纯度生物活性的可溶性胶原，制备不溶性胶原纤维；
(2)将由步骤(1)制得的可溶性胶原、不溶性胶原纤维和纯化水，按照比例混合，制成胶原混合液；
(3)将步骤(2)制得的胶原混合液与抗生素混合均匀后，调节pH，离心，去除气泡，然后灌注到模具中，冷冻干燥，得到胶原-抗生素复合敷料；
(4)将步骤(3)制得的胶原-抗生素复合敷料进行热交联，得到具有多孔网络结构的胶原-抗生素复合敷料，即得所述能够缓控释放抗生素的胶原敷料。
步骤(1)中，所述可溶性胶原的制备方法为：
①取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破碎成小颗粒状，按照固液比1:30～1:40的比例，加入0.01～0.03mol/L的氢氧化钠水溶液，于6～8℃浸泡1～2小时；所述猪皮替换为牛皮或牛跟腱。
②在上述氢氧化钠水溶液处理的猪皮中，按照固液比1:20～1:40的比例，加入0.05％～0.2％的冰醋酸水溶液，于常温下清洗中和4～7次，沥干水分后，制得清洗中和后的絮状物备用；
③将上述清洗中和后的絮状物，浸入0.5～0.8mol/L冰醋酸和500～800mg/L胃蛋白酶的混合液中，调节pH至2～3，持续搅拌酶解36～60小时；
④将酶解充分后的胶原液，加入20％～30％的NaCl水溶液，使NaCl的终浓度为0.5％～1％，缓慢搅拌24～48小时，离心，沉淀物加入0.5～0.8moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液，再次加入20％～30％的NaCl水溶液，使NaCl的终浓度为0.5％～1％，缓慢搅拌24～48小时，离心，沉淀物加入0.5～0.8moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液；
⑤将步骤④得到的上清液，先以0.6～0.7moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析5～7次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液体；
⑥将上述胶原液冷冻干燥，得到具有三螺旋结构活性的胶原，即可溶性胶原。所述可溶性胶原的分子量为280～300kDa。
步骤(2)中，所述不溶性胶原纤维的制备方法包括以下步骤：
①预处理：将牛腱切片、清洗、粉碎、脱脂、消毒后备用；所述牛腱还可以替换为猪皮或牛皮。
②碱浸泡：将预处理完的牛腱片与0.5％～2.0％NaOH水溶液，按质量比为1：5～1：10混合，混合均匀后，10℃以下，浸泡4～7天；进一步优选1.0％NaOH水溶液，浸泡5天；
③清洗：浸泡结束用0.05％～0.15％冰醋酸水溶液，清洗至白色絮状物析出；进一步优选 0.1％醋酸水溶液；
④酸处理：将白色絮状物用3％～6％盐酸溶液处理，絮状物和盐酸溶液按质量体积比1：2～1：5浸泡，处理时间12～24h，缓慢搅拌；进一步优选4％盐酸溶液，处理时间18～20h；
⑤再清洗：酸处理结束后用纯化水清洗，清洗至絮状物重量为牛腱片的2～5倍；进一步优选清洗至絮状物重量为牛腱片的2～3倍；
⑥粉碎：将絮状物用粉碎机粉碎成均匀的白色丝状短纤维，即得不溶性胶原纤维。
步骤(2)中，所述可溶性胶原与不溶性胶原纤维的干物质量比为1：1～1：4，优选质量比为1：2；胶原混合液的质量浓度为0.05％～2.5％。
步骤(3)中，所述抗生素包括硫酸庆大霉素、罗红霉素、头孢菌素类、青霉素中的一种或多种；抗生素与混合胶原干物质的质量比为1：1～1：5，优选质量比为1：3～1：4。
步骤(3)中，将复合液pH调至3.5～6.0，优选4～5。
步骤(4)中，所述热交联的交联温度为100～130℃，交联时间为40～60h；优选地，交联温度为110～120℃，交联时间为46～50h。
所述能够缓控释放抗生素的胶原敷料制成的形状包括片状、块状、圆台形或圆柱形，可用于普外科、骨科、口腔科等各种科室。
在本发明的一种实施方式中，所述不溶性胶原纤维在pH＜5的酸溶液中为胶原悬浮液，离心时会沉淀，在光学显微镜下可见丝状纤维(纤维厚度0.3μm以上)。
在本发明的一种实施方式中，所述不溶性胶原纤维的酰胺氮含量为0.1～0.5mmol/g。
优选地，所述不溶性胶原纤维的酰胺氮含量为0.3～0.4mmol/g。
在本发明的一种实施方式中，所述不溶性胶原纤维的干物质量为8％～15％。
优选地，所述不溶性胶原纤维的干物质量为10％～12％。
本发明提供的能够缓控释放抗生素的胶原敷料，其有益的技术效果在于：
本发明胶原敷料具有抗菌止血的作用；能够快速吸收自身重量40倍的伤口渗出液，并紧贴伤口床，为创面愈合提供良好的湿性环境(原因：冻干的海绵呈现多孔的、有序排列的、互穿的三维网络结构，多孔结构主要通过纤维丝之间的相互连接形成，增加海绵的孔隙率和通透性，从而提高海绵的吸液性及贴附性)；
本发明胶原敷料能缓控释放抗生素，起到持续抗菌的作用；且具有良好的生物相容性，在创面最终降解产物为机体修复细胞所必须的氨基酸，能够直接为创面提供营养，促进伤口愈合；胶原抗原性极低，免疫排斥反应小。
本发明胶原敷料具有较高的机械强度和抗降解性能强，且降解周期可通过可溶性胶原和不溶性胶原纤维的混合比例、混合胶原终浓度、交联条件进行调控，能与创面的愈合时间相匹配(原因：引入不溶性胶原纤维，增加海绵的机械强度和抗降解性能，与不溶性胶原纤维相比，可溶性胶原制备得到的材料机械强度(撕裂强度)较低，尤其在湿态下，其抗降解性能也较低。这是因为可溶性胶原是由胶原分子组成，而不溶性胶原是由胶原原纤维组成，胶原原纤维是由已经自然彼此交联的横向排列的胶原分子组成，这些已经自然交联的胶原纤维类似化学交联得到的胶原纤维，具有较高的机械强度(撕裂强度)和抗降解性能。)；
本发明胶原敷料安全性高，制备过程中交联方式采用的是物理交联(热交联)，避免了化学交联剂的残留，材料更加安全；可以弥补因为市场上复合抗生素的胶原敷料多以进口为主，价格昂贵，造成的国产复合抗生素的胶原敷料市场的空白。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
图2为本发明提供的胶原敷料实品照片，其中(a)表示片状；(b)表示圆柱形；(c)表示块状；(d)表示圆台形。
图3为本发明实施例1制得胶原敷料的微观结构，其中(a)表示在实施例1条件下制备得到的胶原敷料的外表面微观结构(×42)；(b)表示在实施例1条件下制备得到的胶原敷料的外表面微观结构(×85)；(c)表示在实施例1条件下制备得到的胶原敷料的内部微观结构(×50)结构；(d)表示在实施例1条件下制备得到的胶原敷料的内部微观结构(×190) 结构。
图4为本发明不同实施例下制备得到的胶原敷料在动物体内的降解情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
本发明实施例所用可溶性胶原为自制的，其制备方法为：
①取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破碎成小颗粒状，按照固液比1:30的比例，加入0.03mol/L的氢氧化钠水溶液，于7℃浸泡2小时；
②在上述氢氧化钠水溶液处理的猪皮中，按照固液比1:30的比例，加入0.1％的冰醋酸水溶液，于常温下清洗中和5次，沥干水分后，制得清洗中和后的絮状物备用；
③将上述清洗中和后的絮状物，浸入0.6mol/L冰醋酸和700mg/L胃蛋白酶的混合液中，调节pH至2，持续搅拌酶解48小时；
④将酶解充分后的胶原液，加入20％的NaCl水溶液，使NaCl的终浓度为0.7％，缓慢搅拌24小时。离心，沉淀物加入0.6moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液，再次加入20％的NaCl 水溶液，使NaCl的终浓度为0.7％，缓慢搅拌24小时。离心，沉淀物加入0.6moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液；
⑤将步骤④得到的上清液，先以0.6moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析6次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液；
⑥将上述胶原液冷冻干燥，得到具有三螺旋结构活性的胶原，即可溶性胶原。
实施例1
一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备方法，所述方法的步骤如下：
不溶性胶原纤维的制备：将牛腱切片、清洗、粉碎、脱脂、消毒。称取100g预处理完成的牛腱片，投入到500mL 1％的NaOH水溶液中，混合均匀后8℃下，浸泡5天。浸泡结束后，用0.1％醋酸水溶液清洗至白色絮状物析出。将白色絮状物，投入到500mL 4％的盐酸溶液中， 10℃下，缓慢搅拌20h。酸处理结束后用纯化水清洗，清洗至絮状物重量为牛腱片的2.5倍，最后将絮状物用粉碎机粉碎成均匀的白色丝状短纤维，测定其干物质含量，测得其干物质含量为12.86％。
能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备：称取62.21g不溶性胶原纤维，4g可溶性胶原，加入1429.62g纯化水，用粉碎机混合均匀；然后加入4.17g硫酸庆大霉素(硫酸庆大霉素预先用少量纯化水溶解)，混合均匀后，用2M NaOH调节混合液的pH为4.5。将混合均匀的料液3600rpm/min离心10min去除气泡，然后定量灌注于模盒中，每片装量为18g。灌注完后，冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵取出放入真空干燥箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，交联温度为120℃，交联时间为48h。交联完成后即得能够缓控释放抗生素的胶原敷料。
实施例2
一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备方法，所述方法的步骤如下：
不溶性胶原纤维的制备：将牛腱切片、清洗、粉碎、脱脂、消毒。称取100g预处理完成的牛腱片，投入到500mL 1.5％的NaOH水溶液中，混合均匀后，9℃下浸泡6天。浸泡结束后，用0.12％醋酸水溶液清洗至白色絮状物析出。将白色絮状物，投入到500mL 5％的盐酸溶液中，10℃下，缓慢搅拌19h。酸处理结束后用纯化水清洗，清洗至絮状物重量为牛腱片的2 倍，最后将絮状物用粉碎机粉碎成均匀的白色丝状短纤维，测定其干物质含量，测得其干物质含量为10.85％。
能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备：称取41.47g不溶性胶原纤维，4.5g可溶性胶原，加入1451.03g纯化水，用粉碎机混合均匀；然后加入3g硫酸庆大霉素(硫酸庆大霉素预先用少量纯化水溶解)，混合均匀后，用2M NaOH调节混合液的pH为5.5。将混合均匀的料液4000rpm离心8min去除气泡，然后定量灌注于模盒中，每片装量为18g。灌注完后，冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵取出放入真空干燥箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，交联温度为110℃，交联时间为56h。交联完成后即得能够缓控释放抗生素的胶原敷料。
实施例3
一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备方法，所述方法的步骤如下：
不溶性胶原纤维的制备：将牛腱切片、清洗、粉碎、脱脂、消毒。称取100g预处理完成的牛腱片，投入到500mL 2％的NaOH水溶液中，混合均匀后，10℃下浸泡5天。浸泡结束后，用0.15％醋酸水溶液清洗至白色絮状物析出。将白色絮状物，投入到500mL4％的盐酸溶液中，10℃下，缓慢搅拌20h。酸处理结束后用纯化水清洗，清洗至絮状物重量为牛腱片的3倍，最后将絮状物用粉碎机粉碎成均匀的白色丝状短纤维，测定其干物质含量，测得其干物质含量为13.12％。
能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备：称取102.90g不溶性胶原纤维，4.5g可溶性胶原，加入1388.1g纯化水，用粉碎机混合均匀；然后4.5g硫酸庆大霉素(硫酸庆大霉素预先用少量纯化水溶解)，混合均匀后，用2M NaOH调节混合液的pH为4.0。将混合均匀的料液5000rpm离心8min去除气泡，然后定量灌注于模盒中，每片装量为18g。灌注完后，冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵取出放入真空干燥箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h 以上，交联温度为115℃，交联时间为60h。交联完成后即得能够缓控释放抗生素的胶原敷料。
实施例4
一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备方法，所述方法的步骤如下：
不溶性胶原纤维的制备：将牛腱切片、清洗、粉碎、脱脂、消毒。称取100g预处理完成的牛腱片，投入到500mL 1％的NaOH水溶液中，混合均匀后，6℃下浸泡5天。浸泡结束后，用0.1％醋酸水溶液清洗至白色絮状物析出。将白色絮状物，投入到500mL 4％的盐酸溶液中， 10℃下，缓慢搅拌20h。酸处理结束后用纯化水清洗，清洗至絮状物重量为牛腱片的2.5倍，最后将絮状物用粉碎机粉碎成均匀的白色丝状短纤维，测定其干物质含量，测得其干物质含量为11.85％。
能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备：称取151.89g不溶性胶原纤维，4.5g可溶性胶原，加入1332.36g纯化水，用粉碎机混合均匀；然后11.25g硫酸庆大霉素(硫酸庆大霉素预先用少量纯化水溶解)，混合均匀后，用2M NaOH调节混合液的pH为5.0。将混合均匀的料液3000rpm离心12min去除气泡，然后定量灌注于模盒中，每片装量为18g。灌注完后，冷冻干燥。将冷冻干燥后的海绵取出放入真空干燥箱内，对箱内抽真空至-90Kpa以上，并保持1h以上，交联温度为130℃，交联时间为50h。交联完成后即得能够缓控释放抗生素的胶原敷料。
测试例1
方法：取实施例1和实施例2制备得到的胶原敷料，各取3片，分装入麻制纤维袋中，以避免在以后的操作中散开，分别放入20mL 0.1M PBS溶液中，在37℃孵育。每天更换PBS洗脱液并轻轻挤出敷料中残存液体，将0、24、48、72、96、120、144、168h的洗脱液保留，检测抗生素的释放量。检测结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002467535840000071
实施例1条件下制备得到的胶原敷料中抗生素的总含量为50mg/片，若完全溶于20mL 水中则缓释部分质量浓度为2500u·mL-1，实施例2条件下制备得到的胶原敷料中抗生素的总含量为36mg/片，若完全溶于20mL水中则缓释部分质量浓度为1800u·mL-1，在表2中，庆大霉素非缓释部分被认为在0h时已全部溶解。从表中的数据可以表明，本发明实施例1和实施例2制备得到的胶原敷料24h的释放率为分别为30.7％和31.6％，72h累计释放率为62.9％和63.1％，到168h的时候几乎完全释放，累计释放率达到98.7％和99.6％。说明本发明制备的胶原敷料具有良好的缓控释放抗生素的作用。
测试例2
液体吸收性：
方法：取质量约为20mg的试样，精密称量，记为m1浸入盛有20℃±1℃水的烧杯中，用手指轻揉直至完全浸湿，且所有空气被除去，注意不使破损，待吸足水分后，用小镊子轻轻夹住一角将其从水中取出，轻持镊子在水面上排水1min后，再次称量，记为m2，按下式计算。共随机抽取试样5份，以平均值计算吸水倍数：
Figure BDA0002467535840000072
式中：A—试样吸水倍数；
m1—试样浸湿前的质量，单位为克(g)；
m2—试样浸湿后的质量，单位为克(g)。各实施例所得产品的测试结果如表2所示。
抗拉性能：
方法：取规定数量样品，分别将各片剪切成10mm宽的条状试样，在试样上做两个间距为100mm的平行标记，并使两间距至两端为等距离。将试样标记以外夹于拉伸试验机的两头中，并以300mm/min的拉伸速度拉伸至断裂。记录拉力值，每个样品平行5个样，取平均值。
拉伸强度计算公式：TS＝Fmax/(L×W)
其中，TS是拉伸强度(MPa)，Fmax是样品断裂时所承受的最大拉力(N)，L是敷料的厚度(mm)，W是敷料的宽度(mm)。各实施例所得产品的测试结果如表2所示。
体外降解时间：
方法：
(1)配制0.1M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)：NaCl 80.06g(1.37M)，KCl 2.01g(27mM)， Na2HPO4·12H2O 35.81g(100mM)，KH2PO4 2.72g(20mM)先加一定量的水使其充分溶解，然后再定容至1L，37℃预热。
(2)胶原水解酶溶液(酶活力≥125U/mL)：准确称取40mg胶原水解酶，溶解在250mL已预热的0.1M PBS溶液中，酶活力为20U/mL，备用。
(3)准确称取约15mg各交联浓度下交联的敷料，浸泡在10mL上述胶原水解酶溶液中，在温度为37℃并轻微振荡的条件下降解，每个样品平行3个样，降解液为澄清透明时即为完全降解时间。各实施例所得产品的测试结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002467535840000081
由表2可知，各实施例制备得到的胶原敷料的液体吸收性、抗拉性能、体外降解时间表明，敷料具有很好的吸液性、高机械强度及很好的抗降解性能，且降解周期可以通过可溶性胶原和不溶性胶原纤维的添加比例、混合胶原的终浓度、交联条件进行调控。
本发明申请改变反应条件等因素，最终所得的能够缓控释放抗生素的胶原敷料整体具有的性能如表3所示。
表3
Figure BDA0002467535840000091
测试例3
实施例1所得胶原敷料微观结构如图3所示。
方法：取冻干的胶原敷料，用刀片裁成大小约5×5mm的块状，粘结在贴有导电胶的样品座上，然后喷金后观察材料微观结构及表面形貌。加速电压为1kV。
从扫描电镜观察敷料微观结构可以看到，敷料的表面呈现多孔的、有序排列的、互穿的三维网络结构，敷料内部也呈现较规则的三维网络结构，多孔结构主要是通过纤维丝之间的相互连接而形成，孔内部可见纤维丝状结构。通过孔径软件统计，敷料表面的孔径大小在 80～150μm之间，内部孔径大小在100～200μm之间。
测试例4
设计依据：按GB/T16886.6、GB/T16886.9标准要求，以大鼠作为动物模型进行动物体植入试验及生物降解试验。
实验动物：按ISO10993.6标准要求，选用清洁级SD大鼠，雌雄不限。所有动物在正式开始实验前，适应性预养一周。
试验分组及试验周期：实施例1、实施例2、实施例3、实施例4条件下制备得到的胶原敷料，共四组，每组30只大鼠，共120只。每组设置试验期为1w、3w、4w、6w、8w(w：周)。
实验步骤：
1.大鼠腹腔麻醉，背部剃毛。
2.沿脊柱两侧旁开1厘米行纵行皮肤全层切口，左侧游离肌肉筋膜深部，右侧游离皮下。
3.左侧于肌肉层(肌肉筋膜深部)植入约直径1.5mm长度5mm大小1块敷料，右侧于皮下植入约直径1.5mm长度5mm大小1块敷料；缝合切口。
4.每周进行照相。
5.每一观察期结束后，每组随机选取6只大鼠，取植入部位周围肌肉组织，福尔马林固定，石蜡包埋，切片、脱水、HE染色，光镜下观察。
结果分析：图4(a)为实施例1条件(可溶性胶原和不溶性胶原纤维的质量比为1：2，混合胶原终浓度为0.08％(m/m)，交联温度为120℃，交联时间为48h)下制备得到的敷料在大鼠皮下植入3周后的组织观察结果，从图中可以看出，肉眼观察还有约20％的材料未降解。该敷料的完全降解周期为4w。图4(b)为实施例2条件(可溶性胶原和不溶性性胶原纤维的质量比为1：1，混合胶原终浓度为0.06％(m/m)，交联温度为110℃，交联时间为 56h)下制备得到的敷料在大鼠皮下植入3周后的组织观察结果，从图中可以看出，材料完全降解，肉眼未见未降解材料。该敷料的完全降解周期为3w。图4(c)为实施例3条件(可溶性胶原和不溶性性胶原纤维的质量比为1：3，混合胶原终浓度为1.2％(m/m)，交联温度为115℃，交联时间为60h)下制备得到的敷料在大鼠皮下植入3周后的组织观察结果，从图中可以看出，肉眼观察还有约50％的材料未降解。该敷料的完全降解周期为6w。图4(d) 为实施例4条件(可溶性胶原和不溶性性胶原纤维的质量比为1：4，混合胶原终浓度为1.5％ (m/m)，交联温度为130℃，交联时间为50h)下制备得到的敷料在大鼠皮下植入3周后的组织观察结果，从图中可以看出，肉眼观察还有约60％的材料未降解。该敷料的完全降解周期为8w。综上所述，不同实施例条件下制备得到的胶原敷料在植入小鼠皮下3w后，有的敷料已经完全降解，有的敷料还没有降解，且呈现不同比例的降解情况。说明敷料具有不同的降解周期，降解周期可以通过可溶性胶原和不溶性胶原纤维的添加比例、混合胶原的终浓度、交联条件进行调控。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种能够缓控释放抗生素的胶原敷料的制备方法，其特征在于，所述方法的步骤如下：
(1)制备具有低免疫原性、高纯度生物活性的可溶性胶原，制备不溶性胶原纤维；
(2)将由步骤(1)制得的可溶性胶原、不溶性胶原纤维和纯化水，按照比例混合，制成胶原混合液；
(3)将步骤(2)制得的胶原混合液与抗生素混合均匀后，调节pH，离心，去除气泡，然后灌注到模具中，冷冻干燥，得到胶原-抗生素复合敷料；
(4)将步骤(3)制得的胶原-抗生素复合敷料进行热交联，得到具有多孔网络结构的胶原-抗生素复合敷料，即得所述能够缓控释放抗生素的胶原敷料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述可溶性胶原的制备方法为：
①取新鲜猪皮，切割清除油脂层和毛皮层，去除杂质，清洗，将猪皮破碎成小颗粒状，按照固液比1:30～1:40的比例，加入0.01～0.03mol/L的氢氧化钠水溶液，于6～8℃浸泡1～2小时；
②在上述氢氧化钠水溶液处理的猪皮中，按照固液比1:20～1:40的比例，加入0.05％～0.2％的冰醋酸水溶液，于常温下清洗中和4～7次，沥干水分后，制得清洗中和后的絮状物备用；
③将上述清洗中和后的絮状物，浸入0.5～0.8mol/L冰醋酸和500～800mg/L胃蛋白酶的混合液中，调节pH至2～3，持续搅拌酶解36～60小时；
④将酶解充分后的胶原液，加入20％～30％的NaCl水溶液，使NaCl的终浓度为0.5％～1％，缓慢搅拌24～48小时，离心，沉淀物加入0.5～0.8moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液，再次加入20％～30％的NaCl水溶液，使NaCl的终浓度为0.5％～1％，缓慢搅拌24～48小时，离心，沉淀物加入0.5～0.8moL/L冰醋酸溶解，离心，取上清液；
⑤将步骤④得到的上清液，先以0.6～0.7moL/L的冰醋酸为透析外液透析2次，每次4小时，再以蒸馏水为透析外液透析5～7次，每次4小时，至外液检测不到氯离子，得到胶原液；
⑥将上述胶原液冷冻干燥，得到具有三螺旋结构活性的胶原，即可溶性胶原。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述猪皮替换为牛皮或牛跟腱。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性胶原的分子量为280～300kDa。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述不溶性胶原纤维的制备方法包括以下步骤：
①预处理：将牛腱切片、清洗、粉碎、脱脂、消毒后备用；
②碱浸泡：将预处理完的牛腱片与0.5％～2.0％NaOH水溶液，按质量比为1：5～1：10混合，混合均匀后，10℃以下，浸泡4～7天；
③清洗：浸泡结束，用0.05％～0.15％冰醋酸溶液，清洗至白色絮状物析出；
④酸处理：将白色絮状物用3％～6％盐酸溶液处理，絮状物和盐酸溶液按质量体积比1：2～1：5浸泡，处理时间12～24h，缓慢搅拌；
⑤再清洗：酸处理结束后用纯化水清洗，清洗至絮状物重量为牛腱片的2～5倍；
⑥粉碎：将絮状物用粉碎机粉碎成均匀的白色丝状短纤维，即得不溶性胶原纤维。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述牛腱替换为猪皮或牛皮。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述可溶性胶原与不溶性胶原纤维的干物质量比为1：1～1：4；胶原混合液的质量浓度为0.05％～2.5％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述抗生素包括硫酸庆大霉素、罗红霉素、头孢菌素类、青霉素中的一种或多种；抗生素与混合胶原干物质的质量比为1：1～1：5；将复合液pH调至3.5～6.0。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述热交联的交联温度为100～130℃，交联时间为40～60h。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述能够缓控释放抗生素的胶原敷料制成的形状包括片状、块状、圆台形或圆柱形。
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