ITMI20001794A1

ITMI20001794A1 - Membrane di collagene a due facce di cui una organizzata a livello macromolecolare.

Info

Publication number: ITMI20001794A1
Application number: IT2000MI001794A
Authority: IT
Inventors: Bruna Parma
Original assignee: Mediolanum Farmaceutici Srl; Opocrin Spa
Priority date: 2000-08-02
Filing date: 2000-08-02
Publication date: 2002-02-02
Also published as: DK1307247T3; DE60106056D1; ES2228942T3; WO2002009790A1; AU2001285858A1; EP1307247B1; PT1307247E; ITMI20001794A0; IT1318663B1; EP1307247A1; ATE277648T1; DE60106056T2; CA2418052A1; US20040013712A1; WO2002009790A8

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

“Membrane di collagene a due facce di cui una organizzata a livello macromolecolare'’

CAMPO DELL’INVENZIONE

Il campo tecnico della presente invenzione è quello della preparazione di supporti biocompatibili per ricostruzione tissutale, in particolare costituiti da membrane di collagene.

TECNICA ANTERIORE

Il collagene è una scleroproteina variamente presente nei tessuti e organi animali. Nell'uomo è una proteina strutturale molto rappresentata che costituisce circa il 30% delle proteine totali.

Esistono vari tipi di collagene che si distinguono prevalentemente in rapporto alla funzione del tessuto o organo di provenienza. Per tutti i tipi di collagene è disponibile ampia letteratura relativa a struttura primaria, secondaria, composizione, purezza, impieghi (Marcel E. Nimni Collagen Biochemistry, Biochemistry and Biomechanics, Biotechnology, CRC Press Ine. Boca Raton Florida 1988; Cunningham and Frederiksen Methods in Enzymology, Academic Press, New York , 1-554,1982).

E' noto che le proprietà del collagene dipendono non solo dalla struttura dei monomeri proteici costituenti la triplice elica della fibra, ma, soprattutto, dalla complessa organizzazione macromolecolare che contraddistingue questa ed altre proteine strutturali con funzioni meccaniche (ad es. miosina e tropomiosina nelle fibre muscolari, etc.) e che prevede una organizzazione in fibrille, il loro superawolgimento, la loro organizzazione in monomeri testa-coda e così via.

L’organizzazione macromolecolare delle strutture di collagene native, viene in parte persa con i procedimenti di estrazione del collagene. Essa può essere in parte ristorata artificialmente, ad esempio mediante cross-linking chimico. Questo trattamento ristora, anche se solo parzialmente, la resistenza meccanica delle fibrille di collagene e rende il prodotto finale più resistente anche alla digestione proteolitica.

Sono stati finora introdotti nella pratica medica molti preparati a base di collagene da solo o con altri componenti naturali, sia in forma di gel che di feltri, membrane o cerotti, come agenti stimolanti per la cicatrizzazione di ferite, o come veicoli o dispositivi a lenta cessione di altri farmaci o come matrici adatte alla interazione con cellule.

E' nota infatti l'importanza del collagene come substrato adatto a favorire l'interazione e la crescita cellulare. E' nota anche la preferenza di linee cellulari di origine diversa per i vari tipi di collagene: ad esempio fibroblasti della cute e cellule epiteliali endoteliali (Murray J.C. et al. Cancer Res. 40,347, 1980; Wicha M.S. et al. Exp. Celi Res. 124.81.

1979) crescono meglio su collagene di tipo IV (collagene presente nella membrana basale) mentre i condrociti preferiscono il collagene tipo II (presente nella cartilagine ialina) (Hewit A.T. et al. Proc. Nati. Acad. Sci.

USA 77,385, 1980) e si adatano anche alla crescita su collagene I e III. In questo tipo di applicazione è risultata altresì importante la presenza di fibronectina, prodotta endogenamente dalle cellule (Grinnel F. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75,4408(1978), per l’adesione di fibroblasti sul substrato di collagene (Pearlstein E., Int. J. Cancer 22,32, 1978) e di condronectina per l'interazione dei condrociti con il collagene, (Hewit et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77.385. 1980).

Numerose sono le applicazioni dei collagene ed i suoi metodi di estrazione e preparazione.

Il brevetto US 5,785,983 rivendica un processo di preparazione di membrane di collagene tipo I, chimicamente immodificato, otenuto da gel di collagene distribuito in vassoi di teflon antiaderenti, per essiccamento lento in opportune condizioni di temperatura, vuoto e flussi di azoto. Le membrane così ottenute vengono proposte nella cicatrizzazione di ferite e bruciature e come barriere di interposizione per prevenire aderenze dopo operazioni di chirurgia interna. La preparazione di gel di collagene da tendine bovino è anche descrita in WO98/44809.

Esistono molti breveti su feltri o membrane di collagene otenuti per congelamento e rapida liofilizzazione di soluzioni di collagene in forma di gel. La struttura di tali feltri non è organizzata in quanto tali procedimenti fissano come in una fotografia istantanea il disordine delle fibre di collagene in soluzione. La resistenza di queste membrane è limitata in quanto il collagene, denaturato nel processo di estrazione, non si è riorganizzato sufficientemente.

Il breveto W095/18638 rivendica membrane di collagene riassorbibili, come guida nella riparazione dei tessuti e caratterizzate da due opposte facce di cui una fibrosa adata alla crescita di cellule ed una liscia adatta ad inibire le aderenze. Tali membrane sono ottenute da membrane peritoneali o placentari di vari mammiferi, tra cui il vitello, e vengono preparate mediante un grossolano processo di pulizia, disidratazione e sgrassaggio con acetone e N-esano. Grazie al metodo di preparazione utilizzato, le membrane hanno le dimensioni dell’organo da cui provengono e anche le caratteristiche peculiari, quali la porosità ed il tipo di collagene di cui sono costituite, rispecchiano quelle del tessuto di partenza.

Il brevetto WO 96/25961 rivendica matrici riassorbibili di collagene di tipo Il (da cartilagine) adate per le ricostruzioni di tessuti cartilaginei naturali. Tali matrici sono preparate mediante congelamento e/o liofilizzazione e possono essere integrate con glicosaminoglicani.

Il brevetto WO 99/19005 rivendica una membrana multistrato comprendente una matrice prevalentemente di collagene II costituita da una faccia spugnosa e da una faccia relativamente impermeabile. Tale membrana è preparata mediante stratificazioni successive di matrici di collagene (previamente sgrassato con acetone), e su tali membrane vengono poi liofilizzate in successive e discontinue operazioni, porzioni di gel di collagene.

Finora, i procedimenti di preparazione delle membrane di collagene prevedono l’estrazione del collagene in forma semi-purificata solida o in forma di gel che viene rapidamente congelato ed essiccato. In genere, il collagene viene successivamente modificato chimicamente mediante cross-linking, che avviene in modo casuale senza riorganizzazione macromolecolare tipica della fibrilla nativa, per aumentare la resistenza meccanica della membrana. In alternativa le membrane possono essere preparate mediante lenta evaporazione di un gel di collagene, oppure sono preparate direttamente da membrane di collagene preesistenti in natura e solo parzialmente purificate.

Rimane un problema tecnico ancora irrisolto quello di produrre membrane di collagene in cui il collagene sia organizzato a livello macromolecolare in modo quanto più simile alla forma naturale, che siano dotate di resistenza ed elasticità meccanica, pur essendo plasmabili secondo le esigenze del sito di ricostruzione.

SOMMARIO

La presente invenzione riguarda membrane di collagene a due facce aventi un lato poroso adatto all'adesione e/o alla crescita di cellule ed un lato liscio, caratterizzate dal fatto che sul lato liscio il collagene è organizzato a livello macromolecolare in modo simile a quello nativo. Il collagene costituente tali membrane è di tipo I, Il , III o IV. Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un procedimento per la preparazione di membrane di collagene caratterizzato dal fatto che un gel di collagene viene colato e fatto essiccare molto lentamente su piastre o vassoi su cui è stata indotta una carica elettrostatica, e l'uso delle membrane di collagene come supporti per l’adesione e/o la crescita in vitro ed in vivo di cellule di mammifero, in particolare nelle applicazioni di ricostruzione tissutale (ad esempio di tessuto epiteliale, osseo o connettivo) guidata da matrice.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1. Lato liscio delle membrane visto al Microscopio Elettronico a Scansione (SEM).

Il campione è stato trattato come segue: da ogni campione si sono ritagliate 2 piccole porzioni di materiale (circa 5 x 3 mm). Queste sono state poste su un apposito supporto metallico (stub) esponendo per ogni campione (A, B ed E) la parte lucida. I campioni sono stati rivestiti di un film di oro palladio per renderne conduttiva la superficie e permetterne l'osservazione al SEM.

L'analisi SEM della superficie lucida dei campioni ha evidenziato la presenza di fibre organizzate a livello macromolecolare nella parte liscia. Figura 2: Lato poroso delle membrane visto al Microscopio Elettronico a Scansione (SEM).

Il campione è stato trattato come segue: da ogni campione si sono ritagliate 2 piccole porzioni di materiale (circa 5 x 3 mm). Queste sono state poste su un apposito supporto metallico (stub) esponendo per ogni campione (A, B ed E) la parte opaca (marcata con una leggera incisione sul supporto). I campioni sono stati rivestiti di un film di oro palladio per renderne conduttiva la superficie e permetterne l'osservazione al SEM. L'analisi SEM delia superficie opaca dei campioni ha evidenziato la presenza di irregolarità superficiali, rilievi e "bolle" che conferiscono una certa porosità alla membrana.

Figura 3: Resistenza delle membrane alla digestione con collagenasi. Membrane prodotte secondo la presente invenzione (P323 e P50027) e membrane commercialmente disponibili (ChondroGide, Antema F e Antema S) sono state sottoposte a digestione enzimatica con collagenasi. Dopo 24 ore è stato misurato il contenuto di idrossiprolina libera, indice di digestione enzimatica, nei campioni: le membrane secondo la presente invenzione risultano essere più resistenti nel breve termine.

Figura 4: Curva di resistenza delle membrane secondo la presente invenzione. Campioncini di forma ad osso di cane (lunghezza massima 76.7 mm e parte più sottile larga 4 mm e lunga 22 mm) sono stati ritagliati dalle membrane prodotte e sottoposte a prove di trazione, secondo procedure convenzionali, con apparecchio Chantillon mod HTC (USA). I valori medi di resistenza misurati in Kg di carico di rottura per 3 famiglie di campioni (3-6 campioni per ogni famiglia) di spessore diverso, sono stati messi in grafico. La relazione tra spessore medio (x) e carico di rottura medio (y) delle membrane è descritta dall’equazione logaritmica: y = 11.42 7.08 log x , con un indice di correlazione R2 = 0.999.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE

Formano oggetto della presente invenzione membrane di collagene a due facce aventi un lato liscio ed uno poroso adatto alla crescita di cellule di mammifero, caratterizzate dal fatto che sul lato liscio il collagene è organizzato a livello macromolecolare e le fibrille sono orientate nello spazio bidimensionale. Le membrane della presente invenzione sono dotate di una elevata resistenza meccanica e sono inoltre lentamente riassorbibili, risultando pertanto utili nelle applicazioni di ricostruzione tissutale in vivo. In un suo ulteriore aspetto l'invenzione riguarda infatti l'utilizzo delle membrane di collagene per la ricostruzione tissutale: esse sono infatti biocompatibili e vengono colonizzate in vitro da cellule di mammifero preferibilmente scelte tra: cellule staminali, fìbroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali, osteociti, condrociti.

Le membrane della presente invenzione sono costituite prevalentemente da collagene di tipo I, II, ili, oppure IV, o ancora da miscele di almeno due dei diversi tipi di collagene. Hanno un contenuto di collagene compreso tra 70% e 95% , misurato come residuo secco di collagene e corrispondente ad un contenuto di idrossiprolina totale compreso tra 9% e 13% ed un contenuto di acqua non superiore al 15%. Esse possono contenere altri costituenti, ad esempio sostanze naturali e componenti biologici di specifici distretti o caratteristici di particolari organi o di particolari funzioni, quali ad esempio l’acido ialuronico o glicosamminoglicani in varie percentuali.

Le membrane della presente invenzione non sono immunogeniche, in quanto i telopeptidi che costituiscono la parte terminale della fibrilla di collagene sono stati rimossi mediante digestione enzimatica con proteasi: il collagene costituente tali membrane è quindi definibile anche come atelocollagene (collagene privo dei telopeptidi terminali).

Costituisce un ulteriore aspetto della presente invenzione un procedimento per la preparazione di membrane di collagene, caratterizzato dal fatto che un gel di collagene viene colato in vassoi o piastre caricati elettrostaticamente, secondo metodi noti nello stato dell'arte e viene successivamente essiccato, per un tempo superiore alle 40 ore, o fino ad ottenere membrane con un contenuto di acqua non superiore al 15%. L’essiccamento dei gel di collagene avviene preferibilmente ad una temperatura compresa tra 10 e 40°C, preferibilmente tra 20 e 30°C, ancor più preferibilmente 26°C, in un incubatore aereato privo di turbolenze, quale un incubatore con flusso di aria in entrata diaframmato. Successivamente all’essiccamento le membrane sono sterilizzate mediante trattamento fìsico, ad esempio mediante irraggiamento con raggi γ ad una dose compresa tra 2.5 e 25KGy.

I vassoi sono caricati elettrostaticamente ad esempio mediante strofinamento degli stessi con materiali opportuni, oppure mediante interposizione dei vassoi tra le piastre di un condensatore. L’induzione di carica elettrostatica sui vassoi può essere verificata mediante lonizing Fan (RPO Electronic snc, Milano) operante a primary volt 220, secondary volt 6000 power VA 50 Hz 50/60. I vassoi sono di forma standard oppure di forma e dimensioni atte ad impartire alla membrana la forma adatta al successivo tipo di impiego.

Alternativamente, il gel di collagene può essere colato su vassoi sottoposti ad un campo elettrico orientato in maniera opportuna, eventualmente mantenuto anche durante la fase di essiccamento del gel.

L’induzione di un campo elettrico o di una carica elettrostatica consente, sorprendentemente, ed a differenza dell’arte nota, la riorganizzazione e l'orientamento macromolecolare del collagene in strutture fibrillari simili a quelle del tessuto nativo, che permettono di ottenere membrane dotate della massima resistenza e tenacia.

Il gel utilizzato nel procedimento secondo l’invenzione, è costituito da collagene in concentrazione compresa tra 0.5 e 6% (peso/volume, dove il peso è indicato come residuo secco di collagene), preferibilmente in concentrazione compresa tra 1 e 4%, ancor più preferibilmente tra il 2 e 3%. Al gel possono essere aggiunti opzionalmente varie sostanze naturali e non, oppure componenti biologici di specifici distretti dell’organismo o di particolari tessuti. Un esempio di componenti biologici può essere costituita da polisaccaridi di origine animale, vegetate, oppure da proteine della matrice quali fibronectina, laminina, etc.

In un sua realizzazione preferita, il procedimento per la preparazione del gel di collagene comprende essenzialmente i passaggi di:

a) sminuzzamento meccanico di un tessuto connettivo e sua omogeinizzazione in una sospensione di collagene,

b) trattamento della sospensione di collagene con enzimi proteolitici in soluzione acquosa a pH acido, opzionalmente seguito da filtrazione, c) trattamento alcalino della sospensione fino ad un pH preferibilmente superiore ad 8 e sua neutralizzazione con acidi fino a pH preferibilmente compreso tra 5 e 6,

d) precipitazione del collagene per salatura e ottenimento del gel di collagene mediante risospensione del precipitato ad una concentrazione compresa tra 0.5 e 6% (peso/volume) di residuo secco di collagene, in una soluzione acquosa diluita di un acido debole.

Secondo il procedimento della presente invenzione il tessuto connettivo di partenza è preferibilmente ottenuto da mammiferi. Si utilizza un tessuto cartilagineo quale quello della trachea nel caso in cui si vogliano ottenere membrane costituite prevalentemente da collagene di tipo II, oppure si utilizza un tessuto connettivo che contiene prevalentemente collagene di tipo I, quale il tendine, preferibilmente equino, oppure tessuto connettivo derivato dalla lamina basale, che contiene prevalentemente collagene di tipo IV. Il tipo di utilizzo finale delle membrana determina la scelta del tessuto di partenza più appropriato, anche in considerazione delle quantità necessarie. Altre fonti di collagene possono essere utilizzate in alternativa a tessuto connettivo di mammiferi, ad esempio tessuto cartilagineo o osteo-cartilagineo di pesci. Lo sminuzzamento del tessuto connettivo di partenza (fase (a) del procedimento) è ottenuto mediante trattamento del tessuto, al quale viene aggiunto acqua o una soluzione acquosa, preferibilmente in quantità pari a 6-30 volumi del volume iniziale del tessuto, con agitatore a lame rotanti fino al'ottenimento di una sospensione di collagene. La sospensione di collagene così ottenuta contiene particelle di collagene preferibilmente di dimensioni inferiori a 25-30 mesh. Altri sistemi di sminuzzamento o di omogeinizzazione sono noti al tecnico del ramo e possono essere quindi utilizzati in alternativa. Una ulteriore riduzione delle particelle di collagene, dopo omogeinizzazione, è preferita e viene condotta sottoponendo la sospensione di collagene aH’azione di un micronizzatore, ad esempio il Varying Blender a 15-20.000 giri/min a impulsi.

La sospensione così ottenuta viene trattata (fase b) con enzimi proteolitici, di natura non collagenasica, preferibilmente con pepsina, a pH acido, compreso tra 2 e 3, preferibilmente 2.5. Tale trattamento ha il duplice effetto di degradare eventuali proteine contaminanti e di rimuovere i telopeptidi del collagene, che sono fortemente immunogeni. Il collagene così trattato può essere definito anche come atelocollagene, in quanto privo dei telopeptidi terminali. Preferibilmente il trattamento con pepsina avviene per un tempo compreso tra 10 e 20 ore, ancor più preferibilmente 16 ore ed è accompagnato da agitazione per le prime 2-4 ore.

La sospensione di collagene può essere opzionalmente filtrata, attraverso setacci di porosità compresa tra 20 e 100 mesh, preferibilmente a 25 mesh. La sospensione viene successivamente trattata con alcali secondo la fase (c) preferibilmente con una soluzione concentrata di una base forte, preferibilmente NaOH, fino ad un pH superiore a 8, preferibilmente superiore a 10. Il trattamento alcalino ha il duplice effetto di rimuovere eventuali agenti contaminanti ed in parte, i residui glicosidici.

Il pH della sospensione di collagene è quindi neutralizzato con una soluzione di un acido forte, fino a pH compreso tra 5 e 6, preferibilmente circa pH 5.5. L’alcalinizzazione e la successiva neutralizzazione, (passaggio (c) del procedimento), sono preferibilmente molto graduali per evitare una precipitazione massiva delle fibre di collagene.

Alternativamente, come nel caso in cui non sia necessaria una forte alcalinizzazione del materiale di partenza o in altri casi noti al tecnico del ramo, il pH può essere portato a valori compresi tra 5 e 6 direttamente dopo la digestione enzimatica con una base forte.

A pH compreso tra 5 e 6 il collagene precipita per salatura come una massa biancastra che può essere raccolta e separata, il gel di collagene viene quindi ottenuto risospendendo il precipitato di collagene, ad una concentrazione (indicata come percentuale in peso del residuo secco di collagene), compresa tra 0.3 e 6 %, preferibilmente tra 0.5 e 4%, ancor più preferibilmente 2%, preferibilmente dopo aver allontanato i sali di precipitazione mediante lavaggio con acqua distillata sterile, in una soluzione diluita di un acido debole, preferibilmente acido acetico in concentrazione compresa tra 0.1 e 1 % (p/v), preferibilmente 0.3%. In alternativa all'acido acetico altri acidi deboli, quali ad esempio acido citrico, acido ascorbico o acido tartarico, in concentrazione compresa tra 0.5 e 5%, possono essere utilizzati.

Il gel di collagene, ottenuto come sopra descritto, può essere ulteriormente omogeneizzato allo scopo di facilitare la risospensione del precipitato ed è preferìbilmente sottoposto a degasamento sotto vuoto. Esso viene quindi colato molto lentamente in vassoi caricati elettrostaticamente, come sopra descrìtto, di forma e dimensioni opportune, in quantità corrispondente allo spessore che si intende impartire alla membrana, considerando la perdita in volume legata all’essiccamento. Le membrane così ottenute sono quindi sterilizzate ad esempio mediante metodi fisici, quali l’irradiamento con raggi γ ad una dose compresa tra 2,5 e 25 KGy.

In un suo ulteriore aspetto l'invenzione riguarda membrane di collagene In un suo ulteriore aspetto l’invenzione riguarda membrane di collagene ottenute secondo il procedimento descritto. Il gel di collagene può essere miscelato con sostanze naturali e/o componenti biologici di specifici tessuti o distretti organici (ad es. glicosamminoglicani, acido ialuronico etc.), per ottenere membrane a composizione mista, più vicina possibile alla composizione naturale specifica dei tessuto da riparare. In un suo ulteriore aspetto l’invenzione riguarda l’uso delle membrane di collagene ottenute secondo il procedimento descritto, come supporti per l’adesione, per la colonizzazione o per la crescita di cellule di mammifero di varia origine, ad esempio cellule staminali, fibroblasti, cellule epiteliali o endoteliali, condrociti, osteociti, sia per sistemi in vitro, che per sistemi ex-vivo, quali quelli dove le cellule del paziente sono prelevate e poste in coltura in vitro, dove sono amplificate o fatte semplicemente adsorbire o aderire alla membrana. In un ulteriore applicazione le membrane, colonizzate o meno da cellule autologhe o eterologhe, sono utilizzate per la ricostruzione tessutale guidata da matrice, di tessuti quali il tessuto cartilagineo o osteo-cartilagineo, il tessuto epiteliale o endoteliale o il tessuto connettivale. Ai fini della presente invenzione i termini matrice o supporto sono utilizzati indifferentemente, definendo sia semplicemente una impalcatura fisica che la cellula utilizza sia per aderire o crescere anche tridimensionalmente, che un substrato in grado di interagire con i meccanismi cellulari di adesione, di colonizzazione o di proliferazione. Nel caso in cui le membrane di collagene secondo la presente invenzione sono utilizzate come matrici o supporti per l’adesione, la colonizzazione o la crescita di cellule, la membrana diventa una matrice cellulare, utile per gli scopi di ricostruzione tessutale guidata da matrice.

PARTE SPERIMENTALE

Es. 1 Preparazione di gel di collagene da cartilagine

56 g di collagene, prevalentemente di tipo II, derivato da cartilagine tracheale di bovino è stato previamente sgrassato meccanicamente, congelato a -20°C e frammentato in frammenti da circa 2 - 3 cm di 0. E’ stato quindi posto in 900 mi di acqua distillata e macinato a porzioni in blender modello PBI 16 a 7400 rpm.

Le fibre bianche ottenute sono state poste in 15 litri di acqua demineralizzata, portata a pH 2,51 con HCI 30% e addizionate di 0,588 g di pepsina (700 FIP-U/g - 19917 Merck). La massa è stata mantenuta in agitazione per 2 ore ed il pH è stato mantenuto a 2,5 con HCI.

Dopo riposo di una notte le fibre separate per decantazione sono state omogenizzate nel blender a 6800 rpm, filtrate attraverso setaccio con maglie di dimensioni < 25 mesh ed aggiunte alle acque madri. Una soluzione di NaOH al 15% è stata aggiunta fino a pH 5,5. Il collagene precipitato è stato separato e lavato con 2 volumi di acqua a pH 5,5. Sono stati ottenuti g 107.1 di fibre umide a cui sono stati aggiunti 311.6 mi di acqua distillata e 0,93 g di acido acetico glaciale.

In queste condizioni il collagene assorbe acqua e assume forma di gel. il gel è stato omogenizzato in blender modello PBI 16 a 8400 rpm ed è stato osservato avere un residuo secco pari al 4.51%. 310 mi di acqua furono quindi aggiunti e furono ottenuti mediante omogenizzazione 621 mi di gel avente residuo secco (RS) pari allo 2.03% e corrispondente ad un gel di collagene al 2%.

Es. 2. Preparazione di gel di collagene da tendine di cavallo.

50 g di tendine equino, pari ad un residuo secco del 35.5% furono posti in 900 mi di H2O per 4 h e manipolati per rompere i granuli. Furono quindi trasferiti in 15 L di H2O portata a pH 2,5 con HCI in cui erano stati sciolti g 1.5 di pepsina (Merck 700 U. FlP/g) e la digestione enzimatica fu fatta procedere per circa 20 h a circa 15°C.

I frammenti di tendine più grossi furono eliminati per filtrazione su setacci di 25 mesh. La sospensione fu quindi portata a pH 5,4 con NaOH ed il collagene precipitato raccolto in un tempo di circa 2 h. Il precipitato fu raccolto per decantazione e vennero aggiunti 7,5 L di acqua a pH 6.

Le fibre furono lavate per agitazione, lasciate a riposo per 1h e recuperate di nuovo per decantazione. L'operazione di lavaggio venne ripetuta complessivamente per 3 volte. Furono ottenuti 43 g di fibre umide, dalle quali per aggiunta di g 0,376 di acido acetico glaciale, 82 mi di acqua ed omogenizzazione, furono ottenuti 125 g di gel di collagene avente residuo secco di 2,45%.

Esempio 3. Preparazione di gel di collagene In larga scala.

500 g di tendine equino e 10 L di acqua distillata, furono sottoposti a spappolamento mediante turbotest Rayneri SB dotato dì lame taglienti, ricurve rotanti a 1500 giri/minuto poi con turbotest Rayneri H 002 poi con micronizzatore INOX varying blender alla velocità di 15-20.000 giri/1, a impulsi.

51 è lasciato a riposo fino a rigonfiamento (circa 2 - 4 h). Il tendine micronizzato fu trasferito in reattore INOX da 200 L contenente 140 L di acqua distillata, insieme con 5,88 g di pepsina Merck a 700 U FIP/mg e acido cloridrico q.b. a pH 2,5. Si mantenne l'agitazione per 2 - 4 h e la sospensione fu quindi mantenuta a riposo per una notte a pH 2,5.

La massa di reazione fu filtrata per setacciamento a 25 mesh ed il filtrato portato molto lentamente a pH 5,5 con sodio idrossido commerciale. Le fibre di collagene precipitarono e vennero lavate 3 - 4 volte con acqua distillata a pH 5,5 fino ad una concentrazione di cloruri < 50 ppm.

Le fibre raccolte e pesate furono poi disperse in soluzione acquosa di acido acetico allo 0,3% fino ad una concentrazione di collagene espressa da un residuo secco del 2%. Furono ottenuti kg 12,3 di gel. Esempio 4. Preparazione di membrane da gel di collagene.

Il gel ottenuto secondo gli esempi precedenti è stato stratificato in vassoi previamente caricati con corrente elettrostatica ed essiccato al'aria a 26°C per 56 h. La carica elettrostatica fu verificata mediante mediante lonizing Fan (RPO Electronic snc, Milano) operante a primary volt 220, secondary volt 6000 power VA 50 Hz 50/60.

Sono state ottenute membrane denominate A, B, E, che sono state sterilizzate ai raggi γ (gamma) a 25 KGy. Le membrane così prodotte sono state sottoposte ad analisi morfologica, test di degradabilità da collagenasi, permeabilità al vapore d'acqua secondo norma ASTM-E 96-90, e prove di trazione secondo procedure convenzionali.

Le membrane A, B, E sono risultate avere 3, 6, 9 mg/cm2 di residuo secco.

Analisi morfologica

Una prima caratteristica delle membrane così ottenute è apprezzabile anche ad occhio nudo: infatti, anche ad occhio nudo i fogli mostravano due superfici diverse, un lato opaco ed uno lucido. Questa diversa morfologia superficiale è stata meglio caratterizzata mediante osservazione sia con stereomicroscopio che con il Microscopio Elettronico a Scansione (SEM).

L'analisi è stata fatta su campioni di 2 x 2 cm di lato ritagliati dai fogli originali. I provini sono stati posti tal quali sotto uno stereomicroscopio (Nikon, Giappone).

Per l’analisi SEM il campione è stato trattato come segue: da ogni campione si sono ritagliate 2 piccole porzioni di materiale (circa 5 x 3 mm). Queste sono state poste su un apposito supporto metallico (stub) esponendo per ogni campione (A, B ed E) la parte lucida e quella opaca (marcata con una leggera incisione sul supporto). I campioni sono stati rivestiti di un film di oro palladio per renderne conduttiva la superfìcie e permetterne l'osservazione al SEM.

L'analisi SEM delle superfici dei tre campioni ha evidenziato la presenza di fibre organizzate a livello macromolecolare nella parte lucida (vedi figura 1), mentre nella parte opaca, sono visibili delle irregolarità superficiali, rilievi e ‘‘bolle" che conferiscono una certa porosità alia membrana (vedi figura 2).

Lo spessore dei campioni, misurato con micrometro digitale è riportato nella Tabella 1.

Tabella 1

*σ: (deviazione standard)

Test di dearadabilità in presenza di collaaenasi

Le membrane di collagene P323 e P 50027, preparate come descritto negli esempi precedenti sono state sottoposte a demolizione enzimatica con collagenasi batterica (EC 3.4.24.3 da Clostrìdium Histolyticum I, 310 U/mg Sigma C-0130) 1 μg/ml, per 24 h in tampone a 37°C, in confronto con altre membrane di collagene del commercio variamente "crosslinked" con reattivi chimici. Nel bagno sono state misurate le concentrazioni in μg/ml/24h di idrossiprolina idrolizzata dal collagene. Dalla figura 3 si rileva che i campioni P323 e P50027, ottenuti come descritto negli esempi precedenti, non sono attaccati dall’enzima collagenasi dopo 24 ore, mentre altri prodotti del commercio quali Chondro-gide, Antema, per quanto "cross-linked", cominciano ad essere sensibilmente intaccati già dopo 24 ore.

Permeabilità al vapor d'acqua

Le prove sono state eseguite sui campioni (A, B, E) ottenuti come indicato negli esempi precedenti, secondo la prova cosiddetta "ad acqua", descritta in “Standard test method for water vapor trasmission of materiale", come previsto dalla norma ASTM E 96-90.

I valori di WVT ottenuti nel test secondo la formula:

WVT=(G/t)/A

dove:

A = area della membrana;

G = variazione del peso dell’acqua nella camera di misurazione, (grammi)

t = tempo (ore),

sono riportati insieme con i valori di permeanza, permeabilità e spessore delle membrane in Tabella 2:

Tabella 2

La permeanza è stata calcolata in base alla seguente formula:

dove per le condizioni adottate:

Dai valori di permeanza è stata calcolata la permeabilità media con la seguente formula:

Permeabilità = permeanza x spessore della membrana

Dalla tabella risulta che la permeabilità è direttamente proporzionale allo spessore delle membrane ed inoltre che il valori di permeabilità delle membrane preparate come descritto negli esempi precedenti, risultano compresi tra per membrane di spessore compreso tra 0.01 e 0.062 mm.

Prove di trazione

Da membrane originali, preparate secondo il presente processo, sono stati ritagliati provini a forma di "osso di cane" di lunghezza massima 76.7 mm, parte più sottile larga 4 mm e lunga 22 mm. Le prove di trazione sono state eseguite con apparecchio Chantillon mod. HTC (USA), secondo procedure convenzionali.

Sono stati ottenuti i valori riportati in tabella 3.

Tabella 3 Prove di trazione

Dai risultati emerge che lo spessore della membrana è correlato con il suo carico di rottura con una relazione logaritmica (vedi Figura 4) descritta dalla seguente equazione:

In particolare, per i valori medi riportati in tabella il valore di a risulta di 7.08 ed il valore di b è uguale a 11.42 e l'equazione diventa quindi:

come misurato per valori di spessore delle pellicole compresi tra 0.01 e 0.062 mm.

Esempio 5 Preparazione di membrane da gel di collagene 3 Kg di gel di collagene al 2%, preparato secondo l’esempio 4, furono diluiti 1:2 con acido acetico allo 0,3% e agitati in miscelatore Rayneri (dotato di lame, taglienti, ricurve e rotanti operanti a 1300 giri/minuto) per 1.5 ore. Furono poi trasferiti in un prototipo di miscelatore planetario a due velocità, (dedicato), sotto vuoto (76 cm Hg) e ivi mantenuto per 2,5 ore per il degasamento.

Il gel venne poi ripartito in vassoi di materiale plastico melaminico, di dimensione 25,5 x 16,5 cm o di altra dimensione, previamente caricati con corrente elettrostatica, allo spessore di 1,3 cm o di altro spessore in rapporto alla resistenza che si intende impartire alia membrana.

I vassoi furono posti in incubatore su ripiani rigorosamente in bolla e sottoposti a bassa ventilazione di aria sterile. L'incubatore lavora con n. controllato di ricambi/h, a 26°C per 96h.

II flusso di aria in entrata è diaframmato in modo da non lambire in alcun modo i vassoi di gel di collagene e la geometria interna deH'incubatore è tale da impedire la formazione di vortici d'aria.

I vassoi sono previamente caricati elettrostaticamente mediante sfregamento. La reale presenza di carica elettrostatica è stata verificata mediante lonizing Fan (RPO Electronic snc, Milano) operante a primary volt 220, secondary volt 6000 power VA 50 Hz 50/60. L’analisi chimicofisica del lotto di membrane preparate secondo il procedimento ha fornito i seguenti valori:

Perdita essiccamento = 11.72%

Idrossiprolina totale = 12.39% s.s.

Sodio = 0.28% s.s.

Cloruri = 0.19% s.s.

Sterilità = sterile

Esempio 6. Crescita di fibroblasti su membrane di collagene.

Lo studio é stato eseguito su fibroblasti umani al 2°-3° passaggio in coltura. Le cellule erano state ottenute da legamento parodontale.

All'inizio della sperimentazione le cellule presentavano forma allungata o stellata in allineamento randomizzato parallelo e capacità replicative nella norma.

Sono stati confrontate le seguenti membrane:

Campione A: membrana di collagene di tipo I da tendine di Achille bovino cross-linked con formaldeide,

Campione B: membrana costituita da collagene di tipo I estratto da pelle bovina cross-linked con difenilfosforilazide e da Cond roiti n-4-solfato,

Campione C: spugna di collagene di tipo I da pelle bovina non crosslinked,

Campione OP: membrana di collagene di tipo I da tendine di Achille equino, prodotta secondo quanto descritto nell’esempio 5 Quadretti di 1x1 cm di ciascuna membrana sono stati posti in pozzetti di piastre NUNC insieme a 20000 cellule per pozzetto in PBS (Dulbecco1 Phosfate Buffered Saline). Il terreno di crescita opportuno è stato quindi aggiunto ai pozzetti e le cellule sono state quindi incubate a 37°C; in alcune prove al mezzo di coltura é stato aggiunto anche Platelet Growth Factor BB (PGF-BB) 50 ng/ml (Boehringer M.). Il controllo era costituito Factor BB (PGF-BB) 50 ng/ml (Boehringer M.). Il controllo era costituito da sole cellule senza membrana.

Alla fine dell'esperimento (72 ore) tutti i campioni sono stati tripsinizzati (incubazione in 200 pi di tripsina 0.25% per 5') in modo da staccare le cellule dai vari substrati e renderle disponibili per il conteggio. Prima della tripsinizzazione sono state effettuate anche osservazioni dei campioni al microscopio ottico e al SEM.

Sono quindi stati raccolti i seguenti dati:

1) Numero di cellule totali presenti nel pozzetto a 72 ore:

2) Osservazione al microscopio ottico dei pozzetti di crescita contenenti le membrane

Campione A: poche cellule di morfologia anomala, indice di sofferenza cellulare, tanto più evidente quanto minore é la distanza Campione B: cellule allungate e adese presenti à distanza dalla membrana. Vicino alla membrana cellule sferiche non adese.

Campione C: cellule allungate e adese presenti a distanza dalla membrana. Vicino alla membrana cellule sferiche non adese.

Campione OP: cellule allungate e adese presenti a distanza dalla membrana. Vicino alla membrana cellule sferiche non adese.

3) Osservazioni delle membrane al SEM

Campione A: membrane praticamente prive di fibroblasti: i rarissimi elementi cellulari presenti hanno però morfologia normale.

Campione B: non c'é presenza di cellule sulla membrana.

Campione C: non c’è presenza di cellule sulla membrana.

Campione OP: cellule di morfologia normale presenti sulla membrana.

Dai dati relativi alla conta delle cellule dopo tripsinizzazione si vede che la membrana OP riduce leggermente la crescita cellulare (probabilmente per problemi dovuti alla sua acidità accessoria, derivante da non sufficiente lavaggio delle fibre collagene dopo estrazione: tale acidità potrebbe essere rimossa, ad esempio con lavaggi nel mezzo di coltura, prima dell'esperimento).

E' altresì vero che, a parte il campione B, costituito da collagene e da condroitin-4-solfato, anche gli altri campioni saggiati non hanno dato luogo a proliferazione cellulare, come dimostrato nel test di conta delle cellule.

Dalle analisi al microscopio ottico ed elettronico si vede però che anche nel campione dove non si è registrata inibizione marcata della crescita Dalle analisi al microscopio ottico ed elettronico si vede però che anche nel campione dove non si è registrata inibizione marcata della crescita cellulare (C), manca la colonizzazione della membrana stessa in quanto i fibroblasti presenti erano tutti disposti intorno alla membrana, ma non sulla sua superficie.

La sola membrana colonizzata dai fibroblasti risulta essere la membrana OP 323 prodotta secondo il procedimento descritto nei precedenti esempi. Dalle caratteristiche morfologiche delle cellule si può inoltre dedurre che tale membrana non induce sofferenza cellulare.

Claims

RIVENDICAZIONI 1) Membrane di collagene a due facce aventi un lato poroso adatto all’adesione e/o alla crescita di cellule ed un lato liscio, caratterizzate dal fatto che sul lato liscio il collagene è organizzato a livello macromolecolare.
2) Membrane secondo la rivendicazione 1 dove tale collagene è scelto tra collagene di tipo I, II, HI o IV, oppure una miscela costituita da almeno due dei quattro tipi.
3) Procedimento per la preparazione di membrane di collagene caratterizzato dal fatto che un gei di collagene viene colato e fatto essiccare su una piastra su cui è stata indotta una carica elettrostatica.
4) Procedimento secondo la rivendicazione 3 dove l’essiccamento del gel avviene ad una temperatura inferiore a 40°C, per un tempo superiore alle 40 ore.
5) Procedimento secondo la rivendicazione 4, dove la temperatura di essiccamento è compresa tra 20 e 30°C.
6) Procedimento secondo la rivendicazione 3, dove il gel di collagene è prodotto con un procedimento che comprende essenzialmente i passaggi di: a) sminuzzamento meccanico di un tessuto connettivo e sua omogeinizzazione in una sospensione di collagene, b) trattamento della sospensione di collagene con enzimi proteolitici, c) trattamento alcalino della sospensione di collagene fino ad un pH superiore ad 8 e sua neutralizzazione con acidi forti fino ad un pH compreso tra 5 e 6, d) precipitazione del collagene per salatura ed ottenimento del gel di collagene mediante risospensione del precipitato in una soluzione acquosa diluita di un acido debole.
7) Procedimento secondo la rivendicazione 6, dove il tessuto connettivo del passaggio a) è di mammifero.
8) Procedimento secondo la rivendicazione 6, dove il tessuto connettivo del passaggio a) è costituito da tendine.
9) Procedimento secondo la rivendicazione 8, dove tale tendine è equino.
10) Procedimento secondo la rivendicazione 6, dove il tessuto connettivo del passaggio a) è costituito da membrana tracheale.
11) Procedimento secondo la rivendicazione 10, dove tale membrana tracheale è di bovino.
12) Procedimento secondo la rivendicazione 6 dove lo sminuzzamento e l'omogeinizzazione dei passaggio a) avviene dopo aggiunta di una soluzione acquosa e fino all’ottenimento di una sospensione costituita da particelle di collagene di dimensioni inferiori a 25 mesh.
13) Procedimento secondo la rivendicazione 12 dove l’omogeÌnizzazione è seguita da micronizzazione.
14) Procedimento secondo la rivendicazione 6 dove Γ enzima proteolitico di cui al passaggio b) del procedimento è la pepsina ed il trattamento avviene a pH compreso tra 2 e 3 per un tempo compreso tra 10 e 20 ore.
15) Procedimento secondo la rivendicazione 6 dove la risospensione del precipitato del collagene del passaggio d) awiene ad una concentrazione di collagene compresa tra 0.5 e 6%.
16) Procedimento secondo la rivendicazione 15 dove tale concentrazione è compresa tra 2 e 3%.
17) Procediménto secondo la rivendicazione 6 dove tale soluzione acquosa diluita, di cui al passaggio (d) del· procedimento, è una soluzione di acido acetico.
18) Procedimento secondo la rivendicazione 17 dove tale soluzione di acido acetico ha concentrazione compresa tra 0,1 e 1% (p/V).
19) Procedimento secondo la rivendicazione 6, dove il gel di collagene ottenuto nella fase d) del procedimento viene ulteriormente omogeneizzato e degasato mediante aspirazione sotto vuoto.
20) Membrane di collagene ottenute in accordo con il procedimento di cui alle rivendicazioni 3-5.
21) Gel di collagene ottenuto in accordo con il procedimento di cui alle rivendicazioni 6-19.
22) Membrane di collagene ottenute con il gel di cui alla rivendicazione 21.
23) Uso delle membrane di collagene secondo la rivendicazione 1 come supporti per l’adesione, la crescita o la colonizzazione in vitro di cellule di mammifero.
24) Uso delle membrane secondo la rivendicazione 23 dove le cellule di mammifero sono scelte tra: cellule staminali, fìbroblasti, cellule epiteliali, cellule endoteliali, osteociti e condrociti.
25) Uso delle membrane secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di matrici cellulari per la ricostruzione tissutale.
26) Uso delle membrane secondo la rivendicazione 1 per la ricostruzione tissutale.
27) Uso delle membrane secondo la rivendicazione 20 per la preparazione dì matrici cellulari per la ricostruzione tissutale.
28) Uso delle membrane secondo la rivendicazione 20 per la ricostruzione tissutale.
29) Uso delle membrane secondo le rivendicazioni 25-28 dove la ricostruzione tissutale è scelta tra: ricostruzione del tessuto epiteliale, endoteliale, connettivale, cartilagineo, osseo e osteo-cartilagineo.