ES2228942T3 - Membrana de colageno dispuesta a nivel macromolecular. - Google Patents

Abstract

Membranas de colágeno de doble cara con un lado poroso adecuado para la adhesión y/o crecimiento de células y un lado liso, caracterizado porque el colágeno se dispone a un nivel macromolecular en el lado liso, que se puede obtener mediante la aplicación de un campo eléctrico o de una carga electrostática a un gel de colágeno.

Description

Membrana de colágeno dispuesta a nivel macromolecular.

Campo de la invención

El campo técnico de la presente invención se refiere a la preparación de soportes biocompatibles que consisten particularmente en membranas de colágeno para la reconstrucción de tejido.

Técnica anterior

El colágeno es un escleroproteína presente en diferentes formas en los tejidos y órganos animales.

En los humanos es una de las proteínas estructurales más representada y constituye aprox. 30% del total de proteínas.

Existen diversos tipos de colágeno que difieren principalmente con respecto a la función del tejido o del órgano de origen. Está disponible una amplia literatura para todos los tipos de colágeno que se refieren a estructura primaria, secundaria, composición, pureza, utilizaciones (Marcel E. Nimni Collagen Biochemistry, Biochemistry and Biomechanics, Biotechnology, CRC Press Inc., Boca Ratón, Florida 1988; Cunningham and Frederiksen Methods in Enzymology, Academic Press, Nueva York, 1-554,1982).

Es conocido que las propiedades del colágeno no sólo dependen de la estructura de los monómeros proteicos que constituyen la triple hélice de la fibra, sino, sobre todo, de la organización macromolecular compleja que distingue este y otras proteínas estructurales con funciones mecánicas (p.ej., miosina y tropomiosina en fibras musculares, etc.) y que concibe la organización en fibrillas, su sobre-enrollado, su organización en monómeros cabeza-cola y así sucesivamente.

La organización macromolecular de las estructuras de colágeno nativo, se pierde parcialmente con los procedimientos de extracción de colágeno. Se puede restablecer parcialmente de forma artificial, por ejemplo mediante entrecruzamiento químico. Este tratamiento restablece, incluso si es sólo parcialmente, la resistencia mecánica de las fibrillas de colágeno y hace que el producto final sea asimismo más resistente a la digestión proteolítica.

Hasta ahora muchas preparaciones basadas en colágeno se han introducido en la práctica médica solas o con otros componentes naturales, tanto en forma de gel como en neuropilema, membranas o plásticos que forman tejidos, como agentes estimuladores para la cicatrización de heridas, o como vehículos o dispositivos para la liberación lenta de otros principios activos o como matrices adecuadas para la interacción con las células.

La importancia del colágeno como un sustrato adecuado para favorecer la interacción y el crecimiento celular es conocida de hecho. Asimismo es conocida la preferencia de líneas celulares de diferente origen para diversos tipos de colágeno: por ejemplo los fibroblastos de piel y las células epiteliales endoteliales (Murray J.C. et al. Cancer Res. 40, 347, 1980; Wicha M. S. et al. Exp. Cell Res, 124, 81, 1979) crecen mejor sobre el colágeno de tipo IV (un tipo de colágeno presente en la membrana basal) mientras los condrocitos prefieren el colágeno de tipo II (presente en el cartílago de hialino) (Hewit A. T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 77, 385, 1980) pero asimismo se adaptan al crecimiento sobre el colágeno I y III.

En este tipo de aplicación la presencia de fibronectina, producida endógenamente por las células (Grinnel F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 75, 4408, (1978)), demostró asimismo ser importante para la adhesión de fibroblastos sobre el sustrato de colágeno (Pearlstein E., Int. J. Cancer 22, 32, 1978) y la de condronectina para la interacción de condrocitos con el colágeno (Hewit et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 77, 385, 1980).

En la literatura están disponibles un número de aplicaciones de colágeno y procedimientos de extracción y de preparación.

La patente US 5.785.983 reivindica un procedimiento de preparación de membranas de colágeno de tipo I, químicamente no modificadas, obtenidas de gel de colágeno distribuido en bandejas de Teflón antiadherentes, mediante una desecación baja bajo condiciones adecuadas de temperatura, vacío y flujo de nitrógeno. Las membranas obtenidas de este modo se proponen para la cicatrización de heridas y quemaduras y como barreras de interposición para evitar adherencias después de las operaciones de cirugía interna. La preparación del gel de colágeno del tendón bovino se describe en el documento WO 98/44809.

Muchas patentes, tales como EP 284789, existen sobre neuropilema o membranas de colágeno obtenidas mediante congelación y liofilización rápida de soluciones de colágeno en forma de gel. La estructura de tal neuropilema no está organizada ya que tales procedimientos fijan, como en una fotografía instantánea, el desorden de las fibras de colágeno en solución. Según se afirma en EP 284789, la estructura obtenida no es adecuada para permitir el crecimiento celular. En la literatura se describe cómo el tamaño de poro de tal neuropilema se regula mediante el control de la temperatura de congelación. Sin embargo, los poros resultantes poseen un diámetro que excede el de la célula de cultivo, que se deja pasar a través de ellos (Boyce et al. J. Biochem. Mat. Research, 1988, 22:939-957). Además, estas membranas son de resistencia limitada ya que el colágeno, desnaturalizado en el procedimiento de extracción, no está suficientemente reorganizado.

La patente WO 95/18638 reivindica las membranas de colágeno reabsorbibles, como una guía en la reparación de tejidos y caracterizadas por dos lados opuestos, un lado fibroso adecuado para el crecimiento de las células y otro liso para inhibir las adherencias. Tales membranas se obtienen de membranas peritoneales o de membranas de placentas de mamíferos diversos, entre los cuales las terneras, y se preparan mediante un procedimiento basto de limpieza, deshidratación y desengrase con acetona y N-hexano. Debido al procedimiento de preparación utilizado, las membranas poseen la forma y las dimensiones del órgano a partir del cual se originan y asimismo las características distintivas, esto es porosidad y el tipo del colágeno del cual están compuestas, reflejando con gran similitud las del tejido de partida.

La patente WO 96/25961 reivindica las matrices reabsorbibles del colágeno de tipo II (del cartílago) adecuado para las reconstrucciones de tejido cartilaginoso. Tales matrices se preparan mediante congelación y/o liofilización y se pueden combinar con glucosaminoglicanos.

La patente WO 99/19005 reivindica una membrana multicapa que incluye una matriz principalmente de colágeno II que consiste en un lado esponjoso y un lado relativamente impermeable. Esta membrana se prepara mediante estratificaciones sucesivas de matrices de colágeno (previamente desengrasadas con acetona), y porciones de gel de colágeno se liofilizan a continuación sobre tales membranas en ciclos sucesivos y alternados.

Hasta ahora, los procedimientos de preparación de las membranas de colágeno conciben la extracción de colágeno en forma de sólido semipurificado o en forma de gel que se congela rápidamente y se seca. Generalmente, el colágeno posteriormente se modifica químicamente mediante entrecruzamiento, ocurriendo de una manera aleatoria sin reorganización macromolecular típica de las fibrillas nativas, para incrementar la resistencia mecánica de la membrana.

Alternativamente, las membranas se pueden preparar mediante evaporación lenta de un gel de colágeno, o prepararse directamente de membranas de colágeno que existen previamente en la naturaleza y sólo purificadas parcialmente.

Un problema técnico no resuelto que todavía permanece es producir membranas de colágeno en las que el colágeno se disponga a nivel macromolecular de una manera similar a su forma natural, que están dotadas de resistencia mecánica y elasticidad, aunque siendo moldeables, según los requisitos del sitio de reconstrucción.

Resumen

La presente invención se refiere a membranas de colágeno de dos lados con un lado poroso adecuado para la adhesión y/o el crecimiento de células y un lado liso, caracterizado porque el colágeno en el lado liso se dispone a un nivel macromolecular de una manera similar al nativo. El colágeno que comprende tales membranas es del tipo I, II, III o IV. Un objetivo adicional de la presente invención es un procedimiento para la preparación de membranas de colágeno caracterizado porque un gel de colágeno se tensa y se deseca muy lentamente sobre placas o bandejas sobre las que se ha inducido una carga electrostática, y la utilización de las membranas de colágeno como soporte para la adhesión y/o crecimiento in vitro e in vivo de células de mamíferos, particularmente en las aplicaciones de reconstrucción de tejido (por ejemplo de tejido epitelial, de hueso, cartilaginoso o conectivo) guiada por matriz o inducida.

Descripción de las figuras

Figura 1

Lado liso de las membranas según se ve mediante el microscopio electrónico de barrido (SEM)

La muestra se trató como sigue: 2 porciones pequeñas de la membrana producida según la presente invención (aprox. 5 x 3 mm) se cortaron de cada muestra. Éstas se colocaron sobre un soporte metálico especial (matriz) exponiendo el lado liso para cada muestra (A, B y E). Las muestras se cubrieron con una película de oro de paladio para hacer su superficie conductora y permite su observación bajo SEM. El análisis SEM de la superficie brillante de las muestras destacó la presencia de fibras dispuestas en un nivel macromolecular en la parte lisa.

Figura 2

Lado poroso de las membranas según se ve bajo microscopio electrónico de barrido (SEM)

La muestra se trató como sigue: 2 porciones pequeñas de la membrana producida según la presente invención (aprox. 5 x 3 mm) se cortaron de cada muestra. Éstas se colocaron sobre un soporte metálico especial (matriz) exponiendo la parte opaca (marcada con una ligera incisión en el soporte) para cada muestra (A, B y E). Las muestras se cubrieron con una película de oro de paladio para hacer su superficie conductora y permitir su observación bajo SEM.

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El análisis SEM de la superficie opaca de las muestras destacó la presencia de irregularidades superficiales, protuberancias y "burbujas" que confieren una cierta porosidad a la membrana.

Figura 3

Resistencia de las membranas a la digestión con colagenasa

Las membranas producidas según la presente invención (lote P323 y P50027) y membranas disponibles comercialmente (ChondroGide, Anterna F y Anterna S) se sometieron a digestión enzimática con colagenasa. El contenido de hidroxiprolina libre, una indicación de la digestión enzimática, se midió en las muestras después de 24 horas: las membranas según la presente invención demostraron ser más resistentes después de tal periodo.

Figura 4

Curva de resistencia mecánica de las membranas según la presente invención

Muestras moldeadas de hueso de perro pequeñas (longitud máxima 76,7 mm y la parte más delgada 4 mm de ancho y 22 mm de largo) se cortaron de las membranas producidas y sometidas a ensayos a tracción, según los procedimientos convencionales, con el aparato Chantillon HTC mod. (Estados Unidos). Los valores de resistencia promedios medidos en kg de resistencia a la rotura por tracción final para tres familias de muestras (3-6 muestras para cada familia) de diferentes espesores, se mostraron en forma gráfica. La relación entre el espesor promedio (x), en mm y la carga promediada bajo solicitación a la rotura por tracción (y) de las membranas se describe mediante la ecuación logarítmica: y = 11,42 + 7,08 log x, con un índice de correlación R^{2} = 0,999.

Figura 5

Microscopia óptica de las membranas de colágeno preparadas según el Ejemplo 7

Secciones semifinas, perpendiculares a la superficie de la membrana, de la membrana 40046 se tiñeron con colorantes básicos del grupo tiazina y se observaron bajo el microscopio óptico. Una superficie (la superior en la figura, correspondiente al lado en contacto con el lado cargado electrostáticamente de la bandeja durante la fase de secado) es lisa, compacta e intensamente coloreada. Aproximando hacia la superficie opuesta, que corresponde a la superficie inferior en la imagen (que es la expuesta al aire durante la fase de secado) la estructura llega a ser menos homogénea, más suelta e irregular. Ampliación 50X.

Figura 6

Lote de membranas de colágeno 40046, vistas al microscopio electrónico

Secciones semifinas de las membranas de colágeno preparadas según el ejemplo 7, perpendiculares a la superficie de la membrana, se prepararon según Maunsbach AB y Afzelius B. 1999, Academic Press. Se puede observar que la parte inferior de la imagen, correspondiente al lado en contacto con el aire durante la fase seca (lado opaco) es irregular, mientras que el lado opuesto en contacto con la "bandeja cargada" electrostáticamente (correspondiente a la parte superior de la figura), es más regular y las fibras de colágeno son más compactas y están dispuestas en dirección longitudinal.

Figura 7

Crecimiento de fibroblastos dérmicos sobre membranas de colágeno 40046 comparado con el crecimiento en vasijas de material plástico tratadas con cultivo celular

El crecimiento del fibroblasto dérmico sobre la membrana de colágeno preparada según el ejemplo 7 (40046) se comparó con el crecimiento en las vasijas de material plástico tratadas con cultivo celular, según se midió mediante el ensayo MTT, según se describe en el ejemplo 13. Fibroblasto sobre membrana de colágeno (-\medcirc-) y fibroblasto sobre vasijas de material plástico (-\medbullet-). O.D. densidad óptica.

Figura 8

Fibroblastos dérmicos después de 6 días de crecimiento sobre membranas de colágeno observados mediante microscopio confocal

Los fibroblastos dérmicos se depositaron sobre membranas de colágeno preparadas según la presente invención y después de 6 días se tiñeron según se describe en el ejemplo 14. Se dejó que las células alcanzaran la confluencia. La observación microscópica mostró que las células crecieron a diferentes niveles en la membrana. En el día 6, los fibroblastos, de forma poligonal y alargados, estaban en la confluencia ya que cubrieron todo el espacio de la membrana (etiquetados con Phalloidine). Obj:10,0. Zoom:1,430.

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Figura 9

Histomorfometría de las membranas de colágeno según la presente invención y membranas de colágeno comerciales

Los condrocitos humanos (1 x 104) se dejaron crecer durante 7 días sobre membranas de colágeno producidas según la presente invención (40046, 40036 y 40049A/S) o según la presente invención pero liofilizadas (40046LL), o sobre membranas disponibles comercialmente (P322 y C-G). Al final del periodo de 7 días, las membranas, que se colonizaron por células en una extensión diferente se tiñeron con safranina-O, que es específica para los grupos sulfato de matriz extracelular, según se describe en el ejemplo 16. Ya que sólo los condrocitos vitales sintetizan matriz cartilaginosa, un teñido positivo de safranina indica que las células están vivas y no perdieron su capacidad. Los datos de histomorfometría se obtuvieron representando en un gráfico para cada membrana el porcentaje de la superficie entera que se colonizó mediante condrocitos después de un periodo de 7 días (Aa%).

Figura 10 Análisis de microscopio de una membrana de colágeno disponible comercialmente (ChondroGide)

Los condrocitos que crecen sobre una membrana disponible comercialmente se tiñeron con safranina-O. Las células son pocas, alargadas y no coloreadas intensamente con el colorante, indicando una habilidad baja para sintetizar la matriz extracelular. Están dispuestas en una capa única sobre la membrana.

Figura 11

Análisis de microscopio de la membrana 40046 producida según el ejemplo 7.

a) Los condrocitos que crecen sobre la membrana 40046 se tiñeron con safranina-O. Los condrocitos que crecen en la membrana 40046 son morfológicamente muy diferentes de los que se muestran en la figura 10: son redondeados, coloreados intensamente debido a la presencia de grupos sulfato abundantes y crecen en multicapa, presentando la capacidad de penetrar en la membrana. b) Ampliación de uno en particular.

Descripción detallada de la invención

El objetivo de la presente invención son membranas de colágeno de dos lados, con un lado liso y un lado poroso, el primero organizado a un nivel macromolecular y el último adecuado para el crecimiento de células de mamífero. Tales membranas se caracterizan porque el colágeno se dispone a un nivel macromolecular en el lado liso y las fibrillas se organizan en el espacio bidimensional. Las membranas de la presente invención están provistas de una elevada resistencia mecánica y son asimismo reabsorbibles lentamente, proporcionando por lo tanto utilidad en aplicaciones de reconstrucción de tejido in vivo. Un aspecto adicional de la presente invención de hecho concierne a la utilización de membranas de colágeno para la reconstrucción de tejido: éstos son biocompatibles de hecho y se colonizan in vitro mediante células de mamífero preferiblemente elegidas de entre: células germinales, fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, osteocitos, condrocitos.

Las membranas de la presente invención consisten principalmente en el colágeno de tipo I, II, III o IV, o mezclas de por lo menos dos de los diferentes tipos de colágeno. Poseen un contenido en colágeno de entre 70% y 95%, medido como residuo de colágeno seco y correspondiente al total del contenido de hidroxiprolina de entre 9% y 13% y un contenido en agua que no excede el 15%. Pueden comprender otros constituyentes, ser por ejemplo sustancias naturales y componentes biológicos de "áreas" de sectores del cuerpo específicas o características de órganos particulares o de funciones particulares, tales como, por ejemplo, ácido hialurónico o glucosaminoglicanos en porcentajes
diversos.

Las membranas de la presente invención no son inmunogénicas, ya que los telopéptidos que constituyen la parte terminal de las fibrillas de colágeno se eliminan mediante digestión enzimática con proteasa: el colágeno que constituye tales membranas se denomina por lo tanto asimismo atelocolágeno (colágeno sin los telopéptidos terminales).

Una materialización adicional de la presente invención es el procedimiento para la preparación de tales membranas de colágeno, caracterizado porque un gel de colágeno se vierte sobre bandejas o placas cargadas electrostáticamente y posteriormente se secan lentamente, durante un tiempo que excede las 40 horas, o hasta obtener membranas con un contenido de agua no superior al 15%. La desecación del gel de colágeno preferentemente tiene lugar a una temperatura entre 10 y 40ºC, preferentemente entre 20 y 30ºC, todavía más preferentemente a 26ºC, en una incubadora ventilada exenta de turbulencias, esto es una boca de aspiración de aire provista de diafragma.

Después de la desecación, se esterilizaron las membranas mediante tratamiento físico, por ejemplo radiación con rayos y a una dosis de entre 2,5 y 25 KGy.

Las bandejas o placas se cargan electrostáticamente según el procedimiento conocido en la técnica, es decir, frotándolas con materiales adecuados por ejemplo, o preferentemente mediante la colocación de las bandejas entre las placas de un condensador. La inducción de una carga electrostática en las bandejas se puede comprobar mediante un ventilador ionizante (RPO Electronic snc, Milán) trabajando a 220 voltios de tensión de alimentación de arrollamiento primario, 6000 voltios de tensión de alimentación de arrollamiento secundario, VA potencia 50 Hz 50/60. Las bandejas son de una forma estándar o de una forma y tamaño adecuados para dar a la membrana una forma que encaje para la utilización posterior.

Alternativamente, el gel de colágeno se puede verter en bandejas sometidas a un equipo de generación de campo eléctrico de una manera adecuada, mantenido si es necesario asimismo durante la etapa de desecación del gel.

La inducción de un campo eléctrico o de una carga eléctrica permite, y a diferencia de la técnica conocida, la reorganización macromolecular y la orientación del colágeno en las estructuras fibrilares similares a las del tejido nativo, que permiten la consecución de membranas provistas de la resistencia y tenacidad máximas.

El gel utilizado en el procedimiento, según la presente invención, consiste esencialmente en colágeno a una concentración de entre 0,5 y 6% (peso/volumen, donde el peso se indica como residuo de colágeno seco), preferentemente a una concentración de entre 1% y 4%, todavía más preferentemente entre 2% y 3%. Diversas sustancias naturales y no naturales se pueden añadir opcionalmente al gel, o a componentes biológicos de un sector específico del organismo o de tejidos particulares. Un ejemplo de componentes biológicos que se pueden añadir son polisacáridos animales o vegetales o proteínas matriz, esto es fibronectina, laminina, etc.

En una de sus materializaciones preferidas, el procedimiento para la preparación del gel de colágeno comprende esencialmente las etapas siguientes:

a) desmenuzamiento mecánico de un tejido conectivo y homogenización en una suspensión de colágeno.

b) tratamiento de la suspensión de colágeno con enzimas proteolíticos en solución acuosa a pH ácido, opcionalmente seguido de filtrado,

c) tratamiento alcalino de la suspensión hasta un pH mayor de 8 y su neutralización con ácidos hasta un pH preferentemente comprendido entre 5 y 6

d) precipitación de las fibras de colágeno mediante la adición de una solución ácida (precipitación por salinización)

e) resuspensión del precipitado de colágeno a una concentración comprendida entre 0,5 y 6% (peso/volumen) de residuo de colágeno seco, en una solución ligeramente ácida tal como una solución acuosa que contiene un ácido débil, y hasta obtener un gel de colágeno en solución ácida. Según una materialización preferida particularmente, las dos etapas adicionales se añaden entre las etapas d) y e), que son respectivamente las etapas d') de: resuspensión del precipitado en una solución fuertemente alcalina con agitación durante un tiempo de por lo menos 30', y de d'') precipitación de las fibras de colágeno mediante precipitación por salinización de una solución alcalina (añadiendo lentamente una solución ácida) a valores de pH comprendidos entre 5 y 6. Estas dos etapas adicionales, que comprenden una segunda precipitación de las fibras de colágeno, permiten una mejor pureza del gel de colágeno y, posteriormente, de las membranas producidas por este gel. Las membranas según estas etapas adicionales mostraron ser asimismo más elásticas.

Según el procedimiento de la presente invención el tejido conectivo de partida se obtiene preferentemente de mamíferos. Se utiliza un tejido cartilaginoso, tal como el de la tráquea, en el caso en que uno desee obtener membranas que consistan principalmente en el colágeno de tipo II, o se utiliza un tejido conectivo que contiene principalmente colágeno de tipo I, esto es, tendón, preferentemente derivado de animales equinos, bovinos o cerdos, o tejido conectivo derivado de lamina basal, que contiene principalmente colágeno de tipo IV. El tipo final de utilización de la membrana determina la elección más apropiada de tejido de partida según lo que se conoce en la técnica y asimismo considerando las cantidades requeridas. Se pueden utilizar otras fuentes de colágeno como una alternativa al tejido conectivo de mamífero, por ejemplo tejido cartilaginoso u osteo-cartilaginoso de pescado.

El desmenuzamiento del tejido conectivo de partida (etapa (a) del procedimiento) se obtiene mediante tratamiento del tejido, al que se le añade agua o una solución acuosa, preferentemente en una cantidad igual a 6-30 volúmenes del volumen de tejido inicial, con una mezcladora de palas rotatorias hasta que se obtiene una suspensión de colágeno. La suspensión de colágeno contiene partículas de colágeno preferentemente menores de 25-30 de paso de tamiz en tamaño.

Otros sistemas de desmenuzamiento u homogenización son conocidos por la persona experta en la técnica y se pueden utilizar por lo tanto como alternativas a la etapa presente a). Se prefiere una reducción adicional de las partículas de colágeno, después de la homogenización, y se lleva a cabo mediante tratamiento de la suspensión de colágeno con un micronizador, por ejemplo el Waring Blender a 15-20.000 revs/ min con pulsos.

La suspensión obtenida de este modo se acidifica y se trata (etapa b del procedimiento) con enzimas proteolíticas, de clase no colagenásica, preferentemente con pepsina, a pH ácido, comprendido entre 2 y 3, preferentemente 2,5. Los procedimientos de digestión proteolítica y proporción enzima:colágeno son conocidos en la técnica y se pueden ajustar en consecuencia. El tratamiento proteolítico posee el doble efecto de degradar proteínas que posiblemente contaminen y de eliminar los telopéptidos del colágeno, que son fuertemente inmunogénicos. El colágeno obtenido es atelocolágeno, ya que pierde los telopéptidos inmunogénicos terminales. El tratamiento con pepsina se realiza preferentemente durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 20 horas, todavía más preferentemente 16 horas y se acompaña con agitación durante las primeras 2-4 horas.

Opcionalmente la suspensión de colágeno se puede filtrar, a través de tamices, con una porosidad comprendida preferentemente entre 20 y 100 paso de tamiz, preferentemente a 25 paso de tamiz.

La suspensión se trata posteriormente con un álcali según la etapa c) preferentemente con una solución concentrada de una base fuerte, preferentemente NaOH, hasta un pH que excede 8, preferentemente más de 10. Esto se consigue mediante tratamiento alcalino que posee el doble efecto de eliminar los posibles agentes contaminantes y, parcialmente, los residuos glucosídicos.

El pH de la suspensión de colágeno se neutraliza por lo tanto con una solución de un ácido fuerte, hasta un pH de entre 5 y 6, preferentemente un pH de aprox. 5,5. La alcalinización y la neutralización sucesiva, (etapa (c) del procedimiento), son preferentemente muy graduales para evitar una precipitación masiva de las fibras de colágeno.

Alternativamente, como en el caso en que no sea necesaria una fuerte alcalinización del material, o en otros casos conocidos por la persona experta en la técnica, el pH se puede llevar a valores comprendidos entre 5 y 6, directamente después de la digestión enzimática a pH ácido con una base fuerte.

A un pH comprendido entre 5 y 6 el colágeno precipita mediante precipitación por salinización como una masa blanquecina que se puede recoger y separar. Según una materialización preferida, esta masa blanquecina se resuspende en una solución fuertemente alcalina, tal como NaOH 1N y se deja bajo mezcla durante 1 hora. Después de esto, el colágeno se precipita mediante la adición de una solución ácida (precipitación por salinización) a valores de pH comprendidos entre 5-6. Por lo tanto se obtiene un gel de colágeno mediante la resuspensión del precipitado de colágeno a una concentración (indicada como un porcentaje en peso de residuo de colágeno seco) comprendido entre 0,3 y 6%, preferentemente entre 0,5 y 4%, todavía más preferentemente 2%, preferentemente después de la eliminación de las sales de precipitación mediante lavado con agua destilada estéril, en una solución diluida con un ácido débil, preferentemente ácido acético a una concentración comprendida entre 0,1 y 1% (p/v), preferentemente 0,3%. Como una alternativa al ácido acético, se pueden utilizar otros ácidos débiles, por ejemplo ácido cítrico, ácido ascórbico o ácido tartárico, a una concentración comprendida entre 0,5% y 5%. Esta solución se puede opcionalmente homogenizar adicionalmente para ayudar a la resuspensión del precipitado. Después de la resuspensión, la solución de colágeno se desgasifica preferentemente.

A continuación esta solución se vierte muy lentamente en bandejas o placas cargadas electrostáticamente, según se ha descrito anteriormente, de forma y dimensiones adecuadas, en cantidades correspondientes al espesor de membrana deseado, considerando la pérdida en volumen unida a la desecación. Las membranas obtenidas de este modo se esterilizan a continuación mediante procedimientos físicos por ejemplo, esto es irradiación con rayos y a una dosis entre 2,5 y 25 KGy. En una de sus materializaciones adicionales de la presente invención se hace referencia a las membranas de colágeno obtenidas según los procedimientos descritos: esto es, el que comprende el vertido de gel de colágeno en bandejas cargadas electrostáticamente y el que comprende la preparación de tal gel según las etapas a)-e) y a)-e'') del procedimiento, según se ha descrito anteriormente. El gel de colágeno se puede asimismo mezclar con sustancias naturales y/o componentes biológicos de tejidos específicos o de áreas orgánicas (p.ej., glucosaminoglicanos, ácido hialurónico, etc.), antes de verterlo en las placas cargadas electrostáticamente para obtener membranas de composición mezclada tan similares como sea posible a la composición natural específica del tejido que se va a reparar.

En una materialización adicional de la presente invención se hace referencia a la utilización de membranas de colágeno según la presente invención, como soportes para la adhesión, colonización y/o crecimiento de células de mamíferos de orígenes diversos, p.ej., células germinales, fibroblastos, células epiteliales o endoteliales, condrocitos, osteocitos, tanto para sistemas in vitro como sistemas ex-vivo, esto es, aquéllos en los que las células del paciente se eliminan y se ponen en cultivo in vitro, donde se amplifican o simplemente se hace que se adsorban o se adhieran a la membrana. Por lo tanto, en una materialización adicional estas membranas son para utilizar en la terapia. En particular se utilizan colonizadas o no mediante células autógenas o heterólogas, para la reconstrucción del tejido guiada por la matriz, esto es de tejido cartilaginoso u osteo-cartilaginoso, tejido epitelial o endotelial o tejido conectivo. Para los objetivos de la presente invención los términos matriz o soporte se utilizan indistintamente, simplemente definen tanto la estructura física que utilizan las células tanto para adherir como crecer asimismo tridimensionalmente, además de un sustrato capaz de interactuar con los mecanismo celulares de adhesión, colonización o proliferación. En el caso en que las membranas de colágeno, según la presente invención, se utilizan como matrices o soportes para la adhesión, colonización o crecimiento de células, la membrana llega a ser una matriz celular, útil para los objetivos de reconstrucción de tejido guiada por matriz.

Parte experimental Ejemplo 1 Preparación del gel de colágeno a partir de cartílago

El cartílago que contiene principalmente colágeno de tipo II, derivado de la tráquea bovina se desengrasó previamente de forma mecánica, se congeló a -202C y se rompió en fragmentos de aprox. 2-3 cm de diámetro. 56 g de tales fragmentos se colocaron en 900 ml de agua destilada y distribuidos en porciones en una mezcladora modelo PBI 16 a 7400 rpm.

Las fibras blancas obtenidas se colocaron en 15 litros de agua desmineralizada, se llevaron a un pH de 2,51 con HCl al 30% y se añadieron 0,588 g de pepsina (700 FIP-U/g-19917 Merck). La masa se mantuvo bajo agitación durante 2 horas y el pH se mantuvo a 2,5 con HCl.

Después de una noche de descanso las fibras, separadas por decantación, se homogenizaron en el mezclador a 6800 rpm, se filtraron a través de un tamiz con dimensiones \leq 25 de paso de tamiz y se añadieron a las aguas madre. Se añadió una solución de NaOH al 15% hasta pH 5,5.

El precipitado de colágeno se separó y se lavó con 2 volúmenes de agua a pH 5,5. Se obtuvieron 107,1 g de fibras húmedas a las que se les añadieron 311,6 ml de agua destilada y 0,93 de ácido acético glacial.

En estas condiciones el colágeno absorbió agua y asumió una forma de gel. El gel se homogeneizó en una mezcladora modelo PBI 16 a 8400 rpm y se observó que tuviera un residuo seco de 4,51%. Se añadieron a continuación 310 ml de agua y 621 ml de gel mediante homogenización que poseen un residuo seco (RS) de 2,03% y que corresponde a 2% de gel de colágeno.

Ejemplo 2 Preparación de gel de colágeno a partir de tendón de caballo

Se colocaron en 900 ml de H_{2}O durante 4 horas 50 g de tendón de caballo, correspondientes a un residuo seco de 35,5% y se manipularon para romper los gránulos. A continuación éstos se transfirieron a 15 L de H_{2}O llevada a un pH de 2,5 con HCl en el que se disolvieron 1,5 g de pepsina (Merck 700 U.FIP/g) y se dejó que la digestión enzimática siguiera durante aprox. 20 h a 152C.

Los fragmentos de tendón mayores se eliminaron mediante el filtrado en tamices de 25 de paso de tamiz. La suspensión se llevó a continuación a pH 5,4 con NaOH comercial y el precipitado de colágeno se recogió en aprox. 2 h. El precipitado se recogió por decantación y se añadieron 7,5 L de agua a pH 6.

Las fibras se lavaron con agitación, se dejaron en reposo durante 1 h y se eliminaron otra vez por decantación. Los lavados se repitieron todos 3 veces. Se obtuvieron 43 g de fibras húmedas de las cuales, mediante adición de 0,376 g de ácido acético glacial, 82 ml de agua y homogenización, se obtuvieron 125 g de gel de colágeno que poseía 2,45% de residuo seco.

Ejemplo 3 Preparación a gran escala de gel de colágeno

Se sometieron 500 g de tendón de caballo y 10 L de agua destilada, a amasado mediante trituradora turbotest Rayneri SB provista de paletas rotatorias afiladas, curvadas a 1500 revs/min, a continuación con la trituradora turbotest Rayneri H 002 y a continuación con un micronizador de mezcla INOX Waring a una velocidad de 15-20.000 rpm/min con pulsos.

Se dejó la suspensión en reposo hasta obtenerse su hinchamiento (aprox. 2-4 h). El tendón micronizado se transfirió a un reactor INOX de 200 L que contenía 140 L de agua destilada, junto con 5,88 g de pepsina Merck a 700 U FIP/mg y cantidad suficiente de ácido clorhídrico a pH 2,5. La agitación se mantuvo durante 2-4 h y la suspensión se dejó a continuación en reposo toda la noche a pH 2,5.

La masa de reacción se filtró mediante un tamiz de 25 paso de tamiz y el filtrado se llevó muy lentamente hasta un pH 5,5 con hidróxido de sodio al 30% comercial. Las fibras de colágeno precipitaron y se lavaron 3-4 veces con agua destilada a pH 5,5 hasta una concentración de cloruro de < 50 ppm.

Las fibras recogidas y pesadas a continuación se dispersaron en solución acuosa de ácido acético al 0,3% hasta una concentración de colágeno del 2% expresada como residuo seco. Se obtuvieron 12,3 kg de gel.

Ejemplo 4 Preparación de membranas de gel de colágeno

El gel obtenido según los ejemplos anteriores se estratificó en bandejas cargadas previamente con corriente electrostática y aire seco a 262C durante 56 h. La carga electrostática se comprobó mediante un ventilador ionizante (RPO Electronic snc, Milán) trabajando a 220 voltios de tensión de alimentación de arrollamiento primario, 6000 voltios de tensión de alimentación de arrollamiento secundario y potencia de 50 Hz 50/60.

Se obtuvieron las membranas denominadas A, B y E y se esterilizaron mediante rayos y (gamma) a 25 KGy. Las membranas producidas de este modo se sometieron a análisis morfológico, ensayos de degradabilidad mediante colagenasa, permeabilidad al vapor de agua según la norma estándar ASTM-E 96-90, y a ensayos de tracción según los procedimientos convencionales.

Las membranas A, B y E mostraron que poseían 3, 6 y 9 mg/cm^{2} de residuo seco.

Análisis morfológico

Una característica de las membranas obtenidas de este modo fue asimismo detectable mediante observación visual: de hecho, asimismo en la observación visual las láminas mostraron dos superficies diferentes, un lado opaco y un lado brillante. Esta morfología superficial diferencial se caracterizó mejor por la observación tanto con el microscopio estereoscópico como con el microscopio electrónico de barrido (SEM).

Los análisis se llevaron a cabo en muestras de lado de 2 x 2 cm cortadas de las láminas originales. Las muestras se colocaron bajo un microscopio estereoscópico (Nikon, Japón).

Para los análisis SEM la muestra se trató como sigue: 2 porciones pequeñas de material (aprox. 5 mm x 3 mm) se cortaron para cada muestra. Éstas se colocaron sobre un soporte metálico especial (matriz) exponiendo para cada muestra (A, B y E) la parte brillante y la opaca (marcada con una ligera incisión en el soporte). Las muestras se cubrieron con una película de oro de paladio para hacer su superficie conductora y permite su observación bajo SEM.

El análisis SEM de las superficies de las tres muestras destacó la presencia de fibras dispuestas a un nivel macromolecular en la parte brillante (ver figura 1), mientras, en la parte opaca, fueron visibles algunas irregularidades superficiales, protuberancias y "burbujas" dando una cierta porosidad a la membrana (ver figura 2).

El espesor de las muestras, medido con un micrómetro digital, se muestra en la Tabla 1.

TABLA 1

1

Ensayo de degradabilidad en la presencia de colagenasa

Los lotes de membranas de colágeno P323 y P 50027, preparadas según se ha descrito en los ejemplos anteriores y las membranas de colágeno disponibles comercialmente, se sometieron a degradación enzimática con colagenasa bacteria) (EC 3.4.24.3 de Clostridium Histolyticum 1, 310 U/mg Sigma C-0130) 50 \mug/ml, durante 24 h en un regulador a 37ºC, para un ensayo comparativo. Las concentraciones en \mug/ml/24 h de hidroxiprolina hidrolizada mediante colagenasa se midieron en un baño con un procedimiento colorimétrico basado en p-dimetilaminobenzaldehído.

La Figura 3 muestra que las muestras P323 y P50027, obtenidas según se describe en los ejemplos anteriores, no se degradan mediante la enzima colagenasa después de 24 h, mientras otros productos comerciales esto es Chondro-gide y Antema, se degradan considerablemente ya después de las 24 horas, indicando que las membranas preparadas según la presente invención son más resistentes a la degradación.

Permeabilidad al vapor

Los ensayos se llevaron a cabo en las muestras (A, B y E) obtenidas como se indica en los ejemplos anteriores, según el ensayo denominado "agua" según se describe en "Standard test method for water vapour transmission of materials" proporcionado por la norma ASTM E 96-90.

Los valores de TVA (capacidad de transmisión de vapor de agua) se obtuvieron en el ensayo según la fórmula:

TVA = (G/t)/A

en la que:

A = área de la membrana;

B = variación en peso del agua en la cámara de medición, (gramos)

t = tiempo (horas),

y se muestran junto con los valores de permeancia, permeabilidad y espesor de las membranas en la Tabla 2:

TABLA 2

2

La permeancia se calculó utilizando la fórmula siguiente:

Permeancia = TVA/S (R1-R2)

y para las condiciones adoptadas:

S = 46,66 x 10^{2} Pa y R1-R2 = 0,5 (valor expresado como fracción numérica).

La permeabilidad promedio se calculó a partir de los valores de permeancia utilizando la fórmula siguiente:

Permeabilidad = permeancia x espesor de membrana

De la tabla 2 se ve que la permeabilidad es directamente proporcional al espesor de las membranas y además de los valores de permeabilidad de las membranas preparadas según se describe en los ejemplos anteriores, están entre 0,7138*10^{-11} y 4,4946*10^{-11} (g*Pa^{-1} *h^{-1}*m^{-1}) para membranas con un espesor de entre 0,01 y 0,062 mm.

Ensayos de resistencia a la rotura por tracción

De las membranas originales preparadas según el procedimiento presente, se cortaron muestras moldeadas de "hueso de perro" (tres lotes diferentes), de una longitud máxima de 76,7 mm, la parte más delgada 3-6 mm de ancho y 22 mm de largo. Los ensayos de resistencia a la rotura por tracción se llevaron a cabo con el aparato Chantillon, mod. HTC (Estados Unidos), según los procedimientos convencionales.

Los valores obtenidos se muestran en la tabla 3.

TABLA 3

3

Se puede demostrar que el espesor de la membrana se correlaciona con su carga a la rotura con una relación logarítmica (ver Figura 4) descrita mediante la ecuación siguiente:

y = a log (x) + b

En particular, para los valores promedio mostrados en la tabla, el valor a es 7,08 y el valor b es igual a 11,42 y la ecuación por lo tanto se convierte en:

y = 7,08 x + 11,42, con R^{2} = 0,999

según se mide para los valores de espesor de película comprendidos entre 0,01 y 0,062 mm.

Ejemplo 5 Preparación de membranas a partir de gel de colágeno

Se diluyeron 1:2 con ácido acético al 0,3% 3 kg de gel de colágeno al 2%, preparado según el ejemplo 4, y se agitaron en una mezcladora Rayneri (provista de paletas curvadas, afiladas, y una rotación de trabajo a 1300 rpm) durante 1,5 horas. Se transfirieron a continuación a dos batidoras prototipo planetaria de 2 velocidades (especialmente indicada), al vacío (76 cm de Hg) y se mantuvieron ahí durante 2,5 horas para el desgasificado.

El gel se vertió a continuación en bandejas fabricadas de material plástico melamínico, de tamaño 25,5 x 16,5 cm o de otro tamaño, cargadas previamente con corriente electrostática, al espesor de 1,3 cm de gel o de otro espesor en relación a la resistencia que uno desea dar a la membrana.

Las bandejas se colocaron en una incubadora sobre estanterías rigurosamente niveladas y se sujetaron a ventilación baja de aire estéril durante 96 h. La incubadora trabaja con un nº de cambios /h controlado, y se estableció a 26ºC.

La boca de aspiración de aire fue diafragmática para no cepillar las bandejas del gel de colágeno de cualquier manera y la geometría interna de la incubadora fue tal que evita la formación de vórtices de aire.

Las bandejas se cargan previamente de forma electrostática mediante frotación. La presencia actual de carga electrostática se comprobó mediante un ventilador ionizante (RPO Electronic snc, Milán) trabajando a 220 voltios de tensión de alimentación de arrollamiento primario, 6.000 voltios de tensión de alimentación de arrollamiento secundario y VA potencia 50 Hz 50/60. El análisis químico-físico del lote de membranas preparado según el procedimiento dio los valores siguientes:

Pérdida por desecación = 11,72% s.b.s. (sobre base seca)

Total de hidroxiprolina = 12,39% s.b.s.

Total de nitrógeno = 15,80% s.b.s.

Sodio = 0,28% s.b.s

Cloruros = 0,19% s.b.s

Estéril = estéril

Ejemplo 6 Crecimiento de fibroblastos sobre membranas de colágeno

El estudio se realizó en fibroblastos humanos en el 2º-3º paso en cultivo. Las células se obtuvieron del ligamento parodontal.

Al inicio del experimento, las células se alargaron en alineación paralela como característica de las células de fibroblasto (muestra OP) o en una alineación aleatoria (muestra B), o estuvieron en forma de estrella en una alineación aleatoria en la muestras A y C mientras la capacidad replicadora era como la del control.

Se compararon los lotes de membrana siguientes:

Muestra A: Membrana de colágeno de tipo I de tendón de Aquiles bovino, entrecruzado con formaldehído (BIOMEND, Collatech);

Muestra B: Membrana de colágeno del tipo I y de sulfato de 4-condroitina, extraído de piel bovina, entrecruzado con difenilfosforilazida (PAROGUIDE, Celetica);

Muestra C: Esponja de colágeno del tipo I de piel bovina no entrecruzada, (GINGISTAT, Coletica);

Muestra OP: Membrana de colágeno del tipo I de tendón de Aquiles bovino, producido según lo descrito en el ejemplo 5; Se colocaron pequeños cuadrados de 1 x 1 cm de cada membrana en vasijas de placas NUNC junto con 20.000 células por vasija en PBS (salino regulador de fosfato de Dulbecco). El medio de crecimiento adecuado se añadió a continuación a las vasijas y las células se incubaron a continuación a 37ºC; se añadió asimismo al medio de cultivo en algunas pruebas factor de crecimiento de plaquetas BB (PGF-BB) 50 ng/ml (Boehringer M.). El control consistió sólo en células sin membrana.

Al final del experimento (72 horas) todas las muestras se tripsinizaron (incubación en 200 \mul de 0,25% de tripsina durante 5') para desprender las células de diversos sustratos y hacerlas disponibles para el contaje. Las muestras se observaron asimismo bajo el microscopio óptico y bajo SEM antes de la tripsinización.

Se recogieron a continuación los datos siguientes:

1) Contaje de células: número del total de células presentes en la vasija a 72 horas:

4

2) Microscopía óptica: se observó bajo microscopio electrónico el crecimiento celular en las vasijas y sobre las membranas. Muestra A: pocas células de morfología anómala, una indicación de sufrimiento celular, más evidente cuanto más corta es la distancia desde la membrana.

Muestra B: células alargadas y adheridas presentes a una distancia de la membrana. No hay células esféricas no adherentes cerca de la membrana.

Muestra C: células alargadas y adheridas presentes a una distancia de la membrana. No hay células esféricas no adherentes cerca de la membrana.

Muestra OP: células alargadas y adheridas presentes a una distancia de la membrana. No hay células esféricas no adherentes cerca de la membrana.

3) Microscopio electrónico: observaciones de la membrana bajo SEM.

Muestra A: membrana esencialmente sin fibroblastos; sin embargo, los elementos celulares no usuales presentes muestran morfología normal.

Muestra B: no hay células en la membrana

Muestra C: no hay células en la membrana

Muestra OP: células de morfología normal presente en la membrana

A partir de los datos que se refieren al contaje celular (ensayo (1)) después de la tripsinización se ve que la membrana OP reduce sólo ligeramente el crecimiento celular con respecto al control, mientras las muestras A y C suprimen el crecimiento celular (<5.000, límite de detección inferior del procedimiento). La muestra B compuesta de colágeno y sulfato de 4-condroitina, permite asimismo la proliferación celular, según se muestra en el ensayo de contaje celular.

Sin embargo, se ve asimismo a partir de los análisis bajo microscopio óptico y electrónico que en la muestra donde no se encontró una inhibición marcada de crecimiento celular (B), estuvo ausente la colonización de la membrana en sí misma ya que los fibroblastos presentes se dispusieron todos alrededor de la membrana, pero no sobre su superficie.

La única membrana colonizada por los fibroblastos según se observó mediante SEM es la membrana OP 323 producida según el procedimiento descrito en los ejemplos anteriores. Desde un punto de vista morfológico, las células que crecieron sobre la membrana OP según se observó mediante microscopia óptica, parecieron saludables.

Ejemplo 7 Preparación del lote de membranas 40046

Se trataron 500 g de tendón de caballo (lote 40041) exactamente como se describe en el ejemplo 3, hasta la consecución de las fibras de colágeno aislada mediante precipitación por salinización a pH 5,5.

Se trataron 10 kg de dichas fibras con 20 l de NaOH 1N y se dejaron bajo agitación durante 1 hora a temperatura ambiente, a continuación se lavaron y se llevaron a pH 5,5 y a una concentración de cloruro \leq 50 ppm.

Este tratamiento con NaOH 1N además de representar el cumplimiento con una directiva EEC para los objetivos de la eliminación de contaminantes virales potenciales y agentes responsable de TSE (sin embargo mucha de esta patología no se ha encontrado hasta ahora en caballos), llevó, según se muestra en los ejemplos siguientes, mediante análisis comparativos y microscópicos, a una pureza mayor del colágeno y presumiblemente a una reducción modesta en glucosilación. En la tabla 4 se muestran los resultados de los análisis realizados sobre las membranas antes (A) y después del tratamiento con NaOH (B).

TABLA 4

5

Las fibras recogidas y pesadas se dispersaron en solución acuosa de ácido acético al 0,3% y a una concentración de colágeno supuesta (como sustancia seca) de \sim 1%. Se obtuvieron 9,48 kg de gel.

Estos 9,48 kg de gel de colágeno se pusieron bajo agitación durante 1,5 horas en una mezcladora Rayneri Dynavar SB 25 (Groupe VMI ZI, Montaign, Francia), a una velocidad número 80. Este gel se transfirió a continuación a una homogenizadora adecuada (CONDOR S.r.l., Verona) equipada con una batidora planetaria y se mantuvo al vacío y se agitó durante 3 horas a una velocidad 1 y durante 3 horas a una velocidad 2. El gel se dejó a continuación al vacío en reposo toda la noche.

El gel, libre de burbujas de aire incluidas después de este tratamiento, se dividió en bandejas de poliestireno pequeñas de 12 x 12 cm cargadas con corriente electrostática, en cantidades de 130 g de gel/bandeja, correspondiente a membranas con un peso esperado de aprox. 9 mg/cm^{2}.

Las bandejas se colocaron en una incubadora "High Performance" Mod. 2800 (F. lli Galli G. & P.- Milán) fijada termostáticamente a 28ºC sin ventilación y se dejó ahí durante aprox. 120 h.

Sobre la salida de la cabina de desecación, las películas formadas se extrajeron de las bandejas y se dejaron en contacto con el aire durante 1 h y a continuación se envasaron en una bolsa estéril. Después las membranas se cortaron en formas adecuadas, se envasaron en una doble bolsa y se sometieron finalmente a tratamiento de radiación con rayos y a una dosis de 25 Kgy.

6

Después de la digestión enzimatica con colagenasa las cinéticas de liberación de hidroxiprolina, en las membranas 40046, medidas según se muestra en el ejemplo 4 (con p-dimetilaminobenzaldehído), demostraron ser perfectamente comparable con las de las membranas de colágeno preparadas como en el ejemplo 4, es decir, sin tratamiento con hidróxido de sodio.

Ejemplo 8 Preparación de membranas del lote 40046/LL

Siguiendo la eliminación del ácido acético residual mediante lavado, algo de las membranas 40046, preparadas según se describe en el ejemplo 7, se cortaron en cuatro partes y se colocaron en agua destilada, que se cambió 4 veces consecutivas después de 1 hora de inmersión cada vez.

Las membranas se desecaron mediante liofilización con una temperatura en el intervalo de –30ºC a +30ºC.

Se obtuvieron las membranas marcadas 40046/LL, que mostraron un aspecto superficial arrugado, básicamente rizado y escasamente hidrofílico, característico de una estructura proteica desnaturalizada superficialmente.

Los análisis proporcionaron los porcentajes siguientes:

Humedad: 13,5%

Contenido en ácido acético: 50,23%

Después del análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC), la desnaturalización térmica de 40046LL que sucedió a las temperaturas t_{inicio} 49,62ºC, t_{máx} 56,09ºC y t_{final} 62,17ºC, contra los respectivos valores de membrana 40046 de 43,74ºC, 49,52ºC y 55,29ºC, mientras la capacidad de calor aparente fue 6,09 cal/g para la membrana 40046/LL, comparada con 2,82 cal/g para la membrana no lavada/liofilizada 40046.

Se sometieron asimismo las membranas 40046 y 40046/LL al ensayo de absorción y de evaporación de agua.

Las membranas 40046 absorbieron 9% de su peso en agua en 4 horas, mientras las membranas 40046/LL absorbieron sólo 4,3%. Por otro lado, las últimas liberaron el agua absorbida con una velocidad 40% inferior que la de la evaporación de las membranas 40046.

Estos resultados indican que el procedimiento de liofilización no es adecuado para las membranas de colágeno ya que degrada parcialmente la estructura proteica del colágeno superficial.

Ejemplo 9 Preparación de las membranas 40036

Las membranas 40036 se prepararon como las 40046 (ejemplo 7) con la exclusión solamente del tratamiento alcalino de las fibras de colágeno con NaOH 1N.

Ejemplo 10 Preparación de membranas P322

Se preparó gel de colágeno al 1% del lote nº 78631 de tendón de Aquiles equino, según se describe en el ejemplo 3. Se colocan 2 kg de dicho gel en un recipiente al vacío de 10 litros durante 60' para una evacuación del aire ocluido, a continuación se dividió en placas de 90 mm \diameter de forma que fuera capaz de tener una membrana de aprox. 16 mg de residuo seco/cm^{2}. Las placas se secaron con aire mediante desecado espontáneo en incubadora. Todas las operaciones se llevaron a cabo bajo carga microbiológica controlada. Se obtuvo las membranas marcadas P322 del lote 88225.

Ejemplo 11 Preparación de membranas 40049A/S que consisten en su mayor parte en colágeno de tipo II

Se agitaron durante 5 h 0,9 kg de tráquea de cerdo molida (lote RD/7) en 5 l de NaOH 0,5M a temperatura ambiente y a continuación a 5ºC.

El residuo se recogió sobre un filtro que consistía en una red metálica fina, lavado con agua 3 x 2 litros y neutralizado a un pH de 7 con 80 ml de HCl 1N.

La masa se trató dos veces con 2 l de acetona cada vez. La etapa hidroacetónica se eliminó, la masa se lavó con agua, se añade 14 l de agua, 30 ml de HCl 1N hasta un pH de 2,6 y 90 g de pepsina de mucosa gástrica de cerdo, Merck a 700 FIP U/g (lote 15506) y se dejó bajo agitación lenta durante 24 h a 20-24ºC.

Se filtraron al vacío 5,5 l de dicha suspensión, en un buckner con filtros octex® y auxiliar de filtro precapa. El filtrado, opalescente, se llevó a pH 3,5 con HCl, se trató con NaCl hasta 0,7 M y se dejó en reposo toda la noche.

\newpage

El precipitado claro, que consistía en fibras de colágeno de tipo II, se recogió mediante centrifugación. Se obtuvieron 80 ml de fibras húmedas y se marcaron 40049A.

Se colocan 80 ml de fibras 400492 en un tubo de diálisis Spectrapor MWCO 1000 de 4,5 \diameter y de longitud 70 cm, y se dejan ahí durante 48 h a temperatura ambiente con cambios periódicos de agua.

El material retenido, aprox, 100 ml se lleva a pH 3,36 con solución de HCl al 50%. El gel obtenido (1,18% de residuo seco) se dividió en cápsulas de petri de poliestireno, 5,5 cm \diameter, para dar un aumento de 9 mg/cm^{2} a las membranas, y se secó primero durante 30 h en una estufa y a continuación al aire en placas a 30ºC.

Las membranas resultantes se marcaron 40049A/S.

Ejemplo 12 Análisis de película de colágeno bajo el microscopio electrónico óptico, de barrido y de transmisión

Las membranas de colágeno marcadas 40039/E o 40046, preparadas según se describe en los ejemplos descritos anteriormente, se lavaron con H_{2}O destilada estéril, durante aprox. 15 horas, a continuación se sometieron a análisis mediante microscopía electrónica óptica, de barrido y de transmisión.

Se tiñeron secciones semifinas, perpendiculares a la superficie de la membrana, con colorantes básicos del grupo tiazina y se observaron bajo el microscopio óptico. Una superficie (más probablemente la superior) es lisa, compacta e intensamente coloreada; la superficie inferior es menos homogénea, más suelta y más irregular (Fig. 5).

Bajo el microscopio electrónico de barrido, la membrana pareció que estaba formada de un látex tridimiensional de fibrillas de colágeno, la mayoría de las cuales estaban fijadas en haces longitudinales paralelos a la superficie del gel. Un lado del gel, más probablemente el inferior, posee fibrillas más largas y están dispuestas de una manera más uniforme respecto a la otra superficie (superior), que sobre todo está más arrugada y es heterogénea (Figura 6).

Bajo el microscopio electrónico de transmisión, las fibrillas de colágeno, de dimensiones diversas, forman un látex tridimensional, con orientación predominante en una dirección paralela a la superficie del gel. La textura es, en algunos puntos, bastante regular.

La mayoría de las fibrillas de colágeno son lineales, algunas plegadas y la disposición no está clara. Según se menciona, el diámetro de las fibrillas es muy variable, mientras la disposición periódica, cuando se reconoce, es 640 nm para el colágeno nativo.

Ejemplo 13 Medición del crecimiento de fibroblastos dérmicos cultivados sobre películas de colágeno.

Se utilizaron fibroblastos dérmicos humanos, aislados de las biopsias de piel humana de sujetos adultos sanos, cultivados en el medio de cultivo modificación de Dulbecco del medio Eagle (DMEM) a una concentración de glucosa elevada, que contiene 2mM de L-glutamina, 100 IU/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 1 mM de piruvato de Na, aminoácidos no esenciales (NEAA) IX y suero fetal bovino (FBS) a una concentración final de 10%.

En este ensayo, los fibroblastos se depositaron en una "portaobjetos de cámara" de dos vasijas (área= 8,26 cm^{2}), 30.000 células/vasija en un volumen final de 2 ml de medio de cultivo.

Las células se depositaron directamente en una vasija, en la otra antes de la deposición, se colocó la película de colágeno con el lado opaco mirando hacia arriba.

Se utilizó el ensayo MTT (sales de tetrazolio) para determinar el crecimiento de las células.

Este ensayo se basó en la reducción intracelular de las sales de tetrazolio, mediante la deshidrogenasa mitocondrial, en un producto de color rojo ladrillo insoluble en agua (cristales de formazán). Los cristales se solubilizan con dimetilsulfóxido y la solución coloreada obtenida se mide utilizando el espectrofotómetro a una longitud de onda de 565 nm.

Las células vitales, a diferencia de las muertas, reducen las sales de tetrazolio. Este ensayo se utiliza mayoritariamente para medir la vitalidad celular y como un indicador de proliferación.

El número de fibroblastos, crecidos sobre la vasija de plástico adaptada bien al crecimiento celular, aproximadamente era doble en el 4º día de cultivo con respecto al 1º día de deposición.

Los fibroblastos crecidos sobre la película de colágeno muestran la misma tendencia (Figura 7).

Ejemplo 14 Análisis de fibroblastos dérmicos cultivados sobre la película de colágeno bajo el microscopio confocal

Para comprobar la morfología de las células cultivadas sobre las membranas de colágeno y el nivel de crecimiento, después de 3 y 6 días de cultivo, se fijaron las membranas de colágeno con los fibroblastos y se tiñeron con Phalloidine fluoresceinada, que emite radiación verde y destaca el citoesqueleto de actina y con tubulina rodaminada que emite radiación roja y destaca las estructuras de tubulina.

Después de la tinción, las membranas con los fibroblastos, se examinaron bajo microscopio óptico de fluorescencia y bajo el microscopio confocal.

Las células cultivadas sobre la membrana de colágeno fueron claramente visibles y parecieron estar distribuidas en diferentes niveles de la película.

Después de 3 días, las células todavía no habían alcanzado la confluencia. Parecían heterogéneas: alargadas con protrusiones delgadas, poligonales, triangulares. Se observaron en ciertos campos células mitóticas.

En el día 6, los fibroblastos, de forma poligonal y alargada, estaban en la confluencia, cubrieron todo el espacio de membrana (Figura 8 fibroblastos crecidos sobre la película de colágeno en el 6º día de cultivo (marcados con Phalloidine). Obj.:10,0. Zoom: 1,430).

Ejemplo 15 Crecimiento, proliferación y evaluación de la vitalidad de condrocitos tomados del cartílago de la rodilla de pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico prostético

Las membranas de colágeno del lote 40046, preparadas según se describe en el ejemplo 7, se utilizaron en un esquema experimental adecuado para evaluar el crecimiento, proliferación y vitalidad de los condrocitos humanos tomados del cartílago de la rodilla de pacientes sometidos a tratamiento quirúrgico para el implante de prótesis.

Los cultivos crecieron en suero autógeno y se examinaron a 0, 1, 7, 14, 21 y 35 días. El crecimiento y vitalidad de las células se ensayaron en un ensayo MTT, se redujo bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio a formazán mediante la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa según Denizot F., Lang R., J. Immunol Methods, 89, 271-277, 1986.

Después de 7 días se encontró sorprendentemente que no sólo están las células vitales y saludables sobre las membranas en el cultivo sino que crecieron más de lo que se esperaba. Debido a su crecimiento impresionante sobre las membranas, fue difícil para el analista evaluar su grado de proliferación, ya que han alcanzado el punto de confluencia muy pronto.

Para evaluar el crecimiento de condrocitos y la vitalidad durante 35 días, tuvo que modificarse el protocolo: en lugar de depositar 1.000.000 células/cm^{2}, depositaron membranas 40046 con 250.000 células/cm^{2}.

Después de esta modificación, se observó la misma morfología saludable y la misma velocidad de proliferación inesperada después de 35 días de cultivo.

Los resultados extremadamente positivos tanto en fibroblastos como en condrocitos podrían ser, por lo menos en parte, debidos al tratamiento alcalino adicional y a la etapa de precipitación adicional de las fibrillas de colágeno introducidas en el procedimiento de preparación.

Ejemplo 16 Ensayos comparativos para determinar la proliferación y la vitalidad de condrocitos humanos sobre algunas membranas de colágeno

Se han cultivado durante 7 días en paralelo 1 x 10^{4} condrocitos de cartílago humano sobre las siguientes membranas:

- 40046, preparada según se describe en el ejemplo 7

- 40046LL, preparada según se describe en el ejemplo 8

- 40036, preparada según se describe en el ejemplo 8,

- P322, preparada según se describe en el ejemplo 10

- 40049/A/S, preparada según se describe en el ejemplo 11

- Chondro-gide, Geistlich.

Al final del periodo establecido, las membranas colonizadas por células, se han coloreado con safranina-O, lo que destaca el grupo de sulfato característico de la matriz extracelular cartilaginosa sintetizada mediante condrocitos vitales. La histomorfometría de los condrocitos cultivados sobre las membranas se ha evaluado mediante análisis de imágenes y se ha representado los resultados como área de la parte colonizada de la membrana expresada como porcentaje de la membrana entera.

El histograma muestra que las mejores membranas, entre las examinadas, son 40049/A/S y 40046. En particular, la membrana 40046 se ha elegido para otros estudios porque está compuesta de colágeno equino de tipo I ya caracterizado desde el punto de vista inmunológico y toxicológico (ver Bianchini P., Parma B., Ameim-Forsh 51 (I, 414-419, 2001). En la figura 10 y en la 11 se muestran las imágenes de microscopía óptica relacionadas con la colonización de los condrocitos de dos membranas diferentes: Chondro-gide y membrana 40046.

Claims (31)

1. Membranas de colágeno de doble cara con un lado poroso adecuado para la adhesión y/o crecimiento de células y un lado liso, caracterizado porque el colágeno se dispone a un nivel macromolecular en el lado liso, que se puede obtener mediante la aplicación de un campo eléctrico o de una carga electrostática a un gel de colágeno.

2. Membranas según la reivindicación 1, en las que dicho colágeno se elige de entre: colágeno de tipo I, II, III o IV, o una mezcla que consiste en por lo menos dos de los cuatro tipos.

3. Procedimiento para la preparación de las membranas de colágeno según la reivindicación 1, caracterizado porque el gel de colágeno se vierte y se permite desecar sobre una bandeja sobre la que se ha inducido una carga electrostática.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho colágeno posee una concentración de colágeno comprendida entre 0,5-6%.

5. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicha desecación del gel sucede a una temperatura de por lo menos 40ºC, durante un tiempo de por lo menos 40 horas.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha temperatura de desecación está entre 20 y 30ºC.

7. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha desecación se realiza en ausencia de cualquier turbulencia de aire.

8. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicho gel de colágeno se produce con un procedimiento que comprende esencialmente las etapas siguientes:

a) desmenuzamiento mecánico de un tejido conectivo y homogenización en una suspensión de colágeno,

b) tratamiento de la suspensión de colágeno con enzimas proteolíticas,

c) tratamiento alcalino de la suspensión de colágeno a un valor de pH de por lo menos 8 y una neutralización con un ácido fuerte a un pH comprendido entre 5 y 6,

d) precipitación de las fibras de colágeno mediante precipitación por salinización,

e) resuspensión del precipitado en una solución acuosa diluida con un ácido débil y la obtención de un gel de colágeno.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que las etapas adicionales se añaden entre la etapa d) y la e):

d') suspensión del precipitado en una solución fuertemente alcalina mezclando durante un tiempo de por lo menos 30', d'') precipitación de las fibras de colágeno mediante precipitación por salinización de la solución alcalina a valores de pH comprendidos entre 5 y 6.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicha solución alcalina es NaOH 1N.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho tiempo está comprendido entre 45' y 75'.

12. Procedimiento según las reivindicaciones 9 ó 10, en el que dicho tejido conectivo de la etapa a) se deriva de un mamífero.

13. Procedimiento según las reivindicaciones 8 ó 9, en el que el tejido conectivo de la etapa a) es tendón.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho tendón es equino.

15. Procedimiento según las reivindicaciones 8 ó 9, en el que dicho tejido conectivo de la etapa a) es un tejido de tráquea.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicho tejido de tráquea se deriva de un bovino, un cerdo o un equino.

17. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que el desmenuzamiento y la homogenización de la etapa a) ocurre después de la adición de una solución acuosa y hasta la consecución de una suspensión que consiste en partículas de colágeno menores de 25 de paso de tamiz en tamaño.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la homogenización está seguida de micronización.

19. Procedimiento según las reivindicaciones 8 ó 9, en el que la enzima proteolítica de la etapa b) del procedimiento es pepsina y el tratamiento ocurre a un pH comprendido entre 2 y 3 durante un tiempo comprendido entre 10 y 20 horas.

20. Procedimiento según las reivindicaciones 8 y 9, en el que la resuspensión del precipitado de colágeno de la etapa e) se realiza a una concentración de colágeno comprendida entre 0,5 y 6%.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicha concentración está entre 2 y 3%.

22. Procedimiento según las reivindicaciones 8 ó 9, en el que dicha solución acuosa diluida, como en la etapa (e) del procedimiento, es una solución de ácido acético.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicha solución de ácido acético posee una concentración comprendida entre 0,1 y 1% (p/V).

24. Procedimiento según las reivindicaciones 8 ó 9, en el que el gel de colágeno obtenido en la etapa e) del procedimiento se homogeniza adicionalmente y se desgasifica mediante aspiración de cualquiera al vacío.

25. Membranas de colágeno que se pueden obtener mediante el procedimiento según las reivindicaciones 3-7.

26. Utilización de membranas de colágeno según las reivindicaciones 1 o 25 como soportes para la adhesión in vitro, crecimiento o colonización de células de mamíferos.

27. Utilización de las mebranas de colágeno, según la reivindicación 26, en la que dichas células de mamífero se seleccionan de entre: células germinales, fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, osteocitos y condrocitos.

28. Membranas según las reivindicaciones 1 ó 25 para utilizar en terapia.

29. Utilización de las membranas según la reivindicación 28 para la preparación de matrices celulares para la reconstrucción de tejido.

30. Utilización según la reivindicación 29, en el que dicha reconstrucción de tejido se elige de entre: reconstrucción de tejido epitelial, endotelial, conectivo, cartilaginoso, óseo y osteo-cartilaginoso.

31. Membranas según la reivindicación 28 para la reconstrucción de tejido en enfermedades degenerativas crónicas.