DE60106056T2

DE60106056T2 - Kollagenmembran mit makromolekularer anordnung

Info

Publication number: DE60106056T2
Application number: DE60106056T
Authority: DE
Inventors: Bruna Parma
Original assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA; Opocrin SpA
Current assignee: Mediolanum Farmaceutici SpA; Opocrin SpA
Priority date: 2000-08-02
Filing date: 2001-08-01
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2021-08-02
Also published as: IT1318663B1; WO2002009790A8; DK1307247T3; ES2228942T3; ITMI20001794A1; DE60106056D1; CA2418052A1; ATE277648T1; EP1307247B1; EP1307247A1; WO2002009790A1; ITMI20001794A0; AU2001285858A1; PT1307247E; US20040013712A1

Description

TECHNISCHER BEREICH
Der technische Bereich der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von biokompatiblen Trägern insbesondere bestehend aus Kollagenmembranen zur Geweberekonstruktion.
STAND DER TECHNIK
Kollagen ist ein Skleroprotein, das in verschiedenen Arten in tierischen Geweben und Organen vorkommt. Beim Menschen ist es eines der häufigsten Strukturproteine und hat einen Anteil von etwa 30% am Gesamtprotein.
Es gibt verschiedene Kollagentypen, die sich hauptsächlich hinsichtlich ihrer ursprünglichen Gewebe- oder Organfunktion unterscheiden. Umfangreiche Literatur ist verfügbar für alle Kollagentypen bezüglich primärer und sekundärer Struktur, Zusammensetzung, Reinheit und Verwendungsmöglichkeiten (Marcel E. Nimni Collagen Biochemistry, Biochemistry and Biomechanics, Biotechnology, CRC Press Inc. Boca Raton Florida 1988;Cunningham and Frederiksen Methods in Enzymology, Academic Press, New York, 1–554,1982).
Bekannt ist auch, dass die Eigenschaften des Kollagens nicht nur allein von der Struktur der Proteinmonomere abhängen, welche für den Aufbau der Dreifach-Helix der Faser verantwortlich sind, sondern vor allem von der komplexen makromolekularen Organisation, die sowohl hinsichtlich dieser als auch anderer Strukturproteine mit mechanischen Funktionen (z.B. Myosin und Tropomyosin in Muskelfasern etc) unterscheidet und auch anhand der Organisation in Fibrillen, dem Supercoiling und der Organisation in Kopf-Schwanz-Monomere und so weiter.
Die makromolekulare Organisation von nativen Kollagenstrukturen geht bei dem Kollagenextraktionsverfahren teilweise verloren. Zum Teil kann diese künstlich wiederhergestellt werden, beispielsweise durch chemische Quervernetzung. Mithilfe dieser Behandlung wird, wenn auch nur partiell, die mechanische Widerstandskraft der Kollagenfibrillen wiederhergestellt und das Endprodukt somit resistenter gegenüber proteolytischer Verdauung.
Bislang sind viele auf Kollagen allein basierende Zusammensetzungen oder zusammen mit Zusätzen von anderen natürlichen Verbindungen für die medizinische Praxis eingeführt worden sowohl in Form von Gel und filzartigen Geflechten, Membranen oder Pflastern, als auch in Form von stimulierenden Agenzien zur Narbenbildung bei der Wundheilung oder als Trägerstoffe oder Medien für die langsame Freisetzung anderer Wirkstoffe oder als zur Interaktion mit Zellen geeignete Matrices.
Die Bedeutung von Kollagen als einem geeigneten Substrat zur Begünstigung von Zellinteraktion und -wachstum ist in der Tat bekannt. Auch bekannt ist die Vorliebe von Zelllinien unterschiedlicher Herkunft für verschiedene Kollagentypen: beispielsweise wachsen Hautfibroblasten und endotheliale Epithelzellen (Murray J.C. et al. Cancer Res. 40,347,1980: Wicha M.S. et al. Exp. Cell Res. 124,81, 1979) besser auf Kollagen Typ IV (ein Kollagentyp, der in der Basalmembran vorliegt) während Chondrocyten den Kollagentyp II favorisieren (der im hyalinen Knorpel vorkommt) (Hewit A.T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,385, 1980), sie passen sich allerdings auch dem Wachstum an den Kollagentyp I und III an.
Bei dieser Anwendungsweise erwies sich auch die Anwesenheit von Fibronectin, endogen durch die Zellen produziert, (Grinnel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75,4408 (1978) als bedeutend für die Adhäsion von Fibroblasten auf dem Kollagensubstrat (Pearlstein E.; Int. J. Cancer 22,32, 1978) und die Anwesenheit von Chondronectin für die Interaktion der Chondrocyten mit dem Kollagen (Hewit et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,385 (1980).
In der Literatur findet sich eine Reihe von Anwendungsmöglichkeiten für Kollagen sowie Extraktions- und Herstellungsmethoden.
Das US-Patent 5,785,983 beansprucht ein Herstellungsverfahren für Membranen vom Kollagen Typ I, welche chemisch nicht modifiziert sind und aus in nicht haftenden (non-stick) Teflon-Trays verteiltem Kollagengel durch langsame Exsikkation unter geeigneten Temperatur- und Vakuumbedingungen sowie Stickstoffatmosphäre gewonnen wurden. Die auf diese Weise erhaltenen Membranen werden zur Narbenheilung bei Wunden und Brandwunden vorgeschlagen und als Interpositionsbameren, um Adhäsion nach inneren chirurgischen Eingriffen zu verhindern. Die Herstellung von Kollagengel aus Rindersehnen ist beschrieben in WO98/44809.
Viele Patente, wie EP 284789 , liegen vor bezüglich filzartigen Geflechten oder Kollagenmembranen erhalten durch Einfrieren und rasche Lyophilisation von Kollagenlösungen in Gelform. Die Struktur eines solchen filzartigen Geflechtes ist unorganisiert, da solche Prozesse ähnlich wie bei einem Schnappschuss mit der Kamera, die nicht organisierten Kollagenfasern in der Lösung fixieren. Wie in EP 284789 erwähnt, ist die erhaltene Struktur nicht geeignet, um Zellwachstum zu ermöglichen. In der Literatur wird beschrieben, wie die Porengröße eines solchen filzartigen Geflechtes durch Temperaturkontrolle beim Einfriervorgang reguliert wird. Die entstehenden Poren haben allerdings einen Durchmesser, der größer ist als derjenige von Kulturzellen, die somit diese Poren passieren können (Boyce et al. J. Biochem. Mat. Research, 1988 22:939–957). Darüber hinaus besitzen diese Membranen nur eine beschränkte Widerstandkraft, da das im Extraktionsvorgang denaturierte Kollagen nur unzureichend organisiert ist.
Das Patent WO95/18638 beansprucht reabsorbierbare Kollagenmembranen als Träger bei der Gewebereparatur, die charakterisiert sind durch zwei verschiedenen Seiten, eine fibröse, geeignet für das Zellwachstum und eine glatte zur Verhinderung von Adhäsion. Solche Membranen werden erhalten aus Peritoneal- oder Plazentamembranen verschiedener Säugetierarten, darunter Kälbern, und werden mithilfe eines groben Verfahrens umfassend Reinigung, Dehydratation und Entfettung mithilfe von Aceton und N-Hexan hergestellt. Aufgrund der verwendeten Herstellungsmethode haben die Membranen die Form und das Ausmaß der Organe, aus denen sie ursprünglich stammen und auch die entsprechenden deutlichen Kennzeichen wie beispielsweise die Porosität. Auch ähnelt der Kollagentyp stark dem des Ausgangsgewebes.
Das Patent WO 96/25961 beansprucht reabsorbierbare Matrices vom Kollagentyp II (aus Knorpel), die geeignet sind zur Rekonstruktion von natürlichem Knorpelgewebe. Solche Matrices werden durch Einfrieren und/oder Lyophilisation hergestellt und können mit Glycosaminglykanen kombiniert werden.
Das Patent WO 99/19005 beansprucht eine Multischicht-Membran einschließlich einer Matrix hauptsächlich aus Kollagentyp II, bestehend aus einer porösen Seite und einer relativ nicht-permeablen Seite. Hergestellt wird diese Membran durch sukzessive Stratifizierung von Kollagenmatrices (vorher entfettet mit Aceton) und anschließend werden dann Portionen von Kollagengel in sukzessiven und alternierenden Zyklen auf solchen Membranen lyophilisiert.
Insofern steht bei dem Herstellungsverfahren von Kollagenmembranen die Extraktion von Kollagen in halb-gereinigter fester oder Gelform im Mittelpunkt, welches dann rasch eingefroren und getrocknet wird. Im Allgemeinen wird das Kollagen nachfolgend chemisch modifiziert durch Quervernetzung, die auf beliebige Art ohne makromolekulare Reorganisation auftritt, wie es für native Fibrillen typisch ist, um so die mechanische Widerstandkraft der Membran zu stärken. Alternativ dazu können die Membranen durch langsame Evaporation des Kollagengels hergestellt werden oder direkt aus in der Natur bereits vorliegenden Kollagenmembranen, die nur partiell gereinigt werden.
Ein bislang noch ungelöstes technisches Problem bleibt die Herstellung von Kollagenmembranen, bei denen das Kollagen auf makromolekularer Ebene in einer der natürlichen Form sehr ähnlichen Weise angeordnet ist, wobei diese Membranen mit mechanischer Widerstandskraft und Elastizität ausgestattet und somit entsprechend den Anforderungen des Rekonstruktionsortes formbar sind.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf doppelseitige Kollagenmembranen mit einer porösen Seite, welche geeignet ist für die Adhäsion und/oder das Wachstum von Zellen und einer glatten Seite, die dadurch gekennzeichnet ist, dass das Kollagen an der glatten Seite eine Anordnung auf molekularer Ebene aufweist, die der natürlichen sehr ähnlich ist. Solche Kollagenmembranen umfassen die Kollagentypen I, II, III oder IV. Zusätzlicher Gegenstand dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Kollagenmembranen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Kollagengel sehr langsam auf Platten oder Trays, an denen eine elektrische Ladung induziert wird, aufgebracht und getrocknet wird und die Verwendung der Kollagenmembranen als Trägermedien für die Adhäsion und/oder das Wachstum von Säugetierzellen in vitro und in vivo, insbesondere bei der Verwendung zur Geweberekonstruktion (zum Beispiel für Epithel-, Knochen-, Knorpel- oder Bindegewebe), die durch eine Matrix gestützt oder induziert wird.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Abbildung 1. Glatte Seite der Membranen betrachtet unter dem Rasterelektronenmikroskop (SEM= Scanning Electron Microscope).
Die Probe wurde behandelt wie folgt: 2 kleine Anteile der erfindungsgemäß hergestellten Membran (etwa. 5 × 3 mm) wurden aus jeder einzelnen Probe herausgeschnitten. Diese wurden dann auf einen speziellen Metallträger (Stub) aufgebracht, so dass die glatte Seite jeder einzelnen Probe (A, B und E) frei zugänglich war. Die Proben wurden mit einem Palladiumgoldfilm überzogen, um ihre Oberfläche leitend zu machen und die Beobachtung unter dem SEM zu ermöglichen.
SEM-Analysen der glänzenden Oberfläche der Proben hoben deutlich die Anwesenheit von Fasern hervor, die im glatten Anteil auf makromolekularer Ebene angeordnet sind.
Abbildung 2. Poröse Seite der Membranen betrachtet unter dem Rasterelektronenmikroskop (SEM).
Die Probe wurde behandelt wie folgt: 2 kleine Anteile der erfindungsgemäß hergestellten Membran (etwa 5 × 3 mm) wurden aus jeder einzelnen Probe herausgeschnitten. Diese wurden dann auf einen speziellen Metallträger (Stub) aufgebracht, so dass die opake Seite jeder einzelnen Probe (markiert durch einen leichten Einschnitt auf dem Träger) (A, B und E) frei zugänglich war. Die Proben wurden mit einem Palladiumgoldfilm überzogen, um ihre Oberfläche leitend zu machen und die Beobachtung unter dem SEM zu ermöglichen.
SEM-Analysen der opaken Oberfläche der Proben hoben deutlich die Anwesenheit von oberflächlichen Unregelmäßigkeiten, Hervorwölbungen und „Blasen" hervor, die der Membran eine gewisse Porosität verleihen.
Abbildung 3. Resistenz der Membranen gegenüber Verdauung mit Kollagenase.
Die erfindungsgemäß hergestellten Membranen (Batch P323 und P50027) und kommerziell erhältliche Membranen (ChondroGide, Antema F und Antema S) wurden einer enzymatischen Verdauung mit Kollagenase unterzogen. Der Gehalt an freiem Hydoxyprolin, einem Indikator der enzymatischen Verdauung, wurde 24 Stunden später in den Proben gemessen: die erfindungsgemäßen Membranen erwiesen sich nach einem solchen Zeitraum als widerstandsfähiger.
Abbildung 4. Mechanischer Widerstandskurve der erfindungsgemäßen Membranen
Proben in Form kleiner Hundeknochen (Maximallänge 76,7 mm und der schmalste Teil mit 4 mm Breite und 22 mm Länge) wurden aus den hergestellten Membranen ausgeschnitten und Zugbelastungstests unterzogen gemäß den konventionellen Verfahren mit einer „Chantillon"-Vorrichtung HTC mod. (USA). Die mittleren Widerstandswerte gemessen in kg an absoluter Zugfestigkeit wurden für 3 Familien von Proben (3–6 Proben für jede Familie) mit unterschiedlicher Dicke in Form einer Grafik dargestellt. Das Verhältnis zwischen mittlerer Dicke (x) in mm und mittlerer Belastung beim Bruch der Membranen am Punkt der absoluten Zugbelastbarkeit (Y) ist in der logarithmischen Gleichung wiedergegeben: Y=11,42 + 7,08 log x mit einem Korrelationsindex R²=0,999.
Abbildung 5. Optische Mikroskopie der gemäß Beispiel 7 hergestellten Kollagenmembranen
Semi-Dünnschnitte rechtwinklig zur Membranoberfläche der 40046 Membran wurden mit basischen Farbstoffen der Thiazingruppe gefärbt und unter dem optischen Mikroskop untersucht. Eine Oberfläche (die obere in der Abbildung entsprechend der Seite in Kontakt mit der elektrostatischen Ladungsseite des Trays während der Trocknungsphase ist glatt, kompakt und intensiv gefärbt. In Richtung auf die entgegengesetzte Oberfläche, die der unteren Oberfläche auf dem Bild entspricht (diejenige, die während der Trocknungsphase der Luft ausgesetzt ist) erscheint die Struktur weniger homogen, aufgelockerter und ungleichmäßig. Vergrößerung 50x.
Abbildung 6. Kollagenmembranen Batch 40046, betrachtet unter dem Elektronenmikroskop.
Semi-Dünnschnitte der gemäß Beispiel 7 hergestellten Kollagenmembranen, rechtwinklig geschnitten zur Membranoberfläche, wurden gemäß Maunsbach AB und Afzelius B. Academic Press, hergestellt. Beobachtet wird, dass der untere Teil des Bildes, welcher der Seite in Kontakt mit der Luft während der Trocknungsphase (lichtundurchlässige Seite) entspricht, unregelmäßig ist, während die entgegengesetzte Seite der Abbildung gleichmäßiger erscheint und die Kollagenfasern kompakter und in longitudinaler Richtung angeordnet sind.
Abbildung 7. Wachstum von Hautfibroblasten auf Kollagenmembranen 40046 im Vergleich zum Wachstum in für die Zellkultur behandelten Plastik-Wells.
Das Wachstum von Hautfibroblasten auf Kollagenmembranen, die gemäß Beispiel 7 (40046) hergestellt wurden, wurde verglichen mit dem Wachstum von für die Zellkultur behandelten Plastik-Wells, bestimmt mittels MTT-Test wie in Beispiel 13 beschrieben. Fibroblast auf Kollagenmembran (-O-) und Fibroblast auf Platik-Wells (-•-). O.D.= Optische Dichte.
Abbildung 8. Hautfibroblasten nach 6 Tagen Wachstum auf Kollagenmembranen betrachtet unter dem Konfokalmikroskop.
Hautfibroblasten wurden auf Kollagenmembranen aufgebracht, die erfindungsgemäß hergestellt und nach 6 Tagen wie in Beispiel 14 beschrieben gefärbt wurden. Die Zellen wurden bis zum Erreichen des Konfluenzstadiums wachsen gelassen. Die mikroskopische Betrachtung zeigte, dass die Zellen auf verschiedenen Ebenen der Membran wuchsen. Am Tag 6 befanden sich die Fibroblasten mit polygonaler und gestreckter Form, die die gesamte Membran (markiert mit Phalloidin) bedeckten, im Konfluenzstadium; Obj.: 10,0, Zoom: 1,430.
Abbildung 9. Histomorphometrie der erfindungsgemäßen Kollagenmembranen und kommerzieller Kollagenmembranen.
Humane Chondrocyten (1 × 104) wurden für 7 Tage auf erfindungsgemäß hergestellten Membranen (40046, 40036 und 40049A/S) wachsen gelassen oder erfindungsgemäß angezogen aber lyophilisiert (40046LL) oder auf kommerziell erhältlichen Membranen (P322 und C-G) gezüchtet. Am Ende des 7-Tage-Zeitraumes wurden die Membranen, die in unterschiedlichem Maße von Zellen kolonisiert waren, mit Safranin-O gefärbt, ein Farbstoff der spezifisch für extrazelluläre Matrixsulfatgruppen ist, wie in Beispiel 16 beschrieben. Da nur lebensfähige Chondrocyten eine knorpelige Matrix synthetisieren, bedeutet eine positive Safraninfärbung, dass die Zellen leben und diese Fähigkeit nicht verloren haben. Die Histomorphometriedaten für jede einzelne Membran wurden erhalten, indem für jede einzelne Membran der Prozentsatz an der Gesamtoberfläche, der nach Ablauf der 7 Tage durch Chondrocyten kolonisiert war, geplottet wurde (Aa%).
Abbildung 10. Mikroskopische Analyse von kommerziell erhältlicher Kollagenmembran (ChondroGide).
Auf einer kommerziell erhältlichen Membran gezüchtete Chondrocyten wurden mit Safranin-O gefärbt. Es fanden sich nur wenige Zellen, die länglich geformt und nicht intensiv gefärbt waren, woraus sich auf eine geringe Fähigkeit zur Synthese der extrazellulären Matrix schließen lässt. Die Zellen sind in einer einzigen Schicht auf der Membran angeordnet.
Abbildung 11. Mikroskopische Analyse der gemäß dem Beispiel 7 hergestellten Membran 40046
a) Auf Membran 40046 angezogene Chondrocyten wurden mit Safranin-O angefärbt. Auf dieser Membran angezogene Chondrocyten unterscheiden sich morphologisch sehr stark von denjenigen in 10: sie sind abgerundet, intensiv gefärbt aufgrund der reichhaltig vorhandenen Sulfatgruppen und sie wachsen in mehreren Schichten, wodurch sich zeigt, dass sie die Membran penetrieren können. b) Detailvergrößerung.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind doppelseitige Kollagenmembranen mit einer glatten Seite und einer porösen. Die erstere ist auf makromolekularer Ebene organisiert und die letztere eignet sich für die Anzucht von Säugetierzellen. Solche Membranen sind dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen an der glatten Seite auf makromolekularer Ebene und die Fibrillen im zweidimensionalen Raum angeordnet sind. Die Membranen der vorliegenden Erfindung sind mit einer hohen mechanischen Resistenz ausgestattet und auch nur in geringem Maß resorbierbar. Sie sind daher hilfreich zur Verwendung in in vivo Geweberekonstruktionen. Ein zusätzlicher Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von Kollagenmembranen zur Geweberekonstruktion; diese sind tatsächlich biokompatibel und werden in vitro durch Säugetierzellen kolonisiert, die bevorzugt ausgewählt werden unter: Stammzellen, Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, Osteocyten, Chondrocyten.
Die erfindungsgemäßen Membranen bestehen hauptsächlich aus den Kollagentypen I, II, III oder IV oder Mischungen von mindestens zwei der unterschiedlichen Kollagentypen. Sie haben einen Kollagengehalt zwischen 70% und 95% gemessen als Trockenkollagenrest und entsprechend einem Gesamthydroxyprolingehalt zwischen 9% und 13% und einem Wassergehalt, der 15% nicht überschreitet. Andere Bestandteile können auch enthalten sein, wie beispielsweise natürliche Substanzen und biologische Komponenten bestimmter „Bereiche" des Körpers oder Charakteristika spezieller Organe oder bestimmter Funktionen wie beispielsweise Hyaluronsäure oder Glykosaminoglycan in verschiedenen prozentualen Anteilen. Die erfindungsgemäßen Membranen sind nicht immunogen, da die Telopeptide, die den endständigen Teil der Kollagenfibrillen bilden durch enzymatische Verdauung mit Proteasen entfernt werden: Das Kollagen, aus dem solche Membranen aufgebaut sind, wird daher auch als Atelokollagen (Kollagen ohne terminale Telopeptide) bezeichnet. Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren für die Herstellung solcher Kollagenmembranen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kollagengel in elektrostatisch geladene Trays oder Platten gegossen und danach langsam über einen Zeitraum von mehr als 40 Stunden getrocknet wird oder bis die Membranen einen Wassergehalt erreicht haben, der nicht über 15% liegt. Die Trocknung des Kollagengels erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 10 und 40°C, vorzugsweise zwischen 20 und 30°C und noch idealer bei 26°C in einem turbulenzfreien ventilierten Inkubator, einem Inkubator mit einem Lufteinstrom über ein Diaphragma.
Nach der Trocknung wurden die Membranen mit einem physikalischen Verfahren sterilisiert wie beispielsweise mit γ-Strahlen bei einer Dosis von 2,5 bis 25 KGy.
Die Trays oder Platten sind gemäß einer bekannten Methode entsprechend dem Stand der Technik elektrostatisch aufgeladen, d.h. durch Reiben mit geeigneten Materialien beispielsweise oder vorzugsweise durch Platzierung der Trays zwischen den Platten eines Kondensators. Die Induktion einer elektrostatischen Ladung auf den Trays kann mittels eines „Ionizing Fan" (RPO Electronic snc, Milan) bei einer primären Voltzahl von 220, einer sekundären Voltzahl von 6000VA und 50 Hz 50/60 induziert werden. Die Trays haben ein Standardformat oder eine entsprechend geeignete Form und Größe, um der Membran eine Form zu verleihen, die zur nachfolgenden Verwendung geeignet ist.
Alternativ dazu kann die Kollagenmembran auch auf Trays gegossen werden, an die ein entsprechend geeignetes elektrisches Feld angelegt wird, wobei dieses, falls nötig, auch während der Trocknungsphase des Gels aufrecht erhalten werden kann.
Die Induktion eines elektrischen Feldes oder einer elektrostatischen Ladung ermöglicht überraschenderweise und im Gegensatz zum bekannten Stand der Technik die makromolekulare Reorganisation und Ausrichtung des Kollagens in fibrilläre Strukturen ähnlich denjenigen des nativen Gewebes, wodurch Membranen erhalten werden, die eine maximale Resistenz und Reißfestigkeit besitzen. Das in dem Verfahren verwendete Gel besteht gemäß der vorliegenden Erfindung hauptsächlich aus Kollagen in einer Konzentration zwischen 0,5 bis 6% (Gewicht/Volumen, wobei das Gewicht hier bezogen ist auf den Trockenkollagenrest), vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 1% und 4%, noch besser zwischen 2% und 3%. Zahlreiche natürliche und nicht natürliche Substanzen können dem Gel optional zugegeben werden oder auch biologische Komponenten aus bestimmten Körperbereichen oder bestimmten Gewebearten. Ein Beispiel für biologische Komponenten, die zugegeben werden können, sind tierische oder pflanzliche Polysaccharide oder Matrixproteine, wie Fibronectin, Laminin usw.
Eine der bevorzugten Ausführungsformen ist das Verfahren zur Herstellung von Kollagengel hauptsächlich umfassend die folgenden Schritte:

a) mechanisches Zerkleinern von Bindegewebe und Homogenisation zu einer Kollagensuspension,
b) Behandlung der Kollagensuspension mit proteolytischen Enzymen in wässriger Lösung bei saurem pH-Wert, optional gefolgt von Filterung,
c) Alkalische Behandlung der Suspension bis ein pH-Wert höher als 8 erreicht wird, der dann mit Säuren bis auf einen bevorzugten pH-Wert zwischen 5 und 6 neutralisiert wird
d) Präzipitation der Kollagenfasern durch Zugabe einer Säurelösung (Aussalzen)
e) Resuspension des Kollagenpräzipitates bei einer Konzentration zwischen 0,5 und 6% (Gewicht/Volumen) vom Trockenkollagenrest in einer leicht sauren Lösung, wie etwa einer wässrigen Lösung mit einer schwachen Säure und dann bis zum Erhalt

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren stammt das anfängliche Bindegewebe aus Säugetieren. Ein knorpelartiges Gewebe wird dann verwendet, wenn eine Membran hauptsächlich bestehend aus dem Kollagentyp II erhalten werden soll oder es wird. Bindegewebe genommen, welches hauptsächlich den Kollagentyp I enthält, wie beispielsweise Sehnen, vorzugsweise vom Pferd, Rind oder Schwein stammend oder Bindegewebe aus der Basallamina, die hauptsächlich den Kohagentyp IV enthalten. Letztendlich bestimmt der Verwendungszweck der Membran die best angemessene Wahl des Ausgangsgewebes gemäß dem Stand der Technik und auch hinsichtlich der erforderlichen Mengen. Andere Kollagenquellen können als Alternative zum Säugetierbindegewebe verwendet werden, wie beispielsweise chondrales- oder osteochondrales Gewebe vom Fisch.
Das Zerkleinern von Ausgangsbindegewebe (Schritt (a) des Verfahrens) wird erreicht durch eine Behandlung des Gewebes, bei der Wasser oder eine wässrige Lösung zugegeben wird, vorzugsweise in einer Menge entsprechend dem 6–30fachen an Volumen des anfänglichen Gewebevolumens mithilfe von rotierenden Mixerscheiben bis eine Kollagensuspension entstanden ist. Die Kollagensuspension enthält Kollagenpartikel vorzugsweise in einer Größe unter 25–30 Mesh. Den Experten sind auch weitere Systeme zur Zerkleinerung bekannt; diese können als Alternativen zu dem vorliegenden Schritt a) angewendet werden. Nach der Homogenisation wird vorzugsweise eine weitere Zerkleinerung der Kollagenpartikel angestrebt und durchgeführt, indem die Kollagensuspension in einem Mikronisierer weiterverarbeitet wird, beispielsweise in einem „Waring Blender" bei 15–20.000 U/min.
Die so erhaltene Suspension wird angesäuert und mit proteolytischen Enzymen (Schritt b des Verfahrens) behandelt, die nicht vom Kollgenasetyp sind, vorzugsweise mit Pepsin bei einem sauren pH zwischen 2 und 3, vorzugsweise 2,5. Methoden für die proteolytische Verdauung und Enzym:Kollagenverhältnis sind gemäß dem Stand der Technik bekannt und können entsprechend angepasst werden. Die proteolytische Verdauung hat einen zweifachen Effekt: den Abbau von Kantaminationsproteinen und das Entfernen von Telopeptiden des Kollagens, welche stark immunogen sind. Die Behandlung mit Pepsin wird vorzugsweise für einen Zeitraum zwischen 10 und 20 Stunden durchgeführt, besser noch 16 Stunden und begleitet durch Rühren während der ersten 2–4 Stunden.
Optional kann die Kollagensuspension gefiltert werden über Siebe mit einer Porosität vorzugsweise umfassend eine Größe zwischen 20 und 100 Mesh, Idealerweise 25 Mesh. Die Suspension wird nachfolgend mit alkalischer Lösung gemäß Schritt (c) vorzugsweise mit einer konzentrierten Lösung einer starken Base, vorzugsweise NaOH bis zu einem pH-Wert über 8, vorzugsweise über 10 eingestellt. Erreicht wird dies durch eine alkalische Behandlung, welche einen zweifachen Effekt hat, nämlich mögliche kontaminierende Agenzien und partiell auch die glykosidischen Reste zu entfernen.
Der pH-Wert der Kollagensuspension wird deshalb mit einer Lösung einer starken Säure neutralisiert bis zu einem pH zwischen 5 und 6, vorzugsweise einem pH von etwa 5,5. Alkalisierung und die nachfolgende Neutralisation (Schritt (c) des Verfahrens) werden vorzugsweise in langsamen Schritten durchgeführt, um eine allzu starke Präzipitation der Kollagenfasern zu vermeiden.
Alternativ dazu für den Fall, dass eine starke Alkalisierung des Materials nicht notwendig ist oder in anderen Fällen, die den Experten bekannt sind, kann der pH-Wert direkt nach der enzymatischen Verdauung bei saurem pH mit einer starken Base auf einen Wert zwischen 5 und 6 gebracht werden.
Bei einem pH-Wert von 5 und 6 präzipitiert das Kollagen durch Aussalzen als weißliche Masse, welche gesammelt und abgetrennt werden kann. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird diese weißliche Masse in einer alkalischen Lösung, wie beispielsweise NaOH 1N, resuspendiert und unter Rühren für 1 Stunde stehen gelassen. Danach wird das Kollagen präzipitiert durch Zugabe einer Säurelösung (Aussalzen) bei pH-Werten zwischen 5 und 6. Dann wird ein Kollagengel durch Resuspension des Kollagenpräzipitates erhalten bei einer Konzentration (angegeben als ein Prozentsatz bezogen auf das Gewicht des Trockenkollagenrestes) zwischen 0,3 und 0,6% vorzugsweise zwischen 0,5 und 4% noch besser 2%, vorzugsweise nach dem Entfernen des Präzipitationssalzes durch Waschen mit sterilem destilliertem Wasser in einer Lösung verdünnt mit einer schwachen Säure, vorzugsweise Essigsäure in einer Konzentration zwischen 0,1 und 1 % (w/v), vorzugsweise 0,3%. Alternativ zu Essigsäure können auch andere schwache Säuren wie zum Beispiel Citronensäure, Ascorbinsäure oder Weinsäure in einer Konzentration zwischen 0,5 und 5% verwendet werden. Diese Lösung kann dann optional weiter homogenisiert werden, um die Resuspension des Präzipitates zu verbessern. Nach der Resuspension wird die Kollagenlösung vorzugsweise entgast. Sie wird dann sehr langsam in elektrostatisch aufgeladene Trays oder Platten von geeigneter Form und Größe gegossen, wie oben beschrieben, in einer Menge, die der gewünschten Membrandicke entspricht unter Berücksichtigung des Volumenverlustes bei der Trocknung. Die so erhaltenen Membranen werden mittels physikalischer Verfahren, beispielsweise γ-Strahlung in einer Dosierung zwischen 2,5 und 25 KGy, sterilisiert.
Eine der erfindungsgemäßen weiteren Ausführungsformen bezieht sich auf Kollagenmembranen gemäß den beschriebenen Verfahren: dem Verfahren, welches das Gießen des Kollagengels in elektrostatisch geladene Trays beinhaltet und das Verfahren, welches die Herstellung eines solchen Gels gemäß den Schritten a)-e) und a)-e") des Verfahrens, wie zuvor beschrieben, umfasst. Das Kollagengel kann auch mit natürlichen Substanzen und/oder biologischen Komponenten aus bestimmten Organen oder Organbereichen (z.B. Glycosaminoglycane, Hyaluronsäure usw.) gemischt werden, bevor es in die elektrostatisch aufgeladenen Trays oder Platten gegossen wird, um gemischte Membranzusammensetzungen zu erhalten, die den spezifischen natürlichen Bestandteilen des zu reparierenden Gewebes so nahe wie möglich kommen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Kollagenmembranen zur Unterstützung der Adhäsion, Kolonisation und/oder der Anzucht von Säugetierzellen unterschiedlicher Herkunft, z.B. Stammzellen, Fibroblasten, Epithel- oder Endothelzellen, Chondrocyten, Osteocyten sowohl für in vitro als auch ex-vivo Systeme; für diejenigen Systeme also, bei denen dem Patienten Zellen entnommen werden und in in vitro Systeme eingebracht werden, in denen sie verstärkt oder einfach dazu gebracht werden, sich an die Membran zu adsorbieren oder mit dieser zu verwachsen. Daher sind diese Membranen in einer anderen Ausführungsform zur therapeutischen Verwendung bestimmt. Insbesondere werden sie entweder durch autologe oder heterologe Zellen kolonisiert oder nichtkolonisiert verwendet für die Matrix-gestützte Rekonstruktion von Geweben, beispielsweise von chondralem oder osteochondralem Gewebe, Epithel- oder Endothelgewebe oder Bindegewebe. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe „Matrix" und „Träger" gleichbedeutend genannt, da sie einfach beide einen physikalischen Rahmen bilden, den die Zellen benutzen, um sich einerseits festzuhalten und/oder dreidimensional zu wachsen und andererseits ein Substrat darstellen, welches zur Interaktion mit dem zellulären Adhäsionsmechanismus und Kolonisation oder Proliferation befähigt ist. Im dem Fall, in dem die erfindungsgemäßen Kollagenmembranen als Matrices oder Träger zur Adhäsion, Kolonisation oder Zellwachstum verwendet werden, wird die Membran zu einer zellulären Matrix, welche hilfreich ist für Matrix-gestützte Geweberekonstruktionszwecke.
EXPERIMENTELLER TEIL
Beispiel 1. Herstellung von Kollagengel aus Knorpel
Aus der Trachea vom Rind stammender Knorpel, der hauptsächlich Kollagen vom Typ II enthält, wurde zuvor mechanisch entfettet, bei –20°C eingefroren und in Fragmente von etwa 2–3 cm Durchmesser zerlegt. 56 g von solchen Fragmenten wurden in 900ml destilliertes Wasser gegeben und portionsweise in einem „Blender" Modell PBI 16 bei 7400 U/min zermahlen.
Die erhaltenen weißen Fasern wurden in 15 Liter demineralisiertes Wasser gegeben, mit 30% HCl auf einen pH von 2,51 gebracht und mit 0,588 g Pepsin (700 FIP-U/g- 19917 Merck) versetzt. Die Masse wurde für 2 Stunden gerührt und mit HCl auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt.
Nach dem Stehenlassen über Nacht wurden die Fasern durch Dekantieren abgetrennt und in einem „Blender" bei 6800 U/min homogenisiert, durch ein Sieb mit ≤ 25 Mesh gefiltert und zu dem Ursprungswasser zugegeben. Es wurde 15%ige NaOH-Lösung bis zu einem pH-Wert von 5,5 zugegeben. Das Kollagenpräzipitat wurde abgetrennt und mit 2 Volumina Wasser bei einem pH von 5,5 gewaschen. 107,1 g der feuchten Fasern wurden genommen und mit 311,6m1 destilliertem Wasser und 0,93g eiskalter Essigsäure versetzt.
Unter diesen Bedingungen absorbierte das Kollagen Wasser und nahm eine gelartige Form an. Anschließend wurde dieses in einem „Blender" Modell PBI 16 bei 8400 U/min homogenisiert; es ergab sich ein Trockenrückstand von 4,51%. Dann wurden 310 ml Wasser zugefügt und 621 ml Gel durch Homogenisation erhalten mit einem Trockenrückstand (TR) von 2,03% und entsprechend 2 % Kollagengel.
Beispiel 2. Herstellung von Kollagengel aus Pferdesehnen.
50 g Pferdesehne entsprechend einem Trockenrückstand von 35,5% wurden für 4 h in 900 ml Wasser gegeben und bis zum Aufbrechen der Granula bearbeitet. Dann wurden diese in 15 l H₂O mit einem mit HCl eingestellten pH-Wert von 2,5 überführt, in welchem 1,5g Pepsin (Merck 700 U. FIP/g) gelöst wurden und die enzymatische Verdauung für etwa 20 h bei circa 15°C ablaufen gelassen.
Die größeren Sehnenfragmente wurden durch Filtern über Siebe mit einer Meshgröße von 25 entfernt. Die Suspension wurde dann mit kommerziell erhältlicher NaOH auf pH 5,4 gebracht und das Kollagenpräzipitat in etwa 2 h erhalten. Gesammelt wurde das Präzipitat durch Dekantieren und Zugabe von 7,5 1 Wasser mit einem pH-Wert von 6. Die Fasern wurden unter Rühren gewaschen, für 1 Stunde ruhen gelassen und dann nochmals durch Dekantieren entfernt. Der Waschvorgang wurde dreimal wiederholt. 43 g der feuchten Fasern wurden entnommen, aus denen durch Zugabe von 0,376g eiskalter Essigsäure und 82 ml Wasser und anschließender Homogenisation 125 g Kollagengel mit einem Trockenrückstand von 2,45% erhalten wurden.
Beispiel 3. Herstellung von Kollagengel in großem Maßstab
500 g Pferdesehnen und 101 destilliertes Wasser wurden mehrmals durchmischt mittels eines „Rayneri Turbotest SB" ausgestattet mit scharfen rundgebogenen Rotationsblättern mit 1500 U/min, dann mit einem „Rayneri Turbotest H 002" und anschließend mit einem „INOC Waring Blender Mikroniser" mit einer Geschwindigkeit von 15–20.000 U/min.
Die Suspension wurde stehen gelassen bis sie gequollen war (etwa 2–4 h). Die mikronisierte Sehne wurde in einen 200 1 INOX-Reaktor mit 140 1 destilliertem Wasser überführt zusammen mit 5,88 g Merck-Pepsin bei 700 U FIP/mg und Hydrochlorsäure q.s. bei pH 2,5. Der Rührvorgang wurde über 2-4 h beibehalten und die Suspension dann über Nacht bei einem pH-Wert von 2,5 ruhen gelassen.
Die Reaktionsmasse wurde gefiltert mit Sieben von 25 Mesh und das Filtrat sehr langsam mit 30%igem handelsüblichem Natriumhydroxid auf pH 5,5 gebracht. Die Kollagenfasern präzipitierten und wurden 3-4mal mit destilliertem Wasser mit pH 5,5 gewaschen bis die Chloridkonzentration unter < 50 ppm lag.
Die gesammelten und gewogenen Fasern wurden dann in einer wässrigen Lösung von 0,3% Essigsäure dispergiert, bis eine Kollagenkonzentration von 2% erreicht war, ausgedrückt als Trockenrückstand. Es wurden 12,3 kg Gel erhalten.
Beispiel 4. Herstellung von Membranen aus Kollagengel.
Das gemäß der vorherigen Beispiele erhaltene Gel wurde in Trays geschichtet, an die zuvor eine elektrostatische Spannung angelegt und welche an der Luft für 56 h bei 26°C getrocknet wurden. Die elektrostatische Ladung wurde mittels eines „Ionizing Fan" (RPO Electronics snc, Milan) mit einer Arbeitsleistung von primär 220 Volt, sekundär 6000 VA 50 Hz 50/60 überprüft.
Die Membranen benannt A, B, E wurden erhalten und mit γ(gamma)-Strahlen mit 25 KGy sterilisiert. Die so hergestellten Membranen wurden Morphologieanalysen, Tests hinsichtlich der Abbaubarkeit durch Kollagenase, Permaebilität von Wasserdampf gemäß dem Standard ASTM-E 96–90 und Zugfestigkeitstests gemäß konventioneller Verfahren unterzogen.
Die Membranen A, B, E ergaben einen Trockenrückstand von 3,6,9 mg/cm².
Morphologische Analyse
Eine anfängliche Charakteristik der so erhaltenen Membranen war auch mit bloßem Auge erkennbar: tatsächlich zeigten die Bögen auch mit bloßem Auge erkennbar zwei unterschiedliche Oberflächen, eine nicht durchscheinende (opake) und eine glänzende. Die unterschiedliche Oberflächenmorphologie wurde besser charakterisiert durch Beobachtung mithilfe von Stereomikroskop und Rasterelektronenmikroskop (SEM).
Die Analyse wurde durchgeführt auf einer Probe mit einer Größe von 2 × 2 cm, ausgeschnitten aus den Originalbögen. Die Proben wurden so unter ein Stereomikroskop (Nikon, Japan) gelegt.
Für die SEM-Analyse wurden die Proben wie folgt behandelt: 2 kleine Materialportionen (etwa 5 mm × 3 mm) wurden aus jeder Probe herausgeschnitten. Diese wurden dann auf einem metallischen Träger (Stub) platziert, wobei hierfür die Proben (A, B, E) einmal mit der glänzenden Seite und mit der nicht durchscheinenden Seite (markiert durch einen kleinen Einschnitt auf dem Träger) nach oben aufgebracht wurden. Die Proben wurden dann mit einem Palladium-Goldfilm überzogen, um die Oberfläche leitend zu machen und die Beobachtung unter dem SEM zu ermöglichen. Die SEM-Analyse der Oberflächen der drei Proben hob das Vorkommen von Fasern hervor, die auf makromolekularer Ebene im glänzenden Teil (siehe 1) angeordnet sind, während im nicht durchscheinenden Teil einige oberflächliche Unregelmäßigkeiten, Hervorwölbungen und „Blasen" zu sehen waren, die der Membran eine gewisse Porosität verliehen (siehe 2).
Die Dicke der Proben, bestimmt mit einem digitalen Mikrometer, ist in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1
Test zur Abbaubarkeit durch Kollagenase
Die Kollagenmembran-Batches P323 und P50027 hergestellt wie in den vorherigen Beispielen beschrieben und kommerziell erhältliche Kollagenmembranen wurden in einem Vergleichstest einem enzymatischen Abbau mit bakterieller Kollagenase (EC 3.4.24.3 aus Clostridium histolyticum I, 310 U/mg Sigma C-0130) unterzogen bei einer Konzentration von 50μg/ml für einen Zeitraum von 24 h in Puffer bei 37 °C. Konzentrationen gemessen in μg/ml/24h an Hydroxyprolin hydrolisiert mit Kollagenase wurden in einem Bad mit einer kolorimetrischen Methode gemessen basierend auf p-Dimethylaminobenzoaldehyd.
3 zeigt, dass die Proben P323 und P50027, erhalten wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, nicht durch das Kollagenaseenzym nach Ablauf von 24 Stunden abgebaut wurden, während die anderen handelsüblichen Produkte, namentlich Chondrogide und Antema innerhalb dieses Zeitraums bereits erheblich abgebaut wurden. Dies deutet darauf hin, dass die erfindungsgemäß hergestellten Membranen resistenter gegenüber Abbau sind.
Permeabilität von Wasserdampf
Diese Tests wurden durchgeführt mit den Proben (A, B, E), erhalten wie in den vorherigen Beispielen angegeben, gemäß dem so genannten „Wasser"-Test wie beschrieben in "Standard test method for water vapour transmission of materials", die der Standard ASTM E 96–90 bereit stellt.Die „WVT" (Water Vapour transmission = Wasserdampftransmission)-Werte wurden mit dem Test ermittelt gemäß der Formel: WVT = (G/t)/Awobei:
A = Membranbereich
G = Abweichung vom Gewicht des Wassers in der Messkammer (Gramm)
t = Zeit (Stunden)
und diese werden zusammen mit den Werten für Permeation, Permeabilität und Dicke der Membranen in Tabelle 2 aufgeführt
Tabelle 2
Die Permeation wurde mittels folgender Formel berechnet.
⊗Perneation = WVT/S (R1–R2)
und für die Bedingungen angepasst:
S=46,66 × 102 Pa und R1–R2 = 0,5 (Wert ausgedrückt als Bruch)
Die mittlere Permeabilität wurde aus den Permeationswerten unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: Permeabilität = Permeation × Membrandicke
Aus Tabelle 2 ist zu ersehen, dass die Permeabilitätswerte direkt proportional zur Membrandicke sind, und dass außerdem die Permeabilitätswerte der wie in den vorherigen Beispielen beschriebenen Membranen zwischen 0,7138 * 10^–11 und 4,4946 10^–11 (g* Pa–1* h–1* m–1) für Membranen mit einer Dicke von 0,01 bis 0,062 mm betragen.
Test zur Zugbeanspruchung
Aus den urprünglichen erfindungsgemäß hergestellten Membranen wurden Proben in „Hundeknochen"-Form (drei verschiedene Batches) ausgeschnitten mit einer Maximallänge von 76,7 mm, wobei der dünnste Teil 3–6 mm breit und 22 mm lang war. Die Belastungstests wurden mithilfe eines „Chantillon"-Gerätes durchgeführt Model HTC (USA), entsprechend konventioneller Verfahren.
Die in Tabelle 3 gezeigten Werte wurden erhalten.
Tabelle 3 Zugfestigkeitstest
Es wird gezeigt, dass die Membrandicke in einem logarithmischen Verhältnis zur Reißbelastung steht (siehe 4) wie anhand folgender Gleichung beschrieben: Y=a log (x) + b
Für die in der Tabelle angegebenen Mittelwerte im Einzelnen ist der Wert a =7,08 und der Wert b = 11,42; es ergibt sich daraus die Gleichung: Y = 7,08 x + 11,42, mit R2 = 0,999
Für die Filmdicke ergaben sich Messwerte von 0,01 bis 0,062mm
Beispiel 5: Herstellung von Membranen aus Kollagengel
3 kg eines 2%igen Kollagengels hergestellt gemäß Beispiel 4 wurden 1:2 mit 0,3% Essigsäure verdünnt und in einem „Rayneri"-Mixer (ausgestattet mit scharfen abgerundeten Mischerblättern und einer Rotation bei 1300 U/min) für 1,5 Stunden gemischt. Anschließend wurde diese Mischung in einen „two-speed prototype planetary Mixer" (Leihgabe) unter Vakuum (76 cm Hg) gegeben und darin für 2,5 Stunden entgast.
Das Gel wurde dann in Trays aus Melamin-Kunststoffmaterial mit einer Größe von 25,5 × 16,5 cm oder anderer Größe mit einer Dicke von 1,3 cm oder anderer Dicke mit Hinsicht auf die gewünschte Membranresistenz gegossen; die Trays wurden zuvor elektrostatisch aufgeladen.
Sie wurden dann in einen Inkubator auf streng eben ausgerichtete Regale gestellt und für 96 h einer geringen Ventilation mit steriler Luft unterzogen. Der Inkubator arbeitete mit einer kontrollierten Anzahl an Wechseln/h und war auf 26°C eingestellt.
Die Luft strömte durch ein Diaphragma ein, um jeden Kontakt mit dem Kollagengel auf den Trays zu verhindern. Das Innere des Inkubators war so gebaut, dass es nicht zur Bildung von Luftwirbeln kam.
Die Trays wurden zuvor durch Reiben elektrostatisch aufgeladen. Das tatsächliche Auftreten der elektrostatischen Ladung wurde mithilfe eines „Ionizing Fan" (RPO Electronic snc, Mailand) überprüft, der mit einer primären Voltzahl von 220 und sekundär mit 6000 VA, 50 Hz 50/60 arbeitete. Die chemisch physikalische Analyse des verfahrensgemäß hergestellten Membranbatch ergab die folgenden Werte:

Trockungsverlust = 11,72% a.Tb. (auf Trockenbasis)

Gesamthydroxyprolin = 12,39% a.Tb.

Gesamtstickstoff = 15,89% a.Tb.

Natrium = 0,28% a.Tb.

Chloride = 0,19 a.Tb.

Sterilität = steril
Beispiel 6. Wachstum von Fibroblasten auf Kollagenmembranen
Die Untersuchung wurde mit humanen Fibroblasten im 2.–3. Kulturdurchgang durchgeführt.
Die Zellen wurden aus parodontalem Ligament entnommen.
Zu Beginn des Experimentes waren die Zellen parallel angeordnet und in die Länge gezogen, wie es für Fibroblastzellen charakteristisch ist oder sie lagen in randomisierter Anordnung (Probe B) vor oder waren willkürlich sternförmig in Probe A und C angeordnet, während die Replikationsfähigkeit gleich der in der Kontrolle war.
Die folgenden Membranbatches wurden miteinander verglichen:

Probe A: Membran vom Kollagentyp I aus Rinder-Achillessehne quervernetzt mit Formaldehyd (BIOMEND, Collatech);
Probe B: Membran vom Kollagentyp I und Chondroitin-4-sulfat, extrahiert aus Rinderhaut, quervernetzt mit Diphenyphosphorylazid (PAROGUIDE, Clectica);
Probe C: schwammiges Kollagen vom Typ I aus Rinderhaut, nicht quervernetzt (GINGISTAT, Coletica);
Probe OP: Membran vom Kollagentyp I aus der Achillessehne vom Pferd, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben

Kleine Vierecke von 1 × 1 cm wurden aus jeder Membran ausgeschnitten und in Wells von NUNC-Platten gegeben zusammen mit 20000 Zellen pro Well in PBS (Dulbecco' Phosphat Buffered Saline = Phosphat-gepufferte Salzlösung). Danach wurde das geeignete Wachstumsmedium in die Wells gegeben und die Zellen bei 37 °C inkubiert.
Bei einigen Tests wurde auch „Platelet Growth Factor" (Plattchenwachstumsfaktor) BB (PGF-BB) 50 ng/ml (Boehringer M.) zugegeben. Die Kontrolle bestand nur aus Zellen ohne Membran.
Um die Zellen von den verschiedenen Substraten abzulösen und sie so zählbar zu machen, wurden am Ende des Experimentes (72 Stunden) alle Proben trypsinisiert (Inkubation in 200 μl 0,25% Trypsin für 5'). Die Proben wurden vor der Trypsinisierung mit einem optischen Mikroskop sowie mit einem Rasterelektronenmikroskop betrachtet.
Die folgenden Daten wurden erhalten: 1) Zellzählung: Anzahl der gesamten Zellen im Well nach 72 Stunden:

Kontrolle von A 22000

Kontrolle + PGF-BB 24750

Probe 0 (<5000)

Probe A + PGF-BB 0 (<5000)

Kontrolle von B, C, OP 21000

Kontrolle + PGF-BB 36000

Probe B 10500

Probe B + PGF-BB 14000

Probe C 0 (<5000)

Probe C + PGF-BB 0 (<5000)

Probe OP 8250

Probe OP + PGF-BB 5500
2) Optische Mikroskopie: das Zellwachstum in den Wells und auf den Membranen wurde unter dem optischen Mikroskop betrachtet.

Probe A: wenige Zellen anomaler Morphologie, ein Zeichen von nicht optimalen Bedingungen für die Zellen, umso deutlicher, je kürzer die Entfernung zu der Membran.
Probe B: gestreckte und aneinander haftende Zellen in einiger Entfernung zur Membran.
Nicht aneinander haftende kugelige Zellen in der Nähe der Membran.
Probe C: gestreckte und aneinander haftende Zellen in einiger Entfernung zur Membran.
Nicht aneinander haftende kugelige Zellen in der Nähe der Membran.
Probe OP: gestreckte und aneinander haftende Zellen in einiger Entfernung zur Membran.

Nicht aneinander haftende kugelige Zellen in der Nähe der Membran.
3) Elektronenmikroskopie: Beobachtungen der Membranen unter dem SEM

Probe A: Membran zum größten Teil ohne Fibroblasten, allerdings weisen die sehr ungewöhnlichen zellulären Elemente eine normale Morphologie auf.
Probe B keine Zellen auf der Membran
Probe C: keine Zellen auf der Membran
Probe OP: Zellen mit normaler Morphologie kommen auf der Membran vor

Anhand von Daten aus der Bestimmung der Zellzahl (Assay (1)) nach der Trypsinisierung ergab sich, dass die OP-Membran das Zellwachstum nur leicht verlangsamte im Vergleich zur Kontrolle, während die Proben A und C das Zellwachstum(<5000, untere Nachweisgrenze der Methode) ganz unterdrückten. Probe B bestehend aus Kollagen und Chondroitin-4-sulfat zeigte ebenfalls zelluläre Proliferation, wie bei der Zellzahlbestimmung dargestellt.
Allerdings zeigte sich bei den Analysen unter dem optischen und Rasterelektronenmikroskop auch, dass die Probe, bei der keine deutliche Hemmung des Zellwachstums (B) beobachtet wurde, die Kolonisation der Membran selbst fehlte, da die auftretenden Fibroblasten alle um die Membran herum aber nicht auf der Membranoberfläche angeordnet waren.
Die einzige mit Fibroblasten kolonisierte Membran, die mit dem SEM zu beobachten war, war die gemäß dem in den vorherigen Beispielen beschriebenen Verfahren hergestellte OP-323-Membran. Morphologisch betrachtet sahen die mit dem optischen Mikroskop betrachteten auf der OP-Membran wachsenden Zellen gesund aus.
Beispiel 7: Herstellung von Membranbatch 40046.
500 g Sehnen vom Pferd (Batch 40041) wurden auf die exakt gleiche Weise behandelt wie in Beispiel 3 beschrieben, bis auf die Gewinnung von Kollagenfasern, welche mittels Aussalzen (Präzipitation) bei einem pH von 5,5 isoliert wurden.
10 kg dieser genannten Fasern wurden mit 201 1N NaOH behandelt und unter Rühren für 1 Stunde bei Raumtemperatur gehalten, dann gewaschen und auf einen pH-Wert von 5,5 und eine Chloridkonzentration von <50ppm eingestellt.
Diese Behandlung mit 1N NaOH, die in Übereinstimmung mit der EEC-Richtlinie zum Zweck der Entfernung potenzieller viraler Kontaminanten und Agenzien, die TSE hervorrufen können (obwohl diese Krankheit bei Pferden bislang noch nicht gefunden wurde) steht, hat aufgrund vergleichender und mikroskopischer Analysen, wie in den folgenden Beispielen gezeigt, zu einer größeren Reinheit des Kollagens und vermutlich auch zu einer mäßigen Reduktion der Glykosylierung geführt. In Tabelle 4 sind die Resultate der an den Membranen vor (A) und nach (B) der NaOH-Behandlung durchgeführten Analysen aufgelistet. Tabelle 4

TS = Trockensubstanz

Die gesammelten und gewogenen Fasern wurden in wässriger Lösung von 0,3% Essigsäure dispergiert und enthielten schätzungsweise eine Kollagenkonzentration (als Trockensubstanz) von ca. 1 %. Es wurden 9,48 kg Gel erhalten.
Diese 9,48 kg Kollagengel wurden für 1,5 Stunden in einem "Rayneri Dynavar SB 25 Mixer" (Groupe VMI ZI, Montaign France) mit einer Geschwindigkeit von n.80 gemischt. Das Gel wurde anschließend in einen geeigneten Homogenisator (CONDOR S.r.I Verona), ausgestattet mit einem Planetenmischer überführt, unter Vakuum gesetzt und für 3 Stunden auf Geschwindigkeitsstufe 1 und danach 3 Stunden auf Stufe 2 geschüttelt. Das Gel wurde dann über Nacht im Vakuum belassen.
Die Luftblasen wurden nach dieser Behandlung aus dem Gel entfernt. Es wurde dann in 12 × 12 cm kleine elektrostatisch aufgeladene Polystyrol-Trays verteilt, in einer Menge von 130 g Gel/Tray entsprechend Membranen mit einem zu erwartenden Gewicht von etwa 9 mg/cm².
Die Trays wurden in einen Inkubator, Mod 2800 "High Performance" (F.lli Galli G.& P.-Mailand) gestellt mit einer Temperatureinstellung auf 28°C ohne Ventilation und für etwa 120 h darin belassen.
Nach der Entnahme aus dem Exsikkator wurden die geformten Filme aus den Trays extrahiert, für 1 Stunde der Luft ausgesetzt und dann in sterile Beutel verpackt. Danach wurden die Membranen auf geeignete Formen zurecht geschnitten, in Doppelbeutel gepackt und schließlich einer Strahlenbehandlung mit γ-Strahlen bei einer Dosis von 25 Kgy ausgesetzt. Analysen der Membranen von Batch 40046 ergaben die folgende Zusammensetzung:

Feuchtigkeit: 15,6%

Essigsäuregehalt, gemessen durch Potentiometrie: 2,5

Hydroxyprolingehalt: 13,39%
Nach der Verdauung mit Kollagenase erwies sich die Freisetzungs-Kinetik von Hydroxyprolin in den 40046 Membranen, wie in Beispiel 4 gemessen (mit p-Diaminobenzoaldehyd) als absolut vergleichbar mit derjenigen von Kollagenmembranen, die gemäß Beispiel 4 hergestellt wurden ohne die Behandlung mit Natriumhydroxid.
Beispiel 8: Herstellung von Membranbatch 40046/LL
Folgend auf die Entfernung der restlichen Essigsäure durch Waschen, wurden einige der wie in Beispiel 7 hergestellten 40046 Membranen in vier Teile zerschnitten und in destilliertes Wasser gegeben, welches 4mal nach jeweils 1 Stunde Immersion gewechselt wurde.
Die Membranen wurden durch Lyophilisation in einem Temperaturbereich von –30°C bis +30°C getrocknet.
Erhalten wurden als 40046/LL gekennzeichnete Membranen, deren Oberfläche faltig, im Wesentlichen gekräuselt und kaum hydrophil erschien und somit charakteristisch für eine nur oberflächlich denaturierte Proteinstruktur war.
Die Analyse erbrachte die folgenden Prozentzahlen:
Feuchtigkeit; 13,5%
Essigsäuregehalt: ≤0,23%
Bei der „Differential Scanning Calorimetry" (DSC) trat die Hitzedenaturierung von 40046LL bei den Temperaturen t_Start 49,62°C, t_Max 56,09°C und t_Ende 62,17 auf im Vergleich zu jeweiligen Werten für 40046 Membranen von 43,74°C, 49,52°C und 55,29°C, während die offensichtliche Hitzekapazität bei 6,09 cal/g für die Membran 40046/LL lag gegenüber 2,82 caUg für die nicht gewaschene/lyophilisierte Membran 40046.
Die Membranen 40046 und 40046/LL wurden auch dem Wasserabsorptions- und Evaporationstest unterzogen.
Die Membranen 40046 absorbierten 9% ihres Gewichtes an Wasser innerhalb von 4 Stunden, während die Membranen 40046/LL nur 4,3% aufnahmen. Andererseits gab die letztere das absorbierte Wasser mit einer 40% geringeren Geschwindigkeit ab im Vergleich zur Wasserevaporation der Membranen 40046.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Lyophilisationsverfahren für Kollagenmembranen nicht geeignet ist, da es teilweise zum Abbau der oberflächlichen Proteinstruktur führt.
Beispiel 9. Herstellung der Membranen 40036
Die Membranen 40036 wurden hergestellt wie die Membranen 40046 (Beispiel 7) mit Ausnahme der alkalischen Behandlung der Kollagenfasern mit 1N NaOH.
Beispiel 10. Herstellung von Membranen P322
1 % Kollagenbatch n. 78631d wird aus Achillessehne von Pferd hergestellt, wie in Beispiel 3 beschrieben. 2 kg des genannten Gels wurden in einen 10 Liter-Vakuumbehälter für 60' zur Entgasung gegeben, dann aufgeteilt auf Platten mit einem Durchmesser von 90 mm, um so eine Membran von etwa 16 mg Trockenrückstand/cm² zu erhalten.
Die Platten wurden luftgetrocknet durch spontane Inkubatorexsikkation. All diese Vorgänge wurden unter kontrollierten mikrobiologischen Bedingungen durchgeführt. Der als P322 markierte Batch 88225-Membranen wurde erhalten.
Beispiel 11: Herstellung der Membranen 40049A/S, die hauptsächlich aus Kollagentyp II bestehen.
0,9 kg Trachea vom „Ground pig" (Batch RD/7) wurden in 5 10,5M NaOH für 5 h bei Raumtemperatur und dann bei 5 °C geschüttelt. Die Fragmente des Fett- und/oder Phospholipidmaterials wurden mechanisch aus dem Überstand eliminiert.
Der Rückstand wurde über einen Filter gesammelt, der aus einem fein-metallischen Netz besteht, gewaschen mit 3 × 2 Litern und bei pH 7,0 mit 80 ml 1N HCl neutralisiert.
Die Masse wurde zweimal mit jeweils 2 1 Aceton behandelt. Der Hydroaceton-Schritt wurde weggelassen, die Masse mit Wasser gewaschen, 14 l Wasser, 30 ml 1N HCL bis zu einem pH von 2,6 und 90g Pepsin aus Schweinemagenschleimhaut (Merck) bei 700 FIP U/g (Batch 15506) zugegeben und unter weiterem leichten Rühren für 24 h bei 20-24°C stehen gelassen.
5,5 l der genannten Suspension wurden vakuumfiltriert, über „Buckner" mit Octex^®Filtern und „pre-stratum of filtering aid". Das opaleszente Filtrat wurde mit HCl auf pH 3,5 eingestellt, mit NaCl bis auf 0,7M versetzt und über Nacht stehen lassen.
Das leichte Präzipitat, bestehend aus Fasern vom Kollagentyp II, wurde mithilfe der Zentrifugation gesammelt. 80 ml der feuchten Fasern wurden gewonnen und mit 40049A gekennzeichnet.
80 ml der Fasern 40049° wurden in ein Dialyseröhrchen „Spectrapor MWCO 1000" mit einem Durchmesser von 4,5 und einer Länge von 70 cm gegeben und darin für 48 h bei Raumtemperatur belassen; in regelmäßigen Abständen wurde das Wasser gewechselt.
Die aufgefangenen etwa 100 ml wurden mit 50% HCL auf pH 3,36 eingestellt. Das erhaltene Gel (1,18% Trockenrückstand) wurde auf Polystyrol-Petrischalen mit einem Durchmesser von 5,5 cm verteilt, um so eine Membran von 9mg/cm2 herzustellen. Diese wurden dann zunächst für 30 h in einem Ofen und anschließend auf Platten an der Luft bei 30°C getrocknet.
Die entstandenen Membranen wurden mit 40049A/S gekennzeichnet.
Beispiel 12. Analyse von Kollagenfilm unter dem optischen Mikroskop, Raster- und Transmissionselektronenmikroskop
Die mit 40039/E oder 40046 gekennzeichneten Membranen, hergestellt wie in den vorherigen Beispielen beschrieben, wurden in sterilem destilliertem H₂O für 15 Stunden gewaschen, dann mithilfe von optischem, Rasterelektronen- und Transmissionsmikroskop analysiert.
Semi-Dünnschnitte, rechtwinklig zur Membran, wurden gefärbt mit basischen Farbstoffen der Thiazingruppe und unter dem optischen Mikroskop betrachtet. Eine Oberfläche (höchst wahrscheinlich die obere) war glatt, kompakt und intensiv angefärbt; die untere Oberfläche war weniger homogen, eher aufgelockert und uneben (5).
Unter dem Rasterelektronenmikroskop erschien die Membran aus einem dreidimensionalen Gitter aus Kollagenfibrillen zu bestehen, von denen die meisten in longitudinal verlaufenden Bündeln parallel zur Oberfläche ausgerichtet waren. Eine Seite des Gels, höchst wahrscheinlich die untere, hatte längere Fibrillen, welche einheitlicher angeordnet waren bezogen auf die andere Oberfläche (obere), die insgesamt faltiger und inhomogener (6) war.
Unter dem Transmissionselektronenmikroskop bildeten die Kollagenfibrillen mit unterschiedlichen Ausdehnungen ein dreidimensionales Gitter mit vorherrschender Ausrichtung parallel zur Geloberfläche. Die Beschaffenheit war in manchen Bereichen ziemlich regelmäßig.
Die meisten Kollagenfibrillen waren linear, einige waren umgefaltet und die Anordnung nicht immer eindeutig. Wie bereits erwähnt, ist der Durchmesser der Fibrillen sehr variabel, während die periodische Ausrichtung, sofern erkennbar, wie bei dem nativen Kollagen bei 640 nm liegt.
Beispiel 13: Messung des Wachstums von dermalen Fibroblasten, kultiviert auf Kollagenfilm
Es wurden humane dermale Fibroblasten verwendet, isoliert aus Hautbiopsien von gesunden Erwachsenen, kultiviert in Kulturmedium „Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) mit hoher Glukosekonzentration, enthaltend 2mM L-Glutamin, 100 IU/ml Penicillin, 100mg/ml Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat, nicht essentielle Aminosäuren (NEAA) 1X und fetales Rinderserum (FBS) in einer Endkonzentration von 10%.
In diesem Assay wurden die Fibroblasten auf Platten mit zwei Wells ausgebracht, so genannten „Chamber Slide" (Bereich = 8,26 cm²), 30.000 Zellen/Well in einem Endvolumen von 2 ml Kulturvolumen.
Die Zellen wurden direkt in eines der Wells gegeben, in das andere erst nachdem es mit einem Kollagenfilm mit der opaquen Seite nach oben überzogen war.
Zur Bestimmung des Zellwachstums wurde der MTT-Test (Tetrazoliumsalze) eingesetzt. Dieser Test basiert auf der intrazellulären Reduktion der Tetrazoliumsalze durch die mitochondriale Dehydrogenase zu einem ziegelroten, in Wasser unlöslichen Produkt (Formazan-Kristalle). Die Kristalle werden mit Dimethylsulphoxid gelöst und die erhaltene farbige Lösung wird in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 565 nm gemessen.
Die vitalen Zellen reduzieren im Gegensatz zu den toten die Tetrazoliumsalze. Dieser Test wird häufig zur Messung der zellulären Vitalität und als ein Proliferationsindikator eingesetzt.
Im Vergleich zum ersten Tag in Kultur verdoppelte sich die Zahl der Fibroblasten, die auf dem für Zellwachstum angepassten Plastik-Well wuchsen, am vierten Tag der Kultur. Die Fibroblasten, die auf dem Kollagenfilm wuchsen, zeigten dieselbe Tendenz (7).
Beispiel 14. Auswertung von auf Kollagenfilm kultivierten dermalen Fibroblasten mittels Konfokalmikroskop
Zur Überprüfung der Morphologie der auf den Kollagenmembranen kultivierten Zellen und der Wachstumsebenen nach 3 und 6 Tagen in Kultur wurden die Kollagenmembranen mit den Fibroblasten fixiert und mit fluoreszenzmarlciertem Phalloidin, das grüne Strahlung aussendet und das Cytoskelett des Aktins sichtbar macht und mit rhodaminmarkiertem Tubulin, das rote Strahlung aussendet und die Tubulinstrukturen sichtbar macht, angefärbt.
Nach der Färbung wurden die Membranen mit den Fibroblasten mittels Fluoreszenzmikroskop und Konfokalmikroskop untersucht.
Die auf der Kollagenmembran kultivierten Zellen waren deutlich sichtbar und schienen auf verschiedenen Ebenen des Films verteilt zu sein.
Nach 3 Tagen hatten die Zellen noch keine Konfluenz erreicht. Sie erschienen heterogen: länglich mit dünnen polygonalen dreieckigen Vorwölbungen. In bestimmten Feldern wurden mitotische Zellen beobachtet.
Am Tag 6 konfluierten die länglich und polygonal aussehenden Fibroblasten und bedeckten die gesamte Membranfläche (8 Fibroblastenwachstum auf Kollagenfilm am 6. Tag der Kultur (Markierung mit Phalloidin) Obj: 10,0 Zoom: 1.430
Beispiel 15. Wachstum, Proliferation und Bewertung der Vitalität von Chondrocyten aus dem Knieknorpel von Patienten, an denen ein prothetisch chirurgischer Eingriff vorgenommen wurde.
Kollagenmembranen im Batch 40046, wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt, wurden in einem geeigneten experimentellen Schema zur Bewertung des Wachstums, der Proliferation und der Vitalität von humanen Chondrocyten aus dem Knieknorpel von Patienten, die sich einem chirurgischen Eingriff zur Implantation einer Prothese unterzogen haben, verwendet.
Die Kulturen wuchsen in autologem Serum und wurden nach 0, 1, 7 14, 21 und 35 Tagen untersucht. Das Wachstum und die Vitalität der Zellen wurden mittels MTT-Assay getestet, 3-(4.5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid reduziert zu Formazan durch das mitochondriale Enzym Succinat-Dehydrogenase gemäß Denizot F., Lang R., J Immunol Methods, 89, 271–277, 1986.
Nach 7 Tagen wurde überraschender Weise erkannt, dass die Zellen auf den Membranen in Kultur nicht nur vital und gesund waren, sondern dass sie stärker als erwartet wuchsen. Auf Grund ihres beeindruckenden Wachstums auf den Membranen war es für den Betrachter schwierig, das Ausmaß der Proliferation zu bewerten, da sie bereits sehr frühzeitig den Konfluenzpunkt erreicht hatten.
Um das Chondrocytenwachstum und die Chondrocytenvitalität über 35 Tage zu bewerten, musste das Protokoll modifiziert werden: Statt 1.000.000 Zellen/cm² mussten auf den 40046-Membranen 250.000 Zellen/cm² ausplattiert werden.
Nach dieser Modifikation wurden nach 35 Tagen in Kultur dieselbe gesunde Morphologie und dieselbe unerwartete Proliferationsrate beobachtet.
Das äußerst positive Ergebnis sowohl für Fibroblasten als auch für Chondrocyten könnte, zumindest teilweise, auf die zusätzliche alkalische Behandlung zurückzuführen sein und auf den zusätzlichen Präzipitationsschritt der Kollagenfasern, die in das Herstellungsverfahren aufgenommen wurden.
Beispiel 16. Vergleichende Assays zur Bestimmung der Proliferation und Vitalität humaner Chondrocyten auf einigen Kollagenmembranen
1 × 10⁴ Chondrocyten aus Knorpel humanen Ursprungs wurden für 7 Tage parallel auf den folgenden Membranen kultiviert:

– 40046, hergestellt wie in Beispiel 7 beschrieben
– 40046LL, hergestellt wie in Beispiel 8 beschrieben
– 40036, hergestellt wie in Beispiel 9 beschrieben
– P322, hergestellt wie in Beispiel 10 beschrieben
– 40049/A/S, hergestellt wie in Beispiel 11 beschrieben
– Chondro-gide, Geistlich

Am Ende des betrachteten Zeitintervalls wurden die mit Zellen bewachsenen Membranen mit Safranin-O, das die charakteristische Sulfatgruppe der von den vitalen Chondrocyten gebildeten knorpeligen extrazellulären Matrix hervorhebt, angefärbt. Die Histomorphometrie der auf den Membranen kultivierten Chondrocyten wurde bewertet durch Analysieren der Bilder und Darstellen der Ergebnisse als Fläche des bewachsenen Membranteils ausgedrückt in Prozent der gesamten Membran. Das Histogramm zeigt, dass 40049/A/S und 40046 von den untersuchten Membranen die besten sind. Insbesondere Membran 40046 wurde für weitere Studien ausgewählt, da diese aus Pferdekollagen Typ I besteht und bereits aus immunologischer und toxikologischer Sicht charakterisiert worden ist (siehe Bianchini P., Parma B., Arzneiur-Forsch 51 (I, 414–419, 2001).

Claims

Doppelseitige Kollagenmembranen mit einer porösen Seite für die Adhäsion und/oder die Anzucht von Zellen und einer glatten Seite, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen auf dieser glatten Seite auf makromolekularer Ebene angeordnet ist und durch Anlegen eines elektrischen Feldes oder einer elektrostatischen Ladung am Kollagengel erhalten wird.
Membranen gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Kollagen ausgewählt wird unter: Kollagen vom Typ I, II, III oder IV oder einer Mischung enthaltend mindestens zwei der vier Typen.
Verfahren zur Herstellung der Kollagenmembranen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kollagengel auf eine Platte, an der eine elektrische Ladung induziert wurde, gegossen und zum Trocknen belassen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das genannte Kollagengel eine Kollagenkonzentration zwischen 0,5-6% aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei genannte Trocknung des Gels bei einer Temperatur von unter 40 °C über einen Zeitraum von mindestens 40 Stunden erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die genannte Trocknungstemperatur zwischen 20 °C und 30 °C liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei genannte Trocknung ohne Luftströmung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei genanntes Kollagengel mittels eines Verfahrens hergestellt wird, welches folgende Schritte umfasst: a) Mechanische Zerkleinerung von Bindegewebe und Homogenisierung bis zu einer Kollagensuspension, b) Behandlung der Kollagensuspension mit proteolytischen Enzymen, c) Alkalische Behandlung der Kollagensuspension bis zum Erreichen eines pH-Wertes von mindestens 8 und Neutralisation mit einer starken Säure bis zu einem pH-Wert zwischen 5 und 6, d) Präzipitation der Kollagenfasern durch Aussalzen, e) Resuspension des Präzipitates in einer wässrigen Lösung verdünnt mit einer schwachen Säure und Gewinnung von Kollagengel.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei folgende Zusatzschritte zwischen den Schritten d) und e) ausgeführt werden: d') Resuspension des Präzipitates in einer starken alkalischen Lösung unter Rühren für einen Zeitraum von mindestens 30 Minuten, d")Präzipitation der Kollagenfasern durch Aussalzen der alkalischen Lösung bei pH-Werten zwischen 5 und 6.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei es sich bei der genannten alkalischen Lösung um 1N NaOH handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei genannte Zeit zwischen 45 und 75 Minuten beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das Bindegewebe von Schritt a) von einem Säugetier stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei es sich bei dem Bindegewebe von Schritt a) um Sehnengewebe handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das genannte Sehnengewebe vom Pferd stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei es sich bei dem Bindegewebe von Schritt a) um Gewebe aus der Trachea handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das Trachealgewebe vom Rind, Schwein oder Pferd stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das Zerkleinern und Homogenisieren von Schritt a) nach der Zugabe einer wässrigen Lösung und bis zum Erreichen einer Suspension bestehend aus Kollagenpartikeln mit einer Größe unter 25 Mesh erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei auf die Homogenisierung eine Mikronisierung folgt.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei es sich bei dem proteolytischen Enzym aus Schritt b) des Verfahrens um Pepsin handelt und die Behandlung bei einem pH-Wert zwischen 2 und 3 durchgeführt wird über einen Zeitraum zwischen 10 und 20 Stunden.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die Resuspension des Kollagenpräzipitates in Schritt e) bei einer Kollagenkonzentration zwischen 0,5 und 6% durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die genannte Konzentration zwischen 2 und 3% liegt.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei genannte verdünnte wässrige Lösung, wie in Schritt (e) des Verfahrens eine Essigsäurelösung ist.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei genannte Essigsäurelösung eine Konzentration zwischen 0,1 und 1% (w/V) besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das in Schritt e) des Verfahrens erhaltene Kollagengel weiter homogenisiert und durch Anlegen eines Vakuums entgast wird.
Kollagenmembranen erhältlich durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3–7.
Verwendung der Kollagenmembranen gemäß Anspruch 1 oder 25 als Träger für die In-Vitro-Adhäsion, Anzucht oder Ansiedelung von Säugetierzellen.
Verwendung der Kollagenmembranen gemäß Anspruch 26, wobei genannte Säugetierzellen ausgewählt werden unter: Stammzellen, Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, Osteozyten und Chondrozyten.
Membranen gemäß Anspruch 1 oder 25 zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung der Membranen gemäß Anspruch 28 zur Herstellung von Zellmatrices für die Geweberekonstruktion.
Verwendung gemäß Anspruch 29, wobei für die genannte Geweberekonstruktion ausgewählt wird unter: Rekonstruktion von Epithel-, Endothelgewebe, Bindegewebe, Knorpel-, Knochen- und Osteochondralgewebe.
Membranen gemäß Anspruch 28 zur Geweberekonstruktion bei chronisch degenerativen Erkrankungen.