DE69720243T2

DE69720243T2 - Chemische modifikation von biomedizinischen materialien mit genipin

Info

Publication number: DE69720243T2
Application number: DE69720243T
Authority: DE
Inventors: Chau-Jen Thomas LEE; Ching-Kuan Lin; Hsing-Wen Sung
Original assignee: Challenge Bioproducts Co Ltd
Current assignee: Challenge Bioproducts Co Ltd
Priority date: 1996-11-05
Filing date: 1997-11-04
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2017-11-05
Also published as: CA2270599C; EP0941130A1; EP0941130B1; CN1236324A; DE69720243D1; JP2001503299A; CN1113672C; CA2270599A1; WO1998019718A1; US6608040B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die chemische Modifikation von biomedizinischen Materialien, wie Kollagen und Chitosan, mit einem natürlich vorkommenden Vernetzungsmittel, Genipin, und betrifft biokompatible Materialien, welche als biokompatible Implantate, Haftmittel und Wundverbände verwendet werden können, umfassend die biomedizinischen Materialien, welche mit Genipin vernetzt oder polymerisiert sind.
Literatur
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Für einen optimalen Wirkungsgrad bei biomedizinischen Anwendungen ist häufig die Vernetzung biologischer Moleküle erwünscht. Kollagen zum Beispiel, welches das strukturelle Gerüst biologischer Gewebe ausmacht, ist sehr umfangreich verwendet worden, um Bioprothesen und andere implantierte Strukturen wie Gefäßtransplantate herzustellen, wobei es ein gutes Medium für die Zell-Infiltration und -Proliferation bereitstellt. Kollagen-Auflagen sind auch als Wundverbände verwendet worden, wobei sie die Vorteile einer hohen Permeabilität für Wasserdampf und einer schnellen Wundheilung bereitstellen. Nachteile von nicht-vernetztem Kollagen beinhalten eine niedrige Bruchfestigkeit und die schnelle Degradation durch Kollagenase. Die Fixierung oder Vernetzung kollagenartiger Gewebe erhöht die mechanische Belastbarkeit, reduziert die Spaltung durch Kollagenase und reduziert die Antigenität und Immunogenität.
Chitosan, ein deacetyliertes Derivat von Chitin enthält freie Aminogruppen, welche auch z. B. durch Glutaraldehyd (Jameela) vernetzt werden können und wurde bei implantierten Arzneimittel-Verabreichungs-Vorrichtungen, als Hautersatz, für Wundverbände und andere Biomaterialien verwendet oder wurde für die Verwendung vorgeschlagen. Es zeigte die nützliche Eigenschaft die Kalkablagerung zu reduzieren, wenn andere implantierte Materialien damit beschichtet waren (Chanda).
Für die chemische Modifikation von Amin-enthaltenden biomedizinischen Materialien sind verschiedene Vernetzungsmittel verwendet worden. Am meisten verbreitet sind synthetische Chemikalien wie Formaldehyd, Glutaraldehyd, Dialdehyd-Stärke, Glycoaldehyd, Cyanamid, Diimide und Diisocyanate. Von diesen ist Glutaraldehyd, welcher rasch mit Proteinen reagiert, die am häufigsten verwendete. Probleme, die mit vernetztem Kollagen aufgetreten sind, beinhalten die Tendenz zur Verkalkung nach Implantation, was zu Erstarrung rund um ein Implantat führt, gegebenenfalls Degradation und Resorption in das umgebende Gewebe und toxische Reaktionen mit den Vernetzungsmitteln. Es ist bekannt, dass Glutaraldehyd allergene Eigenschaften besitzt, wobei es Kontaktdermatitis verursacht, und er ist in Konzentrationen > 10–25 ppm und in der Gewebekultur bereits in einer so geringen Menge wie 3 ppm cytotoxisch.
Eine andere nützliche Verwendung vernetzter biologischer Materialien ist für den Blutersatz. Zellfreies Hämoglobin, ein Blutersatz, ist für Antigen-freie Bluttransfusionen nützlich, wird aber sehr leicht während der Zirkulation vom Tetramer in ein Dimer transformiert. Hohe Sauerstoff-Affinität und kurze Halbwertszeit sind zusätzliche Limitierungen dieses Materials. Diese Schwierigkeiten können durch chemische Modifikation von Hämoglobin mit einem Vernetzungsmittel überwunden werden (siehe z. B. Chang, Keipert). Die Zunahme der Halbwertszeit von Hämoglobin im Blutkreislauf und die Verringerung seiner Sauerstoff-Affinität kann sowohl durch intermolekulare wie auch intramolekulare Vernetzung erreicht werden. Es zeigte sich jedoch, dass die Vernetzung mit Glutaraldehyd die Dimer-Bildung während der Hämoglobin-Polymerisation induziert.
Es ist deshalb wünschenswert ein Vernetzungsmittel bereitzustellen, das für die Verwendung in biomedizinischen Anwendungen geeignet ist, das eine niedrige Toxizität besitzt, stabile biokompatible vernetzte Produkte bildet und nach der Implantation seine Stabilität erhält. In einem Aspekt (einer Ausführungsform) stellt die Erfindung die Verwendung eines biokompatiblen vernetzten, Amin-enthaltenden Biomoleküls in einem biokompatiblen Implantat, Wundverband oder Haftmittel bereit, ausgewählt aus Chitosan oder einem Bindegewebsprotein, wobei das Biomolekül mit Genipin vernetzt ist. Falls das Biomolekül ein Bindegewebsprotein ist, ist das Protein vorzugsweise Kollagen. In einem anderen Aspekt (Ausführungsform) betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung eines biokompatiblen Implantats. Das Verfahren beinhaltet die Schritte Ausbildung eines Materials, welches ein Aminenthaltendes Biomolekül umfasst, das ausgewählt ist aus Chitosan oder einem Bindegewebsprotein, zu einer Struktur, die für das Implantat geeignet ist, und Vernetzen den Materials mit Genipin. Falls das Material ein Bindegewebsprotein umfasst, ist das Protein vorzugsweise Kollagen.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1A-H sind Computer-erzeugte Bilder, die von Fotomikrografien (× 200) unvernetzter oder frischer Gewebe (1A–B) und von Geweben abstammen, welche mit Glutaraldehyd (GA) (1C–D), Epoxy (EX-810) (1E–F) und Genipin (1G–H) vernetzt sind, vor bzw. nach Degradation durch Kollagenase;
Die 2 und 3 zeigen die Denaturierungs-Temperaturen der Test-Proben aus 1, die vor bzw. nach Kollagenaseoder Pronase-Degradation erhalten wurden;
4 zeigt den Bruchwiderstand frischer, Glutaraldehydfixierter, Epoxy-fixierter und Genipin-fixierter Gewebe vor und nach Kollagenase-Degradation;
5 zeigt die Denaturierungs-Temperaturen von frischen, Glutaraldehyd-vernetzten (GA), Epoxy-vernetzten (EX-810) und Genipin-vernetzten Pericardial-Gewebe vor (t = 0) und nach (t = 1 Woche; t = 4 Wochen) subkutaner Implantation in ein wachsendes Rattenmodell;
6 zeigt den Bruchwiderstand der Proben von 5 vor und nach der Implantation;
7 zeigt den Calcium-Gehalt der Proben von 5 vor und nach der Implantation;
Die 8A–8D sind Computer-erzeugte Bilder, die von Fotomikrografien (Vergrößerung × 100) von Zellen abstammen, welche in (A) Kontrollmedium und in Medium, welches mit (B) 1 ppm Glutaraldehyd, (C) 5 ppm Epoxy-Verbindung und (D) 1.000 ppm Genipin ergänzt wurde;
Die 9A–9H sind Computer-erzeugte Bilder, die von Abtastungs-Elektronen-Mikrografien (Vergrößerung × 1.500) von (A) frischem Gewebe, (B) Glutaraldehyd-vernetztem Gewebe, (C) Epoxy-vernetztem Gewebe und (D) Genipin-vernetztem Gewebe, alle vor der Implantation, (E) dem frischem Gewebe, eine Woche nach Implantation erhalten und (F) Glutaraldehyd-vernetztem Gewebe, (G) Epoxy-vernetztem Gewebe und (H) Genipin-vernetztem Gewebe 12 Wochen nach Implantation, abstammen;
Die 10A–C sind Computer-erzeugte Bilder, die von Fotomikrografien (Vergrößerung × 200) von (A) Glutaraldehydvernetztem Gewebe, (B) Epoxy-vernetztem Gewebe und (C) Genipin-vernetztem Gewebe 12 Wochen nach Implantation und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, abstammen;
I. Definitionen
Falls nicht anders angegeben, haben die nachfolgenden Begriffe die folgenden Bedeutungen.
"Genipin" bezieht sich auf die natürlich vorkommende Verbindung, welche als Struktur I gezeigt ist und auf deren Stereoisomere und Gemische davon.
Ein "kollagenartiges Material" oder eine "kollagenartige Quelle" bezieht sich auf ein Material, welches größtenteils Kollagen umfasst, wie beispielsweise eine Probe von Säuger-Bindegewebe und ist für die Herstellung einer biologischen Prothese, eines Implantats, eines Haftmittels oder eines Wundverbandes geeignet.
Ein "biologisches Implantat" bezieht sich auf eine biomedizinische Vorrichtung, die in Körpergewebe eingebracht wurde oder daran angeheftet wurde, um dort für einen Zeitraum zu verbleiben, wie eine Arzneimittel-Verabreichungs-Vorrichtung für eine erweiterte Freisetzung, ein Blutgefäß- oder Haut-Ersatz oder eine Prothese.
II. Herstellung und Eigenschaften von Genipin
Genipin, welches nachfolgend als Struktur I gezeigt ist, ist ein Glycosid der Regenbogenhaut, das in Früchten vorkommt (Gardenia jasmindides Ellis). Es kann aus der parentalen Verbindung Geniposid, Struktur II, erhalten werden, das aus natürlich vorkommenden Quellen, wie zum Beispiel in Oka, Okada oder Kometani beschrieben, isoliert werden kann. Genipin, das Aglykon von Geniposid kann aus letzterem durch Oxidation gefolgt von Reduktion und Hydrolyse (Tanaka) oder durch enzymatische Hydrolyse (Fujikawa) hergestellt werden. In einer anderen Ausführungsform kann racemisches Genipin synthetisch hergestellt werden, z. B. nach dem Verfahren von Büchi.
Obwohl Struktur I die natürliche Konfiguration von Genipin zeigt, kann jedes Stereoisomer oder Gemisch von Stereoisomeren von Genipin als ein Vernetzungsmittel in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Genipin hat eine niedrige akute Toxizität mit einem LD₅₀ i. v. von 382 mg/kg in Mäusen. Es ist deshalb viel weniger giftig als Glutaraldehyd und viele andere weitläufig verwendeten synthetischen Vernetzungsmittel. Wie nachfolgend beschrieben, ist gezeigt worden, dass Genipin ein wirksames Vernetzungsmittel für die Behandlung biologischer Materialen darstellt, welche beabsichtigt sind, in vivo für biomedizinische Anwendungen wie Prothesen und andere Implantate, Wundverbände und Blut-Ersatz eingesetzt zu werden.
III. Vernetzung von biologischen strukturellen Verbindungen mit Genipin
Die biologischen Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung vernetzt werden, beinhalten vorzugsweise Bindegewebsproteine wie Kollagen oder Elastin, obwohl Materialien, die von solchen Proteinen abstammen, ebenfalls vernetzt werden können, z. B. Gelatine, die durch Hydrolyse von Kollagen oder kollagenartigem Gewebe hergestellt wird. Andere Aminenthaltende strukturelle Verbindungen, wie Chitosan, können auch mit Genipin behandelt werden, um das erfindungsgemäße biokompatible vernetzte Material herzustellen.
Die Fertigung solcher Materialien, insbesondere von Kollagen, mit oder ohne Vernetzung, als Bestandteil medizinischer Vorrichtungen wie Bioprothesen, Haut- und Gefäß-Pfropfen und Wundverbänden ist im Stand der Technik gut etabliert. Siehe zum Beispiel die Diskussion in "Prosthetic and Biomedical Devices", Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Science & Technology, John Wiley & Sons, 1995, und zusätzliche Bezugnahmen wie Hilbert, Khor, Li, Oliver, Sabelman und Stenzel. Für Bezugnahmen zu Verwendungen von Chitosan in solchen Anwendungen siehe zum Beispiel Chandy (1990, 1995) Jameela und Olsen.
Genipin-vernetzte kollagenartige Gewebe können auch für die Homeostase verwendet werden, indem sie eine biokompatible Oberfläche zur Aufhaltung des Blutflusses und zur Unterstützung der Blutgerinnung bereitstellen. Ein biokompatibles Haftmittel kann durch Vernetzung eines Gelatins hergestellt werden, welches aus der Hydrolyse von Kollagen oder der hydrolytischen Behandlung eines Kollagen-enthaltenden Gewebes abstammt, mit einer Menge von Genipin, welche wirksam ist, um die gewünschte Haftung und Konsistenz bereitzustellen.
Für die Vernetzung kollagenartiger Gewebe wurde herausgefunden, dass etwa 200 ml einer 5%-Lösung für einen 6 × 6 cm-Gewebelappen eine wirksame Menge von Genipin ist, wie in Beispiel 1 beschrieben. In Abhängigkeit von der gewünschten Vernetzungsdichte könnte mehr oder weniger Reagenz verwendet werden. Auf ähnliche Weise könnten für die Vernetzung von Gelatine oder Chitosan Routineexperimente verwendet werden, um die Menge an Reagenz zu bestimmen, welche für die gewünschten Eigenschaften des Endproduktes geeignet ist.
Wie nachfolgend dargestellt, sind Genipin-vernetzte kollagenartige Gewebe in hohem Maße resistent für Degradation durch Kollagenase oder Pronase und ihre Biokompatibilität ist in subkutanen Implantations-Experimenten veranschaulicht. Die nachfolgenden Abschnitte beschreiben die Eigenschaften, einschließlich Enzym-Resistenz, Erhaltung mechanischer Eigenschaften und niedrige Toxizität von Kollagen-Gewebeproben, welche mit Genipin vernetzt sind, im Vergleich mit Proben, welche mit anderen herkömmlich verwendeten Mitteln vernetzt sind.
A. Stabilität für degradative Enzyme
Um die Stabilität kollagenartiger Fasern zu bestimmen, welche mit unterschiedlichen Vernetzungsmitteln behandelt wurden, wurden Gewebeproben mit den Mitteln behandelt, der Degradation mit Kollagenase oder Pronase unterzogen und, wie in nachfolgendem Beispiel 1 beschrieben, getestet.
Die 1A–H stellen Computer-erzeugte Bilder dar, welche von Fotomikrografien frischer (1A–B), Glutaraldehydvernetzter (1C–D), Epoxy-vernetzter (1E–F) und Genipinvernetzter (1G–H)-Gewebeproben, vor bzw. nach Degradation mit Kollagenase, abstammen. Nach der Degradation hatte sich das frische Gewebe in Stücke zersetzt (1B). Im Gegensatz dazu verblieben die Kollagen-Faserstrukturen der Glutaraldehyd-vernetzten und Genipin-vernetzten Gewebe nach der Kollagenase-Degradation intakt (1D und 1H), während eine schwache Zersetzung der Kollagenfasern des Epoxyvernetzten Gewebes beobachtet wurde (1F).
Die Denaturierungs-Temperatur jeder Test-Probe wurde mit einem Perkin Elmer Differenzial-Abtast-Kalorimeter (Modell DSC 7, Norwalk, Connecticut, USA) gemessen. Die 2 und 3 zeigen die Denaturierungs-Temperatur der vorstehend ausgewiesenen Test-Proben vor und nach der Kollagenase- bzw. Pronase-Degradation. Es konnte keine Denaturierungs-Temperatur der frischen (nicht-vernetzten) Gewebe nach Kollagenase- oder Pronase-Degradation bestimmt werden, aufgrund des intensiven Zerfalls dieser Proben. Wie in den Figuren veranschaulicht, war die Verminderung der Denaturierungs-Temperatur für das Genipin-vernetzte Gewebe (< 2%) niedriger als das für die Glutaraldehyd- und Epoxy-vernetzten Gewebe (3–10%).
Die Genipin-vernetzten Gewebe zeigten auch eine übergeordnete Erhaltung der Zerreißfestigkeit. Für die Messung der Zerreißfestigkeit wurden von jeder Test-Probe vor und nach in vitro-Degradation Gewebestreifen zurechtgeschnitten. Mit Hilfe von uniaxialen Messungen unter Verwendung einer Instron Universal Test-Maschine (Model 4302) wurden bei einer konstanten Geschwindigkeit von 50 mm/min Druck-Verformungs-Kurven der Gewebestreifen bestimmt. 4 zeigt die Ergebnisse der Zerreißfestigkeit-Spannungs-Messungen der frischen, Glutaraldehyd-vernetzten, Epoxy-vernetzten oder Genipin-vernetzten Gewebe vor und nach Kollagenase-Degradation. Die Zerreißfestigkeit des frischen Gewebes wurde nach der Degradation als 0 verzeichnet, wiederum aufgrund der intensiven Zersetzung dieser Probe. Wie in der Figur gezeigt, war die Verringerung der Zerreißfestigkeit für das Genipinvernetzte Gewebe minimal (< 1%) und war signifikant weniger als für die Glutaraldehyd-vernetzten und Epoxy-vernetzten Gewebe (31% bzw. 25%).
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass Genipin-vernetzte kollagenartige Gewebe thermale Stabilität und Zerreißfestigkeit besitzen, welche denen von Glutaraldehyd-vernetzten Geweben ähnlich sind, und dass sie ihre Zerreißfestigkeit und thermale Stabilität nach Behandlung mit Kollagen-degradierenden Enzymen in signifikant höherem Maße erhalten, als die Glutaraldehyd- und Epoxy-vernetzten Gewebe.
B. Stabilität bei der subkutanen Implantation
1. Kurzfristige Studie (vier Wochen)
Unter Verwendung eines wachsenden Ratten-Modells wurde eine subkutane Implantations-Studie durchgeführt, um die Stabilität (Veränderung der Denaturierungs-Temperatur und der Zerreißfestigkeit) und den Grad an Calcium-Ablagerung von implantierten Pericard-Geweben zu bestimmen, die mit Genipin vernetzt sind.
Die Gewebeproben wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. Eine subkutane Implantations-Studie wurde mit sechs Wochen alten männlichen Wistar-Ratten durchgeführt und die Implantate wurden eine Woche und vier Wochen nach der Implantation wieder entnommen.
Eine Woche nach Implantation waren frische Proben im Allgemeinen dünner als die vernetzten Proben und waren nach vier Wochen vollständig degradiert. Nach vier Wochen wurde auf den Genipin-vernetzten Proben eine dünne Schicht von Wirtsgewebe beobachtet, jedoch nicht auf den Glutaraldehy- oder Epoxy-vernetzten Proben. Unter Verwendung dieses Standards schienen die Genipin-vernetzten Proben die höchste Biokompatibilität aufzuweisen.
Die Denaturierungs-Temperatur und Zerreißfestigkeit der Proben wurde, wie vorstehend beschrieben, vor und nach Implantation bestimmt. Wie in 5 gezeigt, waren die Denaturierungs-Temperaturen der Genipin-vernetzten und Glutaraldehyd-vernetzten Proben ähnlich und waren signifikant höher als die der Epoxy-vernetzten Proben. Das bedeutet eine höhere Vernetzungsdichte bei den Genipin-vernetzten und Glutaraldehydvernetzten Geweben. In allen Fällen wurde bis zu vier Wochen nach Implantation eine geringe Degradation bei der Denaturierungs-Temperatur beobachtet.
Wie in 6 gezeigt, war die Zerreißfestigkeit der Genipin-vernetzten Probe in allen Stadien derjenigen der Epoxy-vernetzten Probe übergeordnet. Vor der Implantation und eine Woche nach Implantation waren die Zerreißfestigkeit der Genipin- und Glutaraldehyd-vernetzten Proben ähnlich. Vier Wochen nach Implantation jedoch zeigte die Genipin-vernetzte Probe im Wesentlichen größere Zerreißfestigkeit als die Glutaraldehyd-vernetzte Probe.
7 zeigt die Menge an Calcium, welche während der Implantation abgelagert wurde, gemessen durch Atom-Absorptionsspektroskopie wie in Beispiel 3 beschrieben. Wie die Abbildung zeigt, war der Calcium-Niederschlag für die Genipinund Epoxy-vernetzten Proben ziemlich ähnlich und war nach einer Woche geringer als die Menge, welche für die nicht vernetzte Probe gezeigt wurde. Die Glutaraldehyd-vernetzte Probe zeigte nach einer Woche wesentlich größere Calcium-Ablagerung und nach vier Wochen einen Spiegel, welcher demjenigen der beiden anderen vernetzten Proben ähnlich war.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass kollagenartige Gewebe, welche mit Genipin vernetzt sind, ähnliche oder übergeordnete Stabilität und Biokompatibilität zeigen im Vergleich zu denjenigen, welche mit Glutaraldehyd vernetzt sind, ohne die begleitende Toxizität von Glutaraldehyd und verwandten Verbindungen.
2. Langfristige Studie (12 Wochen)
Sterilisierte Proben von frischem (nicht vernetztem), Glutaraldehyd-, Epoxy- und Genipin-vernetztem Schweine-Perikard wurden subkutan in ein wachsendes Ratten-Modell (sechs Wochen alte männliche Wistar) unter aseptischen Bedingungen, wie für die kurzfristige Studie vorstehend beschrieben, implantiert. Vier Proben, eine von jeder untersuchten Gruppe, wurden auf dem vorderen Rücken des Tiermodells implantiert; die anderen vier Proben, nochmals eine von jeder untersuchten Gruppe, wurden in umgekehrter Reihenfolge auf dem hinteren Rücken implantiert. Jede Test-Probe war ungefähr 0,5 cm breit und 2 cm hoch. Die Reihenfolge der Test-Proben in jeder Reihe wurde von Tier zu Tier rotiert. Eine Woche (n = 4), vier Wochen (n = 4) und 12 Wochen (n = 8) nach der Operation wurden die implantierten Proben dann wieder entnommen. Bei der Entnahme wurde jede entnommene Probe getestet und fotografiert. Es wurde festgestellt, dass die entnommenen frischen Gewebe signifikant dünner waren als die Glutaraldehyd-, Epoxy- und Genipinvernetzten Gegenstücke. Vier Wochen nach der Operation fanden sich sechs von acht implantierten frischen Gewebeproben voll-ständig degradiert, während die anderen beiden frischen Proben von dem Wirtsgewebe absorbiert wurden. Im Gegensatz dazu verblieben die Glutaraldehyd-, Epoxy- und Genipin-vernetzten Gewebe während des vollständigen Verlaufs der Studie intakt.
Abtast-Elektronenmikroskopie (scanning electron microscopy; SEM) wurde verwendet, um die Morphologie der Oberfläche jeder entnommenen Probe zu untersuchen. Die Proben, welche für die SEM-Untersuchung verwendet wurden, wurden zuerst mit 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat (pH 7,4) fixiert und dann in 1% Osmiumtetroxid nachfixiert. Nachfolgend wurden die Proben in einer ansteigenden Serie von Alkohol-Lösungen dehy driert, mit Kohlendioxid am kritischen Punkt getrocknet und mit einem Goldfilm besprüht (überzogen). Die Untersuchung wurde mit einem Hitachi Modell S-800 Abtast-Elektronenmikroskop durchgeführt.
Die 9A und 9E zeigen Computer-erstellte Bilder, welche von den, SEM-Mikrografien des frischen Gewebes vor der Implantation und eine Woche nach der Operation abstammen. Wie in 9E gezeigt, war das frische Gewebe, das eine Woche nach der Operation entnommen wurde, bereits intensiv degradiert. Die Glutaraldehyd- und Genipin-vernetzten Gewebe, welche 12 Wochen nach der Operation entnommen wurden ( 9F bzw. 9H) waren im Vergleich mit ihren Gegenstücken vor der Implantation kaum degradiert (9B bzw. 9D). Der Grad an Degradation für das Epoxy-vernetzte Gewebe (9G gegenüber 9C) war intensiver als für dessen Glutaraldehyd- und Genipinvernetzte Gegenstücke.
Die Proben, die für die Lichtmikroskopie verwendet wurden, wurden in 10% Phosphat-gepuffertem Formalin für mindestens drei Tage fixiert und für die histopathologische Untersuchung vorbereitet. Bei der histopathologischen Untersuchung wurden die fixierten Proben in Paraffin eingebettet, auf eine Dicke von 5 μm zurechtgeschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt. Die gefärbten Bereiche jeder Test-Probe wurden mit Hilfe der Lichtmikroskopie (Nikon Microfoto-FXA) auf Gewebeentzündliche Reaktion untersucht und mit einem 100 ASA Kodachrom-Film fotografiert.
Computer-erstellte Bilder, welche von den Fotomikrografien der Glutaraldehyd-, Epoxy- und Genipin-vernetzten Gewebe abstammen, welche 12 Wochen nach der Operation erhalten wurden, sind in 10(A–C) gezeigt. Es sollte angemerkt werden, dass von dem frischen Gewebe, welches zu diesem Zeitpunkt entnommen wurde, aufgrund dessen vollständiger Degradation keine Fotomikrografie erstellt werden konnte. Die entzündliche Reaktion des Genipin-vernetzten Gewebes war signifikant weniger als die der Glutaraldehyd- und Epoxyvernetzten Gegenstücke, was eine übergeordnete Biokompatibilität des Genipin-vernetzten Gewebes aufgrund seiner signifikant niedrigeren Toxizität anzeigt (siehe nachfolgenden Abschnitt C). Um den Calciumgehalt jeder entnommenen Probe zu bestimmen, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde eine Atom-Absorptions-Analyse durchgeführt. Die Daten bezüglich des Calciumgehalts für die frischen, Glutaraldehyd-, Epoxy- und Genipin-vernetzten Gewebe vor Implantation und diejenigen, welche 1, 4 und 12 Wochen nach der Operation entnommen wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt, ausgedrückt als μg Calcium pro mg Gewebe-Trockengewicht. Es sollte angemerkt werden, dass für die frischen (nicht vernetzten) Gewebe, welche 4 und 12 Wochen nach der Operation entnommen wurden, aufgrund ihrer vollständigen Zersetzung keine Daten erhalten werden konnten. Wie in der Tabelle gezeigt, wurden keine signifikanten Unterschiede im Calciumgehalt zwischen den Proben vor Implantation und denjenigen, welche zu verschiedenen Implantations-Zeitpunkten entnommen wurden, in dieser Studie beobachtet.
Tabelle 1 Calciumgehalt (μg Calcium/mg Gewebe-Trockengewicht) vor der Implantation und zu verschiedenen Implantationszeiten
C. Cytotoxizitäts-Studie
Die Zellen, die in dieser Studie verwendet wurden, waren menschliche Vorhaut-Fibroblasten, welche von der Vorhaut eines normalen neugeborenen Säuglings abstammten. Die Zellen wurden in Petrischalen mit einem Durchmesser von 3,5 cm in Dulbecco's modifiziertem Igel-Medium (DMEM, Gibco 430–2800EG, Grand Island, NY, USA), ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (Hyclone Laboratories, Logan, Ut., USA) gezüchtet (10⁵ Zellen pro Schale). Die Zellkultur wurde in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C mit 10% CO₂ in Luft für 24 Stunden durchgeführt.
Dann wurde das Medium mit Genipin (Challenge Bioproducts Co., Taichung, Taiwan) in DMEM, in einer Konzentration von 0 (Leerwert), 10, 100 oder 1.000 ppm (μg/ml) ersetzt. Glutaraldehyd und eine Epoxy-Verbindung (Ethylenglycol-diglycidyl ether, Denacol^® EX–810, Nagase Chemicals, Ltd., Osaka, Japan) in einer Konzentration von 1, 5 oder 10 ppm wurden ebenfalls getestet.
24 Stunden nach Züchtung wurden die Zellen zwei Mal mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und das Medium wurde mit einem frischen DMEM-Medium ohne eines der zu testenden Vernetzungsmittel ersetzt. Schließlich wurden die Zellen für weitere zwei Wochen inkubiert. Während dieser Periode wurde das Medium ein Mal gewechselt.
8A zeigt ein Computer-erzeugtes Bild, das von einer Fotomikrografie einer Kontroll-Kultur menschlicher Fibroblasten abstammt, welche wie vorstehend beschrieben gezüchtet wurde, aber ohne eines der zu testenden Vernetzungsmittel. Wie in der Figur gezeigt, waren die Zellen, welche in der Petrischale beobachtet wurden, konfluent. Die 8B–8D zeigen Computer-erzeugte Bilder, welche von Fotomikrografien der menschlichen Fibroblasten abstammen, die in Medium gezüchtet wurden, welches mit unterschiedlichen Vernetzungsmitteln in den folgenden Konzentrationen ergänzt wurde: 1 ppm Glutaraldehyd (8B), 5 ppm Epoxy (8C) und 1.000 ppm Genipin (8A).
Die Zelldichte war in dem Medium, das mit Glutaraldehyd ergänzt wurde (8B) am geringsten, in der Epoxybehandelten Kultur etwas höher. Beide waren viel geringer, als diejenige, welche in dem Kontrollmedium gefunden wurde. Im Gegensatz dazu war die Zelldichte, welche in dem Medium gesehen wurde, das mit Genipin ergänzt wurde (8D), signifikant höher als in denjenigen, welche mit Glutaraldehyd oder der Epoxy-Verbindung ergänzt wurden, trotz einer viel höheren Konzentration von Genipin, welches verwendet wurde. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Cytotoxizität von Genipin signifikant niedriger ist als diejenige von Glutaraldehyd und der Epoxy-Verbindung.
Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, sind jedoch nicht so gedacht, dass sie diese auf irgendeine Art und Weise einschränken.
Beispiel 1: Stabilität von vernetztem kollagenartigem Gewebe gegenüber degradativen Enzymen
Frisches Schweine-Perikard, das aus einem Schlachthaus besorgt wurde, wurde als Rohmaterial verwendet. Die Gewebsproben wurden sofort nach der Entnahme in kalte physiologische Kochsalzlösung gegeben und für die Vernetzung verschickt. 5% Genipin-Lösung, welche mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,4) gepuffert wurde, wurde verwendet, um das biologische Gewebe zu vernetzen. Die Behandlung wurde für drei Tage bei 37°C durchgeführt. Nach der Vernetzung wurde das biologische Gewebe für 60 Minuten in deionisiertem Wasser gespült. Nachfolgend wurde das vernetzte Gewebe mit einer 70 Eigen Alkohol-Lösung für sieben Tage bei 37°C sterilisiert. Glutaraldehyd- und Epoxy-vernetzte Gegenstücke wurden als Kontrollen verwendet. Eine 0,625% Glutaraldehyd-Lösung wurde für die Vernetzung verwendet. Das Epoxy-Reagenz war eine 4%ige Lösung von Ethylenglycol-diglycidylether, Denacol^® EX-810, welches von Nagase Chemicals, Ltd., Osaka, Japan erhalten wurde.
Um die Veränderungen in der Kollagen-Fibrillenstruktur jeder Test-Probe vor und nach Kollagenase- oder Pronase-Degradation zu untersuchen, wurde die Lichtmikroskopie verwendet. Die Test-Proben wurden in einer 10%igen Formalinlösung fixiert und für die histologische Untersuchung vorbereitet. Bei der histologischen Untersuchung wurden Schnitte jeder Test-Probe vor und nach Degradation mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt .
Die Denaturierungs-Temperatur jeder Test-Probe wurde mit einem Perkin Elmer Differenzial-Abtast-Kalorimeter (Modell DSC 7, Norwalk, Connecticut, USA) gemessen. Die Ergebnisse sind vorstehend beschrieben und in den 2 und 3 gezeigt. Für die Zerreißfestigkeits-Messungen wurden von jeder Test-Probe vor und nach in vitro-Degradation Gewebestreifen zugeschnitten. Druck-Dehnbarkeits-Kurven der Gewebestreifen wurden durch uniaxiale Messungen unter Verwendung einer Instron Universal Testing Machine (Modell 4302) bei einer konstanten Geschwindigkeit von 50 mm/min bestimmt. Die Ergebnisse sind vorstehend beschrieben und in 4 gezeigt.
Beispiel 2: Subkutane Implantations-Studie
Frisches Schweine-Perikard, wie vorstehend beschrieben, wurde als Rohmaterial verwendet. Die Proben wurden gespült und zurechtgemacht, um vor dem Vernetzen mit Genipin (5%ige Löung), Epoxid (4%ige Lösung von Denacol^® EX-810, Nagase Chemicals, Ltd., Osaka, Japan) oder Glutaraldehyd (0,625%ige Lösung) für drei Tage bei 37°C, Blut und Fett zu entfernen. Die Menge an Lösung, welche für jeden Fall verwendet wurde, betrug etwa 200 ml für ein 6 × 6 cm Schweine-Perikard. Die Epoxy-Lösung wurde mit 0,21 M Natriumcarbonat/0,02 M Natriumbicarbonat (pH 10,5) gepuffert, während die Glutaraldehyd- und Genipin-Lösungen mit 0,01 M Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,4, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gepuffert wurden. Das vernetzte Perikard wurde mit einer Reihe von Alkohol-Lösungen, welche ansteigende Konzentration besaßen, (20–75%) für etwa fünf Stunden sterilisiert und schließlich mehrere Male in sterilisierter Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gespült.
Eine subkutane Implantat-Studie wurde mit sechs Wochen al-ten männlichen Wistar-Ratten unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Die Implantate wurden eine und vier Wochen nach Implantation wieder entnommen. Die Denaturierungs-Temperaturen und die Zerreißfestigkeit wurden wie in Beispiel 1 bestimmt und der Calciumspiegel wurde durch Atom-Absorptions-Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse sind vorstehend beschrieben und in den 5–7 gezeigt.
Beispiel 3: Bestimmung des Calcium-Gehaltes der implantierten Gewebe-Proben
Die erhaltenen Gewebe-Proben wurden für 24 Stunden lyophilisiert und gewogen. Die lyophilisierten Proben wurden dann in einer 6 N HCl-Lösung (etwa 3 mg lyophilisiertes Gewebe/3 ml 6 N HCl) eingetaucht und nachfolgend in einem Mikrowellen-Hydrolyse-System (MDS–2000, CEM Co., Matthews, NC, USA) für 45 Minuten hydrolysiert. Schließlich wurde die hydrolysierte Probe mit einer 5%igen Lanthanumchlorid in 3 normaler HCl-Lösung verdünnt. Der Calcium-Gehalt jeder Test-Probe wurde mit Hilfe eines Atom-Absorptions-Spektralfotometers (Modell AA-100, Perkin Elmer Inc., Norwalk, Conn., USA) bestimmt.

Claims

Verwendung eines vernetzten, Amin enthaltenden Biomoleküls, ausgewählt aus Chitosan oder einem Bindegewebsprotein, wobei das Biomolekül mit Genipin vernetzt ist, in einem biokompatiblen Implantat, Wundverband oder Haftmittel.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Biomolekül ein Bindegewebsprotein ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Bindegewebsprotein Kollagen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Biomolekül Chitosan ist.
Verfahren zur Bereitstellung eines biokompatiblen Implantats, umfassend die Ausbildung eines Materials, das ein Amin enthaltendes Biomolekül umfasst, das ausgewählt ist aus Chitosan oder einem Bindegewebsprotein, zu einer Struktur, die für das Implantat geeignet ist, und Vernetzen des Materials mit Genipin zur Herstellung einer vernetzten Struktur.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Material ein Bindegewebsprotein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Bindegewebsprotein Kollagen ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Material Chitosan umfasst.
Biokompatibles Implantat, Wundverband oder Haftmittel, umfassend ein vernetztes, Amin enthaltendes Biomolekül, das ausgewählt ist aus Chitosan oder einem Bindegewebsprotein, wobei das Biomolekül mit Genipin vernetzt ist.
Biokompatibles Implantat, Wundverband oder Haftmittel nach Anspruch 9, wobei das Biomolekül wie in einem der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist.