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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf eine nicht auf Gelatine basierende Beschichtung oder ein nicht
auf Gelatine basierendes Dichtmittel für poröse Gefäßprothesen, und auf ein Verfahren
zum Fertigen dieser Beschichtung oder dieses Dichtmittels.
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Aus Textilien (wie etwa Polyester)
konstruierte poröse
Gefäßprothesen
sind normalerweise gewebt oder gewirkt und beruhen letztendlich
auf Wirtsgewebe, das in die Räume
zwischen den Garnen eindringt. Um auf Dauer zu funktionieren, muss
die Prothese daher Porosität
erlangen, während
das Bluten des Implantats durch die Wand der Prothese verhindert
oder mindestens bis zu einem annehmbaren Grad begrenzt werden muss.
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In der Vergangenheit ist dieses Dilemma
durch Einweichen einer porösen,
auf einer Textilie basierenden Prothese im Blut des Patienten, das
dann gerinnt, um eine Dichtung zu bilden, gelöst worden. Diese Vorgerinnungstechnik
ist zeitaufwendig, setzt die Prothese potenzieller Verunreinigung
aus und kann bei Patienten mit reduzierter Gerinnungsfähigkeit
(entweder reduzierte spontane Blutgerinnung oder durch Verabreichung
von Antithrombozyten- oder Anti-Thrombose-Medikation) unwirksam sein.
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In der letzten Zeit sind Gefäßprothesen
mit einer Vielfalt bioresorbierbarer Materialien vorgedichtet worden.
Die bis heute versuchten Dichtmittel basierten eher auf Proteinen,
wie etwa Collagen, Gelatine oder Eiklar. Vernetzer wie etwa Glutaraldehyd,
Formaldehyd, Carbodiimid oder Isocyanate sind verwendet worden, um
die Proteine unlöslich
zu machen, und EP-B-0,183,365; US-A-4,747,848 und US-A-4,902,290,
die alle die Präparation
von vernetzten auf Gelatine basierenden Dichtmitteln beschreiben,
können
erwähnt
werden. Hydrolyse oder enzymatische Einwirkung im Wirtsgewebe hat
das Dichtmittel dann schrittweise aus der Textilie zersetzt oder
entfernt, um das notwendige Einwachsen des Gewebes zu erlauben.
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Die auf Protein basierenden Dichtmittel
des Stands der Technik werden aus tierischen oder menschlichen Quellen
gewonnen, was die Möglichkeit
zur Übertragung
von Infektionen schafft. Dies hat besonders nach der Übertragung
von BSE auf Menschen Besorgnis erregt, was die Besorgnis der Öffentlichkeit
wegen der Sicherheit von von Tieren gewonnenen Implanaten erheblich
vergrößert hat.
Obwohl manche Materialien, wie etwa Gelatine, in großen handelsüblichen
Mengen hergestellt werden und gemischt werden, um hohe Lot-to-lot-Konsistenz
zu gewähren,
weisen Erzeugnisse von natürlichen
Rohmaterialien zusätzlich
die Möglichkeit
zur Veränderlichkeit
auf, was Unsicherheit bezüglich
der Leistung des Transplantats schafft.
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US8 1229 beschreibt eine bioresorbierbare
Dichtmittel-Zusammensetzung, die mindestens zwei Polysaccharide
umfasst, die vernetzt werden können.
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf ein bioresorbierbares Dichtmittel, das nicht aus einem
Tier gewonnen wurde, sondern auf einem vernetzten Dextran basiert.
Dextran wird durch einen Fermentationsprozess unter Verwendung von
Leuconostoc mesenteroides-Bakterien hergestellt, die auf einer auf
Zucker basierenden Energiequelle wie etwa Saccharose wachsen. Teilweise
Hydrolyse des Fermentationsprodukts ergibt Dextrane von definierter
relativer Molekülmasse.
Diese sind weitgehend als Plasmaersatz mit einer typischen relativen
Molekülmasse
von 40000 verwendet worden.
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Dextrane dieser relativen Molekülmasse sind
frei wasserlöslich.
Um ein nützliches
Transplantatdichtmittel zu bilden, müssen die Dextrane unlöslich gemacht
werden. Dextrane sind jedoch nicht leicht vernetzbar, da sie begrenzte
aktivierte Stellen aufweisen, um intermolekulare Bindungen zu bilden.
Die verfügbaren
Gruppen sind fast ausschließlich
Hydroxyl(OH)gruppen.
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Das britische Patent Nr. 854,715
beschreibt die Bildung eines auf Dextran basierenden Polymers unter Verwendung
von Epichlorhydrin. Der auf Epichlorhydrin basierende Ansatz bildet
jedoch sehr stabile Vernetzungen, so dass das resultierende Polymer
gegenüber
enzymatischen als auch hydrolytischen Einwirkungen beständig ist
und nicht biologisch abbaubar ist. Epichlorhydrin vernetztes Dextran
ist daher als ein Gefäßtransplantatdichtmittel
ungeeignet, da es nicht biologisch abbaubar ist und das Einwachsen
von Gewebe innerhalb des erforderlichen Zeitabschnitts nicht erlauben
würde.
EP-B-0,183,365 und US-A-4,747,848 beschreiben beide ein auf Gelatine
basierendes Dichtmittel, in welchem der Zeitraum der Reabsorption
steuerbar ist.
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Um dieses Problem zu beseitigen,
ist ein neuartiges auf Dextran basierendes Polymer hergestellt worden,
das in dem Zeitabschnitt von Interesse durch Hydrolyse biologisch
abbaubar ist.
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Die vorliegende Erfindung stellt
eine biologisch abbaubare Dichtmittel-Zusammensetzung bereit, die ein durch
Reaktion zwischen Dextran, Formaldehyd und Harnstoff gebildetes
Polymer beinhaltet. Während das
Dextranpolymerprodukt unlöslich
ist, ist das Polymer mit Bindungen gebildet, die ausreichend labil
sind, um Resorption in einer angemessenen Geschwindigkeit zum Einwachsen
von Gewebe zu erlauben. Wenn das vernetzte Polymer weiterhin zerfällt, zerfällt es in
einfache Produkte, von denen alle eine geringe relative Molekülmasse aufweisen,
und die vom Körper
leicht beseitigt werden können.
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Der Begriff „Dextran", wie er hier verwendet wird, umfasst
natürlich
vorkommendes Dextran (besonders das, das durch Fermentation von
Mikroorganismen wie etwa Leuconostoc sp. gewonnen wird) sowie hydrophile
Hydroxylgruppen, die Dextranderivate enthalten, zum Beispiel teilweise
depolymerisiertes Dextran, Dextranglyceringlykosid oder Hydrodextran.
Einbezogen sind zusätzlich
modifizierte Formen von Dextran, die andere reaktionsfähige Gruppen,
zum Beispiel Carboxyl, Sulfon, Sulfat, Amino oder substituierte
Aminogruppen enthalten. Als Beispiele für modifiziertes Dextran können Carboxymethyldextran
und Dextransulfat erwähnt
werden. Mischungen aus verschiedenen Dextranen (wie hier definiert)
können
natürlich
auch verwendet werden, wenn geeignet.
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Das hier beschriebene Polymer ist
in Wasser oder einem Lösungsmittel
auf Wasserbasis gebildet. Es ist daher wichtig, dass das als Ausgangsreaktant
ausgewählte
Dextran wasserlöslich
oder in Form von gequollenen Partikeln sein sollte.
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Dextrane, die eine relative Molekülmasse von
10000 bis 100000, insbesondere 20000 bis 80000, besonders 30000
bis 60000 aufweisen, können
verwendet werden. Vorzugsweise weist das in der Erfindung verwendete
Dextran eine typische relative Molekülmasse von ungefähr 40 000
auf.
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Von einem Aspekt aus gesehen stellt
die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zum Bilden von polymerisiertem
Dextran zur Verwendung als eine biologisch abbaubare Beschichtung
für ein
prothetisches Transplantat bereit, wobei das Verfahren Folgendes
beinhaltet:
- a) eine auf Wasser basierende Lösung aus
Dextran 2 bis 25 (Gewicht- %)
Harnstoff auszusetzen und das Eintreten von Harnstoff in die Lösung zu
ermöglichen,
um eine Mischung zu bilden;
- b) die Mischung aus Schritt a) Formaldehyd auszusetzen;
- c) die Mischung aus Schritt b) bei Temperaturen zwischen 20
und 250°C über einen
Zeitraum, der für
die Polymerisation ausreichend ist, zu erhitzen.
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Das Formaldehyd wird in geeigneter
Weise in Form von Formalin (einer 37%igen wässrigen Lösung aus Formaldehydhydrat)
zugegeben. Alternativ wäre
es möglich,
Formaldehydgas durch die Mischung aus Schritt (a) hindurchperlen
zu lassen, um die erforderliche Reaktion zu erreichen. Die Menge
des erforderlichen Formaldehyds kann stöchiometrisch unter Bezugnahme
auf die Menge Harnstoff, die in Schritt (a) zugegeben wurde, bestimmt
werden. Es hat sich herausgestellt, dass eine zu 50 bis 100% (nach
Gewicht) gleichwertige Menge Formaldehyd bezüglich der Harnstoffmenge das
erforderliche Ergebnis erzielt, wobei 70 bis 80% (nach Gewicht)
bevorzugt werden. Normalerweise ist eine Zeitspanne von fünf bis 60
Minuten ausreichend, um das Auftreten der Vernetzungsreaktion zu
erlauben.
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In einem weiteren Aspekt stellt die
vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines nicht porösen Transplantats
durch Imprägnieren
oder Beschichten eines flexiblen Materials mit einer Mischung aus Dextran,
Harnstoff und Formaldehyd bereit, und Inkubation des imprägnierten
Materials bei Temperaturen von 20°C
bis 250°C über einen
Zeitraum, der ausreichend ist, um das Vernetzen des Dextrans zu
erleichtern. Das zu imprägnierende
oder beschichtende flexible Material wird gewöhnlich ein makroporöser (z.
B. ein gewirkter oder gewebter) Stoff sein. Nicht poröse oder
mikroporöse
Materialien können
jedoch ähnlich
beschichtet werden, wobei das Dichtmittel Blutverlust nach dem Vernähen reduziert.
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Die ausgewählte Temperatur liegt vorzugsweise
zwischen 30°C
und 200°C,
zum Beispiel zwischen 45°C
und 160°C.
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Das flexible poröse Material, das durch die
vorliegende Erfindung behandelt werden soll, kann von jeder herkömmlichen
Art oder Konstruktion sein. Besonders können Polyester (z. B. DACRONTM), gewirkter oder gewebter Stoff und auch
auf PTFE basierende Materialien erwähnt werden. Expandiertes PTFE
kann zusätzlich
wie bisher beschrieben, beschichtet werden, obwohl das Material
an sich nicht porös
ist, wird Porösität eingeführt werden,
wenn das Transplantat durch den Chirurgen an die Stelle festgenäht wird.
Das Transplantat kann einfach in die Reaktionsmischung getaucht
oder selektiv darin eingetunkt werden (das Transplantat kann zum
Beispiel auf einem Dorn platziert werden und über die Oberfläche der
Reaktionsmischung „gerollt" werden, um nur die äußere Oberfläche zu beschichten).
Wahlweise kann Druck verwendet werden, um das Eindringen des Reaktionsgemischs
in die Zwischenräume
eines porösen
Transplantats sicherzustellen.
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In einem weiteren Aspekt stellt die
Erfindung auch ein prothetisches Transplantat bereit, das mit dem biologisch
abbaubaren Dichtmittel der Erfindung imprägniert oder beschichtet ist.
Das Transplantat kann zum Beispiel ein gewirktes Transplantat aus
Polyester sein.
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Um zu verhindern, dass das Dichtmittel
auf dem Transplantat austrocknet und bei der Lagerung brüchig wird,
ist es von Vorteil, das behandelte Transplantat mit einem biokompatiblen
Mittel wie etwa Glycerol weichzumachen. Dies wird vorzugsweise durch
Behandeln der abgedichteten Transplantate mit Glycerol nach Vernetzen
des Dextrans erreicht. Überschüssiges Glycerol
kann durch Spülen
mit Alkohol entfernt werden. Geeignete Alkohole umfassen Ethanol,
Methanol und Propanol, andere Alkohole können jedoch ebenfalls verwendet
werden.
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Wie oben beschrieben kann das behandelte
Transplantat weichgemacht werden. Alternativ oder zusätzlich kann
das Transplantat einem separaten Sterilisationsschritt unterzogen
werden, zum Beispiel, indem es einer γ-Bestrahlung ausgesetzt wird. Sterilisation
kann unnötig
sein, wenn das Transplantat und die Beschichtung unter sterilen
Bedingungen gebildet worden sind.
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Der primäre Mechanismus der Polymerisation
schließt
eine Harnstoff/Formaldehyd-Kondensationsreaktion ein, wobei die
Anwendung von hoher Temperatur und Wasser die Polymerisation des
Dextranreaktanten unterstützt.
Nachfolgende Kondensationsreaktionen schließen primäre Hydroxylgruppen, die auf
dem Dextranmolekül
vorliegen, ein. Aufgrund der geringen Mengen Harnstoff und Formaldehyd,
die erforderlich sind, um die Reaktionen zu bewirken, wurde angenommen,
dass der Vorgang nur kurze Harnstoff-Formaldehydkondensatnetze benötigt, um
gute Vernetzungsparameter zu ergeben. Nachfolgend gebildete Bindungen
wurden als reaktionsfähige
Etherbindungen identifiziert, die hydrolitischer Zersetzung unterzogen
wurden. Verschiedene Formen der Analyse wie etwa NMR und FTIR haben
bestätigt,
dass die Zersetzungsprodukte von geringer relativer Molekülmasse sind
und wahrscheinlich Zuckereinheiten, Harnstoff, Formaldehyd und kleine
Komplexe der letzteren Komponenten beinhalten. Es ist natürlich möglich, die
auf dem Dextran zur Reaktion verfügbaren Hydroxylgruppen zu modifizieren
(siehe zum Beispiel EP-B-0,183,365).
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Die Verwendung von Dextransulfat
ist wünschenswert,
da das so hergestellte vernetzte Polymer Sulfatgruppen enthält, die
zum Binden an zum Beispiel die Heparin-Bindungsstelle des Fibroblastwachstumsfaktors verfügbar sind.
Fibroblastwachstumsfaktoren bilden eine große Familie strukturell verwandter,
mehrfunktioneller Proteine, die verschiedene biologische Effekte
regulieren und mit vielen entwicklungsgemäßen und regenerierenden Erscheinungen
in Verbindung gebracht worden sind, einschließlich axiale Gliederung, mesodermales
Muster, Keratinozytgliederung und Gehirnentwicklung. Diese Verbindungen
vermitteln Zellfunktionen durch Binden an transmembrane Fibroblastwachstumsfaktorrezeptoren,
welche Proteintyrosinkinasen sind. Fibroblastwachstumsfaktorrezeptoren
werden durch Oligomerisierung aktiviert, und sowohl diese Aktivierung als
auch die durch den Fibroblastwachstumsfaktor stimulierten biologischen
Effekte erfordern die Anwesenheit „heparinartiger" Moleküle sowie
des Fibroblastwachstumsfaktors.
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Heparine sind lineare Polysaccharidketten;
sie sind typischerweise auf alternierenden L-iduronischen und D-Glycosaminozuckern
heterogen sulfatiert. Ein Überblick
der molekularen Fibroblastwachstumsfaktorkomplexe, die mit heparinartigen
Zuckern assoziiert werden, ist vor kurzem vorgenommen worden (DiGabriele et
al., 1998; ISSN 0028-0836). Heparinsulfate, die N-sulfatierten Polysaccharidkomponenten
der Proteoglycane, sind übliche
Bestandteile der Zellenoberflächen
und der extrazellulären
Matrix. Die Heparinsulfatpolysaccharidkette weist ein einzigartiges
Moleküldesign
auf, in welchem die Cluster der N- und O-sulfierten Zuckerrückstände, getrennt
durch Bereiche niedriger Sulfatierung, spezifische Protein bindende
Eigenschaften bestimmen. Aktuelle Daten zeigen, dass relativ lange
spezifische Bindungssequenzen von Heparinsulfat eine Konformationsänderung
bei basischen Fibroblastwachstumsfaktoren induzieren können, wobei
sie eine Stelle auf dem Protein bloßlegen, die von Signal transduzierenden
Rezeptoren erkannt wird. Es gibt ebenfalls Vorschläge, dass
das Kernprotein der Plasmamembranheparinsulfatproteoglycane am Zellensignalisierungsprozess
(Gallagher, 1994; ISSN 0939-4974) beteiligt sein kann.
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Die Heparinsulfatketten sind an verschiedene
Proteinkerne gebunden, die die Lage des Proteoglycans in der Zellmembran
und der extrazellulären
Matrix bestimmen. Die diversen Funktionen von Heparinsulfat, die von
der Kontrolle der Blutgerinnung bis zur Regulierung von Zellwachstum
und - adhäsion reichen,
hängen
von der Kapazität
der Ketten ab, Proteinligande, wie etwa Antithrombin III und Elemente
der Fibroblastwachstumsfaktorfamilie, zu aktivieren. Diese Eigenschaften
werden gegenwärtig
bei der Entwicklung synthetischer Heparinsulfate als Anti-Koagulanzien
und Promotoren für
Wundheilung ausgenutzt. Dahingegen könnten organische Nachbildungen
von Wachstumsfaktor aktivierenden Sacchariden eventuell angelegt
sein, um Tumorwachstum zu unterdrücken und Restenose nach Herzkranzgefäß-Angioplastie
(Stringer und Gallagher, 1997; ISSN 1357-2725) zu vermeiden. Frühere Forscher
hatten auch über
die Theorie berichtet, dass Fibroblastwachstumsfaktorrezeptoren
von einer viel größeren Bandbreite
an Liganden, einschließlich
Heparinsulfatproteoglycane und neuraler Zelladhäsionsmoleküle sowie verwandte sulfonierte
Komponenten (Green et al., 1996; ISSN 0265-9247) direkt aktiviert
werden könnten.
Bereits 1994 untersuchten Forschungsgruppen Bereiche, die beim Design
synthetischer sulfonierter Oligosaccharide helfen würden, die
darauf abgestimmt sind, die Bio-Verfügbarkeit vom Fibroblastwachsumsfaktor
zu verbessern, wenn sie in vivo als ein therapeutisches Mittel verabreicht
werden (Coltrini et al., 1994; ISSN 0264-6021). Daher beschreibt
Belford et al. (1993) in Journal of Cellular Physiology 157: 184–189 die
Fähigkeit
einiger aus Tieren, Pflanzen und bakteriell gewonnener Polyanione
sowie synthetischer Polyanione, mit Heparin zum Binden des Säure-Fibroblastwachstumsfaktors zu
konkurrieren, und verbindet dies mit ihrer Fähigkeit, die mitogenetischen
und neurotrophischen Vorgänge dieses
Faktors zu verstärken.
Es wurde gezeigt, dass Dextransulfat, Kappa-Carrageenan, Pentosansulfat, Polyanetholsulfonat,
Heparin und Fucoidin um die Heparin-Bindungsstelle auf einem Fibroblastwachstumsfaktor bei
relativ niedrigen Konzentrationen (< 50 μg/ml)
konkurrieren. Die Differentialwirkungen dieser Polyanione beim Verstärken der
biologischen Aktivitäten
des Fibroblastwachstumsfaktors in Relation zu deren Fähigkeit, um
die Heparin-Bindungsstelle auf einem Fibroblastwachstumsfaktor zu
konkurrieren, wird diskutiert. Auf ähnliche Weise untersuchten
Hoover et al. (1980) (in Circulation Research 47: 578: 583) die
in vitro-Wirkungen von Heparin auf das Wachstum von aortischen glatten
Muskelzellen von Ratten. Die Ergebnisse zeigten, dass ein äußerst spezifisches
Zusammenwirken mit Bezug auf Molekül- und Zellart, d. h. andere
Polyanione, vorlag. Der Vorschlag war, dass sich Heparin und verwandte
Dextransulfate in einer Weise an gewisse Faktoren binden könnten, die
für Zellwachstum
und folgende Proliferation verantwortlich sind.
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Es wurde vor kurzem nachgewiesen,
dass nichtenzymatische Glykosylierung basischer Fibroblastwachstumsfaktoren
die mitogene Aktivität
des intrazellulären
basischen Fibroblastwachstumsfaktors verringern kann. Verlust dieser
Bioaktivität
ist mit beeinträchtigter
Wundheilung und Mikroangiopathie von Diabetes mellitus in Verbindung
gebracht worden. Zusätzlich
zur intrazellulären
Lokalisierung wird der basische Fibroblastwachstumsfaktor weitgehend
in der extrazellulären
Matrix verteilt, hauptsächlich
gebunden an Heparinsulfatproteoglycane. Nissen et al. (1999) maßen die
Wirkung nichtenzymatischer Glykosylierung auf einen basischen, an
Heparin, Heparinsulfat und verwandte Komponenten gebundenen Fibroblastwachstumsfaktor (siehe
Biochemical Journal 338: 637–642).
Als Heparin zu dem basischen Fibroblastwachstumsfaktor vor der nichtenzymatischen
Glykosylierung zugegeben wurde, wurden die mitogene Aktivität und Heparinaffinität des basischen
Fibroblastwachstumsfaktors fast vollständig erhalten. Heparinsulfat,
Heparin mit geringer relativer Molekülmasse und das Polysaccharid,
Dextransulfat, zeigten eine ähnliche
Schutzwirkung.
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Die Erfindung wird nun weiter unter
Bezugnahme auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele beschrieben
(zusammen mit einem Vergleichsbeispiel).
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Beispiel 1
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90 ml Wasser wurden zu 50 g Dextran
mit einer relativen Molekülmasse
von 40000 zugegeben und manuell gemischt, um das Eintreten des Dextrans
in die Lösung
zu fördern.
Danach wurde die Mischung auf einem Magnetrührer platziert und das kontinuierliche
Mischen für
15 Minuten, oder bis die Lösung
klar und partikelfrei war, ermöglicht.
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5 g Harnstoff wurden dann zu dem
aufgelösten
Dextran zugegeben, und die Mischung wurde erneut für weitere
15 Minuten auf dem Magnetrührer
platziert, um sicherzustellen, dass der Harnstoff in die Lösung mit
dem Dextran eingetreten war. Schließlich wurden 10 ml Formalin
(eine 38%ige (Gew./Vol.) wässrige
Lösung
aus Formaldehydhydrat), die 3,8 g Formaldehyd bereitstellen, zugegeben,
um die Mischung zu vervollständigen,
die nochmals 15 Minuten gerührt
wurde. Diese Mischung wurde dann unter Verwendung von Vakuumtechniken
in gewirkte Polyestertransplantate imprägniert.
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Durch das Platzieren der Dextran
imprägnierten
Transplantate in einen Ofen bei 150°C für 2 Stunden wurden Gele gebildet.
Während
dieses Zeitraums fand eine Vernetzungsreaktion statt. Die Transplantate
wurden mindestens vier Stunden lang gewaschen, um das Entfernen
von restlichem Formaldehyd sicherzustellen. Die fertigen Transplantate wurden
erweicht, indem sie 10 Minuten lang 100%igem Glycerol ausgesetzt
wurden, gefolgt von einer Alkoholwäsche, um überschüssiges Glycerol zu entfernen.
Die Transplantate wurden dann luftgetrocknet.
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Beispiel 2
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92 ml Wasser wurden zu 40 g Dextran
mit einer relativen Molekülmasse
von 40000 gegeben und manuell gemischt, um das Eintreten des Dextrans
in die Lösung
zu fördern.
Danach wurde die Mischung auf einem Magnetrührer platziert und das kontinuierliche
Mischen für
15 Minuten, oder bis die Lösung
klar und partikelfrei war, ermöglicht.
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4 g Harnstoff wurden dann zu dem
aufgelösten
Dextran zugegeben, und die Mischung wurde erneut für weitere
15 Minuten auf dem Magnetrührer
platziert, um sicherzustellen, dass der Harnstoff in die Lösung mit
dem Dextran eingetreten war. Schließlich wurden 8 ml Formalin
(eine 38%ige wässrige
Lösung
aus Formaldehydhydrat), die 3,04 g Formaldehyd bereitstellen, zugegeben,
um die Mischung zu vervollständigen,
die nochmals 15 Minuten gerührt
wurde. Gewirkte Transplantate aus Polyester wurden mit dieser Mischung
vakuumimprägniert.
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Durch das Platzieren der Transplantate
in einen Ofen bei 50°C
für 12
Stunden wurden Gele gebildet. Während
dieses Zeitraums fand eine Vernetzungsreaktion statt. Die Transplantate
wurden mindestens vier Stunden lang gewaschen, um das Entfernen
von restlichem Formaldehyd sicherzustellen. Die fertigen Transplantate
wurden erweicht, indem sie 10 Minuten lang 80%igem (Vol./Vol. in
Wasser) Glycerol ausgesetzt wurden, gefolgt von einer Alkoholwäsche, um überschüssiges Glycerol
zu entfernen. Die Transplantate wurden dann luftgetrocknet.
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Beispiel 3 – Präparation
von Dextrangemischen
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Tabelle
1: Dextran/Dextransulfat vernetzte Mischungen
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Dextran mit einer relativen Molekülmasse 40
000 wurde gewogen und das entsprechende Gewicht von Dextransulfat
mit einer ähnlichen
relativen Molekülmasse
wurde diesem hinzugegeben. Die korrekte Menge Wasser wurde zugegeben
und die Substanzen gründlich
gemischt, bis sie klar waren. Der Harnstoff wurde nochmals vor der
letzten Zugabe von Formaldehyd gemischt. Die vollständige Präparation
wurde weiter gemischt, um die vollständige Auflösung sicherzustellen. Gele
wurden gebildet, als das vollständige
Gemisch für eine
festgelegte Zeitspanne in einen Ofen platziert wurde. Die Proben
wurden dann 3 Stunden lang unter kontinuierlich laufendem Wasser
gewaschen.
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Eine entsprechende Analyse (Dionex-Ionenchromatographie)
zur Untersuchung des Vorhandenseins von Sulfatgruppen in jeder der
Proben zeigte einen beachtlichen Nachweis von Sulfatierung, mit
den geringsten Mengen in Probe 1 (1 g Dextransulfat) und den größten in
Probe 5 (5 g Dextransulfat). Es wurde vorgeschlagen, dass das Dextransulfat
innerhalb des Netzes vernetzter Dextranketten eingeschlossen worden
war, um ein interpenetrierendes Netz mit der Möglichkeit zu bilden, den Gelen
entsprechende Sulfatierung für
nachfolgendes Binden von Wachstumsfaktoren zu bieten. Aus den Ergebnissen
könnten verschiedene
sulfanierte Gele präpariert
werden, siehe Beispiele 4 bis 7.
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Beispiel 4
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90 ml Wasser wurden zu 30 g Dextran
mit einer relativen Molekülmasse
von 40000 und 20 g Dextransulfat mit einer relativen Molekülmasse von
40000 zugegeben und manuell gemischt, um das Eintreten der zwei
Dextranarten miteinander in die Lösung zu fördern. Danach wurde die Mischung
auf einem Magnetrührer platziert
und das kontinuierliche Mischen für 15 Minuten, oder bis die
Lösung
klar und partikelfrei war, ermöglicht.
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5 g Harnstoff wurden zugegeben, und
die Mischung wurde erneut für
weitere 15 Minuten auf dem Magnetrührer platziert, um sicherzustellen,
dass der Harnstoff in eine Lösung
mit den zwei Dextransorten eingetreten war. Schließlich wurden
10 ml Formaldehyd zugegeben, um die Mischung zu vervollständigen,
die nochmals 15 Minuten gerührt
wurde.
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Durch das Platzieren der Dextranmischung
in einen Ofen bei 50°C
für mindestens
12 Stunden wurden Gele gebildet. Während dieses Zeitraums fand
eine Vernetzungsreaktion statt. Die folgenden Dextranmischungen
wurden mindestens 3 Stunden lang unter kontinuierlich laufendem
Wasser gewaschen.
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Beispiel 5
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90 ml Wasser wurden zu 25 g Dextran
mit einer relativen Molekülmasse
von 40000 und 25 g Dextransulfat mit einer relativen Molekülmasse von
40000 gegeben und manuell gemischt, um das Eintreten der zwei Dextranarten
miteinander in die Lösung
zu fördern.
Danach wurde die Mischung auf einem Magnetrührer platziert und das kontinuierliche Mischen
für 15
Minuten, oder bis die Lösung
klar und partikelfrei war, ermöglicht.
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5 g Harnstoff wurden zugegeben, und
die Mischung wurde erneut für
weitere 15 Minuten auf dem Magnetrührer platziert, um sicherzustellen,
dass der Harnstoff in die Lösung
mit den zwei Dextransorten eingetreten war. Schließlich wurden
10 ml Formaldehyd zugegeben, um die Mischung zu vervollständigen,
die nochmals 15 Minuten gerührt
wurde.
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Durch das Platzieren der Dextranmischung
in einen Ofen bei 50°C
für mindestens
12 Stunden wurden Gele gebildet. Während dieses Zeitraums fand
eine Vernetzungsreaktion statt. Die folgenden Dextranmischungen
wurden mindestens 3 Stunden lang unter kontinuierlich laufendem
Wasser gewaschen.
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Beispiel 6
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90 ml Wasser wurden zu einer Mischung
aus 30 g Dextran mit einer relativen Molekülmasse von 40000 und 20 g Dextransulfat
mit einer relativen Molekülmasse
von 40000 zugegeben und manuell gemischt, um das Eintreten der zwei
Dextranarten miteinander in die Lösung zu fördern. Danach wurde die Mischung
auf einem Magnetrührer
platziert und das kontinuierliche Mischen für 15 Minuten, oder bis die
Lösung
klar und partikelfrei war, ermöglicht.
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5 g Harnstoff wurden zugegeben, und
die Mischung wurde erneut für
weitere 15 Minuten auf dem Magnetrührer platziert, um sicherzustellen,
dass der Harnstoff in eine Lösung
mit den zwei Dextransorten eingetreten war. Schließlich wurden
10 ml Formaldehyd zugegeben, um die Mischung zu vervollständigen,
die nochmals 15 Minuten gerührt
wurde.
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Durch das Platzieren der Dextranmischung
in einen Ofen bei 100°C
für mindestens
2 Stunden wurden Gele gebildet. Während dieses Zeitraums fand
eine Vernetzungsreaktion statt. Die folgenden Dextranmischungen
wurden mindestens 3 Stunden lang unter kontinuierlich laufendem
Wasser gewaschen.
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Beispiel 7
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90 ml Wasser wurden zu einer Mischung
aus 25 g Dextran mit einer relativen Molekülmasse von 40000 und 25 g Dextransulfat
mit einer Molekülmasse
von 40000 zugegeben und manuell gemischt, um das Eintreten der zwei
Dextranarten miteinander in die Lösung zu fördern. Danach wurde die Mischung
auf einem Magnetrührer
platziert und das kontinuierliche Mischen für 15 Minuten, oder bis die
Lösung
klar und partikelfrei war, ermöglicht.
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5 g Harnstoff wurden zugegeben, und
die Mischung wurde erneut für
weitere 15 Minuten auf dem Magnetrührer platziert, um sicherzustellen,
dass der Harnstoff in eine Lösung
mit den zwei Dextransorten eingetreten war. Schließlich wurden
10 ml Formaldehyd zugegeben, um die Mischung zu vervollständigen,
die nochmals 15 Minuten gerührt
wurde.
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Durch das Platzieren der Dextranmischung
in einen Ofen bei 100°C
für mindestens
2 Stunden wurden Gele gebildet. Während dieses Zeitraums fand
eine Vernetzungsreaktion statt. Die folgenden Dextranmischungen
wurden mindestens 3 Stunden lang unter kontinuierlich laufendem
Wasser gewaschen.
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Beispiel 8 – Resorptionsgeschwindigkeiten
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Die Resorptionsgeschwindigkeit des
Dichtmittels von Dextran gedichteten Transplantaten, die gemäß den Beispielen
1 und 2 gefertigt wurden, wurden in vitro durch Inkubationstransplantatproben
von bekanntem Gewicht in Puffer und durch erneutes Wiegen des Transplantats
nach dem Trocknen, um die Menge des verbleibenden Dichtmittels zu
messen, bestimmt. Es stellte sich heraus, dass mit Harnstoffformaldehyd
vernetztes Dextran bei einer Geschwindigkeit vergleichbar mit dem
Gelatinedichtmittel aus EP-B-0,183,365, hydrolysiert wurde.
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Die Hydrolyseprofile von mit Harnstoffformaldehyd
vernetztem Dextran und mit Formaldehyd vernetzten Gelatinetransplantaten
werden in Tabelle 2 genauer dargestellt. Hydrolyse wurde bei 37°C für eine Dauer von
bis zu 4 Wochen bei 125 U/min durchgeführt.
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Tabelle
2
Vergleichende Hydrolyseergebnisse für mit Dextran und Gelatine
beschichtete Gefäßtransplantate.
Die mit Gelatine beschichteten Transplantate wurden gemäß Beispiel
1 des EP-B-0,183,365 hergestellt.
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Beispiel 9 – Implantation
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Gemäß Beispiel 1 präparierte
Transplantate wurden für
jeweils 2 Wochen und 4 Wochen in die Abdominalaorta von Hunden implantiert.
Die histologische Untersuchung der explantierten Vorrichtungen zeigte, dass
das Dichtmittel wie erwartet innerhalb 1 Monats resorbiert wurde
und sich nicht auf den normale Heilungsprozess auswirkte.
