DE69903351T3

DE69903351T3 - Vernetzte hyaluronsäure und ihre medizinischen verwendungen

Info

Publication number: DE69903351T3
Application number: DE69903351T
Authority: DE
Inventors: Rolando Barbucci; Roberto RAPUOLI
Original assignee: Sigmar Italia SpA
Current assignee: Sigmar Italia SpA
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-08
Publication date: 2012-02-09
Anticipated expiration: 2019-11-09
Also published as: HUP0104296A3; ITMI982440A1; NO20012315L; DE69903351D1; CZ296842B6; WO2000027887A3; HU229668B1; US6831172B1; IT1303735B1; PT1144459E; RU2230752C2; ATE225371T1; EP1144459B2; JP2002529550A; CA2350667A1; KR20010101001A; EP1144459B1; BR9915235A; AU757102B2; IL143063A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft vernetzte Hyaluronsäuren, gegebenenfalls hemisuccinyliert oder sulfatiert, die Salze davon mit biologisch geeigneten oder pharmakologisch aktiven Kationen und die Komplexe davon mit Schwermetallen, wie Kupfer, Zink und Eisen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der vernetzten Hyaluronsäuren, Salze und Komplexe auf dem medizinischen, pharmazeutischen und kosmetischen Gebiet.
Hintergrund der Erfindung
Hyaluronsäure ist ein Glycosaminoglycan, zusammengesetzt aus Disaccharideinheiten von D-Glucuronsäure und N-Acetylglucosamino-2-acetamido-2-desoxy-D-glucose, verbunden durch β(1 → 3)Glykosidbindungen.
Natürliche Hyaluronsäure besitzt eine lineare, nicht-vernetzte Struktur mit einem Molekulargewicht im Bereich von 50.000 bis 8.000.000 D oder mehr, abhängig von der Quelle und dem Extraktionsverfahren.
Hyaluronsäure ist in synovialer Flüssigkeit, Bindegewebe und der Glaskörperflüssigkeit höherer Tiere, wie auch in einigen Bakterien vorhanden.
Zusammensetzungen aus Natriumhyaluronat mit verschiedenen Molekulargewichten (in Form von Lösungen mit unterschiedlichen Viskositäten, Gelen mit unterschiedlichen viskoelastischen Eigenschaften, Schwämmen, Filmen oder Membranen) werden in der Humanmedizin und der Chirurgie beispielsweise als Ersatz für synoviale Flüssigkeit, Gewebe-Antiklebemittel, Ersatz für Glaskörperflüssigkeit, künstliche Tränen, als Mittel für die in-vivo-Geweberekonstitution (beispielsweise als extracelluläre Matrices für die Bildung von Knochensegmenten, gefolgt von der Kolonisation von Osteoblasten und der nachfolgenden Calcifikation; von Bindehaut-Geweben, folgend auf die Kolonisation von Fibroblasten), als Materialien für die Herstellung von Kunsthaut, die nützlich ist bei der Behandlung von Verbrennungen oder bei der plastischen Chirurgie; als Beschichtungsmittel für bioverträgliche vaskuläre Prothesen, als Träger für pharmakologisch aktive Bestandteile bei Zubereitungen mit kontrollierter Freisetzung etc. verwendet.
In der Dermatologie und in der Kosmetik und kosmetischen Chirurgie werden diese Zubereitungen aufgrund ihrer viskoelastischen und befeuchtenden Eigenschaften und der hohen Kompatibilität sowohl als Grundstoff für die Befeuchtung topischer Zubereitungen als auch als invasive medizinisch-chirurgische Vorrichtungen (”Füllmittel”) verwendet.
Die Verwendung natürlicher linearer Hyaluronsäure für diese Verwendungen ist jedoch durch ihre schnelle in-vivo-Zersetzung durch enzymatische Systeme, wie Hyaluronidase, Glucosidase und Glucuronidase mit der darauffolgenden Abnahme im Molekulargewicht und der progressiven Verschlechterung der viskoelastischen Eigenschaften und allgemein der physikalischen Eigenschaften der Endzubereitungen und Vorrichtungen (mechanische Festigkeit, Elastizität, Porengröße) usw. beschränkt.
Zur Beseitigung dieser Schwierigkeit, hauptsächlich mit dem Zweck, den Bereich der Zubereitungen zu erweitern und ihre Flexibilität bei der Anwendung zu verbessern, wurden chemisch modifizierte Hyaluronsäuren vorgeschlagen.
Es wurden die Vernetzung mit polyfunktionellen Epoxiden ( U.S. 4 716 224 , 4 772 419 , 4 716 154 ), Polyalkoholen ( U.S. 4 957 744 ), Divinylsulfon ( U.S. 4 582 865 , 4 605 601 , 4 636 524 ), Aldehyden ( U.S. 4 713 448 , 5 128 326 , 4 582 568 ), Biscarbodiimiden ( U.S. 5 356 883 ), Polycarbonsäuren ( EP-A-718312 ) beschrieben.
Die vernetzten Hyaluronsäuren werden als Biomaterialien für Implantate, Prothesen und medizinische Vorrichtungen, als Matrices mit kontrollierter Freisetzung für Medikamente, als Heil-, Antiklebe- und Verbandsmittel verwendet.
Die Sulfatierung der nicht-vernetzten Hyaluronsäure wird allgemein in der U.S. 5 013 724 beschrieben, die hauptsächlich die Sulfatierung von Heparinen, Heparanen und Dermatanen für die Verwendung als antithrombotische und Anti-Koagulationsmittel betrifft.
Die Hemisuccinylierungsrekreation von Hyaluronsäure (HY) wurde niemals beschrieben. Ein Beispiel dieser Funktionalisierung wird in der EP-B-200574 beschrieben, wobei Verbund-Biomaterialien, zusammengesetzt aus succinyliertem Collagen und Chitosan, beansprucht werden.
Die Vernetzung von Carboxyalkylcellulose mittels Di- oder Polyaminen wird in der EP-A-566 118 (Kimberly Clark Corp.) für die Herstellung von Absorptionsmaterialien mit HY als Vernetzungsmittel durch Erhitzen beschrieben. Ein solches Verfahren erscheint wirtschaftlich vorteilhaft und für die Produktion in großem Maßstab, die für diese Art von Produkten erforderlich ist, geeignet.
In der EP-A-462 426 (Fidia) werden perforierte bioverträgliche Membranen und ihre Verwendungen als Kunsthaut beschrieben. Collagen, vernetzt mit Diaminen und Hyaluronsäure, wird allgemeinen als mögliches Material für diese Membranen erwähnt.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde jetzt gefunden, dass neue vernetzte Hyaluronsäuren, die durch Umsetzung geeignet aktivierter Carboxygruppen von HY mit einem Polyamin erhalten werden, wie auch die Salze und Komplexe mit geeigneten organischen oder anorganischen Kationen, vorteilhafte chemisch-physikalische und biologische Eigenschaftenen für biomedizinische und kosmetische Verwendungen besitzen.
Die chemisch-physikalischen Haupteigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen sind:

– hohe Bioverträglichkeit
– hohe Beständigkeit gegenüber dem enzymatischen Abbau, hauptsächlich nach der Sulfatierung;
– hohe Fähigkeit, Wasser zu adsorbieren, mit der Bildung viskoelastischer Eigenschaften, abhängig von dem Vernetzungsgrad wie auch von der Sulfatierung und/oder dem Hemisuccinylierungsgrad;
– die Fähigkeit, Metallionen, wie Zink oder Kupfer, in Chelat zu überführen; wobei die Derivate eine sehr gute Stabilität besitzen.

Das biologische Verhalten ist neu und überraschend. Es ist bekannt, dass die Sulfatierung (oder Supersulfatierung) von Glycosaminoglycanen, wie Heparin, Dermatansulfat, Chondroitin, und nativer Hyaluronsäure, die Anti-Koagulationseigenschaften (Inhibierung von Xa- und IIa-Faktoren und/oder die Änderung in ihrem Verhältnis), bezogen auf das Ausgangsprodukt, erhöht ( U.S. 5 013 724 ).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen, wenn sie sulfatiert sind, eine mäßige Anti-Koagulationsaktivität, wohingegen es vollständig überraschend ist, dass die Plättchenaktivierung und -aggregation (gemessen als Antiklebaktivität; P. R. P.-Modell in Kaninchen, die einem Verhaltensstress unterworfen wurden, wie in ”Abstract IL 15” – International Conference an Advances in Biomaterials and Tissue Engineering, 14.–19. Juni 1998, Capri, Italien beschrieben) sowohl für die erfindungsgemäß vernetzte Hyaluronsäure (mit unterschiedlichen Vernetzungsgraden) als auch für die entsprechenden Sulfatester fehlt; diese Eigenschaft fehlt bei natürlicher Hyaluronsäure und den Esterderivaten vollständig.
Keine polymeren Materialien für die medizinische Verwendung, die bis heute bekannt sind, teilen offensichtlich die gleiche Eigenschaft.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue vernetzte Hyaluronsäuren, die durch Umsetzung aktivierter Carbonsäuregruppen, die aktiviert sind durch Chlormethylpyridyliumiodid, von nativer linearer Hyaluronsäure des Extraktions- oder Biosynthesewegs mit einem Polyamin, insbesondere einem linearen Alkyldiamin, erhalten werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße vernetzte Hyaluronsäure Sulfatierungs- und Hemisuccinylierungsverfahren unterworfen. Die erhaltenen Produkte und ihre Salze oder Komplexe besitzen vollständig neue Eigenschaften (beispielsweise Quellung, Wassermotilität innerhalb des Gels; chemotaktische Aktivität auf die Endothelzellen, viskoelastische Eigenschaften).
Die Veresterungsverfahren werden nach bekannten Verfahren durchgeführt (Verwendung der Reagentien Pyridin/SO₃; Chlorsulfonsäure; Bernsteinsäureanhydrid in homogener oder heterogener Phase, bei pH 6,5 bis 8).
Beispiele von Hemisuccinylierungsverfahren für Collagen werden in der WO 88/10123 und der U.S. 4 493 829 beschrieben.
Das Polyamin, das erfindungsgemäß als Vernetzungsmittel verwendet wird, ist bevorzugt ein Diamin der Formel R₁NHA-NHR₂, worin A eine lineare oder verzweigte C₂-C₁₀-Alkylenkette, bevorzugt eine C_2-6-Kette, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy-, Carboxy-, Halogen-, Alkoxy- und Aminogruppen; eine Polyoxyalkylenkette [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m, worin n 2 oder 3 bedeutet, m eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet; eine C₅-C₇-Cycloalkylgruppe; eine Aryl- oder Heteroarylgruppe, vorzugsweise 1,4- oder 1,3-disubstituiertes Benzol, bedeutet; R₁ und R₂, die gleich oder unterschiedlich sind, Wasserstoff, C_1-6-Alkyl-, Phenyl- oder Benzylgruppen bedeuten.
Bevorzugte Bedeutungen von A sind C₂-C₆-Alkylen oder eine Kette [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m. R₁ und R₂ bedeuten bevorzugt Wasserstoff.
Das Polyamin wird mit der Hyaluronsäure oder ihrem Salz umgesetzt, wobei die Carboxylgruppen vorab aktiviert wurden.
Die Aktivierung kann nach an sich bekannten Verfahren erfolgen; beispielsweise und bevorzugt werden solche Verbindungen in wasserfreien aprotischem Lösungsmittel verwendet, die Amidbindungen bei der Peptidsynthese mit Chlormethylpyridyliumiodid bilden; dieser Aktivator erlaubt die besten Ausbeuten und die höchste Reproduzierbarkeit bezüglich des Vernetzungsgrades.
Die Hyaluronsäure wird bevorzugt mit einem lipophilen Kation, beispielsweise Tetraalkylammonium oder anderen lipophilen organischen Basen, die eine geeignete Löslichkeit in einem polaren aprotischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder ähnlichen, induzieren können, in Salzform überführt.
Die Transformation anorganischer Salze, wie von Natrium, in ein geeignetes organisches Kation, kann nach an sich gut bekannten Ioinenaustauschverfahren in homogener Phase oder durch Präzipitation der Säurekomponente, ihre Gewinnung und nachfolgende Salzbildung mit der gewünschten organischen Base erfolgen.
Die Aktivierungsreaktion der Carboxygruppen erfolgt üblicherweise in homogener Phase und in einem wasserfreien polaren aprotischen Lösungsmittel.
Das Vernetzungs-Polyamin wird zu der Lösung des aktivierten Ester in dem gleichen wasserfreien Lösungsmittel gegeben, wobei die Temperatur von 0 bis 30°C gehalten wird. Die Reaktionszeit liegt im Bereich von 1 bis 12 Stunden, abhängig von der Anwesenheit geeigneter Basen, wie Triethylamin.
Im Allgemeinen wird das gewünschte Endprodukt durch Zugabe eines unterschiedlichen Lösungsmittels bei verringertem Druck, gefolgt von der üblichen Aufarbeitung, gewonnen.
Der Vernetzungsgrad kann innerhalb weiter Grenzen liegen und er kann eingestellt werden, indem die Menge an Carboxy-Aktivierungsmittel geändert wird, wobei die Aktivierung und die Vernetzungsreaktionen praktisch quantitativ ablaufen.
Als Folge ist der gewünschte Vernetzungsgrad (C. L. D.: Prozent der Carboxylgruppen, die bei der Vernetzung teilnehmen) perfekt reproduzierbar, wie es durch NMR-Werte gezeigt wird. Die Endprodukte, die bei ähnlichen Verfahrensbedingungen erhalten werden, besitzen daher konstante Eigenschaften.
Die Ausgangs-Hyaluronsäure kann irgendeine Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von etwa 5000 bis 8.000.000 D, bevorzugt von 10.000 bis 200.000 D, extrahiert aus bekannten Quellen, oder erhalten durch Fermentation von Mikroorganismen der Gruppe Streptococcus oder anderen hergestellten Stämmen, sein.
Die erfindungsgemäße vernetzte Hyaluronsäure kann einer Sulfatierungsreaktion mit einem geeigneten Reagens, bevorzugt mit Pyridin/Schwefeltrioxid-Komplex in Dimethylformamid, unterworfen werden.
Die Reaktion wird in heterogener Phase bei einer Temperatur von 0 bis 10°C mit Reaktionszeiten im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 0,6 Stunden durchgeführt.
Der erhaltene Sulfatierungsgrad kann innerhalb weiter Grenzen liegen und er kann eingestellt werden, indem die Reaktionszeit und die Temperatur geändert werden. Im Allgemeinen liegt der Sulfatierungsgrad (definiert als Äq. Sulfatgruppen/g) im Bereich von 1 × 10^–6 bis 6 × 10^–6, ist bevorzugt etwa 2 × 10^–6 Äq./g für einen C. L. D. = 0,5.
Die erfindungsgemäße vernetzte Hyaluronsäure kann ebenfalls der Hemisuccinylierungsreaktion bei bekannten Bedingungen unterworfen werden (wässrige heterogene Phase unter starkem Rühren, Zugabe von festem Bernsteinsäureanhydrid in aufeinanderfolgenden Teilen in Verhältnissen von 1:1 bis 1:5, ausgedrückt durch das Gewicht; Halten des pH-Werts von 7 bis 8,5 mit Alkali bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis 30°C). Der Hemisuccinylierungsgrad kann innerhalb weiter Grenzen liegen, abhängig von den folgenden Parametern: Reaktionszeit und -Temperatur; Rührgeschwindigkeit des mehrphasischen Systems und Zugabegeschwindigkeit des festen Bernsteinsäureanhyrids. Indem die Parameter konstant gehalten werden, ergibt die Reaktion reproduzierbare Produkte. Die vernetzten Hyaluronsäuren gemäß der Erfindung, gegebenenfalls sulfatiert oder hemisuccinyliert, zeigen die Fähigkeit, Komplexe mit Metallionen, wie Kupfer, Zink, Eisen, zu bilden.
Diese Komplexe können leicht erhalten werden durch Auflösen oder durch Dispergieren bis zur vollständigen Quellen des Hyaluronsäurederivats in Wasser und Zugabe unter Rühren, bevorzugt bei Raumtemperatur, einer konzentrierten Lösung eines organischen oder anorganischen Salzes von Kupfer, Zink oder Eisen, beispielsweise CuCl₂, ZnCl₂ oder Fe₂(SO₄)₃; nach 12 bis 24 Stunden unter Rühren wird der Komplex unter Zentrifugieren oder Präzipitation, folgend auf die Änderung des Lösungsmittels (beispielsweise Zugabe von Ethanol oder Aceton) oder durch Verdampfen bei verringertem Druck gewonnen, wobei das gewonnene Rohprodukt gut mit destilliertem Wasser zur Entfernung überschüssiger Ionen gewaschen wird.
Die Komplexe werden dann gefriergetrocknet.
Der Gehalt an Metallionen hängt ab von der Verwendung der Verfahrensbedingungen, den Polymer-zu-Ionen-Molverhältnissen, der Konzentration und dem pH der Lösung; den Reaktionszeiten und insbesondere dem Vernetzungsgrad. Er kann maximale Volumen von 1 Metallion pro Disaccharideinheit, die nicht an der Vernetzung teilnimmt, erreichen.
Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Möglichkeit, durch geeignete Änderungen des Vernetzungsgrads und/oder des Sulfatierungs- oder Succinylierungsgrads Hyaluronsäurederivate innerhalb eines großen Bereichs unterschiedlicher Formen herzustellen, die durch verschiedene Eigenschaften charakterisiert sind (wie die Viskoelastizität, Metallionen, die Fähigkeit, Hydrogele, Filme, Schwämme zu bilden, mechanische Festigkeit usw.).
Dies erlaubt die Verwendung der erfindungsgemäßen Hyaluronsäurederivate auf verschiedenen medizinischen und pharmazeutischen Gebieten, auf dem Gebiet Human- oder Veterinärmedizin:

1) als intraartikulären Ersatz für Synovialflüssigkeit für die Behandlung von osteoarthritischen Krankheitsbildern;
2) als Glaskörperflüssigkeitsersatz für die Behandlung von Pathologien und Nebenwirkungen, die mit der opthalmischen Chirurgie verbunden sind;
3) als Grundmaterial künstlicher Tränen-Zubereitungen, die für die Therapie von trockenem Auge geeignet sind;
4) als Matrices mit kontrollierter Freigabe für Arzneimittel (beispielsweise antiinflammatorische Mittel, Antibiotika, β-adrenerge Agonisten und Antagonisten, Aldose-Reduktaseinhibitoren, Anti-Akne-Mittel, Antiallergika, Anti-Alopezie-Mittel, antineoplastische Mittel, Antiglaucom-Mittel, Anti-Brenn bzw. -Schmerzmittel, Anti-Psoriasis-Mittel, Anti-Seborrhea-Mittel, Anti-Ulcer-Mittel, antivirale Mittel, Wachstumsfaktoren usw.) durch einfachen Einschluss in die Hydrogele, die aus den erfindungsgemäßen Verbindungen erhalten werden. Alternativ zu dem Einschluss-Verfahren können die Arzneimittel durch covalente Bindungen an die Hyaluronsäurematrices gebunden werden mittels: a) Veresterung oder Amidierung von COOH, das bei der Vernetzung mit den Polyaminen nicht involviert ist, wenn das Arzneimittel ein Alkohol oder ein Amin ist; b) Veresterung der freien Hydroxygruppen der Hyaluronsäurederivate, wenn das Arzneimittel freie Carboxygruppen enthält. Die Produkte gemäß a) können unter Verwendung des gleichen Aktivierungsverfahrens der Carboxygruppen, wie oben beschrieben, in einem sorgfältig hergestellten wasserfreien Medium oder durch Umesterung erhalten werden.
5) Zur Herstellung einer Vorrichtung zu Heilen von Wunden oder Hautulcern in Form von Filmen unterschiedlicher Dicke, mehr oder weniger permeabel gegenüber Gasen, als Schwämme usw. Diese Vorrichtungen enthalten bevorzugt geeignete Arzneimittel, wie Antibiotika, Heilfaktoren. Sie sind ebenfalls nützlich bei der Kultur von Epithelzellen, Keratinozyten usw.
6) Für alle Anwendungen, für die die bekannten Hyaluronsäuren bereits vorgeschlagen wurden, beispielsweise für die Herstellung fester oder semifester Formen oder einer verformbaren Form zur Herstellung vaskulärer Prothesen als anti-klebende Überzüge von Blutgefäßen, als künstliche Herzklappen usw.); als Biohydridorgane (künstliches Pankreas, Leber); als ophthalmische Produkte (Linsenersatz, Kontaktlinsen); als otologische Produkte; allgemein als anti-klebende Implantate, die in der abdominalen, gynäkologischen, plastischen, orthopädischen, neurologischen, ophthalmologischen, Thorax-, otorhinolaryngologischen Chirurgie verwendet werden; als medizinische Vorrichtungen, wie als Stent-Abdrücke, Katheter, Kanülen usw.

Die Verwendungen vernetzter Hyaluronsäure und von Biomaterialien, die daraus erhalten werden, sind bekannt und werden beispielsweise beschrieben in WO 97/39788 , WO 97/22629 , WO 97/18244 , WO 97/7833 , EP 763754 , EP 718312 , WO 96/40005 , WO 96/33751 , U.S. 5 532 221 , WO 95/1165 und EP 320 164 .
Die Verwendung der erfindungsgemäßen vernetzten Hyaluronsäuren in der kosmetischen Dermatologie ist von besonderem Interesse, beispielsweise als Befeuchtungsmittel, als Grundstoffe für verschiedene kosmetologische Zubereitungen, injizierbare Füllmittel usw.
Die formalen Produkte, die aus den erfindungsgemäßen vernetzten Hyaluronsäurederivaten erhalten werden, können Sterilisationsverfahren (beispielsweise durch Erhitzen auf 120°C oder mittels Ethylenoxid) ohne Änderung in den technologischen Eigenschaften unterworfen werden, was natürlich ein weiterer, erfindungsgemäß zur Verfügung gestellter Vorteil ist.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
BEISPIEL 1
Hyaluronsäurenatriumsalz (1 × 10^–3 mol, bezogen auf die Disaccharideinheiten) wird in das TBA-Salz gemäß einem der folgenden Verfahren überführt.

a) eine 1%ige wässrige Lösung von Natriumhyaluronat wird in die H⁺-Form durch ein starkes kationisches H⁺-Harz überführt (Amberlite IR 120); die Endlösung wird mit einer 0,5%igen Lösung von TBA-OH von etwa pH = 9 behandelt.
b) eine 1%ige wässrige Lösung von Natriumhyaluronat wird in das TBA-Salz durch Behandlung mit einem schwachen kationischen Harz in TBA⁺-Form (Amberlite IRC 50) überführt.

In beiden Fällen werden die Endlösungen lyophilisiert. Das TBA-Salz wird dann in 15 ml wasserfreiem DMF gelöst, unter N₂ und bei 0°C, während 0,02 g Chlormethylpyridyliumiodid (CMPJ) in 2 ml wasserfreiem DMF tropfenweise zu der vorhandenen Lösung von TBA-Salz gegeben werden.
Das Reaktionsgemisch wird dann mit 0,1 ml Triethylamin und dann tropfenweise mit einer Lösung von 1,3-Diaminopropan (d = 0,88, in großem Überschuss, so dass die Vernetzung der aktivierten Carboxygruppen leichter erfolgt) in 2 ml wasserfreiem DMF versetzt. Nach Beendigung der Zugabe wird das Reaktionsgemisch mindestens 30 Minuten gerührt und das Lösungsmittel wird dann bei verringertem Druck entfernt, der Rückstand wird in DMF aufgenommen, welches anschließend durch Destillation entfernt wird, der Rückstand wird dann mit Ethanol, Ethanol-Wasser und schließlich mit Wasser behandelt.
Das Produkt wird dann lyophilisiert und der Rückstand wird der Analyse unterworfen.
IR (Film): 1630 cm^–1(-CO-NH); 1740 cm^–1 (-COOH, Polysaccharid); 3200 cm^–1 (-NH-).
SD (Quellgrad in Wasser und R. t. nach 15 Minuten; gravimetrische Bestimmung; berechnet gemäß:
wobei:
W_s = Gewicht des hydratisierten Gels; Wd = Gewicht des trockenen Gels): 31.000
Vernetzungsgrad: 0,05 (5% der anfänglich verfügbaren Carboxygruppen).
BEISPIEL 2
Gemäß dem Verfahren und den Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, werden die gleiche HY und das gleiche Aktivierungsmittel, aber 1,6-Diaminohexan anstelle von 1,3-Diaminopropan, verwendet, es wird eine vernetzte Hyaluronsäure mit einem Vernetzungsgrad von 0,05 erhalten.
IR (Film): 1630 cm^–1 (-CO-NH); 1740 cm^–1 (-COOH, Polysaccharid); 3200 cm^–1 (-NH-).
BEISPIEL 3
Gemäß dem Verfahren und den Bedingungen, wie in Beispiel 1 verwendet, wird als Vernetzungsmittel 0,0'-Dis-(2-aminopropyl)-PEG 500 verwendet, es wird eine Hyaluronsäure mit einem Vernetzungsgrad von 0,05 erhalten.
IR (Film): 1630 cm^–1 (-CO-NH); 1740 cm^–1 (-COOH, Polysaccharid); 3200 cm^–1 (-NH-).
SD = 31,000
BEISPIEL 4
0,6 g Hyaluronsäuretributylammoniumsalz (1 × 10^–3 mol, bezogen auf die Disaccharideinheit) werden unter Rühren in 30 ml DMF unter Stickstoff gelöst. 0,08 g Chlormethylpyridyliumiodid (3,5 × 10^–4 mol), gelöst in 2 ml DMF, werden tropfenweise zu der gerührten Lösung, die bei 0°C gehalten wird, gegeben. Das Molverhältnis beträgt daher etwa 3/1.
Nach 20 Minuten werden 2 ml 1,3-Diaminopropan (0,024 mol) zugegeben, gefolgt unmittelbar von 0,5 ml Triethylamin. Es wird ein festes, gelatinöses Produkt erhalten, das Produkt wird mit Wasser gequollen und erneut mit Ethanol gewaschen.
Das Endprodukt zeigt nach der Lyophilisierung in einem Abtastmikroskop ein unregelmäßiges Muster mit glatten Zonen, alternierend mit schwammartigen Zonen.
Der Vernetzungsgrad betrug 0,3 (30% der anfänglich verfügbaren Carboxygruppen).
IR (Film): 1740 cm^–1 (-COOH); 1630 cm^–1 (-CO-NH); 1610 cm^–1 (-COO); 1560 cm^–1 (-CO-NH);
BEISPIEL 5
0,6 g Hyaluronsäuretributylammoniumsalz (HY TBA) (1 × 10^–3 mol, bezogen auf die Disaccharideinheit) wurden unter Rühren in 30 ml DMF unter Stickstoff gelöst. 0,15 g Chlormethylpyridyliumiodid (CMPJ) (6 × 10^–6 mol), gelöst in 2 ml DMF, wurden zu der Lösung, die bei 0°C gehalten wurde, zugegeben. Das Malverhältnis betrug 2HY.TBA:1 CMPJ. Nach 20 Minuten werden 2 ml 1,3-Diaminopropan (0,024 mal) zu der Lösung zugegeben.
Danach wurden 0,5 ml Triethylamin zugegeben.
Es wurde ein festes, gelartiges Produkt erhalten und gründlich mit DMF gewaschen.
Nach dem Verdampfen des DMF wurde das Produkt mit Wasser gequollen und mit Ethanol vor der Lyophilisierung gewaschen. Das erhaltene Produkt besaß einen Vernetzungsgrad von 0,5 und zeigte im Abtastmikroskop ein körniges Aussehen, zwischengelagert von großen Netzen. Bei höherer Auflösung schienen die beiden Morphologien identisch und zeigten rundgeformte Vorsprünge mit einigen Mikrometer im Durchmesser.
IR (Film): 1740 cm^–1 (-COOH); 1630 cm^–1 (-CO-NH); 1610 cm^–1 (-COO); 1560 cm^–1 (-CO-NH);
Die Gele wurden in PBS gequollen und die maximale Quellfähigkeit wurde bewertet:
SD = 23,500
NMR = (13 C; ppm): 29,3 und 39,8
Die rheologischen Eigenschaften, bestimmt in einem Bohlin-VOR-Rheometer, bei einer Temperatur von 23 ± 0,1°C zeigten einen einen dynamischen Elastizitätsmodul G' (100 Pa bei 100 Hz) identisch mit den zwei in Betracht gezogenen Konzentrationen (10 und 20 mg/ml) immer höher als der viskose dynamische Modul (G'' 40 Pa für 20 mg bei 10 Hz und 20 Pa für 10 mg bei 10 Hz).
BEISPIELE 6–9
Gemäß den Verfahren der vorherigen Beispiele wurden vernetzte Hyaluronsäurederivate mit den Eigenschaften, die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt sind, erhalten, unter Verwendung von 1 × 10^–3 mal (0,6 g) Hyaluronsäuretributylammoniumsalz als Ausgangsmaterial.
Die erhaltenen Derivate besaßen die folgenden Eigenschaften
BEISPIEL 10: Sulfatierung von 50% vernetzter HY
Das in Beispiel 5 erhaltene Derivat wird in 5 ml DMF unter starker Rühren und Stickstoffatmosphäre dispergiert.
Eine Lösung von 1 g SO₃/Pyridin in mol DMF wird bei 0°C zugegeben und dann wird 3 Stunden gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe eines Überschusses an H₂O (50 ml) blockiert und der pH wird auf 9 mit 0,1 M NaOH eingestellt.
Das Produkt wird gut mit Ethanol und H₂O gewaschen und dann lyophilisiert.
Das IR-Spektrum zeigt zusätzlich zu den Banden des Ausgangsproduktes einen Peak bei 1260 cm^–1 und eine stärkere Bande bei 1025 cm^–1.
Das Gel quillt in PBS mit SD = 33.000. Höhere Auflösung 13C-NMR-Spektrum zeigt die Signale in H₂O bei 37°C, die in Tabelle 2 aufgeführt sind. Die Intensität der NMR-Signale bei 29,3 und 38,8 ppm (-CH₂-) und des Signals bei 172,5 ppm (CONH) bestätigen einen Vernetzungsgrad von etwa 50%.
Die rheologischen Eigenschaftenen werden durch einen dynamischen Elastizitätsmodul G' (2500 Pa mit 20 mg und 1000 Pa mit 10 mg bei 10 Hz) charakterisiert, der höher ist als die dynamischen viskosen Module G'' (600 Pa mit 20 mg und 150 Pa mit 10 mg bei 10 Hz) und wesentlich höher als die entsprechenden Werte, erhalten mit nicht-sulfatierter HY (13 bei 50% – Beispiel 5). Diese Verbindung besitzt eine Thrombinzeit (TT), die höher (61 ± 5'') ist als beim Vergleich (14,0'') und der entsprechenden nicht-vernetzten Verbindung (14,6'').

Die Verbindung war ebenfalls aktiv im PRP-Test unter Verwendung gestresster Kaninchen. TABELLE 2 Tabelle: 13C-chemische Verschiebung

C-1	C-2	C-3	C-4	C-5	x-C=O	y-CH₃
103,5	57,3	85,4	71,3	78,7	178,0	25,3	ppm
C-1'	C-2'	C-3'	C-4'	C-5'	6-C=O
105,9	75,2	76,4	82,8	78,6	176,2		ppm
1-CH2	2-CH2	3-CH2	6'C=O	VERNETZUNG
39,8	29,3	39,8	172,5				ppm

BEISPIEL 11
Unter Verwendung der gleichen Methodologie werden sulfatierte Derivate mit 50% vernetzten Produkten gemäß den Beispielen 7, 8 und 9 synthetisiert.
Die kolorimetrischen Eigenschaften der sulfatierten Derivate sind in der Tabelle 3 zusammen mit denen der Produkte, die sich von den Beispielen 5 und 10 ableiten, aufgeführt.
BEISPIEL 12: Herstellung der Komplexe von Cu, Zn und Fe
100 mg lyophilisiertes Gel von Beispiel 5 werden unter Rühren bei Raumtemperatur zu 200 ml konzentrierter Lösung von Kupfer(II)-chlorid in destilliertem Wasser gegeben. Die Suspension wird 24 Stunden gerührt und der Komplex wird durch Zugabe von Ethanol präzipitiert. Nach dem Zentrifugieren wird der Rückstand wiederholt mit Wasser und Ethanol zur Entfernung überschüssiger Ionen gewaschen.
Das Endgel, blau-grün in der Farbe, wird lyophilisiert und analysiert.
Das gleiche Verfahren wird unter Verwendung von ZnCl₂ und FeCl₂ durchgeführt.
Die Analyse (EDAX, Polarographie, HCl 0,1 N Titration, Atomadsorption) zeigt einen Kupfergehalt von 0,5 mol/Disaccharidenheiten.

Claims

Vernetzte Hyaluronsäuren, erhältlich durch die Umsetzung der Carbonsäuregruppen der Hyaluronsäure, die mit Chlormethylpyridyliumiodid aktiviert wurden, und einem Polyamin.
Vernetzte Hyaluronsäuren nach Anspruch 1, wobei das Polyamin ein Diamin ist.
Vernetzte Hyaluronsäuren nach Anspruch 2, wobei das Diamin die Formel R₁NH-A-NHR₂ besitzt, worin A eine lineare oder verzweigte C₂-C₁₀-Alkylenkette, bevorzugt eine C₂-C₆-Kette, gegebenenfalls substituiert durch Hydroxy-, Carboxy-, Halogen-, Alkoxy und Aminogruppen; eine Polyoxyalkylenkette [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m, worin n 2 oder 3 bedeutet, m eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet; eine Aryl- oder Heteroarylgruppe, bevorzugt 1,4- oder 1,3-disubstituiertes Benzol bedeutet; R₁ und R₂, die gleich oder unterschiedlich sind, je Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl-, Phenyl- oder Benzylgruppen bedeuten.
Vernetzte Hyaluronsäuren nach Anspruch 3, worin A lineares C₂-C₆-Alkylen oder eine Kette der Formel [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m bedeutet, worin n 2 bedeutet und m eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet.
Vernetzte Hyaluronsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Hydroxygruppen sulfatiert oder hemisuccinyliert sind.
Vernetzte Hyaluronsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche in Gelform.
Vernetzte Hyaluronsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche in festen oder semi-festen Formen.
Zink-, Kupfer- oder Eisen-Komplexe der Produkte der Ansprüche 1 bis 7.
Verwendung von vernetzten Hyaluronsäurederivaten der Ansprüche 6 und 8 als Ersatz für Gelenkflüssigkeit, Glaskörperflüssigkeit, als Matrices für Arzneimittel mit kontrollierter Freigabe, als Heil- und Antiklebemittel.
Verwendung von vernetzten Hyaluronsäurederivaten nach Anspruch 7 für die Herstellung von Gefäßprothesen, biohybrider Organe, Heilvorrichtungen, ophthalmologischen und otologischen Zusammensetzungen, Prothesen, Implantaten und medizinischen Einrichtungen.
Biomaterialien, umfassend die vernetzten Hyaluronsäuren nach den Ansprüchen 1 bis 8.