CZ296842B6

CZ296842B6 - Zesítené hyaluronové kyseliny

Info

Publication number: CZ296842B6
Application number: CZ20011650A
Authority: CZ
Inventors: Barbucci@Rolando; Rapuoli@Roberto
Original assignee: Farmila-Thea Farmaceutici S.P.A.
Priority date: 1998-11-11
Filing date: 1999-11-08
Publication date: 2006-06-14
Also published as: PT1144459E; RU2230752C2; ES2184521T3; WO2000027887A2; US6831172B1; CN1328573A; EP1144459B2; ATE225371T1; TR200101324T2; IL143063A0; ES2184521T5; HK1041011B; CN1131241C; KR20010101001A; DE69903351T3; KR100674177B1; EP1144459A2; HU229668B1; ZA200103799B; HUP0104296A2

Abstract

Nové zesítené hyaluronové kyseliny, získatelné reakcí aktivovaných karboxylových skupin prirozené rovné hyaluronové kyseliny z extraktivního nebo biosyntetického zdroje, s polyaminem, zejména rovným alkyldiaminem. Zesítené hyaluronové kyseliny mohoubýt volitelne sulfatovány nebo hemisukcinylovány a jsou vhodné jako náhrada synoviální tekutiny, ocního sklivce, jako matrixové formy léciv s rízenýmuvolnováním, jako hojivá a protiprilnavá cinidla a pro výrobu cévních protéz, biohybridních orgánu,hojivých prípravku, oftalmických a otologických prostredku, protéz, implantátu, implantátu a lécebných prípravku.

Description

Zesítěné hyaluronové kyseliny (57) Anotace:

Nové zesítěné hyaluronové kyseliny, získatelné reakcí aktivovaných karboxylových skupin přirozené rovné hyaluronové kyseliny z extraktivního nebo biosyntetického zdroje, s: polyaminem, zejména rovným alkyldiaminem. Zesítěné hyaluronové kyseliny mohou být volitelně sulfatovány nebo hemisukcinylovány a jsou vhodné jako náhrada synoviální tekutiny, očního sklivce, jako matrixové formy léčiv s řízeným uvolňováním, jako hojivá a protipřilnavá činidla a pro výrobu cévních protéz, biohybridních orgánů, hojivých přípravků, oftalmických a otologických prostředků, protéz, implantátů, implantátů a léčebných přípravků.

; CZ 296842 B6

Zesítěné hyaluronové kyseliny·

Oblast technikyi

5:

Předkládaný vynález se týká zesítěných hyaluronových kyselin (HK), podle volby hemisukciny1 ováných nebo sulfatovaných, jejich solí s biologicky vhodnými nebo farmakologicky aktivními kationty a jejich komplexů s těžkými kovy jako je měď, zinek a železo.

Dosavadní stav techniky

Hyaluronová kyselina je glykosaminoglykan, sestávající z disacharidových jednotek kyseliny Dglukuronové a N-acetylglukosamin-2-acetamid-2-deoxy-D-glukózy, spojených β(1—>3)glyko15 s idovými vazbami.

Přírodní kyselina hyaluronová má přímou, nikoli zesítěnou strukturu o molekulové hmotnosti 50 000 až 8 000 000 či více, v závislosti na zdroji a způsobu extrahování. :

Hyaluronová kyselina je přítomna v synoviální tekutině, pojivové tkáni a v očním sklivci vyšších živočichů, stejně jako u některých bakterií.

Směsi hyaluronátu sodného o různých molekulových hmotnostech (ve formě roztoků, majících různé viskozity, gelů o rozdílných viskoelastických charakteristikách, filmu či membrán nebo 25 houbiček) se používají v humánní medicíně a chirurgii například jako náhrady synoviální tekutiny, tkáňová protipřilnavá agens, náhrady sklivce, umělé slzy, činidla pro tkáňovou rekonstituci λ'podmínkách in vivo (například jako vněburiěčné matrice pro formování kostních segmentů s; následnou kolonizací osteoblastů a kalcifíkací; pojivové pokožkové tkáně s následnou kolonizací fibroblastů), jako materiály pro přípravu umělé kůže, vhodné k léčbě popálenin nebo pro 30 plastickou chirurgii; jako překiývací agenš pro biologicky slučitelné cévní protézy, jako nosiče farmakologicky aktivních přísad v prostředcích se řízeným uvolňováním aktivní složky a podobně.

V dermatologii a kosmetice se, vzhledem ke svým viskoelastickým a zvlhčujícím vlastnostem a 35 A^ysoké biologické slučitelnosti, uvedené směsi používají jednak jako základ pro zvlhčující, místně nanášené prostředky a také jako agresivní léčebné-operační přípravky („výplňová činidla“).

Použití přírodní, přímé (lineární) kyseliny hyaluronové pro zmiňované účely je samozřejmě ome40 zeno jejím rychlým rozpadem (degradaci in vivo působením enzymových systémů jako je hyaluronidáza, glukosidáza a glukuronidáza), s následným snížením molekulové hmotnosti a progresivním zhoršením viskoelastických vlastností a, obecně, fyzikálních charakteristik konečných směsí a přípravků (mechanické síly, pružnosti, velikosti pórů) a podobně.

Pro překonání tohoto problému, hlavně pak s cílem zvýšit škálu směsi a jejich pružnost nanášení, byly navrženy chemicky pozměněné hyaluronové kyseliny.

Bylo předloženo zesítění s polyfunkčními epoxidy (US 4 716 224, US 4 772 419, US 4 716 154), polyalkoholy (US 4 957 744), divinylsulfonem (US 4 582 865, US 4 605 601, US 4 636 524), 50 aldehydy (US 4 713 448, US 5 128 326, US 4 582 568), biskarbodiimidy (US 5 356 883) a s polykarboxylovými kyselinami (EP-A 718312).

Uvedené zesítěné hyaluronové kyseliny se používají jako biologické materiály pro implantáty, protézy a léčebné přípravky, jako jsou matrice s řízeným uvolňováním léčiva, jako jsou hnojivá, 55 protipřilnavá a obvazová činidla.

-1 CZ 296842 B6

Sulfatace nezesítěné hyaluronové kyseliny je obecně předložena v US 5 013 724, týkající se především sulfatování heparinů, heparanů a dermatanů pro použití jako protitrombotických a protisrážlivých činidel.

Hemisukcinylační reakce kyseliny hyaluronové (HK) nebyla nikdy předložena. Příklad zavedení této skupiny je uveden vEP-B 200 574, nárokující kompozitní biologické materiály, sestávající ze sukcinylovaného kolagenu a chitosanu.

ž^esítění karboxyalkylcelulózy prostřednictvím diaminů nebo polyaminů je uvedeno v EPA 566 118 (Kimberly Clark Corp.) pro přípravu absorbujících materiálů sHK jako síťovacím činidlem pomocí zahřívání. Takový postup se zdá ekonomicky výhodný a vhodný pro výrobu ve velkém měřítku, vyžadovaném pro tento typ výrobků.

EP-A 642 426 (Fidia) předkládá perforované biologicky slučitelné membrány a jejich použití jako umělé kůže. Kolageny zesítěné diaminy a kyselinou hyaluronovou jsou všeobecně uváděny jako možné materiály pro uvedené membrány.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že nové zesítěné hyaluronové kyseliny, které lze získat reakcí vhodně aktivovaných karboxylových skupin hyaluronové kyseliny s polyaminem, stejně jako jejich sole a komplexy s vhodnými organickými nebo anorganickými kationty, mají výhodné fyzikálně chemické a biologické vlastnosti pro použití v biomedicíně a kosmetice.

Hlavní fyzikálně-chemické a biochemické charakteristiky sloučenin podle vynálezu jsou:

- vysoká biologická slučitelnost,

- vysoká odolnost vůči enzymatickému odbourávám, zejména po sulfatováníj

- vysoká kapacita absorbování vody, s vytvářením viskoelastických charakteristik závislých na stupni zesítění, stejně jako na stupni sulfatování a/nebo stupni hemisukcinylace,

- schopnost chelatovat kovové ionty jako je zinek nebo měď; uvedené deriváty mají velice dobrou stálost.

Biologické chování je nové a překvapující; je známo, že sulfatace (nebo supersulfatace) glykosaminoglykanů jako je heparin, dermatansulfát, chondroitin a přírodní kyselina hyaluronová zvyšuje jejich protisrážlivé účinky (inhibice faktorů Xa a Ha a/nebo změna jejich poměru) oproti výchozímu produktu (US 5 013 724).

Sloučeniny podle vynálezu mají, pokud jsou sulfatované, slabou protisrážlivou aktivitu, ovšem naprosto překvapivá je nepřítomnost aktivace destiček a srážení (měřeno jako protipřilnavá aktivita; P.R.P model u králíků podrobených stresu chování, popsanému v „Abstract IL 15“ - International Conference on Advances in Biomaterials and Tissue Engineering, 14.-19. Juin 1998, Capri, Itálie) jak u zesítěné hyaluronové kyseliny podle vynálezu (o různých stupních zesítění), tak u odpovídajících sulfátových esterů; tato vlastnost zcela chybí u přírodní kyseliny hyaluronové a esterových derivátů.

Žádné až do teď známé polymemí materiály pro léčebné použití očividně tuto vlastnost nesdílejí.

Vynález se týká nových zesítěných hyaluronových kyselin, získatelných reakcí aktivovaných karboxylových skupin přírodní rovné kyseliny hyaluronové z extrakčního nebo biosyntetického zdroje, s polyaminem a zejména pak s rovným alkyldiaminem.

-2CZ 296842 B6

Podle upřednostňovaného ztělesnění je zésítěná hyaluronová kyselina podle vynálezu dále podrobena sulfataci a hemisukóiňýláci. Získané produkty á jejich sole nebo komplexy mají zcela nové vlastnosti (například bobtnavost, pohyblivost vody v gelu, chemotaktickou aktivitu v endoteliálních buňkách, viskoelastické vlastnosti). í

Uvedené esterifíkační postupy se provádějí známými způsoby (použití reagencií pyridinu/SO₃, kyseliny chlorsulfonové; sukcinanhydridu, v homogenní nebo heterogenní fázi, při pH od 6,5 do 8).

Příklady postupu hemisukcinylace kolagenu jsou uvedeny ve WO 88/10123 a vUS 4 493 829.

Polyaminem, který má být použitý jako síťující činidlo podle vynálezu, je s- výhodou diamin o vzorci '

RjNH-A-NHR₂, kde A je rovný nebo větvený C₂-C_w alkylenový řetězec, s výhodou C₂-C₆ řetězec, podle volby substituovaný hydroxyskupinami, karboxyskupinami, halogenovými skupinami, alkoxyskupinami a aminoskupinami; polyoxyalkylenový řetězec.

[(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m, kde n je 2 nebo 3, m je celé číslo od 2 do 10; C5-C7 cykloalkylová skupina; arylová nebo hetarylová skupina, s výhodou 1,4 substituovaný nebo 1,3 disubstituovaný benzen; Ř] a R₂, stejné nebo 25 rozdílné, jsou vodíkovými, C]-C₆ alkylovými, fenylovými nebo benzylovými skupinami.

Upřednostňovaným A jsou C₂-C₆ alkylen nebo řetězec [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m, Ri a R₂ jsou s výhodou atomy vodíku.

Polamin reaguje s hyalurinovou kyselinou nebo jejími solemi, jejichž karboxylové skupiny byly předem aktivovány.

Aktivace se může provádět běžnými metodami; například a s výhodou těmi obvykle používanými, v bezvodém aprotickém rozpouštědle, k vytvoření amidových vazeb v peptidové syntéze 35 látkami jako karbonyldiimidazol; karbonyltriazol; hydróxybenzotriazol; N-hydroxysukcinimid;

{>-nitrofenol + p-nitrofenyltrifluoracetát; chlořmethylpyridyliumjodid; s výhodou chlormethylpyridyliumjodid a podobně; tyto aktivátory umožňují ňejlepší výtěžky a největší reprodukovatelnost pokud jde o stupeň zesítění.

Hyaluronová kyselina je s výhodou převáděna do formy sole s lipofilním kátiontem, například tetralkylamoniovým kátiontem nebo jinými lipofílními organickými bázemi, schopnými indukovat vhodnou rozpustnost v polárním aprotickém rozpouštědle jako je dimethylformamid, tetrahydrofuran a podobně.

Transformace anorganických solí, jako sodných solí, na vhodné organické kationty, může být prováděna dobře známými metodami iontové výměny v homogenní fázi, nebo vysrážením kyselé složky, jejím znovunabytím a následnou tvorbou sole s požadovanou organickou bází.

Aktivační reakce karboxylových skupin se obvykle provádí v homogenní fázi a v bezvodém 50 polárním aprotickém rozpouštědle. Síťující polyamin se přidává k roztoku aktivovaného esteru ve stejném bezvodém rozpouštědle za udržování teploty v rozmezí od 0 do 30 °C. Doba reakce se pohybuje [od 1 do 12 hodin v závislosti na přítomnosti vhodných bází jako je triethylamin.

Obecně se požadovaný konečný produkt znovu získává přidáním odlišného rozpouštědla za sníženého tlaku a následným běžným zpracováním.

Stupeň zesítění se může pohybovat v širokých mezích a může být upraven změnou množství aktivačního činidla karboxylových skupin, přičemž aktivace a síťovací reakce jsou téměř kvantitativní.

V důsledku toho je požadovaný stupeň zesítění (C.L.D., procento karboxylových skupin zapojených v zesíťování) výborně reprodukovatelný, jak je prokázáno údaji z NMR (nukleární magnetické rezonance). Konečné produkty, získané za podobných určujících podmínek mají proto konstantní charakteristiky.

Výchozí hyaluronovou kyselinou může být jakákoli hyaluronová kyselina, mající molekulovou hmotnost od 5000 do 8 000 000 a svýhodou od 10 000 do 200 000, extrahovaná zběžných zdrojů, nebo získatelná kvašením mikroorganizmů skupiny Streptococcus nebo jiných technických kmenů.

Zesítěná kyselina hyaluronová podle vynálezu může být podrobena sulfataci s vhodným reakčním činidlem, s výhodou s komplexem pyridin/oxid sírový v dimethylformamidu.

Reakce se provádí v heterogenní fázi při teplotě 0 až 10 °C po dobu od přibližně 0,5 do přibližně 6 hodin.

Stupeň získatelné sulfatace může být v širokém rozmezí hodnot a lze ho upravit změnou reakční doby a teploty.

Obecně se může stupeň sulfatace (definovaný jako ekviv. sulfátové skupiny/g) pohybovat od IxlO^-6 do óxlO^-6, lépe pak činí přibližně 2x10^-6 ekviv./g pro C.L.D. = 0,5.

Zesítěná kyselina hyaluronová podle vynálezu může být rovněž podrobena hemisukcinylačním reakcím za známých podmínek (vodná heterogenní fáze, za důkladného míchání, přidánípevného sukcinanhydridu v následných dávkách, v hmotnostních poměrech od 1:1 do 1:5; udržování pH na hodnotě 7 až 8,5 pomocí alkalického činidla, při teplotách od 5 do 30 °C). Stupeň hemisukcinylace může být v širokém rozmezí v závislosti na následujících parametrech: reakční době a teplotě; rychlosti míchání vícefázového systému a rychlosti přidávání pevného sukcinanhydridu. Při udržování těchto parametrů na konstantní úrovni poskytuje reakce reprodukovatelné produkty. Zesítěné hyaluronové kyseliny, volitelně sulfatované nebo hemisukcinylované, podle vynálezu vykazují schopnost vytvářet komplexy skovovými ionty jako je měď, zinek a železo.

Tyto komplexy lze snadno získat rozpuštěním nebo rozptýlením až do úplného nabobtnání derivátu hyaluronové kyseliny ve vodě a přidáním za míchání, s výhodou při teplotě místnosti, koncentrovaného roztoku organické či anorganické sole mědi, zinku nebo železa, například CuCl₂, ZnCl₂ či Fe₂(SO₄)₃; po 12 až 24 hodinách míchání se komplex zpětně získá odstředěním nebo vysrážením po změně rozpouštědla (např. přidání ethanolu nebo acetonu), anebo odpařením za sníženého tlaku; takto získaný surový produkt se důkladně promyje destilovanou vodou k odstranění přebytku iontu.

Poté se komplexy lyofilizují.

Obsah kovových iontů závisí na použitých provozních podmínkách: molámích poměrech polymeru a iontu, koncentraci a pH roztoku; reakčních dobách a zejména stupni zesítění. Ten může dosáhnout maximálního objemu 1 kovového iontu na disacharidovou jednotku, neúčastnící se zesíťování.

-4ČZ 296842 B6

Důležitá výhoda vynálezu spočívá v možnosti získání, vhodnou změnou stupně zesítění a/nebo stupně sulfatace či sukcinylace, derivátů kyseliny hyaluronové v široké škále odlišných forem, charakterizovaných různými vlastnostmi (jako viskoelastičností, kovovými ionty, schopností vytvářet hydrogely, filmy, houbičky, mechanickou sílou a podobně).

To umožňuje použití derivátů kyseliny hyaluronové podle vynálezu v různých lékařských a farmaceutických oblastech, v oblasti veterinární nebo humánní medicíny:

1) jako nitrokloubní náhrady synoviální tekutiny pro léčbu osteoarthritických stavů;

2) jako náhrad sklivce pro léčbu patologických změn a vedlejších účinků spojených s chirurgií ίο oka;

3) jako základu přípravků umělých slz pro léčbu suchého oka;

4) jako matrix pro řízené uvolňování léčiv (např. protizánětlivých léčiv, antibiotik, β-adrenergních agonistů a antagonistů, inhibitorů aldosareduktázy, antialergik, léčiv působících proti akné, proti plešatosti, novotvarům, glaukomu, svědění, lupence, proti mazotoku, protivředo- vých léčiv, protivirových činidel, růstových faktorů a podobně) jejich jednoduchým uzavřením do hydrogelů, získaných ze sloučenin podle vynálezu. Jinou možností je vazba léčiva kovalentními vazbami k matrixu kyseliny hyaluronové, pomocí:

a) esterifíkace nebo amidace skupin COOH, které še neúčastní zesítění s polyaminy, pokud je léčivem alkohol nebo amin;

b) esterifíkace volnými hydroxyskupinami derivátů kyseliny hyaluronové, pokud má léčivo volné karboxylové skupiny.

Produkty spadající do (a) mohou být získány za použití stejného způsobu aktivace karboxylových skupin, jaký byl popsán dříve, v důsledně bezvodém médiu, nebo transesterifíkací.

5) Pro přípravu přípravku na rány nebo kožní vředy, působícího léčivě, ve formě filmů o různé tloušťce, více či méně propustných pro plyny, houbiček a podobně. Takové přípravky s výhodou obsahují vhodná léčiva jako jsou antibiotika, léčivé faktory. Hodí se také pro kultivaci epiteliálních buněk, keratinocytů a podobně.

6) Pro veškeré aplikace, u nichž bylo již dříve navrženo použití známých hyaluronových kyselin, například pro přípravu pevných či polopevných forem či modelovatelných forem pro výrobu cévních protéz (protipřilnavých obvazů krevních cév, umělých srdečních ventilů a pod.) biohybridních orgánů (umělé slinivky, umělých jater); oftalmologických výrobků (náhrad očních čoček, kontaktních čoček); otologických výrobků (pro ušní lékařství); obecně protipřilnavých implantátů k použití v břišní, gynekologické, plastické, ortopedické, neurologické, oftalmologické, hrudní, otorhinolaryngologické chirurgii; léčebných přípravků 35 jako jsou steny, katetry, kanyly a podobně.

Použití zesítěné hyaluronové kyseliny a zní získaných biomateriálů jsou známá a popsaná, například ve WO 97/3978, WO 97/22629, WO 97/18244, WO 97/7833, EP 763754, EP 718312, WO 96/40005, WO 96/33751, US 5 532 221, WO 95/1165 a EP 320 164.

Zvláštní zájem se věnuje použití zesítěných hyaluronových kyselin podle vynálezu v kosmetické dermatologii, například jako zvlhčujících činidel, základů různých kosmetoíogických prostředků, injikovatelných plnidel a podobně.

Formální výrobky, získané z derivátů zesítěné kyseliny hyaluronové podle vynálezu, mohou být podrobeny sterilizaci (napříklád zahřátím na 120 °C nebo působením ethylenoxidu) bez jakékoli změny technologických vlastností, což je samozřejmě další výhodou, poskytovanou předkládaným vynálezem.

Předkládaný vynález je podrobněji popsán v následujících příkladech.

-5CZ 296842 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 ;

Sodná sůl kyseliny hyaluronové (lxlO“³ mol. vzhledem k disacharidové jednotce) byla přeměněna na tributylamoniovou sůl (TBA sůl) podle jedné z následujících metod: ;

a) 1 % vodný roztok hyaluronátu sodného se převede do Ff formy pomocí silné H⁺ kationtové pryskyřice (amberlite IR 120); na konečný roztok se působí 0,5% roztokem TBA-OH přiio bližně do pH = 9.

t>) 1% vodný roztok hyaluronátu sodného se převede na roztok TBA sole působením slabé kationtové pryskyřice v TBA⁺ formě (Amberlite IRC 50).

V obou případech se konečný roztok lyofilizuje TBA sůl se poté rozpustí v 15 ml bezvodého 15 dimethylformamidu (DMF) pod dusíkovou atmosférou a k tomuto roztoku TBA sole se při 0 °C po kapkách přidá roztok 0,02 g chlormethylpyridiliumjodidu (CMPJ) ve 2 ml bezvodého DMF.

Reakční směs byla poté doplněna 0,1 ml triethylaminu a následně, po kapkách, roztokem 1,3diaminpropanu (d=0,88, ve velkém přebytku, aby se snadněji vytvořilo zesítění aktivovaných 20 karboxylových skupin) ve 2 ml bezvodého DMF. Po skončení adice byla reakční směs míchána alespoň 30 minut a poté bylo rozpouštědlo odstraněno za sníženého tlaku, zbytek byl odebrán s DMF, který byl hned následně odstraněn destilací a zbytek byl promyt ethánolem, směsí ethanolu a vody a konečně vodou. Produkt byl lyofllizován a získaný zbytek podroben analýzám:

Infračervená spektra (IR, film): 1630 cm*¹ (-CO-NH); 1740 cm*¹ (-COOH. polysacharid); 3200 cm^-1 (-NH-).

SD (stupeň nabobtnání, ve vodě a při teplotě místnosti, po 15'; gravimetrické stanovení; počítáno podle:

Ws-Wd

SD= —---.100

Wd kde Ws = hmotnost hydratovaného gelu; Wd je hmotnost suchého gelu): 31 000 stupeň zesítění: 35 0,05 (5 % z původně dostupných karboxylových skupin).

Příklad 2

Postupem popsaným v příkladu 1 za stejných podmínek jako v příkladu 1, za použití stejné hyaluronové kyseliny á stejného aktivačního činidla, kdy pouze místo 1,3-diaminopropanu byl jako aktivační činidlo použit 1,6-diaminohexan, byla získána zesítěná kyselina hyaluronová, mající stupeň zesítění 0,05.

IR (film): 1630 cm*¹ (-CO-NH); 1740 cm*¹ (-COOH polysacharid); 3200 cm*¹ (-NH-).

-6CZ 296842 B6

Příklad 3 ;

Postupem popsaným v příkladu 1 a za stejných podmínek jako v příkladu 1, kdy byl jako aktivační činidlo použit 0,0'-dis(2-aminopropyl) PEG 500, byla získána zesítěná kyselina hyaluronová, mající stupeň zesítění 0,05.

IR (film): 1630 cm^-1 (-CO-NH); 1740 cm^-1 (-COOH polysacharid); 3200 cm'¹ (-NH-).

SD = 31000

Příklad 4

0,6 g tributylamoniové sole kyseliny hyaluronové (lxl O³ mol. vzhledem k disacharidové jednotce) bylo za míchání rozpuštěno ve 30 ml DMF pod dusíkovou atmosférou. K míchanému roztoku, udržovanému při teplotě 0 °C, byly po kapkách přidány 0,08 g chlormethylpyridyliumjodidu (3,5.10¹ mol), rozpuštěné ve 2 ml DMF. Molární poměr byl tedy přibližně 3:1.

Po 20 minutách byly přidány 2 ml 1,3-diaminopropanu (0,024 mol) a bezprostředně poté 0,5 ml triethylaminu. Získán byl pevný, želatinovitý produkt, který pak byl ponechán nabobtnat vodou a opět promyt ethanolem.

Konečný produkt vykazoval po lyofilizaci v skenovacím mikroskopu nepravidelný profil s hladkými zónami, střídajícími houbovité zóny.

Stupeň zesítění byl 0,3 (30 % původně dostupných karboxylových skupin).

IR (film): 1740 cm¹ -(COOH); 1630 cm¹ (-CO-NH); 1610 cm¹ (-COO-); 1560 cm“¹ (-CONH-).

Příklad 5

0,6 g tributylamoniové sole kyseliny hyaluronové (lxlO”³ mol. vzhledem k disacharidové jednotce) bylo za míchání rozpuštěno ve 30 ml DMF pod dusíkovou atmosférou. K míchanému roztoku, udržovanému při teplotě 0 °C, bylo po kapkách přidáno 0,15 g chlořmethylpyridyliumjodidu (CMPJ) (6xl0“⁶ mol), rozpuštěného ve 2 ml DMF. Molámí poměr byl 2(HK.TBA):1(CMPJ). Po 20 minutách bylý k roztoku přidány 2 ml 1,3-diaminopropanu (0,024 mol). Následně bylo přidáno 0,5 ml triethylaminu.

Získaný pevný, rosolovitý produkt byl důkladně promyt DMF.

Po odpaření DMF byl produkt ponechán nabobtnat ve vodě a promyt ethanolem před tím, než byl lyofilizován.

Získaný produkt měl stupeň zesítění 0,5 a vykazoval ve skanovacím mikroskopu zrnitý vzhled, přerušovaný širokým síťovím. Při vyšších zvětšeních obě morfologie působily identicky a vykazovaly kulaté výčnělky o průměru několika mikrometrů.

Gely byly podrobeny bobtnání v PBS (pufrovaném fyziologickém roztoku) a stanovena byla maximální schopnost bobtnání.

-7CZ 296842 B6

SD = 23 500

3.

NMR = ¹³C, ppm, tj. dílů z milionu): 29,3 a 39,8 (-CH,-CH₂-CH₂-própandiaminové spojeni); 172,5 (-’C-NH-CH₂-CH₂-CH,-).

O

Reologické vlastnosti, stanovované přístrojem Bohlin VOR Rheometer, při teplotě 23±0,l °C, 5 ukázaly, že dynamický modul pružnosti G' (100 Pa při 10 Hz), identický při dvou uvažovaných koncentracích (10 a 20 mg/ml), je vždy vyšší než viskózní dynamický modul (G” = 40 Pa pro 20 mg při 10 Hz a 20 Pa pro 10 mg při 10 Hz). '

Příklady 6 až 9

Způsoby popsanými v předcházejících příkladech byly získány zesítěné deriváty hyaluronové kyseliny o charakteristikách, které jsou shrnuty v následující tabulce 1, přičemž se vycházelo z 1x10“³ mol (0,6 g) tributylamoniové sole hyaluronové kyseliny.

Získané deriváty měly následující vlastnosti:

-8Tabulka 1 i ¹

CZ 296842 B6 í

-9,ř

Příklad 10

Sulfatování 50% zesítěné kyseliny hyaluronové ; ·

Derivát získaný v příkladu 5 byl dispergován v 5 ml DMF za důkladného míchání a pod dusíkovou atmosférou.

Za teploty 0 °C byl přidán roztok 1 g SO₃/pyridinu v mol DMF a míchán 3 hodiny. Reakce byla io zablokována přidáním přebytku H₂O (50 ml) a pH bylo upraveno na hodnotu 9 pomocí

0,1 mol.F¹ NaOH.

Produkt byl důkladně promyt ethanolem a H₂O a poté byl lyofílizován.

Infračervené spektrum prokazuje kromě pásů výchozího produktu, maximum (pík) o hodnotě 1260 crrT¹ a silnější pás o hodnotě 1025 cm^-1. ;

Gel bobtná vpufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) se stupněm nabobtnání SD = 33 000. ¹³C NMR spektrum o vyšší rozlišovací schopnosti prokazuje signály v H₂O při 37 °C, uvedené 20 v tabulce 2. Intenzita NMR signálů při 29,3 a 38,8 ppm (částí z milionu) (-CH₂-) a signál při 172,5 ppm (CONH) potvrzuje přibližně 50% stupeň zesítění.

Reologické vlastnosti (týkající se deformační chování) jsou charakterizovány dynamickými moduly pružnosti G' (2500 Pa u 20 mg a 1000 Pa u 10 mg při 10 Hz), které jsou vždycky vyšší 25 než dynamické viskózní moduly G (600 Pa u 20 mg a 150 Pa u 10 mg při 10 Hz) a mnohem vyšší než odpovídající hodnoty, získané s nesulfatovanou hyaluronovou kyselinou (13 při 50 % příklad 5). Tato sloučenina má dobu thrombinu (thrómbin time) TT vyšší (61±5) než kontrola (14,0) a odpovídající nezesítěná sloučenina (14,6). ;

Sloučenina byla aktivní také v testu PRP za použití stresovaných králíků.

Tabulka 2: ¹³C chemický posun

C-l	C-2	C-3	C-4	C-5	x-C=O	y- CH₃
103,5	57,3	85,4	71,3	78,7	178,0	25,3	ppm
c-r	C-2'	C-3'	C-4'	C-5'	6-C=O
105,9	75,2	76,4	82,8	78,6	176,2		ppm
1-CH2	2-CH2	3-CH2	6'-C=O	zesítění
39,8	29,3	39,8	172,5		ppm

Příklad 11

Za použití stejné metodologie byly syntetizovány sulfatované deriváty 50% zesíťovaných produktů podle příkladu 7, 8 a 9.

-10CZ 296842 B6

Kolorimetrické charakteristiky sulfatovaných derivátů jsou uvedeny v tabulce 3 společně s charakteristikami produktů, odvozených od příkladů 5 a 10.

Tabulka 3

zesítěný polymer (50% st. zesítění)	AHa [J/g]	Tg [°C]	AHb [J/g]	hm.% vody
zesíť. hyal-1,3 (př. 5)	276	51	42 ' í.	12
zesíť. hyalS-1,3 (př. 10)	357	64	53 ;	16
zesíť. hyal-1,6 (př. 9)	327	64	58 ’ 1	16
zesíť. hyalS-1,6	465	64	65	20
5 zesíť. hyal-P500.2NH₂ (př. 7)	239	45	72	10
6 zesíť. hyal-P500.2NH,	384	69	113	16
7 zesíť. hyal-P800.2NH₂ (př. 8)	179	73	30	10
8 zesíť. hyalS-P800.2NH₂	206	76	52.	¹⁰
hyal ITBA	164	-	130	5

AHa [J/g]: entalpie odpaření vody

Tg [°C]: entalpie tepelného degradačního procesu

AHb [J/g]: teplota sklovatění hmotn. % vody: % obsah vody vzhledem k AHa

Příklad 12

Příprava komplexů Cu, Zn a Fe

100 mg lyofílizovaného gelu z příkladu 5 bylo přidáno za míchání a při teplotě místnosti, k 200 ml koncentrovaného roztoku chloridu měďnatého v destilované vodě. Suspenze byla míchána 24 hodin a komplex byl vysrážen přidáním ethanolu. Po odstředění byl vzniklý zbytek opakovaně promyt vodou a ethanolem k odstranění přebytku iontů.

Konečný gel světle zelené barvy byl lyofilizován a analyzován.

Stejný postup byl proveden za použití ZnCl₂ a FeCl₂.

Provedené analýzy (EDAX, polarografie, titrace 0,1 N HC1, atomová adsorpce) prokázaly obsah mědi 0,5 mol/disacharidové jednotky.

-11 απ j

PATENTOVÉ NÁROKY j

Claims

5 j

1. Zesítěné hyaluronové kyseliny, získatelné reakcí karboxylových skupin hyaluronové kyseliny a polyaminu.
2. Zesítěné hyaluronové kyseliny podle nároku 1, přičemž polyaminem je diamin.
3. Zesítěné hyaluronové kyseliny podle nároku 2, přičemž diamin má vzorec

R]NH-A-NHR₂ kde A je rovný nebo větvený C₂-Ci₀ alkylenový řetězec, s výhodou C₂-C₆ řetězec, podle volby substituovaný hydroxyskupinami, karboxyskupinami, halogenovými skupinami, alkoxyskupi15 námi a aminoskupinami; polyoxyalkylenový řetězec [(CH₂)_n-O-(CH₂)_n]_m kde n je 2 nebo 3, m je celé číslo od 2 do 10; arylová nebo hetarylová skupina, s výhodou 1,4 substituovaný nebo 1,3 disubstituovaný benzen; R] a R₂, stejné nebo rozdílné, jsou vodíkovými, Cj-C₆ alkylovými, fenylovými nebo benzylovými skupinami. !
4. Zesítěné hyaluronové kyseliny podle nároku 3, přičemž A je rovný C₂-C6 alkylen nebo řetězec o vzorci í [(CH₂)_n-O(CII₂)_n]_ni kde n je 2 a m je celé číslo od 2 do 10.
5. Zesítěné hyaluronové kyseliny podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, přičemž hydroxylové skupmy jsou sulfatované nebo hemisukcinylováné.
6. Zesítěné hyaluronové kyseliny podle kteréhokoliv z předcházejících nároků ve formě gelu.
7. Zesítěné hyaluronové kyseliny podle kteréhokoliv z předcházejících nároků v pevných nebo polopevných formách.
8. Komplexy zinku, mědi nebo železa se zesítěnými hyaluronovými kyselinami podle nároků 1

35 až 7. ;
9. Použití zesítěných hyaluronových kyselin podle nároku 6 a jejich komplexů podle nároku 8 jako náhrad synoviální tekutiny, očního sklivce, jako matrixových foremTéčiv s řízeným uvolňováním, jako hojivých a protipřilnavých činidel.
10. Použití zesítěných hyaluronových kyselin podle nároku 7 k výrobě cévních protéz, biohybridních orgánů, hojivých přípravků, oftalmických a otologických prostředků, protéz, implantátů a léčebných přípravků.