KR20070106702A

KR20070106702A - 알파 히드록시산의 중합체와 연결된 히알루론산

Info

Publication number: KR20070106702A
Application number: KR1020077017561A
Authority: KR
Inventors: 카디자 슈와슈-아브델라우이; 미셸 베르트; 로렝 프라바타
Original assignee: 노보자임스 바이오폴리머 에이/에스
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2007-11-05
Also published as: WO2006069578A1; CN101133102A; EP1833882A1; IL184191A0; US20080139501A1; JP2008527056A; CA2593064A1; US20100210588A1

Abstract

본 발명은 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물에 관한 것으로서, 이때 히알루론산은 알파 히드록시산의 중합체와 부분적으로 또는 전체적으로 연결되거나 교차결합되어 있다. 본 발명은 또한 그 생성물의 제조, 위생용 및 수술용 물품의 제조를 위해 사용되는 생체 내에서 분해될 수 있는 플라스틱 재료 분야, 약제학적 및 화장품 분야에, 및 그러한 분야에서 그것들로 제조된 다양한 물품에 사용되는 본 발명의 생성물의 용도에 관한 것이다.

히알루론산, 히알루로네이트, 알파 히드록시산 중합체, 폴리(락트)산, 위생용품, 수술용품의 제조, 바실루스 속 박테리아.

Description

알파 히드록시산의 중합체와 연결된 히알루론산{HYALURONIC ACID LINKED WITH A POLYMER OF AN ALPHA HYDROXY ACID}

본 발명은 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물에 관한 것으로서, 이 생성물에서 히알루론산은 알파 히드록시산의 중합체와 부분적으로 또는 전체적으로 연결되어 있거나 교차 결합되어 있다. 본 발명은 또한 생성물의 제조방법, 및 위생 및 수술용품의 제조에 사용되는 생체 내에서 분해될 수 있는 플라스틱 재료 분야, 제약 및 화장품 분야와, 그러한 분야에서 그것으로 제조된 다양한 물품을 포함하여 본 발명의 생성물의 용도에 관한 것이다.

신체에 있는 가장 풍부한 헤테로 다당류는 글리코사미노글리칸이다. 글리코사미노글리칸은 분지되지 않은 탄수화물 중합체로서, 반복되는 이당류 단위로 구성되어 있다 (단지 케라탄 술페이트만이 탄수화물의 코어 영역에서 분지되어 있다). 이당류 단위는 일반적으로 첫 번째 당 단위로서 두 개의 변형된 당 - N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 또는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 중 하나를 포함한다. 두 번째 단위는 보통 우론산, 예컨대 글루쿠론산 (GlcUA) 또는 이두로네이트이다.

글리코사미노글리칸은 음으로 하전된 분자이며, 용액중에 있을 때 고점성을 부여하는 연장된 형태를 갖는다. 글리코사미노글리칸은 주로 세포 표면 또는 세포 외재성 매트릭스에 위치한다. 글리코사미노글리칸은 또한 용액 중에서 낮은 압축성을 가지며, 그 결과로서 생리적 윤활 유체, 예컨대 관절로서 이상적이다. 글리코사미노글리칸의 견고성은 세포에 구조적 일체성을 제공하고 세포들 사이에 통로를 제공함으로써 세포 이동을 가능하게 한다. 생리적으로 가장 중요한 글리코사미노글리칸은 히알루로난, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, 데르마탄 술페이트, 및 케라탄 술페이트이다. 대부분의 글리코사미노글리칸은 특이한 올리고당 구조를 통하여 프로테오글리칸 코어 단백질에 공유 결합된다. 히알루로난은 특정한 프로테오글리칸과 큰 응집체를 형성하지만, 프로테오글리칸과 비-공유 복합체를 형성하는 유리 탄수화물 사슬과 같은 예외도 있다.

히알루로난의 신체 내에서의 수많은 역할은 이미 확인되었다 (Laurent T. C. and Fraser J. R. E., 1992, FASEB J. 6:2397-2404; Toole B. P., 1991, "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation." In: Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, Hay E. D., ed., Plenum, New York). 히알루로난은 유리질 연골, 활액 연골 유체, 및 피부 조직, 진피와 표피 둘 다에 존재한다. 히알루로난은 또한 많은 생리적 기능, 예컨대 점착, 발생, 세포 이동성, 암, 혈관형성, 및 상처 치유 등에서 역할을 하는 것으로 추정된다. 히알루로난의 독특한 물리적 및 생물학적 특성으로 인해 그것은 눈과 관절의 수술에 사용되고 다른 의료 과정에서도 평가되고 있는 중이다.

문헌에서 사용되는 용어 "히알루론산"은 세포 표면에서, 척추동물의 연결 조직의 염기성 세포외재성 물질에서, 관절의 활액에서, 눈의 인경 내에서, 사람의 탯 줄 조직에서 및 수탉의 벼슬에서 자연적으로 발생하는 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민산 잔기에 의해 구성된 상이한 분자량을 가지는 산성 다당류를 의미한다.

용어 "히알루론산"은 실제로 통상적으로는 분자량이 달라지거나 심지어는 그것의 분해된 단편을 가지는 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-글루코사민산 잔기가 교대로 있는 다당의 전체 시리즈를 의미하는 것으로 사용되며, 따라서 "히알루론산"은 복수형으로 사용되는 것이 더 정확할 것으로 보인다. 그러나 단일형태의 용어가 본 명세서에서 모두 같게 사용될 것이며, 또한 용어 "HA"가 이 포괄적인 용어 대신에 자주 사용될 것이다.

HA는 생물학적 유기체에서 많은 조직의 세포에 대한 기계적 지지체로서, 예컨대 피부, 힘줄, 근육 및 연골로서 중요한 역할을 하며, 세포간 매트릭스의 주요 성분이다. HA는 또한 생물학적 과정에서 예컨대 조직의 보습과 윤활에서 다른 중요한 부분을 차지한다.

HA는 상기 언급된 천연 조직으로부터 추출될 수 있지만, 오늘날에는 그것을 미생물학적 방법에 의해 제조함으로써 감염성 병원체를 전달하는 잠재적 위험을 최소화하고, 생성물의 균일성, 품질 및 활용성을 증가시키는 것이 바람직하다 (WO 03/0175902, Novozymes).

HA와 그것의 다양한 분자 크기 분획들과 그것들의 각각의 염은 약품으로서, 특히 관절병증의 치료에서, 특히 안과 및 성형 수술에서 천연 기관 및 조직을 위한 보조 및/또는 대체 제제로서, 및 화장품 제조시 제제로서 사용되어 왔다. 히알루로 난의 생성물은 또한 정형외과술, 류머티즘학, 및 피부학에 사용하기 위하여 개발되어 왔다.

HA는 또한 위생 및 수술용 물품, 예컨대 폴리우레탄, 폴리에스테르 등에 사용되는 다양한 중합체 물질에 대한 첨가제로서 사용될 수 있는데, 이때 이들 물질을 생체에 적합하게 만드는 효과가 있다.

다기능성 에폭시 화합물과 HA를 교차결합시킴으로써 제조된 교차결합된 HA 또는 그것의 염의 제조는 EP 0 161 887 B1에 개시되어 있다. 지방족 알코올과 HA의 전체 또는 부분적인 교차결합된 에스테르, 및 그러한 부분 에스테르와 무기 또는 유기 염기와의 염은 US 4,957,744에 개시되어 있다.

US 6673919 B2 (Chisso Corp. pub. Date 06/01/2004)는 히알루론산 또는 그것의 염을 O-아세틸화, 알콕실화, 또는 히알루론산 또는 그것의 염으로 구성되는 복합체와 양이온성 화합물의 용액을 교차결합함으로써 화학적으로 변형하는 방법에 관한 것이다.

FR 2707653 (Vetoquinol)은 생체적합하고 생체내에서 분해될 수 있는 중합체와 분자 사이의 콘쥬게이트, 특히 이동성 수소를 함유하는 생물학적으로 활성인 분자; 그것들의 제조 방법; 및 이 콘쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 반복하는 단위의 알파 히드록시산, 예컨대 폴리(락트산) (폴리락타이드로도 불림)으로 구성된 합성 중합체 및 올리고머, 및 어떠한 락트산-기제 중합체, 입체공중합체 및 공중합체, 특히 글리콜산을 가지고 있는 것들, 또한 다른 공중합체, 예컨대 ε-카프로락톤을 경유한 히드록시 카프로산, 글루콘산 및 화학적으로 변형된 글루콘산, 말산과의 공중합체, 수상에서 녹을 수 있고 신장 여과를 통해 제거될 수 있는 분해 부산물, 예컨대 저분자량 폴리(에틸렌 글리콜)을 유도할 수 있는 저분자량 절편을 가지는 공중합체를 사용하는 히알루론산(HA)에 대한 화학적 그래프팅 기법에 관한 것이며, 이때 중합체들은 하나 또는 두 개의 카르복실기를 사슬 단부에 포함하고 단일 산의 경우 소수성을 제공할 수 있어야 한다. 중요한 것은 방법은 그래프팅 또는 교차 결합에 의해 HA를 유도하기 위하여 활용되며, 생성물은 기술적, 생물의학적 및 약제학적 용도에 사용될 수 있다는 것이다. 그래프트된 HA는 생체 내에서 분해될 수 있고, 생체에 적합하며 생체에서 재흡수될 수 있다.

발명의 개요

폴리 알파 히드록시산, 예컨대 락트산 또는 글리콜산의 올리고머를 사용한 HA의 유도체화는 HA 자체보다 더 소수성을 나타내는 그래프트된 HA 구조를 제조하기 위해 사용된다. 그 결과로 생성된 양친매성 특성은 화장품 용도, 예컨대 에멀션 안정화, 피부 보습 및 밀착, 및 필름 형성에 바람직하다. 그러한 그래프트된 물질로부터 유래한 하이드로겔 또는 나노 크기의 콜로이드상 분산액은 또한 조직 증대, 점착 방지, 골관절염 및 안과학에 대해서도 사용될 수 있다.

그래프트된 물질이 생체 내에서 분해될 때 단지 생체적합성 대사산물만이 방출될 것이다. 분해 부산물, 예컨대 락트산 또는 글리콜산은 신체에 의해 대사되고 완전히 제거됨으로써, 그래프트된 생성물이 완전히 체내에서 생체 재흡수되도록 한 다.

락트산은 화장품 제형에 널리 사용되고 폴리(락트산)(PLA)은 조직의 공학적 처리를 위해 생물 의학 용도에, 및 또한 예컨대 PLA 미소구 및 나노입자를 사용하는 약물 전달을 위한 제약 용도에 널리 사용된다.

폴리(락트산)(산 염화물 형태)은 HA (테트라(n-부틸) 암모늄 또는 세틸티메틸 암모늄 염 형태)에 그래프트되었다. 그 결과의 생성물은 겔 또는 나노 크기의 콜로이드상 분산액으로서 얻어졌으며, 나트륨 EDTA 또는 인산염 완충액-DMSO에 대해, 그리고 물과 에탄올에 대해 투석함으로써 정제되었다. 암모늄 이온을 제거할 수 있는 투석 시스템이라면 어느 것이든지 효과적인 것으로 여겨진다. PLA-유도된 HA의 동결건조로 스폰지가 생성되었다.

PLA-HA는 물에 녹지 않았다 (비록 미셸이 형성되기는 한다). 그러나 그것은 1:1 DMSO-물 혼합물에서는 녹았다.

첫 번째 측면으로, 본 발명은 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물에 관한 것으로, 이 히알루론산 또는 그것의 염은 부분적으로 또는 전체적으로 알파 히드록시산, 바람직하게는 폴리락타이드로 언급되는 폴리(락트산)의 중합체, 및 어떠한 락트산-기제 중합체, 스테레오공중합체 및 공중합체, 특히 글리콜산을 가지고 있는 것들, 또한 다른 공중합체, 예컨대 ε-카프로락톤을 경유한 히드록시 카프로산, 글루콘산 및 화학적으로 변형된 글루콘산, 말산과의 공중합체, 수상에서 녹을 수 있고 신장 여과를 통해 제거될 수 있는 분해 부산물, 예컨대 저분자량 폴리(에틸렌 글리콜)을 유도할 수 있는 저분자량 절편을 가지는 공중합체와 연결되거나 교차결합되며, 단 그것들은 하나 또는 두 개의 카르복실기를 사슬 단부에 포함하고 단일 산의 경우 소수성을 제공할 수 있어야 한다.

두 번째 측면으로, 본 발명은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물과 활성 성분을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 바람직하게는 활성 성분은 약제학적 활성 성분이다.

세 번째 측면으로, 본 발명은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물의 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

네 번째 측면으로, 본 발명은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물의 유효량을 비히클로서, 약리학적으로 활성 제제와 함께 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

다섯 번째 측면으로, 본 발명은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물의 유효량을 활성 성분으로서 포함하는 화장품에 관한 것이다.

여섯 번째 측면으로, 본 발명은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물을 포함하는 위생용, 의료용 또는 수술용 물품에 관한 것으로, 바람직하게는 물품은 수술용 스폰지, 상처 치유용 스폰지, 또는 반창고 또는 다른 상처 드레싱 재료에 포함되는 부품이다.

중요한 측면은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물을 포함하는 의약 캡슐 또는 마이크로캡슐에 관련된다.

본 발명의 다른 중요한 측면은 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성 물의 제조 방법에 관한 것으로, 생성물 중의 히알루론산은 부분적으로 또는 전체적으로 알파 히드록시산, 바람직하게는 폴리락타이드로 언급되는 폴리(락트산)의 중합체, 및 어떠한 락트산-기제 중합체, 스테레오공중합체 및 공중합체, 특히 글리콜산을 가지고 있는 것들, 폴리(글리콜산), 또한 ε-카프로락톤을 경유한 히드록시 카프로산, 글루콘산 및 화학적으로 변형된 글루콘산, 말산과의 공중합체, 수상에서 녹을 수 있고 신장 여과를 통해 제거될 수 있는 분해 부산물, 예컨대 저분자량 폴리(에틸렌 글리콜)을 유도할 수 있는 저분자량 절편과의 공중합체와 연결되거나 교차결합되며, 단 그것들은 하나 또는 두 개의 카르복실기를 사슬 단부에 포함하고 단일 산의 경우 소수성을 제공할 수 있어야 하고, 상기 방법은

a) 히알루론산 또는 그것의 염을 알파 히드록시산의 중합체의 모노-아실 클로라이드 또는 디-아실 클로라이드와 함께 유기 용매, 바람직하게는 DMSO 중에서 반응시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 마지막 측면은 안과학에서, 골관절염 또는 암의 치료시에, 상처를 치료하고, 약리학적으로 활성인 제제의 포유류에 대한 피부의 또는 경피적 투여, 또는 화장품의 피부 투여를 수행하는 방법에 관한 것으로, 개선점은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물, 또는 두 번째, 세 번째, 또는 네 번째 측면 중 어느 것에서든지 규정된 바와 같은 조성물을 사용하는 것을 포함한다.

많은 측면들이 골관절염, 암의 치료용 의약의 제조에, 안과적 치료를 위한 의약의 제조에, 상처 치유를 위한 의약의 제조에, 혈관형성을 위한 의약의 제조에, 또는 보습제의 제조에 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물 또는 선행 측면 들 중 어느 것에서 규정된 바와 같은 조성물을 사용하는 것과 관련이 있다.

정의

핵산 구성물

"핵산 구성물"은 본원에서 자연 발생 유전자로부터 분리되거나 그렇지 않다면 자연적으로 존재하지 않을 방식으로 조합되거나 병렬배치된 핵산의 절편을 함유하도록 변형된 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자로서 규정된다. 용어 핵산 구성물은 핵산 구성물이 코딩 서열의 발현에 필요한 모든 제어 서열을 함유할 때 용어 발현 카세트와 동일하게 사용될 수 있다. 용어 "코딩 서열"은 본원에서 아래에서 언급되는 제어 서열의 제어하에 놓이게 될 때 mRNA로 전사되고 관심의 효소로 번역되는 서열로서 규정된다. 코딩 서열의 경계선은 일반적으로 mRNA의 5' 단부에 있는 오픈 리딩 프레임의 바로 앞에 있는 리보솜 결합 부위와 mRNA의 3' 단부에 있는 오픈 리딩 프레임의 바로 아래에 위치한 전사 터미네이터 서열에 의해 결정된다. 코딩 서열은 DNA, cDNA, 및 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있지만 그것들에 한정되지는 않는다.

폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 분리하거나 클론하기 위해 사용된 기법들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 게놈 DNA로부터의 분리, cDNA로부터의 제조, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 그러한 게놈 DNA로부터의 핵산 서열의 클로닝은 예컨대 공유된 구조적 특징을 가지는 클론된 DNA 단편을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 스크리닝 또는 잘 알려져 있는 중합효소 사슬 반응(PCR)을 사용함으로써 이루어질 수 있다. (예컨대 Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York). 다른 핵산 증폭 과정, 예컨대 리가제 사슬 반응, 결찰되고 활성화된 전사, 및 핵산 서열-기초 증폭이 사용될 수 있다. 클로닝 과정은 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 원하는 핵산 단편의 절출 및 분리, 그 단편의 벡터 분자 안으로의 삽입, 및 재조합 벡터의 핵산 서열의 클론들이 복제될 장소인 바실루스 세포 안으로의 통합을 포함한다. 핵산 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반-합성, 합성 기원, 또는 이것들의 어떠한 조합의 것일 수 있다.

효소를 코드화하는 분리된 핵산 서열은 효소의 발현을 제공하기 위하여 다양한 방법으로 조작될 수 있다. 핵산 서열이 구성물 또는 벡터 안으로 삽입되기 전에 조작되는 것은 발현 벡터 또는 바실루스(Bacillus) 숙주 세포에 따라 바람직하거나 필요할 수 있다. 클로닝 방법을 활용하여 핵산 서열을 변형하는 기법들은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 핵산 서열은 또한 숙주 세포에서 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법들을 사용하여 생체 내에서 조작될 수 있다는 것이 인지될 것이다.

많은 효소들이 히알루론산의 생합성에 포함된다. 그러한 효소로는 히알루로난 합성효소, UDP-글루코스 6-데히드로게나제, UDP-글루코스 피로포스포릴라제, UDP-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제, 글루코스-6-포스페이트 이소메라제, 헥소키나제, 포스포글루코뮤타제, 아미도트란스페라제, 뮤타제, 및 아세틸 트란스페라제가 있다. 히알루로난 합성효소가 히알루론산의 제조에 사용되는 핵심 효소이다.

"히알루로난 합성효소"는 본원에서 GlcUA 및 GlcNAc 당 선구체의 첨가에 의 해 히알루로난 사슬의 신장을 촉매하는 합성효소로서 규정된다. 스트렙토코쿠스 히알루로난 합성효소, 척추동물 히알루로난 합성효소, 및 바이러스의 히알루로난 합성효소의 아미노산 서열들은 파스퇴렐라 히알루로난 합성효소와 구별되며, 그룹 I과 그룹 II 히알루로난 합성효소로서 분류되는 것으로 제안되었는데, 그룹 I 히알루로난 합성효소는 스트렙토코쿠스 히알루로난 합성효소 (DeAngelis, 1999)를 포함한다. 바실루스 숙주 세포에서 히알루로난을 제조하기 위해, 진핵세포 기원의 히알루로난 합성효소, 예컨대 포유류 히알루로난 합성효소를 사용하는 것은 바람직하지 않다.

히알루로난 합성효소를 코드화하는 서열은 바실루스 숙주 세포에서 발현될 수 있는 어떠한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 어떠한 기원의 것이어도 좋다. 바람직한 히알루로난 합성효소 유전자는 그룹 I 또는 그룹 II의 어느 것이든지 포함하며, 예를 들면 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스(Streptococus equisimilis), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococus pyogenes), 스트렙토코쿠스 유베리스(Streptococus uberis), 및 스트렙코코쿠스 에퀴(Streptococus equi) 하위종 주에피데미쿠스(zooepidemicus)로부터의 그룹 I 히알루로난 합성효소 유전자, 또는 파스퇴렐라 물토시다(Pasturella multocida)의 그룹 II 히알루로난 합성효소 유전자를 포함한다.

그것으로 인해 히알루로난의 선구체 당이 숙주 세포에 공급되는 구성물은 배양 배지에, 또는 바실루스 숙주 세포의 내인성 유전자, 비-내인성 유전자에 의해, 또는 내인성 및 비-내인성 유전자의 조합에 의해 본 발명의 HA를 생산하는 데 바람 직하다. 선구체 당은 D-글루쿠론산이거나 또는 N-아세틸-글루코사민일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 핵산 구성물은 추가로 하나 또는 그 이상의 히알루로난의 선구체 당의 생합성에 사용되는 효소를 코드화하는 유전자를 포함할 수 있다. 또는 달리 바실루스 숙주 세포는 추가로 선구체 당의 생합성에 사용되는 효소들을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 두 번째의 핵산 구성물을 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다. 히알루로난 생성은 히알루로난의 선구체 당의 합성 경로의 단계를 지시하는 유전자 또는 유전자들을 코드화하는 핵산 서열 또는 서열들을 가지는 구성물을 사용함으로써 개선된다. "히알루로난의 선구체 당의 합성 경로의 단계를 지시하는"이라는 것은 유전자의 발현된 단백질이 N-아세틸-글루코사민 또는 D-글루쿠론산, 또는 N-아세틸-글루코사민 및 D-글루쿠론산 중 하나의 선구체인 당의 형성에 활성적이라는 것을 의미한다.

선구체 당을 공급하기 위한 바람직한 방법에서, 구성물은 히알루로난 합성효소를 가지는 숙주 세포에서의 히알루로난 생성을 개선하기 위해, 히알루로난의 선구체 당의 합성 경로의 단계를 지시하는 유전자를 코드화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 이종성 프로모터 영역을 가지는 재조합 구성물을 가지는 숙주 세포를 배양함으로써 제공된다. 바람직한 방법에서 숙주 세포는 또한 히알루로난 합성효소에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 가지는 재조합 구성물을 포함하는데, 그것은 N-아세틸-글루코사민의 생합성에 포함된 합성효소에 대한 핵산 서열과 상이하거나 동일한 프로모터 영역을 사용할 수 있다. 추가로 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 히알루로난의 선구체 당의 합성에 포함된 두 번째 유전자를 코드화하는 상이한 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 가지는 재조합 구성물을 가질 수 있다.

그러므로 본 발명은 또한 히알루로난의 선구체 당의 합성 경로의 단계를 지시하는 유전자를 코드화하는 핵산 서열을 가지는 구성물을 사용함으로써 히알루로난 생성을 개선하는 구성물에 관한 것이다. 선구체 당에 대한 핵산 서열은 히알루로난 합성효소를 코드화하는 핵산 서열과 동일하거나 상이한 프로모터로부터 발현될 수 있다.

히알루론산의 생성을 위해 선구체 당의 생합성에 포함된 유전자들로는 UDP-글루코스 6-데히드로게나제 유전자, UDP-글루코스 피로포스포릴라제 유전자, UDP-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제 유전자, 글루코스-6-포스페이트 이소메라제 유전자, 헥소키나제 유전자, 포스포글루코뮤타제 유전자, 아미도트란스페라제 유전자, 뮤타제 유전자, 및 아세틸 트란스페라제 유전자가 있다.

히알루로난 합성효소를 함유하는 세포에서, hasB, hasC 및 hasD, 또는 그것들의 동족체, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) tuaD, gtaB, 및 gcaD 각각과, 또한 hasE의 둘 또는 그 이상의 어떠한 하나 또는 조합이 히알루로난 합성효소에 대해 활용할 수 있는 선구체 당의 풀(pool)을 증가시키기 위해 발현될 수 있다. 바실루스 서브틸리스 게놈에 대해서는 문헌에 소개되어 있다 (Kunst, et al., Nature 390, 249-256, "The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis", 20 November 1997). 어떤 경우에, 예컨대 숙주 세포가 천연 히알루로난 합성효소 활성을 갖지 않았을 경우, 구성물은 hasA 유전자를 포함할 것이다.

생합성 효소를 코드화하는 핵산 서열은 숙주 세포에 대하여 천연일 수 있지만, 다른 경우에는 이종성 서열이 활용될 수 있다. 만약 둘 또는 그 이상의 유전자가 발현될 수 있다면, 그것들은 천연 오페론에서 다른 것과 결합되어 있는 유전자, 예컨대 hasA, hasB, hasC 및 hasD를 포함하는 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스의 HAS 오페론의 유전자일 것이다. 다른 경우에 선구체 유전자 서열의 어떤 조합을 사용하는 것이 포함된 오페론의 각 요소가 없어도 바람직할 수 있다. 숙주 세포에 대해 천연인 어떤 유전자들의 사용, 및 외인성인 다른 유전자들의 사용은 또한 다른 경우에 바람직할 것이다. 선택은 주어진 숙주 세포에서 당의 활용가능한 풀, 세포가 숙주 세포의 다른 기능을 간섭함이 없이 과잉생성을 수용할 수 있는 능력, 및 세포가 외인성 유전자와는 다른 그것의 천연 유전자로부터의 발현을 조절하는지 아닌지에 따라 좌우될 것이다.

한 실례로서, 세포의 대사적 요구조건과 성장 조건, 및 활용할 수 있는 선구체 당 풀에 따라, UDP-N-아세틸-글루코사민 피로포스포릴라제, 예컨대 hasD 유전자, 바실루스 gcaD 유전자, 및 그것들의 동족체를 코드화하는 핵산 서열의 발현에 의해 N-아세틸-글루코사민의 생성을 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 또는 달리 선구체 당은 D-글루쿠론산일 수 있다. 그러한 한 구체예에서 핵산 서열은 UDP-글루코스 6-데히드로게나제를 코드화한다. 그러한 핵산 서열은 바실루스 tuaD 유전자, 스트렙토코쿠스의 hasB 유전자, 및 그것들의 동족체를 포함한다. 핵산 서열은 또한 예컨대 바실루스 gtaB 유전자, 스트렙토코쿠스의 hasC 유전자, 및 그것들의 동족체 에서와 같이 UDP-글루코스 피로포스포릴라제를 코드화할 수 있다. 본 발명의 방법에서, UDP-글루코스 6-데히드로게나제 유전자는 hasB 유전자 또는 tuaD 유전자; 또는 그것들의 동족체일 수 있다.

본 발명에서 히알루로난 합성효소 유전자와 선구체 당을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 유전자들은 동일한 프로모터의 제어하에 있다는 것이 명백하다. 또는 달리, 선구체 당을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 유전자들은 동일한 프로모터지만 히알루로난 합성효소 유전자를 구동하는 상이한 프로모터의 제어하에 있다. 추가로 다른 점은 히알루로난 합성효소 유전자와 선구체 당을 코드화하는 각각의 유전자가 상이한 프로모터의 제어하에 있는 것이다. 바람직한 구체예에서 히알루로난 합성효소 유전자 및 선구체 당을 코드화하는 하나 또는 그 이상의 유전자들은 동일한 프로모터의 제어하에 있다.

본 발명은 또한 히알루로난 합성효소 유전자와 UDP-글루코스 6-데히드로게나제 유전자, 및 임의로 UDP-글루코스 피로포스포릴라제 유전자, UDP-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제 유전자, 및 글루코스-6-포스페이트 이소메라제 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 히알루로난 합성효소 오페론을 코드화하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성물에 관한 것이다.

어떤 경우에 숙주 세포는 재조합 구성물로부터의 히알루로난 합성효소의 발현과 일치할 수 있는, 히알루로난의 선구체 당의 합성 경로의 한 단계를 지시하는 유전자를 코드화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 이종성 프로모터 영역을 포 함하는 재조합 구성물을 가질 것이다. 히알루로난 합성효소는 선구체의 생합성에 포함된 효소를 코드화하는 핵산 서열과 동일하거나 상이한 프로모터 영역으로부터 발현될 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 히알루로난의 선구체 당의 생합성에 포함된 두 번째 유전자를 코드화하는 상이한 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 영역을 포함하는 재조합 구성물을 가질 것이다.

선구체 당(들)의 생합성에 포함된 효소들을 코드화하는 핵산 서열은 히알루로난 합성효소를 코드화하는 핵산 서열과 동일하거나 상이한 프로모터로부터 발현될 수 있다. 전자의 경우 "인공 오페론"이 구성되는데, 그것은 각각의 hasA, hasB, hasC 및 hasD, 또는 그것들의 동족체를 가진다는 점에서 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스의 오페론을 모방할 수 있거나, 또는 달리, 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스 오페론에 존재하는 전체 상보물보다 덜 활용될 것이다. "인공 오페론"은 또한 헥소키나제 유전자, 포스포글루코뮤타제 유전자, 아미도트란스페라제 유전자, 뮤타제 유전자, 및 아세틸 트란스페라제 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자뿐만 아니라 글루코스-6-포스페이트 이소메라제 유전자 (hasE)를 포함할 수 있다. 인공 오페론에서, 최소한 하나의 요소는 요소들 중 다른 하나, 예컨대 코드화 서열에 대해 이종성인 프로모터 영역에 대해 이종성이다.

바람직한 구체예에서 핵산 구성물은 hasA, tuaD 및 gtaB를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서 핵산 구성물은 hasA, tuaD, gtaB 및 gcaD를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서 핵산 구성물은 hasA 및 tuaD를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서 핵산 구성물은 hasA를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 핵산 구성물은 hasA, tuaD, gtaB, gcaD, 및 hasE를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서 핵산 구성물은 hasA, hasB, hasC, 및 hasD를 포함한다. 또 다른 바람직한 ㄱ구체예에서 핵산 구성물은 hasA, hasB, hasC, hasD, 및 hasE를 포함한다. 이런 바람직한 구체예들을 토대로 주지된 유전자들은 그것들의 동족체를 대체할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 핵산 구성물은 히알루로난 합성효소를 코드화하는 서열에 외래인 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 히알루로난 합성효소 코드화 서열을 포함한다. 프로모터 서열은 예를 들면 단일 프로모터 또는 탠덤 프로모터일 수 있다.

"프로모터"는 본원에서 유전자의 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소의 결합에 포함된 핵산 서열로서 규정된다. "탠덤 프로모터"는 그 각각이 본원에서 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고 mRNA로 코딩서열이 전사되는 것을 중재하는 둘 또는 그 이상의 프로모터 서열로서 규정된다. "작동가능하게 연결된다"는 것은 본원에서 제어 서열, 예컨대 프로모터 서열이 제어 서열이 코딩 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드의 생성을 제어하도록 코딩 서열에 관련된 위치에 적절하게 자리잡고 있는 형태로서 규정된다. 앞에서 지적된 바와 같이, "코딩 서열"은 본원에서 적절한 제어 서열의 제어하에 놓여있을 때 mRNA로 전사되고 폴리펩티드로 번역되는 핵산 서열로서 규정된다. 코딩 서열의 경계선은 일반적으로 mRNA의 5' 단부에 있는 오픈 리딩 프레임의 바로 위쪽에 위치한 리보솜 결합 부위와 mRNA의 3' 단부에 있는 오픈 리딩 프레임이 바로 아래쪽에 위치한 전사 터미네이터 서열에 의해 결정된다. 코딩 서열은 게놈 DNA, cDNA, 반합성, 합성, 및 재조합 핵산 서열을 포함하지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 구체예에서, 프로모터 서열은 박테리아 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서 프로모터 서열은 바실루스 균주, 예컨대 바실루스 아가라드헤렌스(Bacillus agaradherens), 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 퍼뮤스(Bacillus firmus), 바실루스 라우투스(Bacillus lautus), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 메가테리윰(Bacillus megaterium), 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 스테아로써모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 또는 바실루스 튜링기엔시스(Bacillus thuringiensis), 또는 스트렙토마이세스 균주, 예컨대 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 또는 스트렙토마이세스 뮤리뉴스(Streptomyces murinus)와 같은 그람 양성 박테리아; 또는 예컨대 대장균(E. coli) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 그람 음성 박테리아로부터 얻어질 수 있다.

본 발명의 방법에서 핵산 서열의 전사를 지시하기에 적당한 프로모터의 실례로는 다음과 같은 것들로부터 얻어지는 프로모터들이 있다: 대장균 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) 아가라제 유전자 (dagA), 바실루스 렌투스 또는 바실루스 클라우시이 알칼린 프로테아제 유전자 (aprH), 바실 루스 리케니포르미스 알칼리성 프로테아제 유전자 (서브틸리신 칼스버그 유전자), 바실루스 서브틸리스 레반슈크라제 유전자 (sacB), 바실루스 서브틸리스 알파-아밀라제 유전자 (amyE), 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자 (amyL), 바실루스 스테아로써모필루스 말토제닉 아밀라제 유전자 (amyM), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 알파-아밀라제 유전자 (amyQ), 바실루스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자 (penP), 바실루스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 바실루스 튜링기엔시스 하위종인 테네브리오니스(tenebrionis) CryIIIA 유전자 (cryIIIA) 또는 그것들의 부분, 전핵 베타-락타마제 유전자 (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727-3731). 다른 실례는 spo1 박테리아 파지 프로모터와 tac 프로모터의 프로모터이다 (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25). 추가의 프로모터들은 문헌에 설명되어 있다 ("Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94; Sambrook, Fritsch, and Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York).

프로모터는 또한 "-35" 영역에 대한 서열 TTGACA와 "-10" 영역에 대한 TATAAT를 가지는 "일치" 프로모터일 수 있다. 일치 프로모터는 바실루스 숙주 세포에서 기능할 수 있는 모든 프로모터로부터 얻어질 수 있다. "일치" 프로모터의 구성은 바실루스 서브틸리스에 대한 성장력 있는 "시그마 A-형" 프로모터의 "10" 및 "-35" 영역에 대한 수립된 일치 서열로 보다 완벽하게 형태를 구성해가는 프로모터를 생성하기 위한 부위-특정 돌연변이생성에 의해 이루어질 수 있다 (Voskuil et al., 1995, Molecular Microbiology 17:271-279).

바람직한 구체예에서 "일치" 프로모터는 대장균 lac 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리컬러 아가라제 유전자 (dagA), 바실루스 클라우시이 또는 바실루스 렌투스 알칼리성 프로테아제 유전자 (aprH), 바실루스 리케니포르미스 알칼리성 프로테아제 유전자 (서브틸리신 칼스버그 유전자), 바실루스 서브틸리스 레반슈크라제 유전자 (sacB), 바실루스 서브틸리스 알파-아밀라제 유전자 (amyE), 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자 (amyL), 바실루스 스테아로써모필루스 말토제닉 아밀라제 유전자 (amyM), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 알파-아밀라제 유전자 (amyQ), 바실루스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자 (penP), 바실루스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 바실루스 튜링기엔시스 하위종 테네브리오니스 CryIIIA 유전자 (cryIIIA) 또는 그것의 일부, 또는 전핵 베타-락타마제 유전자 spo1 박테리아 파지 프로모터로부터 얻어지는 프로모터로부터 얻어진다. 보다 바람직한 구체예에서 "일치" 프로모터는 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 알파-아밀라제 유전자 (amyQ)로부터 얻어진다.

위드너 등은 미국 특허 6,255,076호 및 5,955,310호에서 짧은 일치 amyQ 프로모터 (또한 scBAN으로도 불림)를 포함하여, 바실루스 세포에서 발현에 사용하기 위한 탠덤 프로모터 및 구성물 및 방법을 설명하였다. 바실루스에서의 생성을 개선하기 위해 사용되는 cryIIIA 안정화제 서열, 및 서열을 사용한 구성물에 대해서도 역시 상기 문헌에 설명되어 있다.

탠덤 프로모터의 각 프로모터 서열은 돌연변이, 절단된, 및 하이브리드 프로 모터를 포함하여 선택된 바실루스 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떠한 핵산 서열일 수 있고, 바실루스 세포에 대해 동종성이거나 이종성인 세포외재성 또는 세포내재성 폴리펩티드를 코드화하는 유전자로부터 얻어질 수 있다. 각 프로모터 서열은 바실루스 세포에 대해 천연적이거나 외래적인 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열에 대해 천연이거나 외래적일 수 있다. 프로모터 서열은 동일한 프로모터 서열이거나 상이한 프로모터 서열일 수 있다.

탠덤 프로모터의 둘 또는 그 이상의 프로모터 서열은 동시에 핵산 서열의 전사를 촉진할 수 있다. 또는 달리 탠덤 프로모터의 하나 또는 그 이상의 프로모터 서열은 바실루스 세포의 상이한 성장 단계들에서 핵산 서열의 전사를 촉진할 수 있다.

바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 최소한 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 알파-아밀라제 유전자의 amyQ 프로모터를 함유한다. 다른 바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 최소한 "-35" 영역에 대해 서열 TTGACA 및 "-10" 영역에 대하여 TATAAT를 가지는 "일치" 프로모터를 함유한다. 다른 바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 최소한 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자의 amyL 프로모터를 함유한다. 다른 바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 최소한 cryIIIA 프로모터 또는 그것의 부분들을 함유한다 (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13:97-107).

보다 바람직한 구체예에서, 탠덤 프로모터는 최소한 amyL 프로모터와 cryIIIA 프로모터를 함유한다. 다른 보다 바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 최 소한 amyQ 프로모터와 cryIIIA 프로모터를 함유한다. 다른 보다 바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 최소한 "-35" 영역에 대해 서열 TTGACA 및 "-10" 영역에 대하여 TATAAT와 cryIIIA 프로모터를 가지는 "일치" 프로모터를 함유한다. 다른 보다 바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 최소한 2개의 복사물의 amyL 프로모터를 함유한다. 다른 보다 바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 최소한 2개의 복사물의 amyQ 프로모터를 함유한다. 다른 보다 바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 "-35" 영역에 대해 서열 TTGACA 및 "-10" 영역에 대하여 TATAAT를 가지는 "일치" 프로모터의 최소한 2개의 복사물을 함유한다. 다른 보다 바람직한 구체예에서 탠덤 프로모터는 최소한 2개의 복사물의 cryIIIA 프로모터를 함유한다.

"mRNA 프로세싱/안정화 서열"은 본원에서 하나 또는 그 이상의 프로모터 서열의 하류 및 코딩 서열의 상류에 위치하여 하나 또는 그 이상의 프로모터 서열의 각각이 작동가능하게 연결됨으로써 각 프로모터 서열로부터 합성된 모든 mRNA가 프로세싱되어 전사물의 5' 단부에 안정화 서열을 가지는 mRNA 전사물이 생성될 수 있는 서열로서 규정된다. mRNA 전사물의 5' 단부에 있는 그러한 안정화 서열의 존재는 그것들의 반감기를 증가시킨다 (Agaisse and Lereclus, 1994, 상기 동일, Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177:3465-3471). mRNA 프로세싱/안정화 서열은 박테리아의 16S 리보솜 RNA의 3' 말단에 상보한다. 바람직한 구체예에서 mRNA 프로세싱/안정화 서열은 전사물의 5' 단부에 안정화 서열을 가지고 있는 본질적으로 단일 크기의 전사물을 생성한다. mRNA 프로세싱/안정화 서열은 바람직하게는 박테리아의 16S 리보솜 RNA의 3' 말단에 상보하는 것이다 (미국 특허 6,255,076호 및 5,955,310호 참조).

보다 바람직한 구체예에서 mRNA 프로세싱/안정화 서열은 WO 94/25612 및 Agaisse and Lereclus, 1994, 상기 동일 문헌에서 개시된, mRNA 프로세싱/안정화 기능을 보유하는 바실루스 튜링기엔시스 cryIIIA mRNA 프로세싱/안정화 서열, 또는 그것의 일부이다. 다른 보다 바람직한 구체예에서 mRNA 프로세싱/안정화 서열은 Hue 등에 의해 개시된 (1995, 상기 동일), mRNA 프로세싱/안정화 기능을 보유하는 바실루스 서브틸리스 SP82 mRNA 프로세싱/안정화 서열 또는 그것의 일부이다.

cryIIIA 프로모터와 그것의 mRNA 프로세싱/안정화 서열이 본 발명의 방법에 사용될 때, 프로모터와 mRNA 프로세싱/안정화 기능을 보유하는, WO 94/25612 및 Agaisse and Lereclus, 1994, 상기 동일 문헌에서 개시된 서열, 또는 그것의 일부를 함유하고 있는 DNA 단편이 사용될 수 있다. 나아가 단지 cryIIIA 프로모터만을 또는 단지 cryIIIA mRNA 프로세싱/안정화 서열만을 함유하고 있는 DNA 단편은 당해 기술 분야에서 다양한 탠덤 프로모터와 mRNA 프로세싱/안정화 서열 조합을 구성하기 위해 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이런 구체예에서 cryIIIA 프로모터와 그것의 mRNA 프로세싱/안정화 서열은 바람직하게는 탠덤 프로머터를 구성하는 다른 프로모터 서열(들)의 위쪽에 위치하고 관심의 유전자의 코딩 서열의 아래쪽에 위치한다.

그런 다음 히알루론산 생성에 포함된 원하는 효소(들)을 코드화하는 분리된 핵산 서열이 핵산 서열의 발현을 개선하기 위해 추가로 조작될 수 있다. 발현은 폴리펩티드의 생성에 포함되는 어떠한 단계, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니 지만 전사, 후-전사 변형, 번역, 후-번역 변형, 및 분비 단계를 포함하는 것으로 인지될 것이다. 클로닝 방법을 활용하여 핵산 서열을 변형하기 위한 기법들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

효소를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성물은 제어 서열과 부합할 수 있는 조건 하에서 바실루스 세포에 있는 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 하나 또는 그 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

용어 "제어 서열"은 본원에서 핵산 서열의 코딩 서열의 발현에 필요하거나 유익한 모든 성분들을 포함하는 것으로 규정된다. 각각의 제어 서열은 효소를 코드화하는 핵산 서열에 대해 천연이거나 외래적일 수 있다. 상기에서 설명된 프로모터 서열 외에 그러한 제어 서열로는 리더 서열, 신호 서열, 및 전사 터미네이터 서열이 있으며, 그것들에 한정되지는 않는다. 최소한으로 제어 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 제어 서열에는 효소를 코드화하는 핵산 서열의 코딩 영역과의 제어 서열의 결찰을 촉진하는 특이한 제한 부위들을 도입할 목적으로 링커들이 제공될 수 있다.

제어 서열은 또한 전사를 종결짓기 위해 바실루스 세포에 의해 인지된 서열인 적당한 전사 터미네이터 서열일 수 있다. 터미네이터 서열은 오페론의 효소 또는 마지막 효소를 코드화하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 바실루스 세포에서 기능할 수 있는 터미네이터라면 어떤 것이라도 본 발명에 사용될 수 있다.

제어 서열은 또한 바실루스 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 미번역 영역 인 적당한 리더 서열일 수 있다. 리더 서열은 효소를 코드화하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택된 바실루스 세포에서 기능할 수 있는 것이라면 어떤 리더 서열이든지 본 발명에 사용될 수 있다.

제어 서열은 또한 세포의 분비 경로 안으로 발현된 폴리펩티드를 지시할 수 있는 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코드하는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다. 신호 펩티드 코딩 영역은 폴리펩티드에 천연적인 것이거나 외래 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 단부는 본래적으로 분비된 폴리펩티드를 코드화하는 코딩 영역의 절편과 번역 리딩 프레임에서 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 함유할 수 있다. 또는 달리, 코딩 서열의 5' 단부는 분비된 폴리펩티드를 코드화하는 코딩 서열의 그 부분에 대하여 외래적인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유할 수 있다. 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 코딩 서열이 신호 펩티드 코딩 영역을 정상적으로 함유하지 않는 경우 필요할 것이다. 또는 달리, 외래 신호 펩티드 코딩 영역은 코딩 서열과 정상적으로 결합된 천연 신호 펩티드 코딩 영역과 관련하여 폴리펩티드의 증강된 분비를 얻기 위하여 단순히 천연 신호 펩티드 코딩 영역을 대체할 수 있다. 신호 펩티드 코딩 영역은 아밀라제로부터 얻어질 수 있거나 바실루스 종으로부터의 프로테아제 유전자일 수 있다. 그러나 어떠한 신호 펩티드 코딩 영역이든지 선택된 바실루스 세포의 분비 경로에 발현된 폴리펩티드를 지시할 수 있다면 본 발명에 사용될 수 있다.

바실루스 세포에 대한 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 바실루스 NCIB 11837로부터의 말토제닉(maltogenic) 아밀라제 유전자, 바실루스 스테아로써모필루 스 알파-아밀라제 유전자, 바실루스 리케니포르미스 서브틸리신 유전자, 바실루스 리케니포르미스 베타-락타마제 유전자, 바실루스 스테아로써모필루스 중성 프로테아제 유전자 (nprT, nprS, nprM), 및 바실루스 서브틸리스 prsA 유전자로부터 얻어질 수 있는 신호 펩티드 코딩 영역이다. 추가의 신호 펩티드는 문헌에 설명되어 있다 (Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137).

제어 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열을 코드하는 프로펩티드 코딩 영역일 수 있다. 그 결과의 폴리펩티드는 프로효소 또는 프로폴리펩티드로서 (또는 어떤 경우에는 자이모겐) 알려져있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 비활성이며 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 코딩 영역은 바실루스 서브틸리스 알칼리성 프로테아제 (aprE) 및 바실루스 서브틸리스 중성 프로테아제 (nprT)에 대한 유전자로부터 얻어질 수 있다.

신호 펩티드 및 프로펩티드 영역 두 가지가 모두 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단 다음에 위치하고 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단 다음에 위치한다.

또한 숙주 세포의 성장과 관련하여 폴리펩티드의 발현의 조절을 가능하게 하는 조절 서열이 첨가되는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 조절 시스템의 실례는 화학적 또는 물리적 자극에 대한 반응으로 개시되거나 중지될 유전자의 발현을 유발하는 것들, 이를테면 조절 화합물의 존재를 들 수 있다. 전핵 시스템의 조절 시스템으로는 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터 시스템이 있다.

제조

본 발명의 방법에서, 숙주 세포는 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법들을 사용하여 히알루론산을 제조하기에 적당한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어 세포는 효소가 발현되어야 할 히알루론산 합성과 분리되어야 할 히알루론산에 포함되는 것을 가능하게 하는 적절한 배지에서 및 조건하에서 수행되는 실험실 또는 산업용 발효기에서 진동 플라스크 배양, 소규모 또는 대규모 발효 (연속식, 배치식, 공급-배치식, 또는 고체상 발효를 포함함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 과정들을 사용하여, 탄소 및 질소 공급원 및 무기 염을 포함하는 적당한 영양 배지 중에서 일어난다. 적당한 배지는 상업적인 공급업체로부터 이용가능하거나 공개된 조성에 따라 제조될 수 있다 (예컨대 American Type Culture Collection, ATCC의 카탈로그에서). 분비된 히알루론산은 배지로부터 직접 회수될 수 있다.

그 결과의 히알루론산은 당해 기술 분야에 공지되어 있는 방법들에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어 히알루론산은 종래 과정, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 또는 침전에 의해 영양 배지로부터 분리될 수 있다. 분리된 히알루론산은 그런 다음 추가로 당해 기술분야에 공지되어 있는 다양한 과정들, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 크로마토그래피 (예컨대 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 축출), 전기영동적 과정 (예컨대 제조용 등전점 포커싱), 차등적 용해도 (예컨대 암모늄 술페이트 침전), 또는 추출에 의해 정제될 수 있다 (예컨대 Protein Purification, J-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).

도 1은 본원에서 사용된 다양한 화합물의 구조적 형태를 도시한다.

도 2는 PLA 아실-클로라이드를 형성하기 위하여 티오닐 클로라이드와 폴리(락트산)이 반응하는 개략도를 도시한다.

도 3은 폴리(락트산)의 IR 스펙트럼을 도시한다.

도 4는 히알루론산 (양성자 형태)의 IR 스펙트럼을 도시한다.

도 5는 실시예 3의 HA-PLA의 최종 합성 생성물의 IR 스펙트럼을 도시한다.

도 6은 실시예 3의 HA-PLA의 최종 합성 생성물의 ¹³C 스펙트럼을 도시한다.

도 7은 실시예 4에서 개략적으로 설명된 바와 같은 HA-PLA-HA를 형성하기 위한 PLA 디-아실-클로라이드와 HA-TBA 반응의 개략도를 도시한다.

도 8은 실시예 4의 에탄올 세척물의 IR 스펙트럼과 존재하는 가능한 HA-PLA-HA를 도시한다.

도 9는 실시예 4의 아세톤-세척물의 IR 스펙트럼과 존재하는 가능한 HA-PLA-HA를 도시한다.

도 10은 실시예 4의 HA-CTA로부터의 최종 생성물인 HA-PLA-HA의 IR 스펙트럼을 도시한다.

도 11은 실시예 4의 HA-TBA로부터의 최종 생성물인 HA-PLA-HA의 IR 스펙트럼을 도시한다.

도 12는 실시예 5에서 합성된 HA-CTA의 IR 스펙트럼을 도시한다.

도 13은 잔여 CTA의 존재를 보여주는 스펙트럼인, 실시예 6의 최종 HA-PLA 생성물의 ¹H NMR을 도시한다.

도 14는 실시예 7의 투석 후의, 실시예 6의 최종 HA-PLA 생성물의 ¹H NMR을 도시한다.

"히알루론산"은 본원에서 교대로 베타-1,4 및 베타-1,3 글리코시드 결합에 의해 함께 연결되어 있는 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)과 글루쿠론산 (GlcUA)의 반복된 이당 단위로 구성된 술페이트화되지 않은 글리코사미노글리칸으로서 규정된다. 히알루론산은 또한 히알루로난, 히알루로네이트, 또는 HA로서도 알려져 있다. 용어 히알루로난과 히알루론산은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

수탉의 벼슬은 히알루로난에 대한 중요한 상업적 공급원이다. 또 다른 공급원은 미생물이다. 미국 특허 4,801,539호에는 스트렙토코쿠스 주오에피더미쿠스 균주를 포함하는 히알루론산의 제조를 위한 발효 방법이 개시되어 있는데, 보고된 수율은 리터 당 약 3.6g의 히알루론산이다. 유럽 특허 EP0694616호에는 스트렙토코쿠스 주오에피더미쿠스의 개량된 균주를 사용하는 발효 공정이 개시되어 있는데, 보고된 수율은 리터 당 약 3.5g의 히알루론산이다. WO 03/054163 (Novozymes)에 개시되어 있는 것과 같이 히알루론산 또는 그것의 염은 예컨대 그람-양성 바실루스 숙주에서 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.

히알루로난 합성효소는 척추동물, 박테리아 병원균, 및 해조류 바이러스로부터 설명되었다 (DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci. 56:670-682). WO 99/23227에는 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스로부터 얻어지는 그룹 I 히알루로네이트 합성효소가 개시되어 있다. WO 99/51265 및 WO 00/27437에는 파스퇴렐라 물토시다로부터의 그룹 II 히알루로네이트 합성효소가 설명되어 있다. 페레티 등은 스트렙토코쿠스 피오게네스의 히알루로난 합성효소 오페론을 개시하였는데, 그것은 각각 히알루로네이트 합성효소, UDP 글루코스 데히드로게나제, 및 UDP-글루코스 피로포스포릴라제를 코드화하는 세 개의 유전자, hasA, hasB, 및 hasC로 구성되어 있다 (Ferreti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 4658-4663, 2001). WO 99/51265에는 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스 히알루로난 합성효소에 대한 코딩 영역을 가지는 핵산 절편이 설명되어 있다.

재조합 바실루스 세포의 히알루로난은 배양 배지로 직접 발현되기 때문에, 간단한 과정을 사용하여 배양 배지로부터 히알루로난을 분리할 수 있다. 먼저 바실루스 세포와 세포 파편을 배양 배지로부터 물리적으로 제거한다. 배양 배지는 필요에 따라 배지의 점성을 감소시키기 위하여 먼저 희석될 수 있다. 배양 배지로부터 세포를 제거하기 위한 많은 방법들, 예컨대 원심분리 또는 미소여과 과정이 당업자들에게 공지되어 있다. 그런 다음 필요에 따라, 남아있는 상층액이 여과, 예컨대 한외여과에 의해 여과되어서 히알루로난으로부터 작은 분자의 오염물질이 농축되어 제거된다. 세포와 세포 파편이 제거된 후, 배지로부터 히알루로난의 간단한 침전이 공지된 메커니즘에 의해 수행된다. 염, 알코올, 또는 염과 알코올의 조합물이 여과물로부터 히알루로난을 침전시키기 위해 사용될 수 있다. 일단 침전으로 환원되면, 히알루로난은 물리적 수단에 의해 용액으로부터 쉽게 분리될 수 있다. 히알루로난은 당해 기술분야에 공지되어 있는 증발 기법, 예컨대 동결건조법 또는 분무 건조법을 사용함으로서 여과물 용액으로부터 건조되거나 농축될 수 있다.

본 발명의 첫 번째 측면은 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물에 관한 것으로, 여기서 히알루론산은 부분적으로 또는 전체적으로 알파 히드록시산, 바람직하게는 폴리(락트산), 또는 폴리락타이드의 중합체와, 어떠한 락트산-기제 중합체, 스테레오공중합체 및 공중합체, 특히 글리콜산과의 공중합체, 및 또한 다른 공중합체, 예컨대 ε-카프로락톤을 통하여 히드록시카프로산, 글루콘산 및 화학적으로 변형된 글루콘산, 말산과의 공중합체, 수상에 녹을 수 있고 신장 여과에 의해 제거될 수 있는 분해 부산물로 유도될 수 있는 저분자량 절편, 예컨대 저분자량 폴리(에틸렌 글리콜)과의 공중합체와 연결되거나 교차결합되며, 이때 그것들은 사슬 단부에 하나 또는 두 개의 카르복실기를 포함하여야 하고, 단일 산의 경우 소수성을 제공할 수 있어야 한다.

숙주 세포

바람직한 구체예는 첫 번째 측면의 생성물에 관한 것으로, 이때 히알루론산 또는 그것의 염은 재조합 방법에 의해 생성되며, 바람직하게는 그람-양성 박테리아 또는 숙주 세포에 의해, 보다 바람직하게는 바실루스 속의 박테리아에 의해 생성된다.

숙주 세포는 히알루론산의 재조합 생성에 적당한 모든 바실루스 세포일 수 있다. 바실루스 숙주 세포는 야생형 바실루스 세포 또는 그것의 돌연변이일 수 있다. 본 발명의 실시예 유용한 바실루스 세포로는 그것들에 한정되지는 않지만, 바실루스 아가라데르헨스, 바실루스 알칼로필루스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, 바실루스 브레비스, 바실루스 서큘란스, 바실루스 클라우시이, 바실루스 코아귤란스, 바실루스 퍼무스, 바실루스 라우투스, 바실루스 렌투스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 메가테리움, 바실루스 푸밀루스, 바실루스 스테라오써모필루스, 바실루스 서브틸리스, 및 바실루스 튜링기엔시스 세포가 있다. 재조합 발현에 특히 적용되는 돌연변이 바실루스 서브틸리스 세포가 WO 98/22598에 설명되어 있다. 비-캡슐화 바실루스 세포도 본 발명에 특히 유용하다.

바람직한 구체예에서 바실루스 숙주 세포는 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, 바실루스 클라우시이, 바실루스 렌투스, 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 스테아로써모필루스 또는 바실루스 서브틸리스 세포이다. 보다 바람직한 구체예에서 바실루스 세포는 바실루스 아밀로리퀘파시엔스 세포이다. 다른 보다 바람직한 구체예에서 바실루스 세포는 바실루스 클라우시이 세포이다. 다른 보다 바람직한 구체예에서 바실루스 세포는 바실루스 렌투스 세포이다. 또 다른 보다 바람직한 구체예에서 바실루스 세포는 바실루스 리케니포르미스 세포이다. 또 다른 보다 바람직한 구체예에서 바실루스 세포는 바실루스 서브틸리스 세포이다. 가장 바람직한 구체예에서 바실루스 숙주 세포는 바실루스 서브틸리스 A164△5 (미국 특허 5,891,701호) 또는 바실루스 서브틸리스 168△4이다.

본 발명의 핵산 구성물을 포함하는 바실루스 숙주 세포의 형질전환은 예를 들면 원형질 형질전환에 의해 (Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115), 경합 세포를 사용함으로써 (Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829, 또는 Debnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221), 일렉트로포레이션에 의해 (Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751), 또는 콘쥬게이션에 의해 (Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5271-5278) 이루어질 수 있다.

분자량

히알루론산의 수준은 변형된 카르바졸 방법에 따라 측정될 수 있다 (Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4:330-334). 더욱이 히알루론산의 평균 분자량은 당해 기술 분야의 표준 방법, 예컨대 문헌에 소개되어 있는 것들을 사용하여 측정될 수 있다 (Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta. 272:1-40; Wyatt Technologies, 1999, "Light Scattering University DAWN Course Manual" and "DAWN EOS Manual" Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California).

바람직한 구체예에서 본 발명의 방법에 의해 얻어진 히알루론산은 약 10,000 내지 약 10,000,000 달톤의 분자량을 갖는다. 보다 바람직한 구체예에서 본 발명의 방법에 의해 얻어진 히알루론산은 약 25,000 내지 약 5,000,000 달톤의 분자량을 갖는다. 가장 바람직한 구체예에서 본 발명의 방법에 의해 얻어진 히알루론산은 약 50,000 내지 약 3,000,000 달톤의 분자량을 갖는다.

바람직한 구체예는 첫 번째 측면의 생성물에 관한 것으로, 이때 히알루론산 또는 그것의 염은 300,000과 3,000,000 사이의 범위; 바람직하게는 400,000과 2,500,000 사이의 범위; 보다 바람직하게는 500,000과 2,000,000 사이의 범위; 가장 바람직하게는 600,000과 1,800,000 사이의 범위에 있는 분자량을 갖는다.

염 및 교차결합된 HA

바람직한 구체예는 첫 번째 측면의 생성물과 관려이 있는데, 그것은 히알루론산의 무기염, 바람직하게는 나트륨 히알루로네이트, 칼륨 히알루로네이트, 암모늄 히알루로네이트, 칼슘 히알루로네이트, 마그네슘 히알루로네이트, 아연 히알루로네이트, 또는 코발트 히알루로네이트를 포함한다.

하기의 실시예에서 나트륨 히알루로네이트와 폴리(락트산) 모노- 또는 디-아실 클로라이드와의 반응은 연결된 또는 교차결합된 HA-PLA 또는 HA-PLA-HA 생성물을 초래하고, 그것은 IR 스펙트럼 상에서 1736cm-1에서 HA-PLA 생성물을 형성하기 위해 HA에 대해 새롭게 연결된 폴리(락트산) 절편의 존재에 상응하는, 미처리된 HA 또는 PLA의 표준 스펙트럼에 비교할 때 강력해진 피크를 나타낸다.

따라서 바람직한 구체예는 첫 번째 측면의 생성물에 관한 것으로서, 교차결합된 히알루론산 또는 그것의 염은 중합된 알파 히드록시산, 바람직하게는 폴리(락트산), 또는 폴리락타이드의 중합체와, 어떠한 락트산-기제 중합체, 스테레오공중합체 및 공중합체, 특히 글리콜산과의 공중합체, 및 또한 다른 공중합체, 예컨대 ε-카프로락톤을 경유한 히드록시 카프로산, 글루콘산 및 화학적으로 변형된 글루콘산, 말산과의 공중합체, 수상에 녹을 수 있고 신장 여과에 의해 제거될 수 있는 분해 부산물로 유도될 수 있는 저분자량 절편, 예컨대 저분자량 폴리(에틸렌 글리콜)과의 공중합체의 에스테르를 포함하며, 이때 그것들은 사슬 단부에 하나 또는 두 개의 카르복실기를 포함하여야 하고, 단일 산의 경우 소수성을 제공할 수 있어야 한다.

수분의 측정

본 발명에 따르는 건조된 생성물 분말의 수분 함량은 102℃±2℃에서 분말을 일정한 중량으로 건조시킨 후에, 백분율로서 표시되는, 중량의 손실이다. 그라운드 뚜껑이 달린 비어 있는 중량 측정용 유리 접시를 오븐에서 건조한 후, 냉각하고 민감도가 최소한 0.1mg인 분석용 저울에서 무게를 잰다. 대략 3g의 건조된 생성물 분말이 접시에 올려지고 무게가 측정된다. 분말이 담긴 접시를 오븐에 넣고 2시간 동안 102℃±2℃에서 건조시킨 후 건조기에 넣고 실온으로 냉각시킨 후 다시 무게를 측정한다. 분말이 담긴 접시를 뚜껑 없이 오븐에 넣어 1시간 이상 건조시킨 후, 냉각하고 이미 설명한 것처럼 무게를 측정하며, 이것을 무게가 일정하게 될 때까지, 즉 2회의 연속적인 무게 측정이 0.5mg 이상 다르지 않을 때까지 반복한다.

수분의 백분율을 다음 식에 따라 계산한다: (W2-W3)/(W2-W1)×100, 여기서 W1은 빈 접시의 무게이고, W2는 분말이 담긴 접시의 무게이며, W3은 건조된 분말이 담긴 접시의 무게이다. 그 결과를 소숫점 2자리까지 계산하고, 이 방법의 재현율은 약 ±0.1%이다.

바람직한 구체예에서 첫 번째 측면의 생성물은 건조되고 본원에서 측정되는 바와 같이, 5% 미만, 바람직하게는 2% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만의 수분을 포함한다.

기타 성분들

바람직한 구체예에서, 본 발명의 생성물은 또한 다른 성분들, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 활성 성분, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 약리학적으로 활성인 물질, 및 또한 바람직하게는 수용성 부형제, 예컨대 락토스를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 활성 성분 또는 약리학적으로 활성 물질의 비-제한적인 실례는 단백질 및/또는 펩티드 약물, 예컨대 사람 성장 호르몬, 소의 성장 호르몬, 돼지의 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬/펩티드, 과립구-콜로니 자극 인자, 대식세포-콜로니 자극 인자, 에리트로포이에틴, 뻐 모르포겐성 단백질, 인터페론 또는 그것의 유도체, 인슐린 또는 그것의 유도체, 아트리오펩틴-III, 단클론성 항체, 종양 괴사 인자, 대식세포 활성화 인자, 인터류킨, 종양 퇴행 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 상피 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 인자 IIV, 인자 IIIV, 및 유로키나제를 들 수 있다.

수용성 부형제는 활성 성분(들)을 안정화할 목적으로 포함될 수 있으며, 그러한 부형제로는 단백질, 예컨대 알부민 또는 젤라틴; 아미노산, 예컨대 글리신, 알라닌, 글루탐산, 아르기닌, 라이신 및 그것의 염; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 락토스, 크실로스, 갈락토스, 프룩토스, 말토스, 사카로스, 덱스트란, 만니톨, 소르비톨, 트레할로스 및 콘드로이틴 술페이트; 무기염, 예컨대 포스페이트; 계면활성제, 예컨대 TWEEN® (ICI), 폴리에틸렌 글리콜, 및 그것들의 혼합물이 있다. 부형제 또는 안정화제는 생성물의 0.001 내지 99중량%의 범위의 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 여러 측면은 다양한 조성물 및 다른 구성성분들 중에서도 첫 번째측면에서 규정된 바와 같은 생성물의 유효량, 활성 성분 (바람직하게는 활성 성분은 약리학적으로 활성인 제제이다), 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제, 바람직하게는 수용성 부형제, 및 가장 바람직하게는 락토스를 포함하는 약제학적 조성물에 관련된다.

또한 본 발명의 측면들은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물을 포함하는 물품 또는 상기의 측면들 및 구체예들에서 규정된 바와 같은 조성물, 예컨대 화장용품, 위생용 물품, 의료용 또는 수술용 물품들에 관련된다. 최종 측면으로 본 발명은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물 또는 본 발명의 다른 측면들 및 구체예들에서 규정된 바와 같은 조성물을 포함하는 의약 캡슐 또는 마이크로캡슐에 관련된다.

제조 방법

본 발명은 다른 측면으로 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물의 제조 방법에 관한 것으로, 이때 히알루론산은 부분적으로 또는 전체적으로 알파 히드록시산, 바람직하게는 폴리(락트산), 또는 폴리락타이드의 중합체와, 어떠한 락트산-기제 중합체, 스테레오공중합체 및 공중합체, 특히 글리콜산과의 공중합체, 및 또한 다른 공중합체, 예컨대 ε-카프로락톤을 경유한 히드록시 카프로산, 글루콘산 및 화학적으로 변형된 글루콘산, 말산과의 공중합체, 수상에 녹을 수 있고 신장 여과에 의해 제거될 수 있는 분해 부산물로 유도될 수 있는 저분자량 절편, 예컨대 저분자량 폴리(에틸렌 글리콜)과의 공중합체와 연결되거나 교차결합되며, 이때 그것들은 사슬 단부에 하나 또는 두 개의 카르복실기를 포함하여야 하고, 단일 산의 경우 소수성을 제공할 수 있어야 하며, 상기 방법은

생성물 또는 조성물의 사용 방법

본 발명의 다양한 측면은 예컨대 의료 분야에서 첫 번째 측면의 생성물을 사용하여, 또는 본 발명의 조성물을 사용하여 치료 과정을 수행하는 방법에 관련된다.

한 측면은 안과학에서 과정을 수행하는 방법에 관련되는데, 그것은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물 또는 본 발명의 조성물을 사용하는 것을 포함한다.

다른 측면은 골관절염의 치료시 과정을 수행하는 방법에 관련되는데, 그것은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물 또는 본 발명의 조성물을 사용하는 것을 포함한다.

또 다른 측면은 암의 치료시 과정을 수행하는 방법에 관련되는데, 그것은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물 또는 본 발명의 조성물을 사용하는 것을 포함한다.

한 측면은 약리학적으로 활성인 제제의 경피 또는 피부 투여를 수행하는 방법에 관련되는데, 그것은 첫 번째 측면에서 규정된 바와 같은 생성물 또는 본 발명의 조성물을 사용하는 것을 포함한다.

또 다른 측면은 화장품의 피부 투여를 수행하는 방법에 관련되는데, 그것은 본 발명의 생성물 또는 조성물을 사용하는 것을 포함한다.

많은 화학적 약어는 도 1의 구조적 형태에서 도시되는 것과 같다. 예를 들어 테트라부틸 암모늄 (TBA), 세틸트리메틸 암모늄 (CTA), 히알루론산 (HA), 및 폴리(락트산)(PLA)이다.

실시예 1. DMSO 및 SOCl ₂ 증류

DMSO 증류

1.5l 의 DMSO를 2000ml의 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 자기 교반을 하면서 소량의 P₂O₅를 DMSO에 첨가하여 물을 제거하였다. 그런 다음 플라스크를 진공 증류에 대해 설정하고 축합기를 하나의 100ml 플라스크와 두 개의 1000ml 플라스크가 달려 있는 회전가능한 다중-수용기 어댑터에 맞추어서, 증류를 방해함이 없이 3개의 분획이 개별적으로 수집되도록 하였다.

플라스크를 약 75℃로 진공하에 가열하여 증류하였다. 첫 번째 작은 분획을 100ml의 둥근 바닥 플라스크에 수집하고 나중에 버렸다. 증류된 DMSO를 최종적으로 수집하였다. 칼럼의 상부의 온도는 42℃였고 진공은 2mbar였다. 초고순도의 상업용 DMSO를 증류 없이 사용하였다.

SOCl ₂ 증류

300ml의 티오닐 클로라이드, SOCl₂를 500ml의 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 자기 교반을 하면서 50ml의 트리페닐포스파이트를 한 방울씩 첨가함으로써 염소와 황을 포획하였다. 첨가하는 동안 그것이 매우 발열성이기 때문에 온도를 제어하는 것이 중요하다.

모든 트리페닐포스파이트가 첨가되었을 때 플라스크를 증류에 대해 설정하고 축합기를 50ml, 100ml, 및 250ml 플라스크가 달려 있는 회전가능한 다중-수용기 어댑터에 맞추어서, 증류를 방해함이 없이 3개의 분획이 개별적으로 수집되도록 하였다. 전체 셋업을 알루미늄 쉬트로 싸서 증류된 SOCl₂를 빛으로부터 보호하였다. 염화칼슘 트랩을 또한 증류 셋업에 고정시켜서 물로부터 보호하였다. 그런 다음 플라스크를 105℃까지 가열하여 생성물을 증류하였고; 칼럼의 상부 온도는 72℃였다.

실시예 2. PLA 아실-클로라이드의 제조

반응 개략도는 도 2에 도시되어 있다. 2.4454g의 PLA를 새롭게 증류된 SOCl₂에 녹여 자기 교반되고 있는 250ml의 둥근 바닥 플라스크에 넣고, 그것을 계속해서 환류에 대해 설정하고 CaCl₂ 트랩에 의해 물로부터 보호하였다. 플라스크를 환류 온도 (약 80℃)로 3시간 동안 가열하였다.

반응이 종료되었을 때 과잉의 SOCl₂를 60℃에서 진공하에 증류하였다. 모든 SOCl₂를 제거하기 위하여 남아있는 생성물을 톨루엔에 녹이고 그 용액을 80℃에서 진공하에 다시 증류하여 용매를 제거하였다. 이 단계를 3회 반복하였다.

실시예 3. HA - PLA 합성

CTA 염-형태 (HA-TCA)의 히알루론산과 폴리(락트산) 모노-아실 클로라이드 (PLA-COCl)를 HA-PLA에 대한 PLA-COCl의 몰비가 2:1이 되도록 하여 반응시켰다.

50ml의 DMSO에 녹인 2.03g의 PLA-COCl을 70ml의 DMSO중의 0.512g의 HA-CTA의 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 첨가 후에 용액을 실온에서 밤새 혼합하였다. 회전증발기를 사용하여 DMSO를 제거하고, 용액을 고체 생성물이 얻어질 때까지 농축하였다. 생성물을 계속해서 에탄올과 아세톤으로 세척하였다. 최종 생성물은 물에는 녹지 않았지만 DMSO에서는 팽창하였다.

최종 생성물 (KBr 디스크)의 IR 스펙트럼은 도 5에 도시한다. 그것은 C=O 결합에 상응하는 1735cm-1에서의 피크를 제외하면 HA-H의 스펙트럼 (도 4에 도시됨)과 유사하게 보인다. 그러나 이 피크의 세기가 더 크며, 그것은 폴리(락트산)에 기인한다. PLA의 IR 스펙트럼은 도 3에 도시된다.

¹³C NMR은 최종 생성물의 특성확인에 대해 더 효과적인 방법으로 보이는데, 그 이유는 HA의 ¹³C NMR 스펙트럼에 있는 모든 피크가 다음과 같이 분명하게 확인되기 때문이다; D-글루쿠론산의 탄소 원자는 "U"로 표시하며, N-아세틸-D-글루코사민산의 탄소 원자들은 "N"으로 표시한다:

U6 → 174ppm N7 → 175ppm

U1 → 100 또는 104ppm N1 → 100 또는 104ppm

N8 → 22ppm

U2,3,4,5 → 83ppm에서 54 N3,4,5 → 83ppm에서 54

N2 → 54.5ppm

N6 → 60.5ppm

최종 생성물의 ¹³C NMR 스펙트럼 (도 6)은 HA, PLA의 모든 피크 (16, 57 및 170ppm), 및 세틸암모늄 (CTA) 반대-이온 (13,29, 52ppm)을 보여준다.

생성물을 고화하기 위해 DMSO를 증발시킴으로써 PLA와 HA가 점차적으로 함께 한 공간에 있게 되고, 그것은 다시 보다 좋은 결합 반응으로 이어질 수 있다. HA와 PLA의 사슬 길이의 차이는 반응의 치환 비율에 영향을 줄 수 있다.

실시예 4. HA - PLA - HA 합성

DMSO중의 PLA 디-아실 클로라이드를 HA (TBA 또는 CTA 형태)와 상기에서 설명한 바와 같이 실온에서 하룻밤 동안 혼합하였다. 그런 다음 그 용액을 농축하고 생성물을 에탄올 중에서의 침전에 의해 정제한 후 마지막으로 아세톤으로 세척하였다. 최종 생성물은 물에 녹지 않았다.

이들 두 용매에 의해 제거된 생성물을 IR 스펙트럼에 의해 분석하였고, 도 8과 9에 도시된 바와 같다. 두 개의 스펙트럼은 PLA와 HA에 모두 특징적인 피크를 나타낸다. 본 발명자들은 세척으로 HA에 연결된 일부 PLA가 제거되었다고 추정하였다.

HA-CTA 및 HA-TBA로부터의 최종 생성물의 IR 스펙트럼 (도 10 및 11)은 또한 PLA의 C=O 결합에 상응하는 1736cm^-1에서의 피크를 제외하면 HA-H의 스펙트럼과 유사하게 보인다.

실시예 5. HA - CTA 합성

세틸트리메틸암모늄 브로마이드의 따뜻한 용액 (40℃)을 0.155g의 HA-Na의 따뜻한 용액 (40℃)에 한 방울씩 첨가하였다. 백색 침전을 여과하고, 따뜻한 물로 세척하여 NaBr과 과량의 세틸암모늄 브로마이드를 제거하고 동결건조하였다.

DMSO에 녹을 수 있는 최종 생성물의 IR 스펙트럼 (도 12)은 CTA의 존재를 나타낸다.

실시예 6. 1:1 몰비의 HA - PLA 의 합성

전형적으로, 0.64g의 활성화된 락트산 올리고머를 DMSO중의 1g의 HA-CTA와 실온에서 밤새 혼합하였다. DMSO를 제거하고 형성된 침전물을 에테르로 2회, 에탄올로 3회, 그리고 아세톤으로 2회 세척하였다. 회수한 생성물을 최종적으로 밤새 진공하에서 건조하였다. 최종 생성물의 ¹H NMR (도 13)은 나머지 CTA의 존재를 나타낸다.

실시예 7. HA - PLA 투석

나머지 CTA를 포함한 HA-PLA를 2/1 몰비로 DMSO와 혼합된 인산염 완충액 (pH=7.4 및 농도=0.5M)에 녹였다. 이 용액을 물, DMSO, 에탄올 및 물에 대하여 연속적으로 투석하였다 (컷-오프 = 6000-8000). 이 처리 후 용액을 냉동-건조하고, 최종 화합물을 NMR에 의해 분석하였다 (도 14).

실시예 8. HA - PLA 블랭크 시험

SOCl₂를 사용한 올리고머의 어떠한 사전 활성화 없이 HA와 PLA를 반응시킴으로써 블랭크 시험을 수행하였다. 20ml의 DMSO중에 271mg의 OLA를 함유하는 용액을 40ml의 DMSO중에 211mg의 HA를 함유하는 용액에 한 방울씩 첨가하였다. 이 용액을 3시간 동안 실온에서 교반하고 DMSO를 증발에 의해 제거하였다. 밝은 황색의 고체가 얻어졌다. 이 고체를 DMSO에 밤새 녹였다. 침전이 나타났다. 이 불용성 침전을 용액으로부터 분리하여 아세톤으로 세척하였다. 얻어진 백색 고체를 건조시키고 NMR에 의해 분석하였다.

아세톤을 남아있는 용액에 서서히 첨가하여 신규한 침전을 생성하였다. 이 침전을 수집하고, 건조시킨 후 또한 NMR에 의해 분석하였다. NMR 스펙트럼에서는 PLA의 피크를 볼 수 없었다.

이것은 티오닐 클로라이드에 의한 PLA의 활성화가 사용될 때 PLA가 HA에 화학적으로 결합된다는 것을 확증한다.

Claims

히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물로서, 히알루론산 또는 그것의 염이 알파 히드록시산, 바람직하게는 폴리(락트산)의 중합체와 부분적으로 또는 전체적으로 연결되거나 교차결합되는 것을 특징으로 하는 생성물.
제 1 항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그것의 염이 재조합 방법에 의하여, 바람직하게는 그람-양성 박테리아에 의해, 보다 바람직하게는 바실루스 속의 박테리아에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 생성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그것의 염이 300,000과 3,000,000 사이의 범위; 바람직하게는 400,000과 2,500,000 사이의 범위; 보다 바람직하게는 500,000과 2,000,000 사이의 범위; 가장 바람직하게는 600,000과 1,800,000 사이의 범위에 있는 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 생성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 히알루론산의 무기 염, 바람직하게는 나트륨 히알루로네이트, 칼륨 히알루로네이트, 암모늄 히알루로네이트, 칼슘 히알루로네이트, 마그네슘 히알루로네이트, 아연 히알루로네이트, 또는 코발트 히알루로네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결된 또는 교차결합된 히알루론산 또는 그것의 염이 중합체 알파 히드록시산, 바람직하게는 폴리(락트산)의 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
제 1항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 건조되고, 본원에서 측정되는 바 5% 미만의 수분, 바람직하게는 2% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만의 수분을 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 또한 활성 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
제 7항에 있어서, 상기 활성 성분이 약리학적으로 활성인 물질인 것을 특징으로 하는 생성물.
제 1항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 또한 수용성 부형제, 바람직하게는 락토스를 포함하는 것을 특징으로 하는 생성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물과 활성 성분을 포함하는 조성물로서, 상기 활성 성분이 바람직하게는 약리학적으로 활성인 제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 조성물이 또한 수용성 부형제, 바람직하게는 락토스를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물의 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물의 유효량을 비히클로서, 약리학적 활성 제제와 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물의 유효량을 활성 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 화장품.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물을 포함하는 위생용품, 의료용 또는 수술용 물품으로서, 상기 물품은 수술용 스폰지, 상처 치유용 스폰지, 또는 반창고나 다른 상처 드레싱 재료에 포함된 일부분인 것을 특징으로 하는 물품.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 의약 캡슐 또는 마이크로캡슐.
히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물의 제조 방법으로서,

상기 히알루론산은 알파 히드록시산, 바람직하게는 폴리(락트산)의 중합체와 부분적으로 또는 전체적으로 연결되거나 교차결합되고, 상기 방법이

a) 히알루론산 또는 그것의 염을 알파 히드록시산의 중합체의 모노-아실 클로라이드 또는 디-아실 클로라이드와 함께 유기 용매, 바람직하게는 DMSO 중에서 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그것의 염이 재조합 방법에 의하여, 바람직하게는 그람-양성 박테리아에 의해, 보다 바람직하게는 바실루스 속의 박테리아에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 그것의 염이 300,000과 3,000,000 사이의 범위; 바람직하게는 400,000과 2,500,000 사이의 범위; 보다 바람직하게는 500,000과 2,000,000 사이의 범위; 가장 바람직하게는 600,000과 1,800,000 사이의 범위에 있는 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생성물이 히알루론산 의 무기 염, 바람직하게는 나트륨 히알루로네이트, 칼륨 히알루로네이트, 암모늄 히알루로네이트, 칼슘 히알루로네이트, 마그네슘 히알루로네이트, 아연 히알루로네이트, 또는 코발트 히알루로네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결된 또는 교차결합된 히알루론산 또는 그것의 염이 중합체 알파 히드록시산, 바람직하게는 폴리(락트산)의 에스테르를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
안과학에서 과정을 수행하는 방법으로서, 그 방법은 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물, 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 사용을 포함하는 것이 개선된 것임을 특징으로 하는 방법.
골관절염을 치료하는 과정을 수행하는 방법으로서, 그 방법은 제 1항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물, 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 사용을 포함하는 것이 개선된 것임을 특징으로 하는 방법.
암을 치료하는 과정을 수행하는 방법으로서, 그 방법은 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물, 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어 느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 사용을 포함하는 것이 개선된 것임을 특징으로 하는 방법.
약리학적으로 활성 제제를 경피적으로 투여하는 과정을 수행하는 방법으로서, 그 방법은 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물, 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 사용을 포함하는 것이 개선된 것임을 특징으로 하는 방법.
약리학적으로 활성인 제제를 피부에 투여하는 과정을 수행하는 방법으로서, 그 방법은 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물, 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 사용을 포함하는 것이 개선된 것임을 특징으로 하는 방법.
화장품을 피부에 투여하는 과정을 수행하는 방법으로서, 그 방법은 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물, 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 사용을 포함하는 것이 개선된 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물, 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물을 사용하는 것을 특징으로 하는 안과학적 방법.
골관절염의 치료 방법으로서, 상기 방법이 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물, 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 유효량을 포유류에게 투여하는 것으로 이루어지며, 바람직하게는 투여가 피부에, 경피적으로, 경구로 또는 주사에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
상처를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물, 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 유효량을 포유류에게 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
골관절염의 치료를 위한 의약의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 용도.
안과학 치료를 위한 의약의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 용도.
암의 치료를 위한 의약의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 용도.
상처의 치료를 위한 의약의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물 또는 제 10항 내지 13항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 용도.
혈관형성을 위한 의약의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 용도.
보습제의 제조를 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 규정된 것과 같은 생성물 또는 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에서 규정된 것과 같은 조성물의 용도.