CN101133102A - 与α-羟酸的聚合物连接的透明质酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含透明质酸或其盐的产品，其中已将所述透明质酸与α－羟酸的聚合物部分或全部连接或交联。本发明还涉及该产品的制造、本发明所述产品在以下领域中的用途：用于制备卫生和外科物品的生物可降解塑性材料领域，制药和化妆品领域；包括在这些领域中用该产品制造的多种物品。
Description
发明领域
本发明涉及包含透明质酸或其盐的产品，其中已将所述透明质酸与α-羟酸的聚合物部分或全部连接或交联。本发明还涉及该产品的制备、本发明所述产品在以下领域中的用途：用于制备卫生和外科物品的生物可降解塑性材料领域，制药和化妆品领域；包括在这些领域中用所述产品制备的多种物品。
背景
人体最丰富的杂多糖是糖胺聚糖(glycosaminoglycan)。糖胺聚糖是无支链的糖聚合物，由重复的二糖单元组成(仅硫酸角质素在糖的核心区是分支的)。所述二糖单元通常包含两种修饰的糖-N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)之一，作为第一糖单元。另一单元通常是糖醛酸，例如葡糖醛酸(GlcUA)或艾杜糖醛酸(iduronate)。
糖胺聚糖是负电分子，并且在溶液中(in solution)具有赋予高粘性的延伸构象。糖胺聚糖主要位于细胞表面上或胞外基质中。糖胺聚糖在溶液中还具有低压缩性，并因此是理想的生理润滑液体，例如关节(joint)。糖胺聚糖的刚性为细胞提供结构的整体性并且提供细胞之间允许细胞迁移的通道。具有最高生理重要性的糖胺聚糖是乙酰透明质酸(hyaluronan)、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素和硫酸角质素。多数糖胺聚糖通过特异的寡糖结构共价结合至蛋白聚糖核心蛋白。乙酰透明质酸与某些蛋白聚糖形成大聚集体(large aggregate)，但例外是游离糖链与蛋白聚糖形成非共价复合体。
已鉴定乙酰透明质酸在人体中的许多功能(参见，Laurent T.C.and FraserJ.R.E.，1992，FASEB J.6：2397-2404；和Toole B.P.，1991，“Proteoglycans andhyaluronan in morphogenesis and differentiation.”In：Cell Biology of theExtracellular Matrix，pp.305-341，Hay E.D.，ed.，Plenum，New York)。乙酰透明质酸存在于透明软骨、滑膜关节液(synovial joint fluid)以及真皮和表皮皮肤组织中。还猜测乙酰透明质酸在许多生理功能中具有作用，例如粘附、发育、细胞运动性、癌、血管发生和愈伤。由于乙酰透明质酸独特的物理和生物特性，将其使用在眼和关节外科中，并且正在其它医学方法中对其进行评估。
术语“透明质酸”用于文献中的意思是具有不同分子量的酸性多糖，其由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺的残基构成，其天然存在于细胞表面、脊椎动物结缔组织的基本胞外物质、关节的滑液、眼内球液(endobulbar fluid)、人脐带组织和鸡冠(cocks’comb)中。
术语“透明质酸”事实上通常用来指具有不同分子量的带有交替D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺残基的全系列多糖，或甚至其降解的级分，并且因此看上去使用复数术语“透明质酸”更加正确。然而该单数术语将仍然用在本说明书中；另外，将频繁地使用缩写“HA(hyaluronic acid；透明质酸)”以代替此集合术语。
HA在生物体中扮演重要的角色，作为许多组织的细胞的机械支持，例如皮肤、腱、肌肉和软骨，其是胞间基质的主要成分。HA在生物过程中同样扮演重要的角色，例如组织的润湿和润滑作用。
HA可从上述天然组织中提取，尽管现今优选通过微生物方法制备HA以最小化传递传染剂(infectious agent)的潜在风险，并且提高产品的均匀性、质量和可用性(WO03/0175902，Novozymes)。
已将HA和它不同分子大小的级分和它们各自的盐用作药物，特别在治疗关节病方面；作为天然器官和组织的辅助和/或替代物，特别在眼科学和整容手术方面；以及作为化妆品制剂中的试剂(agent)。也已开发乙酰透明质酸的产品用于整形外科学(orthopaedics)、风湿病学(rheumatology)和皮肤病学(dermatology)。
HA还可用作用于卫生和外科物品的多种聚合材料，例如聚氨酯、聚酯等的添加剂，其具有使这些材料生物相容的效果。
通过将HA与多官能环氧化合物交联来制备交联的HA或其盐，其制备公开于EP0 161 887 B1。US4,957,744中公开了HA与酯族醇的全部或部分交联的酯，以及这些偏酯与无机或有机碱的盐。
US6673919 B2(Chisso Corp.pub.Date 06/01/2004)涉及通过O-乙酰化作用、烷氧化作用或将由透明质酸或其盐和阳离子化合物的溶液组成的复合物交联来化学修饰透明质酸或其盐的方法。
FR2707653(Vetoquinol)涉及生物相容的并且生物可降解的聚合物和分子，特别是含有活动的氢原子的生物活性分子之间的接合物；它的制备方法；和包含这种接合物的药用组合物。
本发明涉及关于透明质酸(HA)的化学接枝技术(chemical graftingtechnology)，其使用由α-羟酸的重复单位构成的寡聚体和合成聚合物，例如聚(乳酸)，也称作聚交酯，和任何基于乳酸的聚合物、立体共聚物(stereocopolymer)和共聚物，特别那些与乙醇酸的共聚物，以及与其它的共聚物，例如与经由ε-己内酯的羟基己酸、葡糖酸和化学修饰的葡糖酸、苹果酸的共聚物，与低分子量片段的共聚物，其能够产生降解副产物，所述副产物是水溶性的并且能够通过肾脏过滤消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它们在链末端具有一或两个羧基，并且在一元酸的情况下它们提供疏水性。重要的是，所述方法学能够用于通过接枝或交联使HA衍生化，并且能够将产品用于技术、生物医学和药用的应用。接枝的HA是生物可降解的、生物相容的和生物可再吸收的(bioresorbable)。
发明概述
用聚α-羟酸，例如乳酸或乙醇酸的寡聚体使HA衍生化，用于制备接枝的HA结构，其比HA本身更疏水。所得两亲性质在化妆品应用例如乳剂稳定作用、皮肤保湿和紧致，以及膜形成中是理想的。来自这些接枝材料的水凝胶或纳米化的胶态分散体也能够用于组织增加、防止粘附、骨关节炎和眼科学。
仅生物相容的代谢物将在接枝材料的生物降解后释放。降解副产物，例如乳酸或乙醇酸，通过人体代谢并且完全消除，因而使接枝产品成为在人体内完全是生物可再吸收的。
乳酸广泛用于化妆品配方中，而聚(乳酸)(PLA)广泛用于组织工程的生物医学应用中，并且还用于药物递送的药用应用，例如，使用PLA微球体和纳米粒子。
将聚(乳酸)(酰基氯(acid chloride)形式)接枝到HA(四(正-丁基)铵或十六烷基三甲基铵盐形式)。所得产品作为凝胶或纳米化的胶态分散体获得，并且通过对EDTA钠或磷酸盐缓冲液-DMSO，以及随后对水和乙醇的透析来纯化，任何将去除铵离子的透析体系均可能是有效的。冷冻干燥PLA-衍生化的HA产生海绵状物(sponge)。
PLA-HA不溶于水(尽管微团(micelles)的形成可能发生)。然而，其溶于1∶1DMSO-水混合物。
本发明第一个方面涉及包含透明质酸或其盐的产品，其中所述透明质酸或其盐部分或全部与α-羟酸的聚合物连接或交联，所述α-羟酸的聚合物优选聚(乳酸)，也称作聚交酯，和任何基于乳酸的聚合物、立体共聚物和共聚物，特别那些与乙醇酸的共聚物，以及与其它的共聚物，例如与经由ε-己内酯的羟基己酸、葡糖酸和化学修饰的葡糖酸、苹果酸的共聚物，与低分子量片段的共聚物，其能够产生降解副产物，所述副产物是水溶性的并且能够通过肾脏过滤消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它们在链末端具有一或两个羧基，并且在一元酸的情况下它们提供疏水性。
第二方面，本发明涉及组合物，其包含第一个方面中所限定的产品，和活性组分，优选所述活性组分是药理学活性剂。
本发明的第三方面涉及药用组合物，其包含有效量的第一个方面中所限定的产品，和可药用的载体、赋形剂或稀释剂。
第四方面涉及药用组合物，其包含有效量的第一个方面中所限定的产品作为媒介物，和药理学活性剂。
第五方面涉及化妆品，其包含有效量的第一个方面中所限定的产品作为活性组分。
第六方面，本发明涉及卫生、医学或外科物品，其包含第一个方面中所限定的产品，优选所述物品是外科海绵(surgical sponge)、愈伤海绵(woundhealing sponge)或包含于急救绷带(band aid)或其它创伤敷裹材料中的部分。
重要的方面涉及药物胶囊或微胶囊(microcapsule)，其包含第一个方面中所限定的产品。
本发明另一个重要的方面涉及产生包含透明质酸或其盐的产品的方法，其中所述透明质酸或其盐部分或全部与α-羟酸的聚合物连接或交联，该α-羟酸的聚合物优选聚(乳酸)，也称作聚交酯(polylactide)，和任何基于乳酸的聚合物、立体共聚物和共聚物，特别那些与乙醇酸、聚乙醇酸的共聚物，以及与其它的共聚物，例如与经由ε-己内酯(ε-caprolactone)的羟基己酸、葡糖酸和化学修饰的葡糖酸、苹果酸的共聚物，与低分子量片段的共聚物，其能够产生降解副产物，所述副产物是水溶性的并且能够通过肾脏过滤消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它们在链末端具有一或两个羧基，并且在一元酸的情况下它们提供疏水性，所述方法包括以下步骤：
a)将透明质酸或其盐与α-羟酸聚合物的单酰氯或二酰氯在有机溶剂中，优选DMSO中反应。
本发明最后的方面涉及方法，其为在眼科学中、在治疗骨关节炎或癌症中执行程序(performing procedure)的方法，处理创伤的方法，将药理学活性剂皮肤施用或透皮施用(dermal or transdermal administration)于哺乳动物的方法，或皮肤施用化妆品的方法，改进，其包含使用第一个方面中所限定的产品或第二、三或四的任何方面所限定的组合物。
许多方面涉及第一个方面中所限定的产品或任何前述方面所限定的组合物的用途，其用于制备治疗骨关节炎、癌症的药物，制备用于眼科治疗的药物，制备用于创伤处理的药物，制备用于血管发生的药物或制备保湿剂(moisturizer)。
定义
核酸构建体
“核酸构建体”在本文定义为单链或双链的核酸分子，其从天然存在的基因分离，或将其修饰以含有核酸的片段，该片段以不存在于自然界的方式组合和并置(juxtapose)。当术语核酸构建体含有表达编码序列所需的所有调控序列时，术语核酸构建体可与术语表达盒同义。术语“编码序列”在本文中定义为，当将其置于下面提到的调控序列的控制之下时，转录成mRNA并且翻译成目标酶(enzyme of interest)的序列。编码序列的边界通常由核糖体结合位点和转录终止子序列决定，所述核糖体结合位点恰位于mRNA 5’端开读框的上游，而所述转录终止子序列恰位于mRNA 3’端开读框的下游。编码序列能够包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域中公知的并且包括，举例来说，从基因组DNA分离，从cDNA制备，或它们的组合。例如，能够通过如下方法实现从这种基因组DNA克隆核酸序列：使用抗体筛选表达文库以探测具有共享结构特征的克隆DNA片段或公知的聚合酶链式反应(PCR)。参见，例如，Innis et al.，1990，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplication，Academic Press，New York。可以使用其它核酸扩增方法例如连接酶链式反应、连接活化转录和基于核酸序列的扩增。克隆方法可涉及切除和分离所需的包含编码多肽的核酸序列的核酸片段，将片段插入到载体分子中，和将该重组载体并入芽孢杆菌属(Bacillus)细胞中，其中所述核酸序列的克隆将被复制。所述核酸序列可以是基因组的、cDNA的、RNA的、半合成的、合成的来源，或它们的任意组合。
分离的编码酶的核酸序列可以按多种方式操作以提供酶的表达。将核酸序列插入构建体或载体之前对核酸序列进行操作是理想的或必要的，这取决于表达载体或芽孢杆菌属(Bacillus)宿主细胞。使用克隆方法修饰核酸序列的技术是本领域中公知的。需理解的是还可使用本领域内公知的方法在宿主细胞体内操作该核酸序列。
许多酶涉及透明质酸的生物合成。这些酶包括乙酰透明质酸合酶(hyaluronan synthase)、UDP-葡糖-6-脱氢酶、UDP-葡糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶、葡糖-6-磷酸异构酶、己糖激酶、葡糖磷酸变位酶、酰胺转移酶、变位酶和乙酰转移酶。乙酰透明质酸合酶是透明质酸生产中的关键酶。
“乙酰透明质酸合酶”在本文中定义为通过添加GlcUA和GlcNAc糖前体催化乙酰透明质酸链的延伸的合酶。链球菌乙酰透明质酸合酶、脊椎动物乙酰透明质酸合酶和病毒乙酰透明质酸合酶的氨基酸序列与巴斯德氏菌属(Pasteurella)乙酰透明质酸合酶截然不同，并且已提议将其分类为I组和II组乙酰透明质酸合酶，I组乙酰透明质酸合酶包括链球菌乙酰透明质酸合酶(DeAngelis，1999)。为了在芽孢杆菌属宿主细胞中产生乙酰透明质酸，真核来源的乙酰透明质酸合酶，例如哺乳动物乙酰透明质酸合酶是较不优选的。
乙酰透明质酸合酶编码序列可以是任何能够在芽孢杆菌属宿主细胞中表达的核酸序列。所述核酸序列可以是任何来源的。优选的乙酰透明质酸合酶基因包括I组或II组中的任何基因，例如来自似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcusuberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的I组乙酰透明质酸合酶基因，或多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)的II组乙酰透明质酸合酶基因。
通过构建体将乙酰透明质酸的前体糖供应于宿主细胞，该构建体优选地将本发明的HA产生至培养基中，或通过由内源基因或非内源基因或内源或非内源基因的组合编码将本发明的HA产生至芽孢杆菌属宿主细胞中。所述前体糖可以是D-葡糖醛酸或N-乙酰-葡糖胺。
在本发明的方法中，核酸构建体可以还包含一个或多个编码乙酰透明质酸前体糖生物合成中的酶的基因。或者，芽孢杆菌属宿主细胞可以还包含一个或多个另一种核酸构建体，其包含一个或多个编码前体糖生物合成中的酶的基因。乙酰透明质酸生产通过使用带有编码一个或多个基因的一个或多个核酸序列来改进，所述基因指导乙酰透明质酸前体糖合成途径中的步骤。“指导乙酰透明质酸前体糖合成途径中的步骤”的意思是该基因表达的蛋白在N-乙酰-葡糖胺或D-葡糖醛酸，或N-乙酰-葡糖胺和D-葡糖醛酸中任一个的前体糖的形成中是活性的。
在提供前体糖的优选方法中，通过培养具有重组构建体的宿主细胞来提供构建体用于改进具有乙酰透明质酸合酶的宿主细胞中的乙酰透明质酸生产，该重组构建体具有异源启动子区，其与编码基因的核酸序列可操作连接，所述基因指导乙酰透明质酸前体糖的合成途径中的步骤。在优选方法中，宿主细胞还包含重组构建体，其具有与乙酰透明质酸合酶可操作地连接的启动子区，所述构建体可使用与涉及N-乙酰-葡糖胺生物合成的合酶的核酸序列相同或不同的启动子区。在另一个优选实施方案中，宿主细胞可以具有带有启动子区的重组构建体，所述启动子区与编码另一种基因的不同核酸序列可操作连接，所述另一种基因涉及乙酰透明质酸前体糖的合成。
因此，本发明还涉及用于改进乙酰透明质酸产生的构建体，通过使用具有编码基因的核酸序列的构建体，所述基因指导乙酰透明质酸前体糖的合成途径中的步骤。可由与编码乙酰透明质酸合酶的核酸序列相同或不同的启动子表达有关前体糖的核酸序列。
用于产生透明质酸的前体糖的生物合成中涉及的基因包括UDP-葡糖-6-脱氢酶基因、UDP-葡糖焦磷酸化酶基因、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因、葡糖-6-磷酸异构酶基因、己糖激酶基因、葡糖磷酸变位酶基因、酰胺转移酶基因、变位酶基因和乙酰转移酶基因。
在含有乙酰透明质酸合酶的细胞中，可表达hasB、hasC和hasD中任何一种或两种或多种的组合，或它们的同源物(homolog)，分别如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)tuaD、gtaB和gcaD，以及hasE，以增加可用于乙酰透明质酸合酶的前体糖的库(pool)。枯草芽孢杆菌基因组在Kunst，et al.，Nature 390，249-256，“The complete genome sequence of the Gram-positive bacteriumBacillus subtilis”(1997年11月20日)中有所描述。在一些情况下，例如宿主细胞不具有天然的乙酰透明质酸合酶活性时，构建体可以包括hasA基因。
编码生物合成酶的核酸序列对于宿主细胞可以是天然的，而在其它情况下，可以使用异源序列。如果表达两种或两种以上基因，它们可以是在天然操纵子中彼此相连的基因，例如似马链球菌HAS操纵子的基因，其包含hasA、hasB、hasC和hasD。在其它情况下，使用前体基因序列的一些组合可为理想的，而不包括操纵子的每个元件。使用天然存在于宿主细胞的一些基因和其它外源基因在其它情况下也可以是优选的。该选择将取决于所给出的宿主细胞中糖的可用库，细胞调节过量产生而不干扰宿主细胞其它功能的能力，和细胞对来自其天然基因的表达的调控是否不同于外源基因。
举例来说，取决于细胞的代谢需要和生长条件，以及可用的前体糖库，理想的是通过如下方法增加N-乙酰-葡糖胺的产生：表达编码UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶的核酸序列，例如hasD基因、芽孢杆菌属gcaD基因和它们的同源物。或者，前体糖可以是D-葡糖醛酸。在一个这样的实施方案中，核酸序列编码UDP-葡糖-6-脱氢酶。这些核酸序列包括芽孢杆菌属tuaD基因、链球菌属(Streptococcus)的hasB基因和它们的同源物。所述核酸序列还可以编码UDP-葡糖焦磷酸化酶，例如在芽孢杆菌属中的gtaB基因、链球菌属的hasC基因和它们的同源物。在本发明的方法中，UDP-葡糖-6-脱氢酶基因可以是hasB基因或tuaD基因；或它们的同源物。
在本发明中，预想乙酰透明质酸合酶基因和编码前体糖的一个或多个基因在相同启动子的控制下。或者，编码前体糖的一个或多个基因在相同启动子的控制下，但不同的启动子驱动乙酰透明质酸合酶基因。其它替换方案是乙酰透明质酸合酶基因和每个编码前体糖的基因在不同启动子的控制下。在优选的实施方案中，乙酰透明质酸合酶基因和编码前体糖的一个或多个基因在相同启动子的控制下。
本发明还涉及核酸构建体，其包含分离的编码乙酰透明质酸合酶操纵子的核酸序列，所述操纵子包含乙酰透明质酸合酶基因和UDP-葡糖-6-脱氢酶基因，和任选的一种或多种选自下组的基因：UDP-葡糖焦磷酸化酶基因、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因和葡糖-6-磷酸异构酶基因。
在某些情况下，宿主细胞将具有带有异源启动子区的重组构建体，所述异源启动子区可操作地与编码基因的核酸序列连接，所述基因指导乙酰透明质酸前体糖合成途径中的步骤，其可与重组构建体的乙酰透明质酸合酶的表达相协调(in concert with)。乙酰透明质酸合酶可由与编码涉及前体生物合成的酶的核酸序列相同或不同的启动子区表达。在另一个优选实施方案中，宿主细胞可具有带有启动子区的重组构建体，该启动子区与不同的核酸序列可操作的连接，所述核酸序列编码涉及乙酰透明质酸前体糖合成的另一个基因。
编码涉及前体糖生物合成的酶的核酸序列可由与编码乙酰透明质酸合酶的核酸序列相同或不同的启动子表达。在之前的含义中，构建“人工操纵子”，其可模仿似马链球菌操纵子而具有每个hasA、hasB、hasC和hasD或其同源物，或者，可以使用少于似马链球菌操纵子中存在的全补体(full complement)。人工操纵子还可以包含葡糖-6-磷酸异构酶基因(hasE)以及一个或多个选自下组的基因：己糖激酶基因、葡糖磷酸变位酶基因、酰胺转移酶基因、变位酶基因和乙酰转移酶基因。在人工操纵子中，元件中的至少一个与元件中的另一个是异源的，例如启动子区与编码序列是异源的。
在优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、tuaD和gtaB。在另外的优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、tuaD、gtaB和gcaD。在另外的优选实施方案中，核酸构建体包含hasA和tuaD。在另外的优选实施方案中，核酸构建体包含hasA。在另外的优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、tuaD、gtaB、gcaD和hasE。在另外的优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、hasB、hasC和hasD。在另外的优选实施方案中，核酸构建体包含hasA、hasB、hasC、hasD和hasE。基于以上优选实施方案，所提到的基因能够用其同源物取代。
在本发明所述方法中，核酸构建体包含与启动子序列可操作连接的乙酰透明质酸合酶编码序列，该启动子序列对于乙酰透明质酸合酶编码序列是外源的。所述启动子序列可以是，例如，单一启动子或串联启动子。
“启动子”在本文定义为参与结合RNA聚合酶以开始基因转录的核酸序列。“串联启动子”在本文定义为两个或多个启动子序列，每个均与编码序列可操作连接并介导将编码序列转录为mRNA。“可操作连接”在本文定义为这样的结构，其中将调控序列，例如启动子序列适当地置于与编码序列相关的位置，以使该调控序列指导由编码序列编码的多肽的产生。如较早所提到的，“编码序列”在本文定义为当将其置于适当的调控序列控制下时，其转录为mRNA并翻译成多肽的核酸序列。编码序列的边界通常由核糖体结合位点和转录终止子序列决定，所述核糖体结合位点恰位于该mRNA 5’端开读框的上游，而所述转录终止子序列恰位于该mRNA 3’端开读框的下游。编码序列能够包括，但不限于，基因组DNA、cDNA、半合成的、合成的和重组的核酸序列。
在优选实施方案中，启动子序列可以从细菌来源获得。在更加优选的实施方案中，启动子序列可以从革兰氏阳性细菌获得，例如芽孢杆菌属菌株，例如，Bacillus agaradherens、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；或链霉菌属菌株，例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或灰鼠链霉菌(Streptomyces murinus)；或从革兰氏阴性菌获得，例如，大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属菌种(Pseudomonas sp.)。
用于指导本发明所述方法中核酸序列转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、迟缓芽孢杆菌或Bacillus clausii碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌tenebrionis亚种CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分，原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：3727-3731)。其它实例是spol噬菌体启动子的启动子和tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 80：21-25)。另外的启动子在″Useful proteins fromrecombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94中；和在Sambrook，Fritsch，and Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d edition，Cold Spring Harbor，New York中有所描述。
启动子还可以是“共有”启动子，其具有″-35″区的序列TTGACA和″-10″区的TATAAT。共有启动子可以从能够在芽孢杆菌属宿主细菌中发挥功能的任何启动子获得。可以通过定位诱变完成“共有”启动子的构建以创造启动子，该启动子更加完美地符合枯草芽孢杆菌营养型(vegetative)“σA型”启动子″-10″和″-35″区的已确定的共有序列(Voskuil et al.，1995，MolecularMicrobiology 17：271-279)。
在优选实施方案中，“共有”启动子从得自以下的启动子获得：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、Bacillus clausii或迟缓芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草蛋白酶Carlsberg基因)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)、地衣芽孢杆菌cα-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌tenebrionis亚种CryIIIA基因(cryIIIA)或其部分，或原核β-内酰胺酶基因spol细菌的噬菌体启动子。在更优选的实施方案中，“共有”启动子从解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)获得。
Widner，等在美国专利编号6,255,076和5,955,310中描述串联启动子和构建体以及用于在芽孢杆菌属细胞中表达的方法，包括短的共有amyQ启动子(也称作scBAN)。其中还描述了cryIIIA稳定子序列的用途，以及使用该序列的构建体，其用于改进在芽孢杆菌属中的产生。
串联启动子的每个启动子序列可以是在所选芽孢杆菌属细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截断的和杂合的启动子，并且可由编码与该芽孢杆菌属细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。每个启动子序列对于编码多肽的核酸序列可以是天然的或外源的，并且对于芽孢杆菌属细胞可以是天然的或外源的。所述启动子序列可以是相同的启动子序列或不同的启动子序列。
串联启动子的两个或两个以上启动子序列可以同时启动核酸序列的转录。或者，串联启动子的一个或多个启动子序列可以在芽孢杆菌属细胞的不同生长阶段启动核酸序列的转录。
在优选实施方案中，串联启动子含有至少解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的amyQ启动子。在另外的优选实施方案中，串联启动子含有至少“共有”启动子，其具有″-35″区的序列TTGACA和″-10″区的序列TATAAT。在另外的优选实施方案中，串联启动子含有至少地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的amyL启动子。在另外的优选实施方案中，串联启动子含有至少cryIIIA启动子或其部分(Agaisse and Lereclus，1994，Molecular Microbiology 13：97-107)。
在更加优选的实施方案中，串联启动子含有至少amyL启动子和cryIIIA启动子。在另外的更加优选实施方案中，串联启动子含有至少amyQ启动子和cryIIIA启动子。在另外的更加优选实施方案中，串联启动子含有至少具有″-35″区的序列TTGACA和″-10″区的序列TATAAT的“共有”启动子以及cryIIIA启动子。在另外的更加优选实施方案中，串联启动子含有至少两个拷贝的amyL启动子。在另外的更加优选实施方案中，串联启动子含有至少两个拷贝的amyQ启动子。在另外的更加优选实施方案中，串联启动子含有至少两个拷贝的“共有”启动子，其具有″-35″区的序列TTGACA和″-10″区的序列TATAAT。在另外的更加优选实施方案中，串联启动子含有至少两个拷贝的cryIIIA启动子。
“mRNA加工/稳定序列”在本文定义为位于一个或多个启动子序列下游和编码序列上游的序列，该编码序列与一个或多个启动子序列中的每个可操作地连接，这样可以将所有从每个启动子序列合成的mRNA加工以产生mRNA转录物，在该转录物的5’端具有稳定子(stablizer)序列。在mRNA转录物5’端的这种稳定子序列的存在增加它们的半衰期(Agaisse and Lereclus，1994，supra，Hue et al.，1995，Journal of Bacteriology 177：3465-3471)。mRNA加工/稳定序列与细菌16S核糖体RNA的3’端互补。在优选实施方案中，mRNA加工/稳定序列产生基本上单一大小的转录物，在该转录物5’端具有稳定序列。mRNA加工/稳定序列优选地是一种与细菌16S核糖体RNA的3’端互补的序列。参见，美国专利编号6,255,076和5,955,310。
在更加优选的实施方案中，mRNA加工/稳定序列是苏云金芽孢杆菌cryIIIA mRNA加工/稳定序列，其公开于WO94/25612和Agaisse and Lereclus，1994，同上，或其保留mRNA加工/稳定功能的部分。在另外的更加优选实施方案中，mRNA加工/稳定序列是枯草芽孢杆菌SP82mRNA加工/稳定序列，其公开于Hue et al.，1995，同上，或其保留mRNA加工/稳定功能的部分。
当将cryIIIA启动子及其mRNA加工/稳定序列用于本发明的方法中时，可以使用DNA片段，其含有公开于WO94/25612和Agaisse and Lereclus，1994，同上，的序列或其保留启动子和mRNA加工/稳定功能的部分。此外，可以使用本领域公知的方法制备仅含有cryIIIA启动子或仅含有cryIIIAmRNA加工/稳定序列的DNA片段，以构建不同的串联启动子和mRNA加工/稳定序列组合。在该实施方案中，cryIIIA启动子及其mRNA加工/稳定序列优选地位于组成串联启动子的其它启动子序列的下游和目标基因的编码序列的上游。
然后可将分离的核酸序列进一步进行操作以改进该核酸序列的表达，所述核酸序列编码所需的涉及透明质酸产生的酶。可理解的是表达包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。使用克隆方法修饰核酸序列的技术是本领域内公知的。
可将包含编码酶的核酸序列的核酸构建体与一个或多个调控序列可操作连接，该调控序列在与其相容的条件下能够指导芽孢杆菌属细胞中编码序列的表达。
术语“调控序列”在本文中定义为包括对核酸序列的编码序列表达是必需的或有利的所有成分。每种调控序列对于编码酶的核酸序列可以是天然的或外源的。除了上述的启动子序列之外，这些调控序列包括，但不限于，前导序列、信号序列和转录终止子。最少的情况下，调控序列包括启动子，以及转录和翻译的停止信号。调控序列可以与接头一起提供，所述接头的目的是引入特异性限制位点，促进调控序列与编码酶的核酸序列的编码区的连接。
调控序列还可以是合适的转录终止子序列，其是由芽孢杆菌属细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码酶或操纵子最后的酶的核酸序列3’末端可操作连接。在所选芽孢杆菌属细胞中有功能的任何终止子均可以在本发明中使用。
调控序列还可以是合适的前导序列，其是mRNA非翻译区，对于芽孢杆菌属细胞的翻译是重要的。前导序列与编码酶的核酸序列的5’末端可操作连接。在所选芽孢杆菌属细胞中有功能的任何前导序列可以用于本发明中。
调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，其能够指导表达的多肽进入细胞的分泌途径。信号肽编码区对于多肽可以是天然的或可以得自外源。核酸序列编码序列的5’端可以固有地(inherently)含有信号肽编码区，其天然地在翻译阅读框之内与编码所分泌多肽的编码区片段连接。或者，编码序列的5’端可以含有信号肽编码区，其对于编码所分泌多肽的编码序列部分是外源的。当编码序列通常不含有信号肽编码区时，所述外源信号肽编码区可能是需要的。或者，外源信号肽编码区可以简单地取代天然信号肽编码区，以获得相对于通常与编码序列连接的天然信号肽编码区增强的多肽分泌。信号肽编码区可以从芽孢杆菌属菌种的淀粉酶或蛋白酶基因获得。然而，能够指导表达多肽进入所选芽孢杆菌属细胞分泌途径的任何信号肽编码区可以在本发明中使用。
对于芽孢杆菌属细胞有效的信号肽编码区是获得自以下基因的信号肽编码区：来自芽孢杆菌属NCIB 11837的产麦芽淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA基因。另外的信号肽由Simonen and Palva，1993，Microbiological Reviews57：109-137描述。
调控序列还可以是前肽编码区(propeptide coding region)，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽被认为是酶原(proenzyme)或多肽原(或在某些情况下是酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的，并且能够通过催化或自催化切割来自该多肽原的前肽而转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)获得。
当信号肽和前肽区二者均存在于多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着多肽的氨基末端，而将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞生长调节多肽的表达。调节系统的实例是响应化学或物理刺激，包括调节化合物的存在而引起基因表达开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。
生产
在本发明的方法中，使用本领域已知的方法将宿主细胞培养在适于透明质酸产生的营养培养基中。例如，可以通过在合适的培养基中以及允许涉及透明质酸合成的酶表达和透明质酸分离的条件下、在实验室中或工业发酵罐中进行的摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。在包含碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中，使用本领域已知的方法进行培养。合适的培养基可以从商业供应商获得，或可以根据已公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。分泌的透明质酸能够直接从培养基中回收。
所得透明质酸可以通过本领域已知的方法分离。例如，透明质酸可以从营养培养基中通过常规方法分离，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。然后可以通过本领域已知的多种方法进一步纯化分离的透明质酸，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排组)、电泳方法(例如，制备等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)或提取(参见，例如，Protein Purification，J.-C.Janson and LarsRyden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。
附图
图1显示本文所用不同化合物的结构式。
图2显示聚(乳酸)和亚硫酰氯(thionyl chloride)一起形成PLA酰氯的反应图解。
图3显示聚(乳酸)的IR光谱。
图4显示透明质酸(质子形式)的IR光谱。
图5显示实施例3的最终合成产品HA-PLA的IR光谱。
图6显示实施例3的最终合成产品HA-PLA的13C光谱。
图7显示HA-TBA与PLA二酰氯形成HA-PLA-HA的反应图解，如实施例4中所概述的。
图8显示实施例4中乙醇洗涤的IR光谱，可能有HA-PLA-HA存在。
图9显示实施例4中丙酮洗涤的IR光谱，可能有HA-PLA-HA存在。
图10显示实施例4中来自HA-CTA的终产品的IR光谱；HA-PLA-HA。
图11显示实施例4中来自HA-CTB的终产品的IR光谱；HA-PLA-HA。
图12显示实施例5中合成的HA-CTA的IR光谱。
图13显示实施例6最终HA-PLA产品的1H NMR，该谱显示残余CTA的存在。
图14显示在实施例7的透析之后，实施例6最终HA-PLA产品的1HNMR。
发明详述
“透明质酸(hyaluronic acid)”在本文中定义为由N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和葡糖醛酸(GlcUA)的重复二糖单元组成的未硫酸化糖胺聚糖，其通过交替的β-1，4和β-1，3糖苷键连接到一起。透明质酸也称作乙酰透明质酸(hyaluronan)、透明质酸盐(hyaluronate)或HA。术语乙酰透明质酸和透明质酸在本文可以互换使用。
鸡冠是乙酰透明质酸重要的商业来源。微生物是可选的来源。美国专利No.4,801,539公开了用于制备透明质酸的发酵方法，其涉及兽瘟链球菌(Streptococcus zooepidemicus)菌株，报道的产率是约3.6g透明质酸每升。欧洲专利No.EP0694616公开了使用改进的兽瘟链球菌菌株的发酵方法，报道的产率是约3.5g透明质酸每升。如完整并入本文的WO03/054163(Novozymes)中所公开的，透明质酸或其盐可以，例如在革兰氏阳性芽孢杆菌属宿主中重组地产生。
已描述了乙酰透明质酸合酶来自于脊椎动物、细菌病原体和藻病毒(DeAngelis，P.L.，1999，Cell.Mol.Life Sci.56：670-682)。WO 99/23227公开了来自似马链球菌的I组透明质酸盐合酶(hyaluronate synthase)。WO 99/51265和WO 00/27437描述来自多杀巴斯德氏菌的II组透明质酸盐合酶。Ferretti等公开了酿脓链球菌的乙酰透明质酸合酶操纵子，其由三个基因hasA、hasB和hasC组成，其分别编码透明质酸盐合酶、UDP葡糖脱氢酶和UDP-葡糖焦磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98，4658-4663，2001)。WO99/51265描述具有似马链球菌乙酰透明质酸合酶编码区的核酸片段。
由于重组芽孢杆菌属细胞的乙酰透明质酸直接表达至培养基，可以使用简单的方法从该培养基中分离乙酰透明质酸。首先，将芽孢杆菌属细胞和细胞碎片从培养基中物理去除。如果需要，首先可将培养基稀释以减少培养基的粘性。用于从培养基去除细胞的许多方法对于本领域那些技术人员是已知的，例如离心和微滤。如果需要，然后可将剩余的上清液，例如通过超滤来过滤以进行浓缩和从乙酰透明质酸去除小分子污染物。去除细胞和细胞碎片之后，通过已知机制从培养基简单沉淀乙酰透明质酸。盐、醇或盐和醇的组合可以用于从滤液沉淀乙酰透明质酸。一旦变为沉淀物，能够容易地将乙酰透明质酸通过物理方法从溶液中分离。可通过使用本领域已知的蒸发技术，例如冷冻干燥或喷雾干燥从滤液溶液干燥或浓缩乙酰透明质酸。
本发明第一个方面涉及包含透明质酸或其盐的产品，其中所述透明质酸或其盐与α-羟酸聚合物部分或全部连接或交联，所述α-羟酸聚合物优选聚(乳酸)，也称作聚交酯(polylactide)，和任何基于乳酸的聚合物、立体共聚物和共聚物，特别是那些与乙醇酸的共聚物，以及与其它的共聚物，例如与经由ε-己内酯的羟基己酸(hydroxy caproic acid)、葡糖酸和化学修饰的葡糖酸、苹果酸的共聚物，与低分子量片段的共聚物，其能够产生降解副产物，所述副产物是水溶性的并且能够通过肾脏过滤消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它们在链末端具有一或两个羧基，而且在一元酸的情况下它们提供疏水性。
宿主细胞
优选实施方案涉及第一个方面的产品，其中所述透明质酸或其盐是重组产生的，优选通过革兰氏阳性细菌或宿主细胞，更优选通过芽孢杆菌属细菌重组产生的。
宿主细胞可以是适于重组产生透明质酸的任何芽孢杆菌属细胞。芽孢杆菌属宿主细胞可以是野生型芽孢杆菌属细胞或其突变体。在本发明的实践中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，Bacillus agaraderhens、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、Bacillus clausii、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。特别适于重组表达的突变枯草芽孢杆菌细胞在WO98/22598有所描述。无被囊的(non-encapsulating)芽孢杆菌属细胞在本发明中是特别有用的。
在优选实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、Bacillusclausii、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在更加优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在其它更加优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是Bacillus clausii细胞。在其它更加优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是迟缓芽孢杆菌细胞。在其它更加优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在其它更加优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌细胞。在最优选的实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌A164Δ5(参见，例如美国专利No.5,891,701)或枯草芽孢杆菌168Δ4。
用本发明的核酸构建体转化芽孢杆菌属宿主细胞可以，例如，通过原生质体转化(参见，例如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)，通过使用感受态细胞(参见，例如Young and Spizizen，1961，Journal ofBacteriology 81：823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal ofMolecular Biology 56：209-221)，通过电穿孔(参见，例如Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或通过接合(参见，例如Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5271-5278)来进行。
分子量
可以根据改进的咔唑方法(Bitter and Muir，1962，Anal Biochem.4：330-334)测定透明质酸的水平。此外，可以使用本领域的标准方法测定透明质酸的平均分子量，例如由Ueno et al.，1988，Chem.Pharm.Bull.36，4971-4975；Wyatt，1993，Anal.Chim.Acta 272：1-40；和Wyatt Technologies，1999，“Light ScatteringUniversity DAWN Course Manual”and“DAWN EOS Manual”Wyatt TechnologyCorporation，Santa Barbara，California所述的那些方法。
在优选实施方案中，通过本发明方法获得的透明质酸具有约10,000至约10,000,000Da的分子量。在更优选的实施方案中，通过本发明方法获得的透明质酸具有约25,000至约5,000,000Da的分子量。在最优选的实施方案中，通过本发明方法获得的透明质酸具有约50,000至约3,000,000Da的分子量。
优选的实施方案涉及第一方面的产品，其中所述透明质酸或其盐具有在300,000-3,000,000范围；优选在400,000和2,500,000范围；更优选在500,000和2,000,000范围；并且最优选在600,000和1,800,000范围的分子量。
盐和交联的HA
优选的实施方案涉及第一方面的产品，其包含透明质酸的无机盐，优选透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌或透明质酸钴。
在下面的实施例中存在透明质酸钠与聚(乳酸)单酰氯或二酰氯(poly(lactic acid)mono-or di-acyl chloride)的反应产生连接或交联的HA-PLA或HA-PLA-HA产品，当与未处理的HA或PLA的标准光谱比较时，其在IR光谱上显示在1736cm-1的强峰，其对应于新近与HA连接以形成HA-PLA产品的聚(乳酸)片段的存在。
因此，优选的实施方案涉及第一方面的产品，其中所述交联的透明质酸或其盐含有聚合α-羟酸的酯，优选是聚(乳酸)的酯，也称作聚交酯，和任何基于乳酸的聚合物、立体共聚物和共聚物，特别那些与乙醇酸的共聚物，以及与其它的共聚物，例如与经由ε-己内酯的羟基己酸、葡糖酸和化学修饰的葡糖酸、苹果酸的共聚物，与低分子量片段的共聚物，其能够产生降解副产物，所述降解副产物是水溶性的并且能够通过肾脏过滤消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它们在链末端具有一或两个羧基，并且在一元酸的情况下它们提供疏水性。
含水量测定
根据本发明的干产品粉末的水分含量是，在102℃±2℃将所述粉末干燥至恒重之后的重量损失，以百分数表示。将带有磨口盖的空玻璃称量盘在烘箱中干燥，然后冷却并且在灵敏度至少0.1mg的分析天平上称量。将大约3g干产品粉末置于盘中并称量。将装有粉末的盘不加盖置于烘箱中并且于102℃±2℃的温度干燥2小时；随后将其置于干燥器中并冷却至室温然后将其再次称量。将装有粉末的盘不加盖置于烘箱中再干燥1小时，然后如已经描述的冷却和称量；将此重复直至重量保持恒定，即，直至两次连续称量的区别不多于0.5mg。
然后将水分百分数的计算为：(W2-W3)/(W2-W1)×100；其中W1是空盘的重量，W2是装有粉末的盘的重量，而W3是装有干粉末的盘的重量。结果计算至2个小数位(2decimal places)，并且此方法的重复性是约±0.1％。
在优选的实施方案中，将第一方面所述产品干燥，并且如本文所测定，其包含少于5％水分，优选少于2％，并且最优选少于1％水分。
其它成分
在优选实施方案中，本发明所述产品还可包含其它成分，优选一种或多种活性组分，优选一种或多种药理学活性物质，并且还优选水溶性赋形剂，例如乳糖。
可用于本发明中的活性组分或药理学活性物质的非限定性实例包括蛋白质和/或肽药物，例如，人生长激素、牛生长激素、猪生长激素、生长激素释放激素/肽、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、骨形态形成性蛋白质(bone morphogenicprotein)、干扰素或其衍生物、胰岛素或其衍生物、心房肽III(atriopeptin-III)、单克隆抗体、肿瘤坏死因子、巨噬细胞活化因子、白细胞介素、肿瘤退化因子(tumor degenerating factor)、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、组织纤溶酶原激活物(tissue plasminigen activator)、因子VII、因子VIII和尿激酶。
可包括水溶性赋形剂用于稳定活性组分的目的，这种赋形剂可包括蛋白质，例如，白蛋白或明胶；氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和它们的盐；糖例如葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖和硫酸软骨素；无机盐例如磷酸盐；表面活性剂例如TWEEN(ICI)、聚乙二醇，及其混合物。赋形剂或稳定剂可以以产品重量的0.001至99％的量使用。
本发明的几个方面涉及各种组合物和药物，其中包含有效量的如第一方面所限定的产品，和活性组分，优选所述活性组分是药理学活性剂；可药用的载体(pharmaceutically acceptable vector)、赋形剂或稀释剂，优选水溶性赋形剂，并且最优选乳糖。
此外，本发明的多个方面涉及包含如第一方面所定义产品或如上多个方面和实施方案中所限定的组合物的物品，例如，化妆品、卫生物品、医学或外科物品。在本发明的最后方面涉及药物胶囊或微胶囊，其包含如第一方面所限定的产品或如本发明其它方面和实施方案所限定的组合物。
产生方法
本发明在另一方面提供产生包含透明质酸或其盐的产品的方法，其中所述透明质酸或其盐与α-羟酸的聚合物部分或全部连接或交联，所述α-羟酸的聚合物优选聚(乳酸)，也称作聚交酯，和任何基于乳酸的聚合物、立体共聚物和共聚物，特别那些与乙醇酸的共聚物，以及与其它的共聚物，例如与经由ε-己内酯的羟基己酸、葡糖酸和化学修饰的葡糖酸、苹果酸的共聚物，与低分子量片段的共聚物，其能够产生降解副产物，所述降解副产物是水溶性的并且能够通过肾脏过滤消除，例如低分子量聚(乙二醇)，只要它们在链末端具有一或两个羧基，并且在一元酸的情况下它们提供疏水性，所述方法包含步骤：
a)将透明质酸或其盐与α-羟酸聚合物的单酰氯或二酰氯在有机溶剂，优选在DMSO中反应。
使用产品或组合物的方法
本发明的不同方面涉及，例如在医学领域使用第一方面的产品或使用本发明的组合物进行处理步骤的方法。
一方面涉及在眼科学(ophtalmology)中执行程序的方法，其包括使用如第一方面所限定的产品或本发明的组合物。
另一方面涉及在骨关节炎(osteoarthritis)治疗中执行程序的方法，其包括使用如第一方面所限定的产品或本发明的组合物。
另一方面涉及在癌治疗中执行程序的方法，其包括使用如第一方面所限定的产品或本发明的组合物。
一方面涉及进行透皮或皮肤施用药理学活性剂的方法，其包括使用如第一方面所限定的产品或本发明的组合物。
另一方面涉及进行皮肤施用化妆品的方法，其包括使用如第一方面所限定的产品或本发明的组合物。
实施例
许多化学缩写通过结构式在图1中说明，例如四丁基铵(TBA)、十六烷基三甲基铵(CTA)、透明质酸(HA)和聚(乳酸)(PLA)。
实施例1DMSO和SOCl2蒸馏
DMSO蒸馏
将1.51DMSO引入2000ml圆底烧瓶中，并且伴以磁力搅拌将少量P2O5添加至DMSO，以分离(withdraw)水。随后如下所述进行装配来进行真空蒸馏：将烧瓶与装有可旋转多收集器转接器(multi-receiver adapter)的冷凝器相连，所述转接器与一个100ml和两个1000ml的烧瓶相连，从而允许独立地收集3种馏分而不必中断蒸馏。
将烧瓶在真空下加热至约75℃以进行蒸馏。将第一种小馏分收集在100ml圆底烧瓶中，并且稍后弃去。最终收集馏出的DMSO。柱顶部的温度是42℃，并且真空是2mbar。超纯商业DMSO能够不经蒸馏使用。
SOCl2蒸馏
将300ml亚硫酰氯SOCl2引入500ml圆底烧瓶中，并且伴以磁力搅拌将50ml亚磷酸三苯酯(triphenylphosphite)逐滴添加以捕集(trap)氯和硫。重要的是在添加期间控制温度，因为该过程是大量放热的。
当已添加了所有的亚磷酸三苯酯时，如下所述进行装配来进行蒸馏：将烧瓶与装有可旋转多收集器转接器的冷凝器相连，所述转接器与50ml、100ml和250ml的烧瓶相连，允许独立地收集3种馏分而不必中断蒸馏。将全部装置包裹在铝片(aluminum sheet)中以保护蒸馏的SOCl2免于光照。还将氯化钙捕集器(trap)装配至蒸馏装置以防水。随后将烧瓶加热至105℃以蒸馏产品；柱顶部的温度是72℃。
实施例2PLA酰氯的制备
反应流程示于图2。将2.4454g PLA溶于新鲜蒸馏的SOCl2中，并且引入带有磁力搅拌的250ml圆底烧瓶，随后将其装配用于回流并且通过CaCl2捕集器防水。将烧瓶加热以回流(大约80℃)3小时。
当反应结束时，将过量的SOCl2在真空下于60℃蒸馏出来。为了去除所有的SOCl2，将剩余的产品溶于甲苯并且将溶液在真空下于80℃再次蒸馏以去除溶剂。将此步骤重复3次。
实施例3HA-PLA合成
将CTA盐形式的透明质酸(HA-CTA)和聚(乳酸)单酰氯(PLA-COCl)以PLA-COCl相对于HA-CTA为2∶1的摩尔比率进行反应。
将溶于50ml DMSO的2.03g PLA-COCl逐滴添加至0.512g HA-CTA的70ml DMSO溶液中。添加之后，将该溶液在室温混合过夜。使用回旋式蒸发器(rotavaporator)以去除DMSO，将溶液浓缩直到获得固体产品。将产品连续用乙醇和丙酮洗涤。终产品是不溶于水但在DMSO中溶胀的(swelled)。
终产品(KBr盘(KBr disk))的IR光谱示于图5。其看起来像HA-H的光谱(示于图4)，除了对应于C＝O键的处于1735cm-1的峰。然而，此峰的强度较大，并且属于聚(乳酸)。PLA的IR光谱示于图3。
13C NMR看起来是用于表征终产品的更加有效的方法，因为HA的13CNMR光谱中所有的峰清楚地鉴定如下；D-葡糖醛酸的碳原子以“U”标记，而N-乙酰-D-葡糖胺酸的那些以“N”标记：
U6→174ppm N7→175ppm
U1→100或104ppm N1→100或104ppm
N8→22ppm
U2，3，4，5→54或83ppm N3，4，5→54或83ppm
N2→54.5ppm
N6→60.5ppm
终产品的13C NMR光谱(图6)显示所有HA、PLA(16，57和170ppm)和十六烷基三甲基铵(CTA)反荷离子(13，29，52ppm)的所有峰。
蒸发DMSO以固化产品可以逐渐地使PLA和HA在空间上更靠近在一起，其随后可导致更好的偶联反应(coupling reaction)。HA和PLA的链长的不同可影响反应中的取代比率。
实施例4HA-PLA-HA合成
将DMSO中的PLA二酰氯与HA(TBA或CTA形式)于室温混合1夜，如上所述。然后将溶液浓缩并通过在乙醇中沉淀来纯化产品，并且最终用丙酮洗涤。终产品不溶于水。
将去除了这两种溶剂的产品通过IR光谱分析，如图8和9所示。两个光谱呈现PLA和HA二者特有的峰。我们设想洗涤消除了一些与HA连接的PLA。
来自HA-CTA和HA-TBA的终产品的IR光谱(图10和11)也看来像HA-H的光谱，除了对应于PLA的C＝O键的在1736cm-1的峰。
实施例5HA-CTA合成
将十六烷基三甲基溴化铵的温溶液(40℃)逐滴添加到0.155g HA-Na的温溶液(40℃)中。将白色沉淀滤出，用温水洗涤以去除NaBr和过量十六烷基三甲基溴化铵并且冰冻干燥。
溶于DMSO的终产品的IR光谱(图12)显示CTA的存在。
实施例6 1∶1摩尔比率的HA-PLA合成
通常，将0.64g活化的乳酸寡聚体与1g HA--CTA在DMSO中在室温过夜混合。将DMSO去除并且将沉淀用醚(ether)洗涤两次，用乙醇洗涤三次，并且用丙酮洗涤两次。最终将回收的产品在真空下干燥过夜。终产品的1HNMR(图13)显示残余CTA的存在。
实施例7HA-PLA透析
将带有残余CTA的HA-PLA溶于磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4并且浓度＝0.5M)中，该缓冲液以2/1体积比率与DMSO混合。将此溶液连续地相对水、DMSO、乙醇和水进行透析(截留(cut-off)＝6000-8000)。在该处理之后，将溶液冷冻干燥，并且通过NMR分析最终的化合物(图14)。
图8HA-PLA空白检验
通过使HA和PLA反应，而不用SOCl2进行任何预先的寡聚体活化来进行空白检验。将20ml DMSO中含有271mg PLA的溶液逐滴添加至211mgHA溶于40ml DMSO的溶液中。将此溶液于室温搅拌3小时，并且通过蒸发去除DMSO。获得浅黄色固体。将此固体溶于DMSO过夜。出现沉淀。将这种不溶的部分从溶液分离并且用丙酮洗涤。将获得的白色固体干燥并通过NMR分析。
将丙酮缓慢地添加至剩余的溶液以产生新的沉淀。将这种沉淀收集、干燥并且也通过NMR分析。在NMR光谱上未见PLA的峰。
这确认了当采用通过亚硫酰氯活化PLA时，PLA与HA化学连接。
Claims (36)
1.包含透明质酸或其盐的产品，其中所述透明质酸或其盐是与α-羟酸的聚合物，优选聚(乳酸)部分或全部地连接或交联的。
2.根据权利要求1的产品，其中所述透明质酸或其盐优选通过革兰氏阳性细菌，更优选通过芽孢杆菌属细菌重组产生。
3.根据权利要求1或2的产品，其中所述透明质酸或其盐具有的分子量在300,000-3,000,000的范围；优选在400,000-2,500,000的范围；更优选在500,000-2,000,000的范围；并且最优选在600,000-1,800,000的范围。
4.根据权利要求1-3中任一项的产品，其包含透明质酸的无机盐，优选透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌或透明质酸钴。
5.根据权利要求1-4中任一项的产品，其中所述连接的或交联的透明质酸或其盐包含聚合α-羟酸的酯，优选聚(乳酸)的酯。
6.根据权利要求1-5中任一项的产品，其为经干燥的，并且如本文所测定包含少于5％水分，优选少于2％，并且最优选少于1％水分。
7.根据权利要求1-6中任一项的产品，其还包含活性组分。
8.根据权利要求7的产品，其中所述活性组分是药理学活性物质。
9.根据权利要求1-8中任一项的产品，其还包含水溶性赋形剂，优选乳糖。
10.组合物，其包含如权利要求1-9中任一项所限定的产品和活性组分，优选所述活性组分是药理学活性剂。
11.根据权利要求10的组合物，其还包含水溶性赋形剂，优选乳糖。
12.药用组合物，其包含有效量的如权利要求1-9中任一项所限定的产品，连同可药用的载体、赋形剂或稀释剂。
13.药用组合物，其包含有效量的如权利要求1-9中任一项所限定的产品作为媒介物，以及药理学活性剂。
14.化妆品，其包含有效量的如权利要求1-9中任一项所限定的产品作为活性组分。
15.卫生、医学或外科物品，其包含如权利要求1-9中任一项所限定的产品；优选所述物品是外科海绵、愈伤海绵，或包含于急救绷带或其它创伤敷裹材料中的部分。
16.药物胶囊或微胶囊，其包含如权利要求1-9中任一项所限定的产品。
17.产生包含透明质酸或其盐的产品的方法，其中所述透明质酸部分或全部地与α-羟酸的聚合物，优选聚(乳酸)连接或交联，该方法包含步骤：
a)将透明质酸或其盐与α-羟酸聚合物的单酰氯或二酰氯在有机溶剂中，优选在DMSO中反应。
18.根据权利要求17的方法，其中所述透明质酸或其盐优选通过革兰氏阳性细菌，更优选通过芽孢杆菌属细菌重组产生。
19.根据权利要求17或18的方法，其中所述透明质酸或其盐具有的分子量在300,000-3,000,000的范围；优选在400,000-2,500,000的范围；更优选在500,000-2,000,000的范围；并且最优选在600,000-1,800,000的范围。
20.根据权利要求17-19中任一项的方法，其中所述产品包含透明质酸的无机盐，优选透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸铵、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌或透明质酸钴。
21.根据权利要求17-20中任一项的方法，其中所述连接的或交联的透明质酸或其盐包含聚合α-羟酸的酯，优选聚(乳酸)的酯。
22.在眼科学中执行程序的方法中的改进，其包含使用如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物。
23.在骨关节炎治疗中执行程序的方法中的改进，其包含使用如权利要求1-9任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物。
24.在癌治疗中执行程序的方法中的改进，其包含使用如权利要求1-9任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物。
25.在进行透皮施用药理学活性剂的方法中的改进，其包含使用如权利要求1-9任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物。
26.在进行皮肤施用药理学活性剂的方法中的改进，其包含使用如权利要求1-9任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物。
27.在进行皮肤施用化妆品的方法中的改进，其包含使用如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物。
28.使用如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物的眼科学方法。
29.治疗骨关节炎的方法，其包含将有效量的如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物施用于哺乳动物，优选所述施用是皮肤施用、透皮施用、口服施用或通过注射施用。
30.处理创伤的方法，其包含将有效量的如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物施用于哺乳动物。
31.如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物用于制备治疗骨关节炎的药物的用途。
32.如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物用于制备眼科学治疗的药物的用途。
33.如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物用于制备治疗癌症的药物的用途。
34.如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物用于制备处理创伤的药物的用途。
35.如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物用于制备用于血管发生的药物的用途。
36.如权利要求1-9中任一项所限定的产品或如权利要求10-13中任一项所限定的组合物用于制备保湿剂的用途。
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