KR101285626B1 - 건조되고 응집된 히알루론산 생성물 - Google Patents

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Abstract

본원에서 정의된 바와 같이 건조되고 응집된, 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물, 본 발명의 생성물 또는 조성물을 포함하는 다양한 조성물 및 물품, 본 발명의 생성물의 제조 방법, 및 그것의 사용.
히알루론산, 그램-양성 박테륨, Bacillus, 히알루로네이트, 락토오스, 탈모, 대머리, 암, 관절염, 보레이트 에스테르.

Description

건조되고 응집된 히알루론산 생성물{A DRIED AND AGGLOMERATED HYALURONIC ACID PRODUCT}
본 발명은 본 발명의 생성물 또는 조성물을 포함하는 다양한 조성물 및 물품은 물론이고, 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 건조되고 응집된 생성물, 본 발명의 생성물의 제조 방법, 및 그것의 사용에 관한 것이다.
신체에서 가장 풍부한 이종다당류는 글리코사미노글리칸이다. 글리코사미노글리칸은 반복하는 이당류 유닛으로 구성되는 미분지 탄수화물 폴리머이다(오직 케라탄 술페이트가 탄수화물의 핵심 영역에서 분지된다). 이당류 유닛은 일반적으로 제 1 단당류 유닛으로서, 2개의 변형된 당 중의 1개 - N-아세틸갈락토사민(GaINAc) 또는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)을 포함한다. 제 2 유닛은 보통 글루쿠론산(GICUA) 또는 이두로네이트와 같은 우론산이다.
글리코사미노글리칸은 음으로 하전된 분자이고, 용액 중에서 높은 점도를 부여하는 확장된 입체형태를 갖는다. 글리코사미노글리칸은 주로 세포 표면에 또는 세포외 매트릭스에 위치한다. 글리코사미노글리칸은 또한 용액중에서 낮은 압축성을 가지며, 그 결과, 생리적 윤활유, 예를 들어, 관절로서 이상적이다. 글리코사미노글리칸의 강성은 구조적 통합성을 세포에 제공하고 세포들 사이에 통로를 제공 하여, 세포 이동을 허용한다. 가장 높은 생리적 중요성의 글리코사미노글리칸은 히알루로난, 콘드로이틴 황산염, 헤파린, 헤파란 황산염, 더마탄 황산염, 및 케라탄 황산염이다. 대부분의 글리코사미노글리칸은 특이적 올리고당류 구조를 통해 공유결합으로 프로테오글리칸 코어 단백질에 결합한다. 히알루로난은 특정 프로테오글리칸과 함께 큰 응집괴를 형성하지만, 자유 탄수화물 사슬이 프로테오글리칸과의 비-공유결합 복합체를 형성하기 때문에 예외이다.
체내에서 히알루로난의 수많은 역할이 확인되었다(참조, Laurent T. C. and Fraser J. R. E. , 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; 및 Toole B. P., 1991, "Proteoglycans and hyaluronan in morphogeneis and differentiation. " In: Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, Hay E. D., ed., Plenum, New York). 히알루로난은 히알린 연골, 활액 관절 유체, 및 피부 조직, 진피 및 표피 모두에 존재한다. 히알루로난은 또한 유착, 발달, 세포 운동성, 암, 혈관신생, 및 상처 치유와 같은 수많은 생리적 기능에서 역할을 갖는 것으로 추측된다. 히알루로난의 유일한 물리적 및 생물학적 성질로 인해, 눈과 관절 외과수술에 채택되고 다른 의학 과정에서 평가되고 있다.
용어 "히알루로난" 또는 "히알루론산"이 척추동물의 결합 조직의 기초 세포외 물질, 관절의 활액, 눈의 안구내부 유체, 사람 탯줄 조직 및 수탉의 볏에서, 세포 표면에서 자연적으로 발생하는, D-글루쿠론산 N-아세틸-D-글루코사민산의 잔기에 의해 구성된 다른 분자량을 갖는 산성 다당류를 의미하는 것으로 문헌에서 사용된다.
용어 "히알루론산"은 사실상 보통 변하는 분자량을 갖는 D-글루쿠론산 N-아세틸-D-글루코사민 산의 교호의 잔기를 갖는 전체 시리즈의 다당류 또는 심지어 동일한 것의 붕괴된 단편을 의미하는 것으로 사용되고 따라서 "히알루론산"의 복수 용어를 사용하는 것이 보다 정확한 것으로 보인다. 그러나, 단수의 용어가 본 명세서에서 모두 동일하게 사용될 것이고; 또한, 약어 "HA"도 이 집합적인 용어의 자리에 자주 사용될 것이다.
HA는 생물학적 기관에서 피부, 힘줄, 근육 및 연골과 같은 많은 조직의 세포를 위한 기계적인 지지체로서 중요한 역할을 하고, 그것은 세포사이의 매트릭스의 주요 성분이다. HA는 또한 조직의 수분공급, 및 윤활과 같은 생물학적 프로세스에서 다른 중요한 부분으로 역할을 한다.
비록 오늘날 전염병 병원체를 옮기는 잠재적인 위험을 최소화하고 생성물 균일성, 품질 및 이용가능성을 증가시키는 미생물학적 방법에 의해 그것을 제조하는 것이 바람직하지만, HA는 위에서 언급한 자연 조직으로부터 추출될 수 있다.
HA와 그것의 다양한 분자 크기 단편 및 각각의 그것의 염은 특히 관절병증의 치료에 있어서 약제로서, 특히 안과학 및 성형수술에서 자연 기관과 조직을 위한 보조제 및/또는 대체제로서, 그리고 화장품 제조에서 약품으로서 사용되었다. 히알루로난의 생성물은 또한 정형외과학, 류마티스학, 및 피부병학에서 사용하기 위해 개발되었다.
HA은 또한 이들 재료를 생체융화성으로 만드는 효과와 함께, 폴리우레탄, 폴리에스테르 등과 같이, 위생 및 외과 물품에 사용된 다양한 폴리머 재료를 위한 첨 가제로서 사용될 수 있다.
히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 수용성 겔 형성 재료는 약제학과 화장품 산업에서는 물론이고 예를 들어, 안과학, 골관절염의 치료와 같은 건강 케어 섹터에서 잘 알려져있고 널리 이용된다. 이들 재료는 이상적으로 건조된 형태로 판매되고, 수송되고 저장된다. 그러나, 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 건조된 생성물은 천천히 용해되는 것으로 악명높았다.
건조된 HA-생성물이 완전히 용해되는데 걸리는 시간은 특히 건강 케어 산업에서 중요한 매개변수이고, 따라서 총 용해 시간, 즉, 건조된 HA 생성물을 분산하고 가용화 하는데 걸리는 시간을 최소화하는 것이 상당한 관심이다. 본 발명은 빠르게 용해하는 히알루론산의 생성물 또는 그것의 염 및 유사한 수용성 겔 형성 재료를 제조하기 위해 유용하다.
발명의 개요
본 발명에 의해 해결될 문제는 고도의 수용성 건조 HA 생성물을 제공하는 방법이다.
본 발명은 건조된 HA 생성물의 응집작용이 생성물의 용해도를 크게 향상시키고, 따라서 바람직하게는 물이나 식염수인 수성 용매에서 매우 빠른 용해를 달성한다는 것을 보여준다.
따라서, 제 1 양태에서 본 발명은 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물에 관한 것이고, 이 생성물은 건조되고 응집되며, 바람직하게는 본원에서 개시된 바와 같이 건조되고 응집된다.
제 2 양태에서, 본 발명은 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 생성물과 활성 성분을 포함하는 조성물에 관한 것이고, 바람직하게는 활성 성분은 약리학적으로 활성제이다.
본 발명의 제 3 양태는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께, 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 효과적인 양의 생성물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제 4 양태는 약리학적으로 활성제와 함께, 매개체로서 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 효과적인 양의 생성물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제 5 양태는 활성 성분으로서 효과적인 양의 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 생성물 또는 제 2, 제 3, 또는 제 4 양태 중 어떤 것에서 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는 화장품에 관한 것이다.
제 6 양태에서, 본 발명은 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 생성물 또는 제 2, 제 3, 또는 제 4 양태 중 어느 것에서 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는, 위생, 의학 또는 외과수술 물품에 관한 것이고, 바람직하게는 물품은 기저귀, 생리대, 수술용 스폰지, 상처 치유 스폰지, 또는 반창고 또는 다른 상처 붕대 재료에 포함되는 일부분이다.
중요한 양태는 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 생성물 또는 제 2, 제 3, 또는 제 4 양태 중 어느 것에서 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는 약제 캡슐 또는 마이크로캡슐에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 중요한 양태는 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 건조되고 응집된 생성물의 제조 방법에 관한 것이고, 방법은 다음 단계를 포함한다:
a)히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물을 건조시키는 단계; 및
b)건조된 생성물을 응집하는 단계.
본 발명의 최종 양태는 안과학에서, 골관절염 또는 암, 탈모 또는 대머리의 치료에서 절차를 수행하는 방법, 상처 치료의 방법, 약리학적으로 활성제의 피부 또는 경피 투여, 또는 화장품의 피부 투여를 수행하는 방법에 관한 것이고, 개선점은 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 생성물, 또는 제 2, 제 3, 또는 제 4 양태 중 어느 것에서 정의된 바와 같은 조성물의 사용을 포함한다.
수많은 양태는 골관절염, 암의 치료를 위한 약제의 제조, 안과학적 치료를 위한 약제의 제조, 상처 치료를 위한 약제의 제조, 혈관신생을 위한 약제의 제조, 탈모 또는 대머리의 치료를 위한 약제의 제조, 또는 보습제의 제조를 위한, 청구항 1-12항 중 어느 항에서 정의된 바와 같은 생성물 또는 청구항 13-16중 어느 항에서 정의된 바와 같은 조성물의 사용에 관한 것이다.
도 1: 실시예 7에서 기술된 바와 같이, 방사능표지된 히알루론산의 4개의 다른 평균 분자량 단편의 피부 침투를 조사하였다. 결과를 표 5에 보여주고, 도 1에 도시화한다. 그들은 더 낮은 분자량 종에 대해 더 우수한 침투가 명백하였고, HA 분자량에 대한 경피 수송(유량:Flux)의 명백한 의존성이 존재한다는 것을 암시한다. 연구된 HA 크기 분율 중 어떤 것에 대해서 5와 22 시간에 측정된 명백한 유량 사이에 상당한 차이가 없었다.
도 2: 형광으로 표지된 히알루론산의 2개의 다른 평균 분자량 단편의 피부 섭취 및 분포는 레이저 스캐닝 공초점 현미경사용법을 사용하여 실시예 8에서 조사되었다. HA 분율의 평균 분자량은 300,000 및 50,000 Da였다. 50,000 Da (F-HA 0.05)의 형광으로 표지된 HA는 단지 드문드문하였고 외견상으로 층 피부각질층의 표면에서 가시적이었지만, 표지된 HA 단편은 분명히 모낭 주변 및/또는 내에서 가시적이었다. 도 2, 패널 A는 피부 표면 (층 피부각질층), 모낭 및 모간을 보여주고; 패널 B는 HA로부터의 녹색 형광성이 주로 가시적 및/또는 소낭 주변 또는 소낭에 있다는 것을 분명히 보여준다.
도 3: 도 2에서 보여진 층 피부각질층의 표면 위에 드문드문 형광성이 또다른 피부 샘플에서 확인되었고, 이것은 소낭이 존재하지 않았다. 도 3, 패널 A는 피부 표면을 보여주고; 도 3 패널 B는 표지된 HA로부터 오로지 제한된 형광성이 그 표면에서 가시적이라는 것을 보여준다.
도 4: 300,000 Da (F-HA 0.30)의 형광으로 표지된 HA로 유사한 관찰을 하였고, 이것은 또한 모낭 주변에 분명히 가시적이었다. 도 4, 패널 A는, 피부 표면 (층 피부각질층), 모낭 및 모간을 보여주고; 패널 B은 소낭 주변의 표지된 HA로부터 녹색 형광성을 보여준다.
도 5: 그러나, 300,000 Da의 표지된 HA 단편은 또한 단지 드문드문하였고 피부 표면에서 외견상으로 가시적이었지만, 그것은 피부 표면에 있는 케라티노사이트 사이의 차별적인 축적을 분명히 보여주었다. 도 5, 패널 A는 피부 표면을 보여주 고; 패널 B는 표지된 HA로부터 제한된 형광성은 그 표면에서 가시적이지만, 그것은 케라티노사이트 사이에 축적된다는 것을 보여준다.
정의
핵산 구성물
"핵산 구성물"은 핵산 분자로서 자연적으로 발생하는 유전자로부터 분리되거나 또는 자연에서 달리 존재하지 않을 방식으로 조합되고 병치되는 핵산의 세그먼트를 함유하도록 변형된, 단일- 또는 이중-가닥 중의 하나로 본원에서 정의된다. 용어 핵산 구성물은 핵산 구성물이 코딩 서열의 발현에 필요한 모든 대조군 서열을 함유할 때, 용어 발현 카세트와 동의어가 될 수 있다. 용어 "코딩 서열"은 아래에 언급한 대조군 서열의 제어하에 놓일 때, mRNA로 전사되고 관심의 효소로 번역되는 서열로서 본원에서 정의된다. 코딩 서열의 경계는 mRNA의 5' 단부에서 개방 판독 프레임의 바로 상류에 위치하는 리보솜 결합 부위 및 mRNA의 3' 단부에서 개방 판독 프레임의 바로 하류에 위치한 전사 종결자 서열에 의해 일반적으로 결정된다. 코딩 서열은 이것으로 제한되지는 않지만, DNA, cDNA, 및 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 분리하거나 클로닝하는데 사용된 기술은 당업계에 잘 알려져있고 예를 들어, 게놈 DNA로부터의 분리, cDNA로부터의 제조, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 그러한 게놈 DNA로부터 핵산 서열의 클로닝은 예를 들어, 공유된 구조적 특징을 클로닝된 DNA 단편을 검출하기 위해 발현 라이브러리의 항체스크리닝을 사용함으로써 또는 잘 알려진 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 이루어질 수 있다. 참조, 예를 들어, Innis et al., 1990, PCR Protocols: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. 리가아제 연쇄 반응, 라이게이션된 활성화 전사, 및 핵산 서열-기반 증폭과 같은 다른 핵산 증폭 과정이 사용될 수 있다. 클로닝 과정은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 원하는 핵산 단편의 절제와 분리, 벡터 분자 안으로 단편의 삽입, 및 재조합 벡터의 핵산 서열의 클론이 복제될 Bacillus 세포 안으로의 혼입을 수반할 수 있다. 핵산 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반-합성, 합성 기원, 또는 그들의 어떠한 조합이 될 수 있다.
효소를 코딩하는 분리된 핵산 서열은 효소의 발현을 공급하기 위한 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 구성물 또는 벡터 안으로 그것의 삽입에 앞서 핵산 서열의 조작은 발현 벡터 또는 Bacillus 숙주 세포에 따라 바람직하거나 또는 필요할 수 있다. 클로닝 방법을 이용하여 핵산 서열을 변형하기 위한 기술은 당업계에 잘 알려져있다. 핵산 서열은 또한 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 생체내 숙주 세포에서 조작될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
수많은 효소가 히알루론산의 생합성에 관여한다. 이들 효소는 히알루로난 신타아제, UDP-글루코스 6-탈수소효소, UDP-글루코스 피로포스포릴라제, UDP-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 헥소키나제, 포스포글루코뮤타아제, 아미도트랜스페라제, 뮤타아제, 및 아세틸 트랜스페라제를 포함한다. 히알루로난 신타아제는 히알루론산의 제조에서 키 효소이다.
"히알루로난 신타아제"은 GICUA 및 GIcNAc 당 전구물질의 첨가에 의해 히알 루로난 사슬의 신장을 촉진시키는 신타아제로서 본원에서 정의된다. 연쇄구균 히알루로난 신타아제, 척추동물 히알루로난 신타아제, 및 바이러스 히알루로난 신타아제의 아미노산 서열은 Pasteurella 히알루로난 신타아제로부터 구별되고, 그룹 I 및 그룹 II 히알루로난 신타아제로서의 분류가 제안되었고, 그룹 I 히알루로난 신타아제는 연쇄구균 히알루로난 신타아제를 포함한다 (DeAngelis, 1999). Bacillus 숙주 세포에서 히알루로난의 제조를 위해, 포유류 히알루로난 신타아제와 같은 진핵생물 기원의 히알루로난 신타아제가 덜 바람직하다.
서열을 코딩하는 히알루로난 신타아제는 Bacillus 숙주 세포에서 발현될 수 있는 어떠한 핵산 서열이 될 수 있다. 핵산 서열은 어떤 기원이 될 수 있다. 바람직한 히알루로난 신타아제 유전자는 Streptococcus equisimilis , Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, 및 Streptococcus equi subsp. zooepidemicus로부터의 그룹 I 히알루로난 신타아제 유전자, 또는 Pasturella multocida의 그룹 II 히알루로난 신타아제 유전자와 같은, 그룹 I 또는 그룹 II 중 어떤 것을 포함한다.
그로인해 히알루로난의 전구물질 당이 숙주 세포에 공급되는 구성물은 바람직하게는 본 발명의 HA를 제조하는데 있어서, 배양 배지가 되거나, 또는 Bacillus 숙주 세포에서 내인성 유전자에 의해, 비-내인성 유전자에 의해, 또는 내인성 및 비-내인성 유전자의 조합에 의해 코딩됨으로써이다. 전구물질 당은 D-글루쿠론산 또는 N-아세틸-글루코사민이 될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 핵산 구성물은 히알루로난의 전구물질 당의 생합성에서 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 더 포함할 수 있다. 대안으로서 Bacillus 숙주 세포는 전구물질 당의 생합성에서 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 하나 이상의 제 2 핵산 구성물을 더 포함할 수 있다. 히알루로난 제조는 히알루로난의 전구물질 당의 합성 경로에서 단계를 지시하는 유전자 또는 유전자들을 코딩하는 핵산 서열 또는 서열들을 갖는 구성물의 사용에 의해 개선된다. "히알루로난의 전구물질 당의 합성 경로에서 단계를 지시하는 것"은 유전자의 발현된 단백질이 N-아세틸-글루코사민 또는 D-글루쿠론산, 또는 N-아세틸-글루코사민 및 D-글루쿠론산 중 어느 하나의 전구물질인 당의 형성에서 활성이라는 것을 의미한다.
전구물질 당을 공급하기 위한 바람직한 방법에서, 히알루로난의 전구물질 당의 합성 경로에서의 단계를 지시하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 이종유래 촉진자 영역을 갖는 재조합 구성물을 갖는 숙주 세포를 배양함으로써, 히알루로난 신타아제를 갖는 숙주 세포에서 히알루로난 제조를 개선하기 위해 구성물이 제공된다. 바람직한 방법에서 숙주 세포는 또한 히알루로난 신타아제에 작동가능하게 연결된 촉진자 영역을 갖는 재조합 구성물을 또한 포함하고, 이것은 N-아세틸-글루코사민의 생합성에 수반된 신타아제에 대한 핵산 서열과 동일하거나 또는 다른 촉진자 영역을 사용할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 히알루로난의 전구물질 당의 합성에 수반된 제 2 유전자를 코딩하는 다른 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 촉진자 영역을 갖는 재조합 구성물을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 히알루로난의 전구물질 당의 합성 경로에서 단계를 지시하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 구성물의 사용에 의해 히알루로난 제조를 개선하기 위한 구성물에 관한 것이다. 전구물질 당에 대한 핵산 서열은 히알루로난 신타아제를 코딩하는 핵산 서열로서 동일하거나 또는 다른 촉진자로부터 발현될 수 있다.
히알루론산의 제조를 위해 전구물질 당의 생합성에 수반된 유전자는 UDP-글루코스 6-탈수소효소 유전자, UDP-글루코스 피로포스포릴라제 유전자, UDP-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제 유전자, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 유전자, 헥소키나제 유전자, 포스포글루코뮤타아제 유전자, 아미도트랜스페라제 유전자, 뮤타아제 유전자, 및 아세틸 트랜스페라제 유전자를 포함한다.
히알루로난 신타아제를 함유하는 세포에서, hasE은 물론이고, 각각 Bacillus subtilis tuaD, gtaB, 및 gcaD과 같은, hasB, hasC 및 hasD중의 어느 하나 또는 2이상의 조합, 또는 그것의 상동은 히알루로난 신타아제에 이용가능한 전구물질 당의 풀을 증가시키기 위해 발현될 수 있다. Bacillus subtilis 게놈은 Kunst, et al., Nature 390,249-256, "그램-양성 박테륨 Bacillus subtilis의 완전한 게놈 서열" (1997년 11월 20일)에 기술된다. 숙주 세포가 천연 히알루로난 신타아제 활성을 갖지 않는 경우와 같은 어떤 경우에, 구성물은 hasA 유전자를 포함할 수 있다.
생합성 효소를 코딩하는 핵산 서열은 숙주 세포에 선천적일 수 있는 반면, 다른 경우에 이종유래 서열이 이용될 수 있다. hasA, hasB, hasC 및 hasD을 포함하는 Streptococcus equisimilis의 HAS 오페론의 유전자와 같이, 2 이상의 유전자가 발현된다면 그들은 천연 오페론에서 서로 연합되는 유전자가 될 수 있다. 다른 경우에, 오페론의 각각의 원소가 포함되지 않은, 전구물질 유전자 서열의 일부 조 합의 사용은 바람직할 수 있다. 숙주 세포에 선천적인 일부 유전자의 사용, 및 외인성인 다른 것들은 또한 다른 경우에 바람직할 수 있다. 선택은 주어진 숙주 세포에서 당의 이용가능한 풀(pool), 숙주 세포의 다른 기능을 방해하지 않고 과생산을 조절하기 위한 세포의 능력, 및 세포가 외인성 유전자 이외에 달리 그것의 천연 유전자로부터 발현을 조절하는지 여부에 의존할 것이다.
하나의 예로서, 세포의 대사 요구조건 및 성장 조건, 및 이용가능한 전구물질 당 풀에 의존하여, hasD 유전자, Bacillus gcaD 유전자, 및 그것의 상동과 같은 UDP-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제를 코딩하는 핵산 서열의 발현에 의해, N-아세틸-글루코사민의 제조를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로서 전구물질 당은 D-글루쿠론산이 될 수 있다. 하나의 그러한 구체예에서, 핵산 서열은 UDP-글루코스 6-탈수소효소를 코딩한다. 그러한 핵산 서열은 Bacillus tuaD 유전자, Streptococcus의 hasB 유전자, 및 그것의 상동을 포함한다. 핵산 서열은 또한 Bacillus gtaB 유전자, Streptococcus의 hasC, 및 그것의 상동에서와 같이, UDP- 글루코스 피로포스포릴라제를 코딩할 수 있다. 본 발명의 방법에서, UDP-글루코스 6-탈수소효소 유전자는 hasB 유전자 또는 tuaD 유전자; 또는 그것의 상동체가 될 수 있다.
본 발명에 있어서 히알루로난 신타아제 유전자 및 전구물질 당을 코딩하는 하나 이상의 유전자는 동일한 촉진자의 제어하에 있다는 것이 계획된다. 대안으로서 전구물질 당을 코딩하는 하나 이상의 유전자는 동일한 촉진자의 제어 하에 있지만 다른 촉진자는 히알루로난 신타아제 유전자를 추진한다. 더 나아간 대안은 히알루로난 신타아제 유전자 및 전구물질 당을 코딩하는 유전자의 각각이 다른 촉진자의 제어하에 있다는 것이다. 바람직한 구체예에서, 히알루로난 신타아제 유전자 및 전구물질 당을 코딩하는 하나 이상의 유전자가 동일한 촉진자의 제어하에 있다.
본 발명은 또한 히알루로난 신타아제 유전자 및 UDP-글루코스 6-탈수소효소 유전자, 및 선택적으로 UDP-글루코스 피로포스포릴라제 유전자, UDP-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제 유전자, 및 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 히알루로난 신타아제 오페론을 코딩하는 분리된 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성물에 관한 것이다.
어떤 경우에는 숙주 세포가 히알루로난의 전구물질 당의 합성 경로에서 단계를 지시하는 유전자를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 이종유래 촉진자 영역을 갖는 재조합 구성물을 가질 것이고, 이것은 재조합 구성물로부터 히알루로난 신타아제의 발현과 협력할 수 있다. 히알루로난 신타아제는 전구물질의 생합성에 수반된 효소를 코딩하는 핵산 서열과 동일하거나 또는 다른 촉진자 영역으로부터 발현될 수 있다. 또다른 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 히알루로난의 전구물질 당의 합성에 수반된 제 2 유전자를 코딩하는 다른 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 촉진자 영역을 갖는 재조합 구성물을 가질 수 있다.
전구물질 당(들)의 생합성에 수반된 효소를 코딩하는 핵산 서열은 히알루로난 신타아제를 코딩하는 핵산 서열과 동일하거나 또는 다른 촉진자로부터 발현될 수 있다. 전자의 의미에서, "인공 오페론"이 구성되고, 이것은 각각의 hasA, hasB, hasC 및 hasD, 또는 그것이 상동을 갖는 데 있어서, Streptococcus equisimilis의 오페론을 흉내낼 수 있고 또는, 대안으로서 Streptococcus equisimilis 오페론에 존재하는 전체 미만의 보체를 이용할 수 있다. 인공 오페론"은 또한 헥소키나제 유전자, 포스포글루코뮤타아제 유전자, 아미도트랜스페라제 유전자, 뮤타아제 유전자, 및 아세틸 트랜스페라제 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자는 물론이고, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 유전자 (hasE)를 포함할 수 있다. 인공 오페론에서, 촉진자 영역이 코딩 서열에 대해 이종유래인 것과 같이, 원소들 중 적어도 하나는 원소들의 서로에 대해 이종유래이다.
바람직한 구체예에서, 핵산 구성물은 hasA, tuaD, 및 gtaB을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 핵산 구성물은 hasA, tuaD, gtaB, 및 gcaD을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 핵산 구성물은 hasA과 tuaD를 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 핵산 구성물은 hasA를 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 핵산 구성물은 hasA, tuaD, gtaB, gcaD, 및 hasE을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 핵산 구성물은 hasA, hasB, hasC, 및 hasD을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 핵산 구성물은 hasA, hasB, hasC, hasD, 및 hasE를 포함한다. 상기 바람직한 구체예에 기초하여, 명시된 유전자는 그것의 상동체로 치환될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 핵산 구성물은 히알루로난 신타아제 코딩 서열에 이질적인 촉진자 서열에 작동가능하게 연결된 히알루로난 신타아제 코딩 서열을 포 함한다. 촉진자 서열은 예를 들어, 단일 촉진자 또는 일렬 촉진자가 될 수 있다.
"촉진자"는 본원에서 유전자의 전사를 개시하는 RNA 폴리머라제의 결합에 수반된 핵산 서열로서 정의된다. "일렬 촉진자"는 그것의 각각이 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고 코딩 서열의 mRNA로의 전사를 매개하는 2개 이상의 촉진자 서열로서 본원에서 정의된다. "작동가능하게 연결된"은 본원에서 제어 서열, 예를 들어, 촉진자 서열이, 제어 서열이 코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 제조를 지시하도록 하는 코딩 서열에 대한 위치에 적절하게 위치하는 구성으로서 정의된다. 앞서 명시한 바와 같이, "코딩 서열"은 적절한 제어 서열의 제어하에 놓일 때, mRNA로 전사되고 폴리펩티드로 번역되는 핵산 서열로서 본원에서 정의된 바와 같다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 mRNA의 5' 단부에서 개방 판독 프레임의 바로 상류에 위치한 리보솜 결합 부위와 mRNA의 3' 단부에서 개방 판독 프레임의 바로 하류에 위치한 전사 종결자 서열에 의해 결정된다. 코딩 서열은 이것으로 제한되지는 않지만, 게놈 DNA, cDNA, 반합성, 합성, 및 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 촉진자 서열은 세균 공급원으로부터 얻을 수 있다. 보다 바람직한 구체예에서, 촉진자 서열은 Bacillus 균주, 예를 들어, Bacillus agaradherens, Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus brevis, Bacillus circulans , Bacillusclausii , Bacillus coagulans , Bacillus firmus, Bacillus lautus , Bacillus lentus , Bacillus licheniformis , Bacillus megaterium, Bacillus pumilus , Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis, 또는 Bacillus thuringiensis와 같은 그램 양성 박테륨으로부터 또는 Streptomyces 균주, 예를 들어, Streptomyces lividans 또는 Streptomyces murinus; 또는 그램 음성 박테륨, 예를 들어, E. coli 또는 Pseudomonas sp로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에서 핵산 서열의 전사를 지시하기 위해 적절한 촉진자의 예는 E. coli lac 오페론, Streptomyces coelicolor agarase 유전자 (dagA), Bacillus lentus 또는 Bacillusclausii 알칼리성 프로테아제 유전자 (aprH), Bacillus licheniformis 알칼리성 프로테아제 유전자 (subtilisin Carlsberg gene), Bacillus subtilis levansucrase 유전자 (sacB), Bacillus subtilis 알파-아밀라제 유전자 (amyE), Bacillus licheniformis 알파-아밀라제 유전자 (amyL), Bacillus stearothermophilus 말토제닉 아밀라제 유전자 (amyM), Bacillus amyloliquefaciens 알파-아밀라제 유전자 (amyQ), Bacillus licheniformis penicillinase 유전자 (penP), Bacillus subtilis xylA 및 xylB 유전자, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis CryIIIA 유전자 (cryIIIA) 또는 그것의 일부분, 원핵 베타-락타마제 유전자로부터 얻어진 촉진자이다 (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731). 다른 예들은 spo1 세균 파지 촉진자 및 tac 촉진자의 촉진자이다 (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). 더 나아간 촉진자는 Scientific American, 1980,242:74-94에서의 "재조합 박테리아로부터의 유용한 단백질" ; 및 Sambrook, Fritsch, 및 Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 제 2판, Cold Spring Harbor, New York에 기술된 다.
촉진자는 또한 "-35" 영역에 대해 서열 TTGACA과 "-10" 영역에 대해 TATAAT를 갖는 "컨센서스" 촉진자가 될 수 있다. 컨센서스 촉진자는 Bacillus 숙주 세포에서 기능할 수 있는 어떠한 촉진자로부터 얻을 수 있다. "컨센서스" 촉진자의 구성은 Bacillus subtilis에 대해서 증식형 "시그마 A-형" 촉진자의 "10" 및 "-35" 영역에 대해서 성립된 컨센서스 서열에 보다 정확하게 합치되는 촉진자를 생성하는 부위-지시적 돌연변이에 의해 수행될 수 있다(Voskuil et al., 1995, Molecular Microbiology 17: 271-279).
바람직한 구체예에서, "컨센서스" 촉진자는 E. coli lac 오페론, Streptomyces coelicolor agarase 유전자 (dagA), Bacillus clausii 또는 Bacillus lentus 알칼리성 프로테아제 유전자 (aprH), Bacillus licheniformis 알칼리성 프로테아제 유전자 (subtilisin Carlsberg gene), Bacillus subtilis levansucrase 유전자 (sacB), Bacillus subtilis 알파-아밀라제 유전자 (amyE), Bacillus licheniformis 알파-아밀라제 유전자 (amyL), Bacillus stearothermophilus 말토제닉 아밀라제 유전자 (amyM), Bacillus amyloliquefaciens 알파-아밀라제 유전자 (amyQ), Bacillus licheniformis penicillinase 유전자 (penP), Bacillus subtilis xylA 및 xylB 유전자, Bacillus thuringiensis subsp. tenebrioniscryIIIA 유전자 (cryIIIA) 또는 그것의 일부분으로부터 얻어진 촉진자, 또는 원핵 베타-락타마제 유전자 spo1 세균 파지 촉진자로부터 얻어진다. 보다 바람직한 구체예에서, "컨센서스" 촉진자는 Bacillus amyloliquefaciens 알파-아밀라제 유전자 (amyQ)로부터 얻어진다.
Widner, et al., 미국 특허 Nos. 6,255,076 및 5,955,310는 짧은 컨센서스 amyQ 촉진자(또한 scBAN라고 불림)를 포함하여, Bacillus 세포에서 발현에서 사용하기 위한 일렬 촉진자 및 구성물 및 방법을 기술한다. cryIIIA 안정제 서열의 사용, 및 Bacillus의 향상된 제조를 위한, 그 서열을 사용한 구성물이 본원에서 또한 기술된다.
일렬 촉진자의 각각의 촉진자 서열은 돌연변이, 끝을자른, 및 잡종 촉진자를 포함하여 선택의 Bacillus 세포에서 전사적 활성을 보여주는 어떤 핵산 서열이 될 수 있고, Bacillus 세포와 동종 또는 이종유래 중의 하나인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 얻어질 수 있다. 각각의 촉진자 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 천연 또는 외래 그리고 Bacillus 세포에 천연 또는 외래가 될 수 있다. 촉진자 서열은 동일한 촉진자 서열 또는 다른 촉진자 서열이 될 수 있다.
일렬 촉진자의 2개 이상의 촉진자 서열은 동시에 핵산 서열의 전사를 촉진할 수 있다. 대안으로서, 일렬 촉진자의 촉진자 서열중 하나 이상은 Bacillus 세포의 성장의 다른 단계에서 핵산 서열의 전사를 촉진할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 Bacillus amyloliquefaciens 알파-아밀라제 유전자의 적어도 amyQ 촉진자를 함유한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 "-35" 영역에 대해 서열 TTGACA 및 "-10" 영역에 대해 TATAAT을 갖는 적어도 "컨센서스" 촉진자를 함유한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자 는 Bacillus licheniformis 알파-아밀라제 유전자의 적어도 amyL 촉진자를 함유한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 적어도 cryIIIA 촉진자 또는 그것의 일부를 함유한다 (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107).
보다 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 적어도 amyL 촉진자 및 cryIIIA 촉진자를 함유한다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 적어도 amyQ 촉진자 및 cryIIIA 촉진자를 함유한다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 적어도 "-35" 영역에 대해 서열 TTGACA 및 "-10" 영역에 대해 TATAAT를 갖는 "컨센서스" 촉진자 및 cryIIIA 촉진자를 함유한다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 적어도 2 복사의 amyL 촉진자를 함유한다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 적어도 2 복사의 amyQ 촉진자를 함유한다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 "-35" 영역에 대해 서열 TTGACA 및 "-10" 영역에 대해 TATAAT를 갖는, 적어도 2 복사의 "컨센서스" 촉진자를 함유한다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, 일렬 촉진자는 적어도 2 복사의 cryIIIA 촉진자를 함유한다.
"mRNA 프로세싱/안정화 서열"은 하나 이상의 촉진자 서열의 하류와, 각각의 촉진자 서열로부터 합성되는 모든 mRNA가 프로세싱되어 전사의 5' 단부에서 안정제 서열을 갖는 mRNA 전사를 생성할 수 있도록 하나 이상의 촉진자 서열의 각각이 작동가능하게 연결되는 코딩 서열의 상류에 위치한 서열로서 본원에서 정의된다. mRNA 전사의 5'단부에서 그러한 안정제 서열의 존재는 그들의 반감기를 증가시킨 다(Agaisse and Lereclus, 1994, 상기, Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465- 3471). mRNA 프로세싱/안정화 서열은 세균 16S 리보솜 RNA의 3' 말단에 상보적이다. 바람직한 구체예에서, mRNA 프로세싱/안정화 서열은 전사의 5' 단부에서 안정화 서열을 갖는 본질적으로 단일-크기 전사를 생성한다. mRNA 프로세싱/안정화 서열은 바람직하게는 하나이고, 이것은 세균 16S 리보솜 RNA의 3' 말단에 상보적이다. 참조, 미국 특허 Nos. 6,255,076 및 5,955,310.
보다 바람직한 구체예에서, mRNA 프로세싱/안정화 서열은 상기 WO 94/25612 및 Agaisse and Lereclus, 1994에서 개시된 Bacillus thuringiensiscryIIIA mRNA 프로세싱/안정화 서열 또는 mRNA 프로세싱/안정화 기능을 보유하는 그것의 일부이다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, mRNA 프로세싱/안정화 서열은 Hue et al., 1995, 상기에서 개시된 Bacillus subtilis SP82 mRNA 프로세싱/안정화 서열 또는 mRNA 프로세싱/안정화 기능을 보유하는 그것의 일부이다.
cryIIIA 촉진자 및 그것의 mRNA 프로세싱/안정화 서열이 본 발명의 방법에 있어서 채택될 때, 상기 WO 94/25612 및 Agaisse and Lereclus, 1994에서 개시된 서열 또는 촉진자 및 mRNA 프로세싱/안정화 작용을 보유하는 그것의 일부를 함유하는 DNA 단편이 사용될 수 있다. 더나아가, 오직 cryIIIA 촉진자 또는 오직 cryIIIA mRNA 프로세싱/안정화 서열을 함유하는 DNA 단편은 다양한 일렬 촉진자 및 mRNA 프로세싱/안정화 서열 조합을 구성하기 위해 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 본 구체예에서, cryIIIA 촉진자 및 그것의 mRNA 프로세싱/안정화 서열은 바람직하게는 일렬 촉진자를 구성하는 다른 촉진자 서열(들)의 하류 와 관심의 유전자의 코딩 서열의 상류에 위치한다.
히알루론산 제조에 수반된 원하는 효소(들)을 코딩하는 분리된 핵산 서열은 핵산 서열의 발현을 개선하도록 더욱 촉진될 수 있다. 발현은 이것으로 제한되지는 않지만, 전사, 후-전사 변형, 번역, 후-번역 변형, 및 분비를 포함하여 폴리펩티드의 제조에 수반된 어떤 단계를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 클로닝 방법을 이용하여 핵산 서열을 변형하는 기술은 당업계에 잘 알려져있다.
효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성물은 제어 서열과 친화성있는 조건하에서 Bacillus 세포에서 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
용어 "제어 서열"은 핵산 서열의 코딩 서열의 발현에 필요하거나 유익한 모든 성분들을 포함하도록 본원에서 정의된다. 각각의 제어 서열은 효소를 코딩하는 핵산 서열에 대해 천연 또는 외래가 될 수 있다. 위에서 상술한 촉진자 서열에 더하여, 그러한 제어 서열은 이것으로 제한되지는 않지만, 리더, 신호 서열, 및 전사 종결부위를 포함한다. 적어도, 제어 서열은 촉진자, 및 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 제어 서열은 효소를 코딩하는 핵산 서열의 코딩 영역을 갖는 제어 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특이적 제한 부위를 도입하려는 목적을 위해 링커가 제공될 수 있다.
제어 서열은 또한 적절한 전사 종결자 서열, Bacillus 세포에 의해 인식되어 전사를 종결하는 서열이 될 수 있다. 종결자 서열은 오페론의 효소 또는 마지막 효소를 코딩하는 핵산 서열의 3' 종말에 작동가능하게 연결된다. 선택의 Bacillus 세포에서 작용하는 어떠한 종결자가 본 발명에서 사용될 수 있다.
제어 서열은 또한 적합한 리더 서열, 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 미번역된 영역이다. 리더 서열은 효소를 코딩하는 핵산 서열의 5' 종말에 작동가능하게 연결된다. 선택의 Bacillus 세포에서 작용하는 어떠한 리더 서열이 본 발명에서 사용될 수 있다.
제어 서열은 또한 신호 펩티드 코딩 영역이 될 수 있고, 이것은 발현된 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 지시할 수 있는 폴리펩티드의 아미노 종말에 연결된 아미노산 서열에 대해 코딩한다. 신호 펩티드 코딩 영역은 폴리펩티드에 선천적이 될 수 있고 또는 외래 공급원으로부터 얻을 수 있다. 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 단부는 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 세그먼트를 갖는 번역 판독 프레임에서 선천적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 본래부터 함유할 수 있다. 대안으로서 코딩 서열의 5' 단부는 분비된 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 서열의 일부와 이종인 신호 펩티드 코딩 영역을 함유할 수 있다. 코딩 서열이 신호 펩티드 코딩 영역을 정상적으로 함유하지 않는 이종(외래) 신호 펩티드 코딩 영역이 필요할 수 있다. 대안으로서 이종 신호 펩티드 코딩 영역은 코딩 서열과 정상적으로 연합된 선천 신호 펩티드 코딩 영역에 비해 강화된 폴리펩티드의 분비를 얻기 위해 선천 신호 펩티드 코딩 영역을 간단히 대체할 수 있다. Bacillus 종으로부터 아밀라제 또는 프로테아제 유전자로부터 신호 펩티드 코딩 영역을 얻을 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 선택의 Bacillus 세포의 분비 경로 안으로 향하게 할 수 있는 어떠한 신호 펩티드 코딩 영역을 본 발명에서 사용할 수 있다.
Bacillus 세포에 대해 효과적인 신호 펩티드 코딩 영역은 Bacillus NCIB 11837로부터의 말토제닉 아밀라제 유전자, Bacillus stearothermophilus 알파-아밀라제 유전자, Bacillus licheniformis subtilisin 유전자, Bacillus licheniformis 베타-락타마제 유전자, Bacillus stearothermophilus 중성 프로테아제 유전자 (nprT, nprS,nprM), 및 Bacillus subtilis prsA 유전자로부터 얻어진 신호 펩티드 코딩 영역이다. 더 나아간 신호 펩티드는 Simonen and Palva에 의해, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137에서 기술된다.
제어 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 종말에 위치한 아미노산 서열에 대해 코딩하는 프로펩티드 코딩 영역이 될 수 있다. 결과의 폴리펩티드는 효소전구체 또는 프로폴리펩티드로 알려진다 (또는 어떤 경우에 효소원). 프로폴리펩티드는 일반적으로 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매 또는 자체촉매 분할에 의해 비활성이고 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. Bacillus subtilis 알칼리성 프로테아제 (aprE) 및 Bacillus subtilis 중성 프로테아제 (nprT)에 대한 유전자로부터 프로펩티드 코딩 영역을 얻을 수 있다.
신호 펩티드와 프로펩티드 영역 둘다 폴리펩티드의 아미노 종말에 존재할때, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 종말 옆에 위치하고 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 종말 옆에 위치한다.
숙주 세포의 성장에 대해 폴리펩티드의 발현의 조절을 허용하는 조절 서열을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 조절 시스템의 예는 조절 화합물의 존재를 포함하는 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여, 유전자의 발현이 시작되거나 멈추게 하 는 것들이다. 원핵 시스템에서 조절 시스템은 lac, tac, 및 trp 작동 시스템을 포함한다.
제조
본 발명의 방법에 있어서, 숙주 세포는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 히알루론산의 제조에 적합한 영양분 배지에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 적절한 배지에서 수행된 실험실 또는 산업 배양기에서, 그리고 히알루론산 합성에 관여된 효소를 발현시키고 히알루론산을 분리시키는 조건하에서, 셰이크 플라스크 배양, 소규모 또는 대규모 발효 (연속, 배치, 공급-배치, 또는 고체상태 발효를 포함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당업계에 알려진 과정을 사용하여, 탄소 및 질소 공급원 및 무기 염을 포함하는 적절한 영양분 배지에서 일어난다. 시중 공급업체로부터 적절한 배지를 이용가능하고 또는 공개된 조성에 따라 제조할 수 있다(예를 들어, American Type Culture Collection의 카탈로그에서). 분비된 히알루론산은 배지로부터 직접 회수할 수 있다.
결과의 히알루론산은 당업계에 알려진 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 히알루론산은 이것으로 제한되지는 않지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 종래의 과정에 의해 영양분 배지로부터 분리될 수 있다. 분리된 히알루론산은 그후 이것으로 제한되지는 않지만, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화력, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기이동 과정(예를 들어, 예비 등전위 포커싱), 차별적 용해도 (예를 들어, 황산암모늄 침전), 또는 추출(참조, 예를 들어, Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)를 포함하여 당업계에 알려진 다양한 절차에 의해 더욱 정제될 수 있다.
상세한 설명
히알루론산
"히알루론산"은 교호의 베타-1,4 및 베타-1,3 글리코시드 결합에 의해 함께 연결된 N-아세틸글루코사민(GIcNAc) 및 글루쿠론산(GICUA)의 반복되는 이당류 유닛으로 이루어진 비술페이트화 글리코사미노글리칸으로서 본원에서 정의된다. 히알루론산은 또한 히알루로난, 히알루로네이트, 또는 HA로 알려져있다. 용어 히알루로난과 히알루론산은 본원에서 상호교환하여 사용된다.
수탉 볏은 히알루로난을 위한 중요한 상업적 공급원이다. 미생물은 대안적인 공급원이다. 미국 특허 No. 4,801,539은 리터당 약 3.6g의 히알루론산의 보고된 수율로 Streptococcus zooepidemicus의 균주를 수반하는 히알루론산을 제조하기 위한 발효 방법을 개시한다. 유럽 특허 No. EP0694616는 리터당 약 3.5 g의 히알루론산의 보고된 수율로 Streptococcus zooepidemicus의 개량된 균주를 사용하는 발효 공정을 개시한다. 본원에서 전체가 포함되는 WO 03/054163 (Novozymes)에서 개시된 바와 같이, 히알루론산 또는 그것의 염은 예를 들어, 그램-양성 Bacillus 숙주에서 재조합으로 제조될 수 있다.
히알루로난 신타아제는 척추동물, 세균 병원체, 및 조류 바이러스로부터 설명된다(DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci. 56: 670-682). WO 99/23227는 Streptococcus equisimilis로부터 그룹 I 히알루로네이트 신타아제를 설명한다. WO 99/51265와 WO 00/27437는 Pasturella multocida로부터 그룹 II 히알루로네이트 신타아제를 설명한다. Ferretti et al.은 각각 히알루로네이트 신타아제, UDP 글루코스 탈수소효소, 및 UDP-글루코스 피로포스포릴라제를 인코딩하는, 3개의 유전자, hasA, hasB, 및 hasC로 이루어진, Streptococcus pyogene의 히알루로난 신타아제 오페론을 개시한다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98,4658-4663, 2001). WO 99/51265는 Streptococcus equisimilis 히알루로난 신타아제에 대한 코딩 영역을 갖는 핵산 세그먼트를 설명한다.
재조합 Bacillus 세포의 히알루로난은 직접적으로 배양 배지에 발현되기 때문에, 배양 배지로부터 히알루로난을 분리하기 위해 간단한 공정이 사용될 수 있다. 먼저, Bacillus 세포 및 세포 조직파편은 배양 배지로부터 물리적으로 제거된다. 배양 배지는 원한다면, 배지의 점도를 줄이기 위해서, 먼저 희석된다. 원심분리 또는 마이크로여과와 같이, 배양 배지로부터 세포를 제거하기 위한 많은 방법이 당업자들에게 알려져있다. 만일 원한다면, 남아있는 상청액은 그후 히알루로난로부터 작은 분자 오염물질을 농축시키고 제거하기 위해 울트라여과 등으로 여과될 수 있다. 세포와 세포 조직파편의 제거 후에, 배지로부터 히알루로난의 간단한 침전이 공지된 메카니즘에 의해 수행된다. 염, 알코올, 또는 염과 알코올의 조합이 여과액으로부터 히알루로난을 침전시키는데 사용될 수 있다. 일단 침전물로 환원되면, 히알루로난은 물리적 수단에 의해 용액으로부터 쉽게 분리될 수 있다. 히알루로난은 분무 건조와 같은 당업계에 공지된 증발 기술을 사용함으로써 건조되거나 여과액 용액으로부터 농축될 수 있다.
본 발명의 제 1 양태는 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물에 관한 것이고, 이 생성물은 본원에서 정의된 바와 같이 건조되고 응집된다.
숙주 세포
바람직한 구체예는 제 1 양태의 생성물에 관한 것이고, 이때 히알루론산 또는 그것의 염은 바람직하게는 그램-양성 박테륨 또는 숙주 세포에 의해, 보다 바람직하게는 속(genus) Bacillus의 박테륨에 의해, 재조합으로 제조된다.
숙주 세포는 히알루론산의 재조합 제조에 적합한 어떠한 Bacillus 세포가 될 수 있다. Bacillus 숙주 세포는 야생형 Bacillus 세포 또는 그것의 돌연변이가 될 수 있다. 본 발명의 실행에 유용한 Bacillus 세포는 이것으로 제한되지는 않지만, Bacillus agaraderhens , Bacillus alkalophilus , Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus brevis , Bacillus circulans , Bacillusclausii, Bacillus coagulans , Bacillus firmus , Bacillus lautus , Bacillus lentus , Bacillus licheniformis , Bacillus megaterium , Bacillus pumilus , Bacillus stearothermophilus , Bacillus subtilis, and Bacillus thuringiensis 세포를 포함한다. 특히 재조합 발현에 적응된 돌연변이 Bacillus subtilis 세포는 WO 98/22598에서 기술된다. 비-캡슐화 Bacillus 세포는 특히 본 발명에 유용하다.
바람직한 구체예에서, Bacillus 숙주 세포가 Bacillus amyloliquefaciens , Bacillus clausii , Bacillus lentus , Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus 또는 Bacillus subtilis 세포이다. 보다 바람직한 구체예에서, Bacillus 세포는 Bacillus amyloliquefaciens 세포이다. 또다른 보다 바람직 한 구체예에서, Bacillus 세포는 Bacillus clausii 세포이다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, Bacillus 세포는 Bacillus lentus 세포이다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, Bacillus 세포는 Bacillus licheniformis 세포이다. 또다른 보다 바람직한 구체예에서, Bacillus 세포는 Bacillus subtilis 세포이다. 가장 바람직한 구체예에서, Bacillus 숙주 세포는 Bacillus subtilis A164△5 (참조 미국 특허 No. 5,891,701) 또는 Bacillus subtilis168△4이다.
본 발명의 핵산 구성물로 Bacillus 숙주 세포의 형질전환은 예를 들어, 원형질체 형질전환에 의해(참조, 예를 들어, Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), 컴피턴트 세포를 사용함으로써(참조, 예를 들어, Young and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221), electroporation에 의해 (참조, 예를 들어, Shigekawa and Dower, 1988, Bio기술 6: 742-751), 또는 컨쥬게이션에 의해 (참조, 예를 들어, Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271-5278) 초래될 수 있다.
분자량
히알루론산의 수준은 변형된 카르바졸 방법에 따라 결정될 수 있다 (Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4: 330-334). 더욱이, Ueno et al., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; 및 Wyatt Technologies, 1999, "Light Scattering University DAWN Course Manual" 및 "DAWN EOS Manual" Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California에 의해 기 술된 것들과 같이, 당업계에 표준 방법을 사용하여 히알루론산의 평균 분자량은 결정될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 히알루론산은 약 10,000 내지 약 10,000,000 Da의 분자량을 갖는다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 히알루론산은 약 25,000 내지 약 5,000,000 Da의 분자량을 갖는다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 히알루론산은 약 50,000 내지 약 3,000,000 Da의 분자량을 갖는다.
바람직한 구체예는 제 1 양태의 생성물에 관한 것이고, 이때 히알루론산 또는 그것의 염은 300,000 내지 3,000,000의 범위에서; 바람직하게는 400,000 내지 2,500,000의 범위; 보다 바람직하게는 500,000 내지 2,000,000의 범위; 및 가장 바람직하게는 600,000 내지 1,800,000 Da의 범위의 분자량을 갖는다.
재조합으로 제조된 히알루론산 또는 그것의 염이 본 발명의 생성물 또는 조성물을 제조하기 위해 본 발명의 방법에서 사용될 때, 그것은 히알루론산 또는 그것의 염의 평균 분자량을 먼저 줄이기 위해 어떤 용도를 위해서 이로울 수 있다. 예를 들어, 히알루론산의 소위 낮은-분자량 단편의 몇몇 제조업체의 의해, 그것이 피부 장벽을 침투하여 피부에서의 히알루론산의 자연 함량을 회복시킬 수 있고, 따라서 그러한 단편은 항-피부-노화 및 항-주름제로서 판매된 화장품 조성물에 특히 적합하다고 언급되었다. 음식 용도를 위해, 낮은 MW 히알루론산이 위장관 장벽을 뚫는 것으로 나타났고, 그로인해 그것의 생물이용가능성을 증가시킨다. 최종적으로, 낮은 MW 히알루론산은 항-염증 효과를 나타내고 염증 질환의 치료에서 잠재적 인 응용을 가진다. 히알루론산 또는 그것의 염의 평균 분자량의 감소는 간단한 열 처리, 효소 분해, 초음파 처리, 또는 산 가수분해와 같은 당업계의 표준 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 첨가제로서 NaOCI를 포함하는 HA의 울트라초음파처리 기술을 설명하는 미국 특허 6,020,484, 및 T. Miyazaki et al. (2001) Polymer Degradation and Stability, 74: 77-85를 참조할것.
따라서, 바람직한 구체예는 제 1 양태의 생성물에 관한 것이고, 이때 히알루론산 또는 그것의 염은 10,000 내지 800,000 Da의 범위; 바람직하게는 20,000 내지 600,000 Da의 범위; 더욱 바람직하게는 30,000 내지 500,000 Da의 범위; 보다더 바람직하게는 40,000 내지 400,000 Da의 범위; 가장 바람직하게는 50,000 내지 300,000 Da의 범위의 낮은 평균 분자량을 가진다.
염과 가교결합 HA
바람직한 구체예는 히알루론산의 무기 염, 바람직하게는 나트륨 히알루로네이트, 칼륨 히알루로네이트, 암모늄 히알루로네이트, 칼슘 히알루로네이트, 마그네슘 히알루로네이트, 아연 히알루로네이트, 또는 코발트 히알루로네이트를 포함하는, 제 1 양태의 생성물에 관한 것이다.
HA를 다작용성 에폭시 화합물과 가교결합시킴으로써 제조되는, 가교결합된 HA 또는 그것의 염의 제조는 EP 0 161 887 B1에서 개시된다. HA의 지방성 알코올과의 총 또는 부분 가교결합된 에스테르, 및 그러한 부분 에스테르의 무기 또는 유기 염기와의 염은 US 4,957,744에 개시된다. 가교-결합 HA의 다른 방법은 미국 특허 Nos. 5,616,568,5,652,347, 및 5,874,417에서 개시된다. 가교결합된 HA은 또한 다음과 같이, HA를 붕산으로 처리함으로써 제조될 수 있다:
발효에 의해 재조합으로 Bacillus subtilis에서 제조된(WO 03/054163; Novozymes), 건조된 나트륨 히알루로네이트 (Na-HA, 203 mg)을 0.2 M NaOH 에 용해시켜 4% 용액을 얻는다. 붕산 (35 mg (대략 1 당량의 HA 이당류)를 첨가하였고 샘플을 실온에서 1.5시간동안 교반하였고, 그후 5℃에서 약 2.5일동안 저장하였다. 상술한 바와 같이 정확하게 단, 붕산은 없이, 대조군 샘플을 병행하여 제조하였다.
25℃에서 Carrimed CSL 제어된 스트레스 레오미터 (원뿔 외형: 6 cm, 2°)를 사용하여 결과의 HA-보레이트 하이드로겔의 점도를 측정하였다. 점도는 전단 속도에 의존하였고 대조군 샘플과 비교할 때 HA- 보레이트 하이드로겔에서 적어도 4.2- 내지 8.4 배) 증가하였고, 이는 가교결합된 네트워크의 형성을 지시한다.
Na-HA의 표준 스펙트럼과 비교할 때, HA-보레이트 하이드로겔의 FT-IR 스펙트럼에서, 1200 및 945 cm-1에서 새로운 피크가 관찰되었고, 이는 가교결합된 HA-보레이트 하이드로겔에서 새로이 형성된 보레이트 에스테르의 존재에 해당한다.
따라서, 바람직한 구체예는 가교결합된 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 제 1 양태의 생성물에 관한 것이고, 바람직하게는 히알루론산은 붕산과 가교결합되고, 더욱 바람직하게는 가교결합된 히알루론산은 보레이트 에스테르를 포함한다.
수분의 결정
본 발명에 따르는 건조된 생성물 분말의 수분 함량은 102℃±2℃에서 분말을 일정 중량으로 건조한 후에 중량의 손실이고, 퍼센트로 표시된다. 그라운드 뚜껑 을 갖는 빈 유리 계량 접시를 오븐에 건조시키고, 그후 냉각시키고 적어도 0.1 mg의 민감도를 갖는 분석 밸런스에서 계량하였다. 대략 3 g 건조된 생성물 분말을 접시에 놓고 계량한다. 분말이 든 접시를 뚜껑없이 오븐에 넣고 102℃±2℃의 온도에서 2시간동안 건조시키고 ; 그후 그것을 건조기에 넣고 그것을 다시 계량하기 전에 실온으로 냉각시킨다. 분말이 든 접시를 뚜껑없이 오븐에 넣고 1 시간 이상 건조시키고, 그후 냉각시키고 이미 기술된 바와 같이 계량한다; 이것을 중량이 일정하게 유지될 때까지, 즉, 두번의 연속 계량이 0.5 mg이상만큼 다르지 않을때까지 반복한다.
수분의 퍼센트는 그후 다음과 같이 계산된다: (W2-W3) /(W2-W1)x100; 이때 W1는 빈 접시의 중량이고, W2은 분말이 든 접시의 중량이고, W3는 건조 분말이 든 접시의 중량이다. 결과는 2 소수 자리까지 계산되고, 이 방법의 재현성은 약 ±0.1%이다.
바람직하게는, 제 1 양태의 건조되고 응집된 덩어리 생성물이 본원에서 결정될 때, 5% 미만 수분, 바람직하게는 2%미만, 가장 바람직하게는 1% 미만 수분을 포함한다.
입자 크기
제 1 양태의 바람직한 생성물은 그것의 50%의 입자 크기, D50를 갖고 이것은 아래 예에서 보여준 바와 같이, 이소프로판올에 현탁된 입자의 레이저 회절 측정에 의해 결정될 때, 10 내지 1,000 미크론, 바람직하게는 100 내지 1,000 미크론, 보 다 바람직하게는 150 내지 900 미크론, 보다 더 바람직하게는 200 내지 800 미크론이다.
바람직한 구체예에서, 제 1 양태의 생성물의 다분산성은 SPAN 값으로서 측정되고, 하기 식: SPAN = (D90-D10)/D50 에 따라서 계산되고, SPAN 값은 1.0 내지 2.5이고; 바람직하게는 SPAN 값은 1.2 내지 2.2이고; 보다 바람직하게는 SPAN 값은 1.5 내지 1.9이고; 가장 바람직하게는 SPAN 값은 1.6 내지 1.8이다.
분산성
본 발명의 생성물의 분산성을 다음과 같이 결정한다: 0.1 g의 건조되고 응집된 덩어리 생성물을 100 ml 유리병에 첨가한다. 50 ml의 0.9% (w/v) 염화나트륨 용액을 첨가하고 병을 밀봉하고 눈으로 검사하여 결정할 때, 모든 첨가된 입자들이 단일 입자로서 분산될 때까지, 즉, 어떤 덩어리도 남지 않을 때까지, 180도 손으로 반복하여 전화시키고, 데이타 시트에 역전을 수행하는데 걸린 시간을 기록한다. 그렇게 기록된 시간은 생성물의 분산성이다.
제 1 양태의 바람직한 생성물은 본원에서 결정될 때, 바람직하게는 물인 수성 용매에서 30 분 미만, 바람직하게는 20 분 미만, 보다 바람직하게는 15 분 미만, 보다 바람직하게는 10 분 미만, 보다 바람직하게는 5 분 미만, 보다 바람직하게는 3 분 미만, 보다 바람직하게는 2 분 미만, 가장 바람직하게는 1 분 미만의 분산성을 가진다.
용해도
본 발명에 따르는 히알루론산을 포함하는 건조, 또는 건조 및 응집된 덩어리 생성물 또는 조성물의 다양한 용매중의 용해도를 다음과 같이 결정할 수 있다:
시험할 0.1 g의 히알루로난 분말을 100ml 밀봉가능 유리 플라스크에 첨가한다. 테스트될 HA 샘플을 함유하는 플라스크에 50 ml의 0.9% (w/v) 염화나트륨을 첨가하고, 등급수, 무수 에탄올, 아세톤 또는 에테르를 주입한다. 플라스크를 밀봉하고 눈으로 검사에 의해 결정될 때, HA가 용액 안으로 갈 때까지 180도 역전을 수행하고, 데이타 시트에서 역전을 수행하는데 걸리는 시간을 기록한다. 기록된 시간은 샘플의 용해도이다.
제 1 양태에 따르는 바람직한 생성물은 본원에서 결정될 때, 수성 용매에서 60 분 미만, 바람직하게는 45 분 미만, 보다 바람직하게는 40분 미만, 보다 더 바람직하게는 35 분, 30 분, 25 분, 20 분, 15 분, 10 분 미만, 가장 바람직하게는 5 분 미만의 용해도를 갖는다.
다른 성분들
바람직한 구체예에서, 본 발명의 건조되고 응집된 생성물은 또한 다른 성분, 바람직하게는 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 하나 이상의 약리학적으로 활성 물질, 및 또한 바람직하게는 락토오스와 같은 수용성 부형제를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 활성 성분 또는 약리학적으로 활성 물질의 비-제한 예는 사람 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, 돼지 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬/펩티드, 과립백혈구-콜로니 자극 인자, 과립백혈구 대식세포- 콜로니 자극 인자, 대식세포-콜로니 자극 인자, 적혈구생성인자, 뼈 형태형성 단백질, 인터페론 또는 그것의 유도체, 인슐린 또는 그것의 유도체, 아트리오펩틴-III, 단일클론 항체, 종양 괴사 인자, 대식세포 활성화 인자, 인터류킨, 종양 변질 인자, 인슐린-유사 성장 인자, 표피 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제, 인자 IIV, 인자 IIIV, 및 우로키나아제과 같은 단백질 및/또는 펩티드 약물을 포함한다.
안정화 활성 성분(들)의 목적을 위해 수용성 부형제가 포함될 수 있고, 그러한 부형제는 단백질, 예를 들어, 알부민 또는 젤라틴; 글리신, 알라닌, 글루탐산, 아르기닌, 리신과 같은 아미노산, 및 그것의 염; 글루코스, 락토오스, 자일로스, 갈락토오스, 프룩토오스, 말토스, 사카로스, 덱스트란, 만니톨, 소르비톨, 트레할로스 및 콘드로이틴 술페이트와 같은 탄수화물; 포스페이트와 같은 무기 염; TWEEN®(ICI), 폴리 에틸렌 글리콜와 같은 계면활성제, 및 그것의 혼합물을 포함할 수 있다. 부형제 또는 안정제를 생성물의 0.001 내지 99중량%의 범위의 양으로 사용할 수 있다.
본 발명의 몇몇 양태는 다른 성분들 중에서, 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 효과적인 양의 생성물, 및 활성 성분을 포함하는, 다양한 조성물 및 약제에 관한 것이고, 바람직하게는 활성 성분은 약리학적으로 활성제; 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제, 바람직하게는 수용성 부형제, 및 가장 바람직하게는 락토오스이다.
기포 정제에 포함된 본 발명의 바람직한 구체예는 본 발명의 생성물 또는 조성물에 당업계에서 기술된대로 다르게 조제될 수 있다. 예를 들어, 기포 정제는 시트르산, 이탄산나트륨, 및 올리고당류 또는 다른 당을 포함할 수 있다. 기포 정 제는 저장하기 쉽고, 신속하게 용해하는 본 발명의 생성물로, 그들은 신속하게 용해되고 따라서 경구 투여의 이상적인 수단을 제공한다.
게다가, 본 발명의 양태는 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 생성물 또는 상기 양태와 구체예에서 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는 물품, 예를 들어, 화장품, 위생 물품, 의학 또는 외과수술 물품에 관한 것이다. 마지막 양태에서 본 발명은 제 1 양태에서 정의된 바와 같은 생성물 또는 본 발명의 다른 양태와 구체예에서 정의된 바와 같은 조성물을 포함하는, 약제 캡슐 또는 마이크로캡슐에 관한 것이다.
제조 방법
또다른 양태에서 본 발명은 본 발명의 제 1 양태 및/또는 그것의 바람직한 구체예에서 정의된 바와 같은 생성물을 제조하는 방법을 제공하고, 방법은
a)히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물을 건조시키는 단계;
b)건조된 생성물을 응집하는 단계를 포함한다.
건조 분무 및 응집
방법의 바람직한 구체예에서, 분무-건조기, 바람직하게는 Two-Fluid-Nozzle(TFN) 또는 회전 분무기를 사용하여 건조 단계를 수행하고, 바람직하게는 TFN 및 하기 조건 범위를 사용하여 분무-건조를 수행하였다:
입구 온도: 100 - 200℃
출구 온도: 40 - 90℃
노즐 분무 압력: 2 - 10 bar
노즐 공기 온도: 40 - 100℃
공급 온도: 40 - 100℃
또다른 바람직한 구체예는 상기 방법에 관한 것이고, 이때 유동화 베드를 사용하여 응집 단계를 수행하고; 바람직하게는 유동화 베드 입구 온도는 30 - 80℃의 범위이고, 이때 분말의 수성 용액은 25-50℃의 출구 온도에 해당하는 속도로 건조된 분말 위에 분무된다.
여전히 또다른 바람직한 구체예는 상기 방법에 관한 것이고, 이때 바람직하게는 0: 100 내지 50: 50의 물-용매 비를 갖는, 보다 바람직하게는 0: 100 내지 20: 80의 물: 용매 비를 갖는 물-용매 혼합물을 사용하여 응집 단계를 수행하고; 바람직하게는 용매가 알코올이고, 보다 바람직하게는 용매가 이소-프로판올이다.
바람직하게는 유동화 분무-건조기를 사용하여, 건조 및 응집을 한 단계로 수행하는 것이 바람직하다.
생성물 또는 조성물을 사용하는 방법
본 발명의 다양한 양태는 예를 들어, 의학 분야에서, 제 1 양태의 생성물을 사용하여, 또는 본 발명의 조성물을 사용하여, 처리 과정을 수행하는 방법에 관한 것이다.
한가지 양태는 안과학에서 과정을 수행하는 방법에 관한 것이고, 이는 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 본 발명의 조성물의 사용을 포함한다.
또다른 양태는 골관절염의 치료에 있어서 절차를 수행하는 방법에 관한 것이고, 이는 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물의 사용을 포함한다.
여전히 또다른 양태는 암의 치료에 있어서 절차를 수행하는 방법에 관한 것이고, 이는 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물의 사용을 포함한다.
여전히 또다른 양태는 탈모 또는 대머리의 치료에 있어서 절차를 수행하는 방법에 관한 것이고, 개선점은 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물의 사용을 포함한다.
한 양태는 약리학적으로 활성제의 경피 또는 피부 투여를 수행하는 방법에 관한 것이고, 이는 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물의 사용을 포함한다.
또다른 양태는 화장품의 피부 투여를 수행하는 방법에 관한 것이고, 이것은 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물의 사용을 포함한다.
한 양태는 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물을 사용하는 안과학 방법에 관한 것이다.
또다른 양태는 효과적인 양의 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 골관절염의 치료 방법에 관한 것이고, 바람직하게는 투여는 피부, 경피, 경구, 또는 주사에 의함이다.
한 양태는 효과적인 양의 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상처의 치료 방법에 관한 것이다.
여전히 또다른 양태는 효과적인 양의 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 탈모 또는 대머리의 치료 방법에 관한 것이고, 바람직하게는 투여는 피부, 경피, 경구, 또는 주사에 의함이다.
다른 양태는 골관절염의 치료를 위한 약제, 안과학적 치료를 위한 약제, 암의 치료를 위한 약제, 상처의 치료를 위한 약제, 혈관신생을 위한 약제, 또는 탈모 또는 대머리의 치료를 위한 약제의 제조를 위한, 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물의 사용에 관한 것이다.
마지막 양태는 보습제의 제조를 위한 제 1 양태에서 정의된 생성물 또는 발명의 조성물의 사용에 관한 것이다.
실시예 1
약 8g/리터를 함유하는 나트륨 히알루로네이트 용액으로 이루어지는 액체 피드를 2개의 다른 타입의 분무 기술을 사용하여 분무 건조하였다 : A) Two-Fluid-Nozzle(TFN) 및 B) 회전 분무기. 시중에서 이용가능한 타입의 분무-건조 기술 및 장비가 또한 본 발명의 목적에 적합한 것으로 계획된다. (예를 들어 Niro Atomizers Inc 참조).
결과의 건조된 분말은 현저하게 달랐다. TFN에 의해 제조된 분말은 상당히 더 작은 벌크 밀도를 가졌다. 이런 차이의 이유는 아래 보여준 더 나아간 분석에서 드러났다.
분무기
(배치 No.) 		입자 밀도
(g/ml) 		용해도 시간
(분) 		입자 크기
( D 50 )
A)TFN
(04PBAC0016)		 0.210 15 95
B)회전 분무기
(MAG30012)		 0.430 31 45
회전 분무기와 비교할 때, TFN 분무 원리를 사용하여 용해도 시간이 상당히 감소되었다는 것을 보여주었다. 입자 크기가 훨씬 더 컸다는 사실에도 불구하고, 이것이 보통 용해도 시간을 증가시킬 것이다. 그러나, 증가된 용해도 시간은 TFN 분무 건조된 입자에 포함된 공기로 인한 것으로 밝혀졌다. 이는 TFN 생성물의 입자 밀도로부터 볼 수 있고, 이것은 회전 분무기에 의해 제조된 건조 생성물의 입자 밀도의 절반 미만이었다.
실시예 2
약 8 g/리터 나트륨 히알루로네이트 및 2400 g 염화나트륨과 함께, 75,000 g 나트륨 히알루로네이트 용액으로 이루어지는 액체 피드 제제를 일정한 속도로 분무 건조기에 첨가하였다. 히알루로네이트는 약 690.000 Da의 분자량을 가졌다. 분무 건조기는 약 1.8 m의 직경과 약 5 m의 높이를 가졌다. Two-Fluid-Nozzle(TFN)을 피드의 분무를 위해 선택하였다. 건조 조건을 조절하여 원하는 입자 크기를 갖는 건조 분말 배치 (배치 nr. 03PBAC0035-1)를 제공하였다:
입구 온도: 160℃
출구 온도: 75℃
노즐 분무 압력: 4 bar
노즐 공기 온도: 70℃
피드 온도: 60℃
이소프로판올중의 분말의 현탁액에서 레이저 회절을 사용하여, 결과의 입자 크기분포를 측정하였다 :
D10 : 12 미크론
D50: 39 미크론
D90: 84 미크론
분자량: 631.000 Da
SPAN: 1.77
다분산성의 측정은 'SPAN' 값이고, 이것은 하기 화학식에 따라 계산될 수 있다:
SPAN = (D90-D10)/D50
분자량은 건조 실시 동안에 거의 변하지 않았고, 따라서 비록 높은 온도가 적용되었지만 분무 건조 프로세스가 매우 부드러웠다는 것을 증명한다.
실시예 3
20 ml의 각각의 하기 용매-물 혼합물 중에 분말 샘플을 현탁시킴으로써 실시예 2에서 제조된 5g 샘플의 분무-건조된 분말이 응집되었다:
100 % 이소프로판올 (IPA)
90 % 이소프로판올
87 % 이소프로판올
현탁액을 이어서 여과하고 진공에서 건조시켰다. 건조된 필터 케이크를 분쇄하고 체를 통해 선별하여 150 미크론 미만이고 600 미크론보다 더 큰 모든 입자를 제거하였다.
놀랍게도 이렇게 제조된 응집된 덩어리 입자는 식염수에 매우 빠르게 분산하고 용해되었다는 것이 밝혀졌다. 이런 현상을 조사하기 위해, 레이저 회절을 사용하여 순수한 IPA중의 생성물의 현탁액에서 입자 크기를 보다 정확하게 측정하였다. 이렇게 결정된 입자 크기는 (10, 50, 및 90 백분위수)하기 표 1에 나와있다. 응집작용을 위해 사용된 용매-물 혼합물 중의 물 함량이 0 에서 13%로 증가되었기 때문에, 평균 덩어리 입자 크기의 상당한 증가가 관찰되었다.
Figure 112006081229866-pct00001
상당히 빠른 분산을 얻기 위해서는 입자 크기가 대략 180 미크론 이상이 되어야 한다는 것이 밝혀졌다. 그 결과, 87% IPA을 사용하여 응집된 배치의 180 - 355 미크론의 체 단편을 제조하였다. 이 단편을 응집되지 않았지만 실시예 2로부터 다른점에서 동일한 생성물과 이어서 비교하였다. 결과는 하기 표 2에 나와있다. 분명히, 용해도 시간은 응집작용 프로세스에 의해 상당히 개선된다.
Figure 112006081229866-pct00002
실시예 4
순수한 히알루로네이트 생성물의 용해도 시간을 변경하는 것이 가능한지를 알아보기 위해, 실시예 3에 기술된 방법을 사용하여 실시예 1에 기술된 2개의 배치를 처리하였다. 하기 표 3에 응집된 덩어리 생성물에 대한 250-500 미크론의 체 소부분에 대한 결과가 나와있다. 실시예 1과 3의 방법을 조합함으로써, 용해도 시간이 상당히 감소될 수 있다는 것을 분명히 보여준다.
Figure 112006081229866-pct00003
실시예 5
실시예 1에서 제조된 분말을 다음의 방식으로 처리하였다: 약 100 g 건조된 분말을 Strea 실험실 유체 베드에 첨가하였다. 입구 온도는 55℃였다. 실시예 1에서 제조된 분말의 1 % 수성 용액을 그후 35℃의 출구 온도에 해당하는 속도로, 건조된 분말 위에 분무하였다. 결과의 형성된 덩어리를 용해도에 대해 테스트하였고, 그들은 미처리 분말과 비교할 때 현저하게 개선된 용해도를 보였다.
실시예 6
75,000 g 나트륨 히알루로네이트 용액 및 2,400 g 염화나트륨으로 이루어지는 액체 피드 제제를 일정한 속도로 유동화 분무 건조기(FSD)에 첨가하였다. FSD 분무 건조기에는 분무 건조-탑 밑에 놓여진 통합 유체-베드가 구비되었다. 동반된 미세물을 갖는 건조 공기를 분무 건조기 지붕을 통해 제거하였고 이어서 입자를 제거한 사이클론을 통과하였다. 제거된 입자를 공기압으로 분무 건조기로 다시 수송하였고 여기서 그들은 노즐 클라우드 안으로 주입되었다.
히알루로네이트는 800 kDa의 분자량과 약 8 g/리터의 농도를 가졌다. 분무 건조기는 약 1.8 m의 직경과 약 5 m의 높이를 가졌다. 건조 조건을 조절하여 원하는 입자 크기를 갖는 건조 분말 배치(배치 nr. 04PBAC0014)를 제공하였다:
입구 온도: 160℃
출구 온도: 68℃
노즐 분무 압력: 3.5 bar
노즐 공기 온도: 50℃
피드 온도: 60℃
이어서, 이소프로판올중의 분말의 현탁액에서 레이저 회절을 사용하여 입자 크기분포를 측정하였다 :
D10 : 89 미크론
D50 : 220 미크론
D90 : 466 미크론
분자량: 796 kDa
히알루로네이트 농도: 493 mg/g
건조 실시에 의해 분자량이 거의 변하지 않았고, 따라서 비록 높은 온도가 가해졌지만 분무-건조 프로세스가 매우 부드럽다는 것을 증명한다.
표 4에서 보이듯이, 250 내지 500 미크론의 생성물 일부분을 그것의 분산성/용해도에 대해 시험하였고, 약 2분 후에 분산하고 용해하는 것으로 밝혀졌고, 이는 응집되지 않은 분무 건조된 생성물에서 관찰된 15분보다 훨씬 더 빨랐다. 결과의 용액의 흡광도를 또한 600 nm에서 측정하여 어떤 미세 입자도 용액에 남아있지 않았다는 것을 확인하였다 (표 4).
Figure 112006081229866-pct00004
실시예 7. 분자량 및 피부 침투
2 cm의 직경을 갖는 나란한 확산 세포를 사용하여, 방사능표지된 히알루론산의 4개의 다른 평균 분자량 단편의 피부 침투를 조사하였다(3.14 cm2의 효과있는 피부 영역). 리셉터 상의 부피는 8 내지 8.5 ml였고, 제공자 구획의 부피는 1 내지 1.5 ml였다.
돼지 귀로부터의 피부분절 피부 (750 마이크로미터)를 해동하였고 확산 세포의 한 쪽에 놓았다. 모든 눈에 띄는 털을 조심스럽게 가위로 잘랐다. 확산 세포의 다른쪽을 규소 디스크로 폐쇄하였다. 리셉터를 pH 7.4에서 포스페이트-완충화 식염수 (PBS)로 채웠다. 자성 교반-막대를 도입하였다.
제공자 상의 3개의 10 마이크로리터 샘플(5.64 mg/ml 냉 대 22.56 마이크로그램/ml 고온의 냉/고온 비가 제공될 때)을 취하여 특이적 활성을 결정하였다. 제공자 상을 그후 제공된 용액으로 채웠다: 5 ml (수용된 부피)에 대해서, 오로지 3 또는 4 세포가 제공될 수 있었다.
세포를 교반기 플레이트에 넣고 실험을 주위 온도에서 수행하였다. 5 시간 후에, 전체 리셉터 상을 회수하였고 액체 섬광 카운팅에 의해 거기에 방사능을 결정하였다. 리셉터 챔버를 그후 PBS으로 다시 채웠고 확산을 밤새 진행시켰다.
22 시간 후에(즉, 5시간 + 17시간), 리시버 용액을 다시 회수하였고 방사능에 대해 분석하였다. 세포가 분해되었고 피부를 섬광 유체를 첨가하고 방사능에 대해 카운팅하기 전에, 48 시간 동안 또는 완전히 용해할 때까지, 5 ml의 SOLUENE®(PerkinElmer)로 배양하였다. 실험 결과는 표 5에서 4개의 다른 분자량 HA 단편에 대해 요약된다.
Figure 112006081229866-pct00005
전형적으로, 3 또는 4 복사본 (표 5: R1, R2, R3, R4)을 얻었다. 그러나, 때때로, 실험적 문제가 분명하였고 (예를 들어, 명백한 피부 천공, 또는 확산 세포로부터의 누출), 이 경우 오로지 2개의 복사본만이 가능하였다.
주로 제공자 상의 점성이 확산 세포 구획으로부터 그들의 완전한 제거를 막기 때문에, 방사능 ('질량 밸런스')의 전체 회복은 100% 미만이었다. 문제는 증가하는 HA 분자량에 따라 증가하였다.
이들 결과는 도 1에 도시되고, 그들은 더 낮은 분자량 종에 대해 분명한 더 우수한 침투와 함께, 경피 수송의 HA 분자량에 대한 분명한 의존성이 존재한다는 것을 암시한다. 연구된 HA 크기 소부분들 중 어떤 것에 대해서 5 및 22 시간에서 측정된 명백한 유량 사이에는 유의한 차이가 없었다.
전반적으로, 따라서, HA 침투는 HA 분자량에 의존한다. 분자량이 더 낮을 수록 피부 침투가 더 우수하다.
그러나 피부를 침투하는 양은 작은 분율의 적용된 방사능에 상응한다.
실시예 8. HA의 다른 분자량 단편의 국소 분포
형광으로 표지된 히알루론산의 2개의 다른 평균 분자량 소부분들의 피부 흡수 및 분포를 레이저 스캐닝 공초점 현미경사용법을 사용하여 조사하였고, HA 단편의 평균 분자량은 300,000와 50,000 Da였다.
형광 HA 샘플은 1 mg/mL의 농도에서 수성 용액이었다; 형광 HA 용액을 도포하기 전에 증류수에서 동일한 분자량의 비-표지된 HA로 10-배 희석시켰다.
HA 도포에 사용된 피부는 돼지 귀로부터 얻었다. 각각의 HA 단편을 도포하였고 다른 동물로부터 기원하는 피부의 적어도 3개의 개별 샘플에서 테스트하였다. 신선한 것으로 피부 샘플을 얻었고 사용하기 전에 2주 이하 동안 냉동 저장 보관시켰다.
실험하기 전에, 해동된 피부 샘플 (대략 0.8 cm2)을 간단한 유리 확산 세포의 제공자와 리셉터 상 사이에 끼웠고 32℃에서 유지하였다. 제공자 상은 0.1 ml의 표지된 HA 용액이었고, 리셉터 상은 pH 7.4 완충액이었다.
형광 HA 용액은 3 시간동안 피부 샘플과 접촉하여 유지되었고, 그후 과잉의 제공자 용액을 제거하였고, 피부를 3 시간 pH 7.4 완충액으로 세척하였고, 조직과 함께 부드럽게 건조시켰다.
피부를 유리 슬라이드 위에 즉시 고정시켰고, 층 피부각질층 쪽이 위로가게하고, LSM 410 Invert Laser Scan Microscope (Carl Zeiss, Germany)을 사용하여 더 나아간 프로세싱 없이, 현미경으로 검사하였다. 시스템은 568 및 488nm의 여기 파장을 갖는 아르곤-크립톤 레이저가 구비되어있고, 이것은 개별적으로 피부 및 표지된 HA을 각각 검사하는데 사용되었다.
Plan-neofluar 10x/0.3 및 40x/0.6 대물렌즈를 사용하여, 이미지를 얻었고 그후 이어서 피부로부터의 형광성이 적색이 되도록 디지탈로 색깔-코딩되었고, 표지된 HA로부터의 형광성은 녹색이었다. 이미지는 색깔-코딩되었고 Zeiss LSM 공초점 소프트웨어를 사용하여 씌웠다(또는 포개놓았다).
각각의 실험에서, 피부 샘플을 형광 프로브의 부재하에서 검사하였다. 돼지 피부로부터의 자동형광성은 구조적 특징이 확인될 수 있도록 하였다. 형광 HA의 분포를 가시화하기 위해, 공초점 이미지를 xy-평면 (즉,, 피부 표면에 평행임)에서 얻었다. 피부 표면 (z = 0μm)을 층 피부각질층의 형태학적 특성을 갖는 가장 밝은 형광성의 이미징 면으로서 정의하였다. 적어도 3개의 개별 피스의 피부를 사용하여, 복제 이미지를 각각의 치료를 위해 수득하였다.
50,000 Da (F-HA 0.05)의 형광으로 표지된 HA는 단지 드문드문하였고 층 피부각질층의 표면 위에서 외견상으로 가시적이었지만, 표지된 HA 단편은 모낭 주변과/또는 모낭에서 분명히 가시적이었다. 도 2, 패널 A는 피부 표면 (층 피부각질층), 모낭 및 모간을 보여주고; 패널 B은 HA로부터의 녹색 형광성이 주로 소낭 주변과/또는 소낭에서 가시적이라는 것을 분명히 보여준다.
층 피부각질층의 표면위의 드문드문 형광성이 또다른 피부 샘플에서 확인되었고, 이것은 소낭이 존재하지 않았다. 도 3, 패널 A는 피부 표면을 보여주고; 패널 B는 표지된 HA로부터 오로지 제한된 형광성이 그 표면에서 가시적이라는 것을 보여준다.
300,000 Da (F-HA 0.30)의 형광으로 표지된 HA를 가지고 유사한 관찰을 하였고, 이것은 또한 모낭 주변에서 분명히 가시적이었다. 도 4, 패널 A는 피부 표면 (층 피부각질층), 모낭 및 모간을 보여주고; 패널 B는 소낭 주변에 표지된 HA로부터 녹색 형광성을 보여준다.
그러나, 300,000 Da의 표지된 HA 단편이 또한 드문드문이었고 피부 표면에서 외견상으로 가시적이었지만, 그것은 피부 표면에서 케라티노사이트 사이에서의 차별적인 축적을 분명히 보여주었다. 도 5, 패널 A는 피부 표면을 보여주고; 패널 B는 표지된 HA로부터 제한된 형광성이 그 표면에서 가시적이지만, 그것은 케라티노사이트 사이에서 축적된다는 것을 보여준다.
결론은 낮은 분자량 HA가 피부에서 소포 조직과 주변에서 일부 차별적인 축적을 보여준다는 것이다. 이것은 본 발명의 조성물의 낮은 MW HA 생성물에 대해 하나의 가능한 침투 경로가 될 수 있었고, 이는 탈모 또는 대머리의 치료에 대해서 특정한 관심이 될 것이다.
HA의 제거 후에, 오직 소수의 형광 종만이 드문드문 외견상으로 표면 층 위에서 발견되었기 때문에, 0.05 MDa의 낮은 MW HA의 무손상 층 피부각질층을 통한 수송에 대한 증거는 없었다. 최종적으로, 0.30 MDa의 HA는 피부 표면에서 케라티노사이트 사이의 차별적인 축적을 보여준다. HA 장벽이 피부로부터 수동적인 표피를 통한 물 손실을 제한할 수 있었기 때문에, 이는 개선된 피부 수화에 공헌할 수 있다.

Claims (51)

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  21. 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 분무-건조되고 응집된 생성물의 제조 방법으로서,
    a) 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 생성물을 분무-건조시키는 단계; 및
    b) 분무-건조된 생성물을 응집하는 단계를 포함하고,
    상기 b)의 응집 단계는 유동화 베드를 사용하여 수행되고, 유동화 베드 입구 온도는 30 - 80℃의 범위이고, 이때 분말의 수성 용액은 25-50℃의 출구 온도에서 건조된 분말 위에 분무되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 히알루론산 또는 그것의 염은 재조합으로 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 히알루론산 또는 그것의 염은 300,000 내지 3,000,000의 범위의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 히알루론산 또는 그것의 염은 10,000 내지 800,000 Da의 범위의 낮은 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 생성물이 히알루론산의 무기 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 생성물이 가교결합된 히알루론산 또는 그것의 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 건조 단계는 분무-건조기 또는 회전 분무기를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 분무-건조는 TFN 분무-건조기 및 하기 조건 범위를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    입구 온도: 100 - 200℃
    출구 온도: 40 - 90℃
    노즐 분무 압력: 2 - 10 bar
    노즐 공기 온도: 40 - 100℃
    공급 온도: 40 - 100℃
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  31. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 응집 단계는 물-용매 혼합물을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 용매가 알코올인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 분무-건조 및 응집을 한 단계로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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