JP5313497B2 - 乾燥および凝集されたヒアルロン酸生成物 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる乾燥および凝集された生成物、ならびに本発明の生成物または組成物を含んでなる種々の組成物および物品、本発明の生成物を製造する方法、およびそれらの使用に関する。
HAは前述の天然の組織から抽出されるが、今日それを微生物学的方法により製造して、感染因子が移動する危険を最小にし、かつ生成物の均一性、品質および利用可能性を増加させることが好ましい。
また、HAは衛生および外科的物品のために使用する種々のポリマー物質、例えば、ポリウレタン、ポリエステルおよびその他のための、これらの物質を生物適合性とする作用を有する、添加物として使用することができる。
本発明が解明すべき問題は、高度に水溶性の乾燥したHA生成物を提供する方法である。
本発明は、乾燥したHA生成物の凝集が生成物の溶解性を改良し、こうして水性溶媒、好ましくは水または生理的食塩水中の非常に速い溶解を達成することを示す。
したがって、第1の面において、本発明は、乾燥し、凝集した、好ましくはここにおいて定義したように乾燥し、凝集した、ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物に関する。
第3の面において、本発明は、薬学上許容される担体、賦形剤または希釈剤と一緒に、有効量の第1の面において規定した生成物を含んでなる医薬組成物に関する。
第4の面において、本発明は、薬理学的活性剤と一緒に、ベヒクルとして有効量の第1の面において規定した生成物を含んでなる医薬組成物に関する。
第5の面において、本発明は、活性成分として有効量の第1の面において規定した生成物または第2 、第3または第4の面において規定した組成物を含んでなる化粧品に関する。
重要な面において、本発明は、活性成分として有効量の第1の面において規定した生成物または第2 、第3または第4の面において規定した組成物を含んでなる薬剤のカプセルまたはマイクロカプセルに関する。
a) ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物を乾燥し、そして
b) 乾燥した生成物を凝集させる。
最後の面において、本発明は、眼科における手順を実行する方法、骨関節炎または癌、毛髪の喪失または禿頭症を治療する方法、創傷を治療する方法、薬理学的活性剤の皮膚への投与または経皮的投与を実行する方法、または化粧品の皮膚への投与を実行する方法において、活性成分として有効量の第1の面において規定した生成物または第2 、第3または第4の面において規定した組成物を使用することを含んでなる改良に関する。
核酸構築物
「核酸構築物」 は、一本鎖または二本鎖の核酸分子として本明細書において定義され、これは天然に存在する遺伝子から単離されるか、あるいはそうでなければ天然に存在しない方法で組合わされかつ並置された核酸のセグメントを含有するように修飾されている。用語 「核酸構築物」 は、核酸構築物がコード配列の発現に必要なすべての制御配列を含有するとき、用語 「発現カセット」 と同義である。
また、宿主細胞の増殖に関してポリペプチドの発現の調節を可能とする調節配列を付加することが望ましいことがある。調節系の例は、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにする系であり、調節化合物の存在を包含する。原核生物の系における調節系は、lac、tacおよびtrpオペレーター系を包含する。
本発明の方法において、宿主細胞を、ヒアルロン酸の産生に適当な栄養培地中で、この分野において知られている方法に従い培養する。例えば、細胞は、震蘯フラスコ培養により、または適当な培地中でヒアルロン酸合成に関係する酵素の発現およびヒアルロン酸の単離を可能とする条件下に実行される実験室用または工業用発酵槽中の小規模または大規模の発酵 (連続的、バッチ式、供給バッチ式または固体状態の発酵を包含する) により培養することができる。培養は、炭素源、窒素原および無機塩を含んでなる適当な栄養培地中で、この分野において知られている手順に従い実施する。適当な培地は商業的供給会社から入手可能であるか、あるいは発表された組成 (例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中に) に従い調製することができる。分泌されたヒアルロン酸は、培地から直接回収することができる。
ヒアルロン酸
「ヒアルロン酸」 は、ここにおいて、交互するβ-1,4およびβ-1,3グルコシド結合により一緒に結合された、N-アセチルグルコサミン (GlcNAc) およびグルクロン酸 (GlcUA) の反復二糖単位から構成された非硫酸化グルコサミングルカンとして定義される。また、ヒアルロン酸はヒアウロナン、ヒアルノネートまたはHAとして知られている。用語 「ヒアウロナン」 および 「ヒアルロン酸」 は、本明細書中において互換的に使用される。
好ましい態様において、本発明は、ヒアルロン酸またはその塩が、好ましくはグラム陽性の細菌または宿主細胞により、より好ましくはバシラス (Bacillus) 属の細菌により、組換え的に産生されている、第1面の生成物に関する。
ヒアルロン酸のレベルは、変更されたカルバゾール法 (BitterおよびMuir、1962、Anal. Biochem. 4: 330-334) に従い決定することができる。その上、ヒアルロン酸の平均分子量は、この分野において標準的方法、例えば、下記の文献に記載されている方法により決定することができる: Ueno 他、1988、Chem. Pharm. Bull. 36: 4971-4975; Wyatt、1993、Anal. Chimi. Acta 272: 1-40; およびWyatt Technologies、1999、“Light Scattering University DAWN Course Manual” および“DAWN EOS Manual” Wyatt Technology Corporation、カリフォルニア州サンタバーバラ。
好ましい態様において、本発明は、ヒアルロン酸の無機塩、好ましくはヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸アンモニウム、ヒアルロン酸カルシウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸亜鉛またはヒアルロン酸コバルトを含んでなる、第1面の生成物に関する。
したがって、好ましい態様において、本発明は、架橋したヒアルロン酸またはその塩、好ましくはホウ酸と架橋したヒアルロン酸またはその塩を含んでなり、より好ましくは架橋したヒアルロン酸がボレートエステルを含んでなる、第1面の生成物に関する。
本発明による乾燥した生成物の湿分は、粉末を102℃±2℃において一定重量に乾燥した後、百分率として表した重量損失である。すられた蓋を有する空のガラスの秤量皿を炉中で乾燥し、次いで冷却し、少なくとも0.1 mgの感度を有する分析用天秤上で秤量する。ほぼ3 gの乾燥した生成物の試料を皿上に置き、秤量する。粉末を含む皿を蓋なしで炉中に入れ、102℃±2℃において2時間乾燥し、次いでそれをデシケーター中に入れ、温室に冷却した後、再び秤量する。前述したように、粉末を含む皿を蓋なしで炉中に入れて、さらに1時間乾燥し、次いで冷却し、再び秤量する。重量が一定に止まるまで、すなわち、2つの連続的秤量が0.5 mgより多く異ならなくなるまで、これを反復する。
好ましくは、第1面の乾燥し、凝集した生成物は、ここにおいて決定して、5%より低い、好ましくは2%より低い、最も好ましくは1%より低い湿分を含んでなる。
第1面の好ましい生成物は、下記の実施例において示すように、イソプロパノール中に懸濁させた粒子のレーザー回折測定により決定して、粒度の50百分位D50が10〜1,000ミクロン、好ましくは100〜1,000ミクロン、より好ましくは150〜900ミクロン、なおより好ましくは200〜800ミクロンである粒度を有する。
本発明の生成物の分散性は次のようにして決定する; 0.1 gの乾燥し、凝集した生成物を100 mlのびんに添加する。50 mlの0.9% (w/v) の塩化ナトリウム溶液を添加し、びんを密閉し、手により反復して180°倒立させて、添加したすべての粒子を単一粒子として分散させ、すなわち、視的検査により決定して、かたまりが残らないようにし、そして倒立を実行するために要した時間をデータ用紙に記録する。こうして、記録された時間は生成物の分散性である。
本発明によるヒアルロン酸を含んでなる乾燥した、または乾燥し、凝集した、生成物または組成物の種々の溶媒中の溶解性を次のようにして決定することができる:
0.1 gの試験すべきヒアウロナン粉末を、100 mlの密閉可能なガラスフラスコに添加する。試験すべきHA試料を含有するフラスコに、50 mlの0.9% (w/v) の塩化ナトリウム、注射等級の水、無水エタノール、アセトンまたはエーテルを添加する。フラスコを密閉し、視的検査により決定して、HAが溶解するまで、手により180°の倒立を実行し、そして倒立を実行するために要した時間をデータ用紙に記録する。記録された時間は試料の溶解性である。
好ましい態様において、本発明の乾燥し、凝集した生成物は、また、他の成分、好ましくは1種または2種以上の活性成分、好ましくは1種または2種以上の薬学的に活性な物質、およびまた水溶性賦形剤、例えば、ラクトースを含んでなることができる。
他の面において、本発明は、下記の工程を含んでなる、本発明の第1面および/またはその好ましい態様において規定した生成物を製造する方法を提供する:
a) ヒアルロン酸またはその塩を含んでなる生成物を乾燥し、そして
b) 乾燥した生成物を凝集させる。
方法の好ましい態様において、噴霧乾燥器、好ましくは2流体ノズル (TFN) またはロータリーアトマイザーを使用して乾燥工程を実施し、好ましくはTNFおよび下記の条件範囲を使用して噴霧乾燥を実施した:
入口温度: 100〜200℃
出口温度: 40〜 90℃
ノズル噴霧化圧力: 2〜 10バール
ノズル空気温度: 40〜100℃
供給温度: 40〜100℃
乾燥工程および凝集工程は1工程で、好ましくは流動化噴霧乾燥器を使用して実施することが好ましい。
本発明の種々の面は、例えば、医学的分野において、第1面の生成物を使用して、または本発明の組成物を使用して、治療手順を実行する方法に関する。
1つの面は、第1の面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、眼科における手順を実施する方法に関する。
他の面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、骨関節炎の治療を実施する方法に関する。
なお他の面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、癌の治療を実施する方法に関する。
1つの面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、薬理学的活性剤の経皮的または皮膚への投与を実施する方法に関する。
他の面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用を含んでなる、化粧品の皮膚への投与を実施する方法に関する。
1つの面は、第1面において規定した生成物または本発明の組成物を使用する眼科の方法に関する。
1つの面は、有効量の第1面において規定した生成物または本発明の組成物を投与することを含んでなる、創傷を治療する方法に関する。
最後の面は、モイシュチャライザーを製造するための、第1面において規定した生成物または本発明の組成物の使用。
2つの異なる型の下記技術に従い、約8 g/リットルを含有するヒアルロン酸ナトリウムから成る液状供給物を乾燥した: A) 2流体ノズル (TFN) およびB) ロータリーアトマイザー。商業的に入手可能な型の噴霧乾燥技術および装置は、また本発明の目的に適当であると考えられる (例えば、下記を参照のこと: Niro Atomizers Inc.) 。
生ずる乾燥した粉末は顕著に異なっていた。TFNにより製造された粉末は有意により小さい嵩密度を有した。この差の理由は、下に示すそれ以上の分析により明らかになった。
約8 g/リットルのヒアルロン酸ナトリウムおよび2,400 gの塩化ナトリウムを含む、75,000 gのヒアルロン酸ナトリウム溶液から成る液状供給調製物を噴霧乾燥燥器に一定速度で添加した。ヒアルロン酸ナトリウムは約690,000 Daの分子量を有した。この噴霧乾燥燥器は約1.8 mの直径および約5 mの高さを有した。2流体ノズル (TFN) を供給物の噴霧化のために選択した。乾燥条件を調節して、必要な粒度を有する乾燥粉末バッチ (バッチNo. 03PBAC0035-1) を得た:
出口温度: 75℃
ノズル噴霧化圧力: 4バール
ノズル空気温度: 70℃
供給温度: 60℃
D10: 12ミクロン
D50: 39ミクロン
D90: 84ミクロン
分子量: 631,000 Da
SPAN: 1.77
SPAN = (D90-D10)/ D50
分子量は乾燥作業間にほとんど未変化であり、こうして適用温度が高いにもかかわらず、噴霧乾燥プロセスは非常に温和であることが示された。
20 mlの下記の溶媒-水混合物の各々の中に粉末試料を懸濁させることによって、実施例2において製造した噴霧乾燥した粉末の5 gの試料を凝集させた:
100%のイソプロパノール (IPA)
90%のイソプロパノール
87%のイソプロパノール
こうして製造された凝集した粒子は生理的食塩水中に非常に高速に分散しかつ溶解することが驚くべきことには発見された。この現象を研究するために、純粋なIPA中の生成物の懸濁液についてレーザー回折を使用して、粒度をいっそう正確に測定した。こうして決定された粒度 (10、50および90百分位) を下記表2に示す。凝集に使用した溶媒-水混合物中の水分が0から13%に増加するにつれて、平均凝集粒度の有意な増加が観察された。
実施例3に記載されている方法を使用して実施例1に記載されている2つのバッチを処理して、純粋なヒアルロン酸塩生成物の溶解性時間を変更できるかどうかを調べた。下記表4において、凝集した生成物の250〜500ミクロンの篩分け画分についての結果を示す。実施例1および3の方法を組合わせることによって、溶解性時間を有意に短縮できることが明らかに理解される。
実施例1において製造した粉末を下記の方法により処理した: 約100 gの乾燥した粉末をストレア (Strea) 実験室用流動床に添加した。入口温度は55℃であった。次いで、実施例1において製造した粉末の1%水溶液を、35℃の出口温度に対応する速度で乾燥した粉末上に噴霧した。生ずる形成した凝集物を溶解性について試験した。それらは、未処理粉末と比較したとき、顕著に改良された溶解性を示した。
75,000 gのヒアルロン酸ナトリウム溶液および2,400 gの塩化ナトリウムから成る液状供給調製物を、流動化噴霧乾燥燥器 (FSD) に一定速度で添加した。FSD噴霧乾燥燥器は、噴霧乾燥塔の下に配置された一体化流動床を装備した。乾燥空気は連行された微細物とともに噴霧乾燥燥器屋根に通して除去し、引き続いて粒子を取出すサイクロンに通過させた。取出された粒子は空気圧で噴霧乾燥器に輸送し戻され、ここで粒子はノズルの霧 (cloud) の中に注入された。
入口温度: 160℃
出口温度: 68℃
ノズル噴霧化圧力: 3.5バール
ノズル空気温度: 50℃
供給温度: 60℃
D10: 89ミクロン
D50: 220ミクロン
D90: 466ミクロン
分子量: 790 kDa
ヒアルロン酸塩濃度: 493 mg/g
250〜500ミクロンの生成物画分を、表5に示すように、その分散性/溶解性について試験し、それは約2分で分散しかつ溶解することが発見され、これは非凝集噴霧乾燥生成物を使用して観察された15分よりも非常に速かった。また、生ずる溶液の吸収を600 nmにおいて測定して、溶液中に小さい粒子が残留しないことを確認した (表5) 。
分子量および皮膚浸透
直径2 cm (3.14 cm2の有効面積) の並んだ拡散セルを使用して、放射線標識化ヒアルロン酸の4つの異なる平均分子量画分の皮膚浸透性を研究した。レセプター相の体積は8〜8.5 mlであり、そしてドナー隔室の体積は1〜1.5 mlであった。
ドナー相の3つの10 μlの試料 (5.64 mg/mlの冷/22.56μg/mlの熱の冷/熱比で準備された) を採取して、比活性を決定した。次いで、ドナー相に準備された溶液を充填した: 5 ml (供給体積) について、わずかに3または4セルを構成することができた。
22時間 (すなわち、5時間+17時間) 後、受容溶液を再び抜出し、放射能について分析した。セルを解体し、皮膚を5 mlのSOLUENE(商標) (Perkin-Elmer) 中で48時間または完全に溶解するまでインキュベートした後、シンチレーション流体添加し、放射能について計数した。4つの異なる分子量のHA画分についての実験結果を、表6に要約する。
主として、ドナー相の粘性的特質が拡散セル隔室からのドナー相の完全な除去を妨害するので、放射能の全回収 ( 「物質収支」 ) は100%より低かった。この問題はHA分子量の増加とともに増加した。
したがって、全体的に、HA浸透はHA分子量に依存する。分子量がより低いほど、皮膚浸透はよりよくなる。
しかしながら、皮膚を浸透する量は適用した放射能の小さい部分に対応する。
HAの異なる分子量画分の局所的分布
蛍光標識化ヒアルロン酸の2つの異なる平均分子量の画分の皮膚吸収および分布をレーザー走査共焦点顕微鏡検査法により研究し、HA画分の平均分子量は300,000〜50,000 Daであった。
蛍光HA試料は1 mg/mlの濃度の水溶液であった。蛍光HA溶液を蒸留水中で同一分子量の非標識化HAで10倍に希釈した後、適用した。
実験前に、融解した皮膚試料 (ほぼ0.8 cm2) を試料ガラス拡散セルのドナー相とレセプター相との間にはさみ、32℃に維持した。ドナー相は0.1 mlの標識化HA溶液であり、そしてレセプター相はpH 7.4の緩衝液であった。
皮膚を直ちに、角質層を上にして、ガラススライド上に設置し、LSM 410 倒立レーザー走査型顕微鏡 (Carl Zeiss、ドイツ国) により、それ以上プロセシングしないで顕微鏡検査した。このシステムは568および488 nmの励起波長を有するアルゴン-クリプトンレーザーを装備し、それぞれ皮膚および標識化HAを見るために別々に使用した。
300,000 Daの蛍光標識化HA (F-HA 0.30) を使用して同様な観察を実施し、これはまた毛嚢の回りにおいて明瞭に可視であった。図4、パネルAは皮膚表面 (角質層) 、毛嚢および毛幹を示す; パネルBは毛嚢の回り標識化HAからの緑蛍光を示す。
Claims (14)
- 噴霧乾燥されそして凝集されたヒアルロン酸またはその塩を含んでなる医薬組成物であって、前記噴霧乾燥が、
入口温度: 100〜200℃
出口温度: 40〜 90℃
ノズル噴霧化圧力: 2〜 10バール
ノズル空気温度: 40〜100℃
での噴霧乾燥機により行われ、そして前記凝集がアルコール又は水−アルコール混合物により行われることを特徴とする医薬組成物。 - 前記アルコール又は水−アルコール混合物が、0:100〜50:50の水:アルコール比を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記ヒアルロン酸またはその塩が、組換え的に産生されている、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 前記組換え生産がグラム陽性細菌により行われる、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記グラム陽性菌がバシラス (Bacillus) 属の細菌である、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記ヒアルロン酸またはその塩が300,000〜3,000,000の範囲の分子量を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 水性溶媒中で30分より短い分散性を有する、請求項1〜6のいずれかに記載の医薬組成物。
- 噴霧乾燥されそして凝集されたヒアルロン酸またはその塩を含んでなる化粧組成物であって、前記噴霧乾燥が、
入口温度: 100〜200℃
出口温度: 40〜 90℃
ノズル噴霧化圧力: 2〜 10バール
ノズル空気温度: 40〜100℃
での噴霧乾燥機により行われ、そして前記凝集がアルコール又は水−アルコール混合物により行われることを特徴とする化粧組成物。 - 前記アルコール又は水−アルコール混合物が、0:100〜50:50の水:アルコール比を有する、請求項8に記載の化粧組成物。
- 前記ヒアルロン酸またはその塩が、組換え的に産生されている、請求項8又は9に記載の化粧組成物。
- 前記組換え生産がグラム陽性細菌により行われる、請求項10に記載の化粧組成物。
- 前記グラム陽性菌がバシラス (Bacillus) 属の細菌である、請求項11に記載の化粧組成物。
- 前記ヒアルロン酸またはその塩が300,000〜3,000,000の範囲の分子量を有する、請求項8〜12いずれか1項に記載の化粧組成物。
- 水性溶媒中で30分より短い分散性を有する、請求項8〜13のいずれかに記載の化粧組成物。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DKPA200400833 | 2004-05-27 | ||
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