DE60036915T2

DE60036915T2 - Verwendung von hyaluronan zur herstellung eines medikaments zur erhöhung der wirksamkeit von zytotoxischen arzneimitteln

Info

Publication number: DE60036915T2
Application number: DE60036915T
Authority: DE
Inventors: Tracey Dpt. of Mole Clayton BROWN
Original assignee: Alchemia Oncology Pty Ltd
Current assignee: Alchemia Oncology Pty Ltd
Priority date: 1999-01-13
Filing date: 2000-01-06
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2020-01-07
Also published as: TWI284042B; KR20010113642A; DK1140198T3; ATE376824T1; CA2370003C; DE60036915D1; JP2002534484A; EP1140198A4; WO2000041730A1; US8741970B2; CN100374163C; HK1041209A1; JP2011178802A; US20130197103A1; EP1140198B1; CA2370003A1; ES2295005T3; NZ512676A; JP4790911B2; EP1140198A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verbesserung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und insbesondere bei Überwindung der Resistenz von Zellen oder Organismen gegenüber Arzneimitteln.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der klinische Nutzen eines beliebigen chemotherapeutischen Mittels oder Arzneimittels kann durch das Auftreten von zellulärer Resistenz gegenüber diesem Arzneimittel schwer beeinträchtigt werden. Entsprechend wurden große wissenschaftliche Anstrengungen mit dem Versuch unternommen, sowohl die zellulären Mechanismen, welche bei der Resistenz gegenüber Arzneimitteln eine Rolle spielen, aufzuklären, als auch Verfahren zur Überwindung derartiger Resistenz aufzuklären. Bis heute wurden mehrere mögliche zelluläre Mechanismen, welche bei Arzneimittelresistenz eine Rolle spielen, vorgeschlagen. Diese umfassen:

(i) einen veränderten Metabolismus der Arzneimittel, welcher eine erniedrigte Aktivierung oder eine erhöhte Deaktivierung umfassen könnte;
(ii) eine Undurchlässigkeit der Zielzelle oder des Zielorganismus gegenüber der aktiven Verbindung;
(iii) eine veränderte Spezifität eines gehemmten Enzyms;
(iv) eine erhöhte Erzeugung eines Zielmoleküls;
(v) eine erhöhte Reparatur von zytotoxischen Läsionen; und
(vi) ein Umgehen einer gehemmten Reaktion durch alternative biochemische Reaktionswege.

Die zellulären Mechanismen, welche bei Arzneimittelresistenz eine Rolle spielen, sind komplex und in der Folge gab es bei der Entwicklung von allgemein anwendbaren Verfahren zur Überwindung von Arzneimittelresistenzproblemen nur einen kleinen Fortschritt. Ein weiterer komplizierender Faktor ist der, dass obwohl Arzneimittelresistenz ein Problem darstellt, welches nahezu mit allen chemotherapeutischen Anwendungen assoziiert ist, sie öfter mit Erkrankungen assoziiert ist, welche eine andauernde und anhaltende Behandlung mit mehreren nebenläufigen Arzneimitteln benötigen.
Beispielsweise wird bei der Krebsbehandlung oftmals eine Undurchlässigkeit der Krebszellen für die aktive Verbindung beobachtet. Darüber hinaus wird oftmals festgestellt, dass eine Resistenz gegenüber einem Arzneimittel eine Resistenz gegenüber anderen biochemisch unterschiedlichen Arzneimitteln verleihen kann. Dies wurde als Multi-Arzneimittelresistenz bezeichnet. Arzneimittel, welche typischerweise vom Multi-Arzneimittelresistenzproblem betroffen sind, umfassen Doxorubicin, Vincristin, Vinblastin, Colchicin und Actinomycin D. Wenigstens in einigen Fällen ist Multi-Arzneimittelresistenz ein komplexer Phänotyp, welcher mit einem hohen Maß an Expression eines Zellmembran-Arzneimitteleffluxtransporters verknüpft worden ist, welcher als Mdrl-Protein bezeichnet wird und welcher auch als P-Glycoprotein bekannt ist. Diese Membran-"Pumpe" weist eine breite Spezifität auf und wirkt, um aus der Zelle eine breite Vielfalt an chemisch nicht-verwandten Toxinen zu entfernen (siehe Endicott et al., 1989).
Kürzlich wurde ein ähnlicher Mechanismus für Breitbandarzneimittelresistenz für bestimmte Mikroorganismen beschrieben. Die Ergebnisse weisen auf die Existenz von bakteriellen Effluxsystemen mit extrem breiter Substratspezifität hin, welche ähnlich sind zu der Multiarzneimittelresistenzpumpe von Säugerzellen (siehe Nikaido, 1993).
Substanzen, welche Multiarzneimittelresistenz umkehren, sind als Resistenzmodifizierungsmittel (RMAs) bekannt und sind bei der Potenzierung der Zytotoxizität von chemotherapeutischen Mitteln, gegenüber welchen ein humaner Krebs resistent geworden ist, wichtig. Obwohl viele Mittel in vitro als RMAs identifiziert worden sind, weist ein großer Teil dieser Mittel nur ein geringes oder kein therapeutisches Potenzial auf, da sie in vivo bei den Dosierungen, welche zur Umkehrung von Multiarzneimittelresistenz notwendig sind, eine hohe Toxizität aufweisen. Beispielsweise können Metabolismusgifte, wie beispielsweise Azid, Multiarzneimittelresistenz in vitro umkehren, weisen aber in vivo keinen Nutzen auf. Die meisten anderen hoch-effektiven RMAs, wie beispielsweise PSC833, scheinen als kompetitive Antagonisten einer Arzneimittelbindungsstelle am Mdrl-Protein zu wirken. Viele dieser Mittel weisen eine Zytotoxizität auf, welche ihren Nutzen in vivo beschränkt. Folglich besteht Bedarf zur Entwicklung von alternativen pharmakologischen Strategien zur Umkehrung von Multiarzneimittelresistenz.
In einem Versuch zur Überwindung einer mangelhaften Aufnahme von anti-neoplastischen Arzneimitteln durch einen Tumor und zur Reduzierung von systemischer Toxizität (Singh et al., 1991) versuchten die Forscher antineoplastische Arzneimittel, wie beispielsweise Methotrexat (MTX), auf die Stelle mit bösartigem Gewebes zielauszurichten. In mehreren Studien wurde bereits versucht, chemotherapeutische Mittel durch Anknüpfen von Arzneimitteln an Polymere, welche hinsichtlich ihrer Affinität für Tumore ausgewählt wurden, auf Tumore hin zielauszurichten (Hudecz et al., 1993; Klein et al., 1994; Akima et al., 1996). Obwohl diese Polymere helfen können, aktive Mittel an ihre Zielgewebe abzugeben, überwinden sie jedoch nicht notwendigerweise das Arzneimittelresistenzproblem.
Ein Polymer, welches als Tumorzielmittel vorgeschlagen worden ist, ist Hyaluronan (HA). HA, welches auch als Hyaluronsäure bekannt ist, ist ein natürlich vorkommendes Polysaccharid umfassend linearkettige Polymere, welches in der Tierwelt ubiquitär vorgefunden wird. HA ist in hohem Maße wasserlöslich, wodurch es zu einem idealen Arzneimittelabgabevehikel für biologische Systeme wird.
Die Anmelder haben nun überraschenderweise herausgefunden, dass HA einzigartige strukturelle und physiochemische Eigenschaften aufweist, welche nicht nur seinen Nutzen als Arzneimittelträger verbessern, sondern welche auch beim Überwinden von Arzneimittelresistenz helfen. In hohen Konzentrationen von 1 g/l, nimmt HA eine versteifte regellose Spiralenkonfiguration ein, welche relativ zur Molekülmasse ein ungewöhnliches Volumen besitzt (Laurent, 1970) und auf diesem Niveau oder darunter bildet es lockere Verknüpfungen zu makromolekularen Netzwerken (1). Obwohl es nicht gewünscht ist, durch irgendeine Theorie gebunden zu sein, nehmen wir aufgrund der physikalischen Eigenschaften von HA an, dass der Mechanismus der Wechselwirkung zwischen Polysaccharid und Mitteln, wie beispielsweise Methotrexat, eine oder beide von zwei Formen annehmen kann:
(i) Chemische Wechselwirkung (2A).
Es könnte eine ionische Bindung stattfinden zwischen den MTX-Amingruppen und den HA-Carboxylgruppen, wobei aber eine derartige Wechselwirkung zur Präzipitierung führen könnte. Eine andere mögliche Wechselwirkung ist mittels Wasserstoffbindung zwischen verfügbaren Amingruppen am Arzneimittel und Hydroxylgruppen des HA, wobei dies aber unwahrscheinlich ist, da Methotrexat in Wasser relativ unlöslich ist. Deshalb würde es sich bei dieser Wechselwirkung, wenn sie auftreten würde, um eine sehr schwache Wechselwirkung handeln. Die wahrscheinlichste Bindung zwischen MTX und HA fände mittels hydrophober Wechselwirkungen zwischen den zahlreichen hydrophoben Gruppen von MTX und den hydrophoben Stellen in der Sekundärstruktur von HA statt (Scott et al., 1989).
(ii) Molekulare Assoziierung.
In Fällen in denen MTX nur in HA-Gel (2B) ohne spezifische chemische Bindungsbildung „eingemischt" wird, könnte MTX innerhalb des dreidimensionalen Maschenwerkes, welches durch höhere Konzentration an HA gebildet wird, eingeschlossen werden (Mikelsaar und Scott, 1994), so dass das Arzneimittel nach der Verabreichung aus dem HA einfach diffundiert. Wenn HA schnell aufgenommen wird und durch spezifische Zellrezeptoren gebunden wird, wird das Arzneimittel in höherer Konzentration an diesen Punkten freigesetzt, z. B. Lymphknoten, Leber, Knochenmark, Tumorzellen mit HA-Rezeptoren.
Obwohl es wiederum nicht erwünscht ist, durch irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, könnte ein Mechanismus, durch welchen HA hilft Wirkstoffe zielauszurichten, in der charakteristischen Überexpression von HA-Rezeptoren in verschiedenen Tumortypen begründet sein (Stamenkovic et al., 1991; Wang et al., 1998). Die HA-Rezeptoren CD44, der Rezeptor für Hyaluronan-vermittelte Beweglichkeit (Receptor for Hyaluronan Mediated Motility) (RHAMM) und ICAM-1 wurden mit Tumorgenese (Bartolazzi et al., 1994) und Tumorprogression (Günthert 1993; Arch et al., 1992) in direkten Zusammenhang gebracht. RHAMM ist ein wichtiger Faktor beim Vermitteln von Tumorzellbeweglichkeit und Tumorzellinvasion (Hardwick et al., 1992). Es wurde gezeigt, dass RHAMM zur H-ras-Transformation von Fibroblasten benötigt wird (Hall et al., 1995), wodurch dieser Rezeptor zu einem möglichen Beteiligten bei der Tumorbildung und beim Tumorwachstum wird. ICAM-1, ein Rezeptor, welcher vorläufig mit dem HA-Metabolismus verknüpft ist (McCourt et al., 1994), wird in transformierten Geweben, wie beispielsweise Maus-Mastozytomen (Gustafson et al., 1995a) und im Stroms und in Ansammlungen von Tumorzellen humaner Brustkarzinome (Ogawa et al., 1998) in hohem Maße exprimiert.
Eine erhöhte Expression von HA-Rezeptoren auf Tumorzellen stellt einen Grund dar, zu versuchen, HA in chemotherapeutische Behandlungskuren einzubeziehen. Jedoch führen die bis heute sehr beschränkt verfügbaren Daten tatsächlich vom gegenwärtig beanspruchten Verfahren weg. Beispielsweise wurde durch chemisches Komplexieren von HA mit Mitomycin C und Epirubicin nur ein beschränkter Erfolg erzielt; die Forscher konnten Kolonkarzinomwachstum um 0,8–25% hemmen (Akima et al., 1996). Klein und Kollegen (1994) beschrieben, dass eine erhöhte Aufnahme des Arzneimittels bei Ratten in implantierte Brustkarzinome und Fischer-Harnblasenkarzinome erreicht wurde nur durch Mischen von HA mit 5-FU. Für Maus-Mastozytome wurde auch gezeigt, dass sie eine Affinität für intravenös injiziertes HA aufweisen (Gustafson et al., 1995b).
WO-A-9902151 beschreibt eine spezifische pharmazeutische Formulierung, welche Hyaluronan mit einem Molekulargewicht von weniger als 750 000 Dalton und Paclitaxel enthält, zur Behandlung von Krebs. Es gibt jedoch keine Lehre und es liegen keine Daten vor, dass Hyaluronan eine erworbene oder ererbte zelluläre Resistenz gegenüber zytotoxischen oder anti-neoplastischen Mitteln überwinden kann.
Klein et al., Reg. Cancer Treatment, Bd. 7, 1994, Seiten 163–164 diskutiert die Verwendung von Hyaluronan und 5-Fluoruracil in Mäusen mit „Leber-implantierten" Ratten-Brustkarzinomen oder „subkutan implantierten" Fischer-Harnblasenkarzinomen. Die beschriebenen Experimente adressieren die Aufnahme von 5-Fluoruracil und geben wiederum keinerlei Hinweis hinsichtlich der Frage einer Verwendung von Hyaluronan mit einem zytotoxischen Mittel zur Überwindung oder zur Reduktion einer erworbenen oder ererbten Resistenz gegenüber diesem Mittel.
WO-A-9104058 stellt keine Offenbarung zur Verwendung von Hyaluronan in Kombination mit einem zytotoxischen oder anti-neoplastischen Mittel zur Überwindung oder zur Verringerung von erworbener oder ererbter Resistenz eines Krebses bereit. Anstelle dessen wird verdeutlicht, dass von Hyaluronan angenommen wird, dass es die Penetration des Anti-Krebsmittels zu der zu behandelnden Stelle erleichtert.
WO-A-9606622 stellt breite Ausführungen hinsichtlich des vorgeschlagenen Nutzens von Hyaluronan bereit. Es gibt keinen Vorschlag oder keine Daten, welche die Verwendung von HA zur Überwindung der zellulären Resistenz gegenüber Chemotherapeutika betreffen oder sogar dahingehend, dass Hyaluronan als Träger chemotherapeutischer Mittel wirken kann, wie dies in der vorliegenden Erfindung der Fall ist.
Bioconjugate Chemistry, Bd. 10, 1999, Seiten 755–763 beschreibt eine spezifische Anti-Krebsbehandlung mit einem Konjugat aus Paclitaxel und Hyaluronan mit einem Molekulargewicht von 1,5 MDa. Dieses Konjugat, wobei es sich um eine chemisch synthetisierte Verbindung handelt, welche als Adipin-Dihydrazid-modifiziertes Hyaluronan (HA-ADH) bekannt ist, ist von den Hyaluronanen der vorliegenden Erfindung strukturell sehr verschieden und es gibt keine Lehre und es liegen keine Daten vor, dass Hyaluronan eine erworbene oder ererbte zelluläre Resistenz gegenüber Chemotherapeutika überwinden kann, wie dies für die vorliegende Erfindung der Fall ist.
Obwohl ein Teil der HA-Forschung gezeigt hat, dass HA als Arzneimittelträger verwendet werden kann, haben aber keine dieser Untersuchungen gezeigt, dass HA zelluläre Resistenz gegenüber Arzneimitteln überwinden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Hyaluronan bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in Kombination mit oder zur Co-Verabreichung mit einem Arzneimittel zur Behandlung von einem Krebs bereit, welcher gegenüber dem Arzneimittel resistent ist.
Üblicherweise verbessert die Co-Verabreichung eines zytotoxischen oder neoplastischen Mittels mit Hyaluronan dessen Potenzial zur Krebszellabtötung. Das heißt, Krebszellen, welche normalerweise resistent gegenüber dem Arzneimittel sind, werden für das Arzneimittel empfänglich.
Vorzugsweise ist das Mittel Methotrexat, Paclitaxel (Taxol), 5-Fluoruracil (5-FU) oder Cyclophosphamid oder eine Kombination davon.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend Hyaluronan mit einem modalen Molekulargewicht von 890000 Da und ein zytotoxisches oder anti-neoplastisches Mittel. Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend Hyaluronan mit einem modalen Molekulargewicht von 750000 Da und ein zytotoxisches oder anti-neoplastisches Mittel. Gegebenenfalls können übliche pharmazeutische Zusätze in den pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten sein.
Typischerweise wird das Arzneimittel in Hyaluronan mitgerissen oder ist an Hyaluronan gebunden.
Obwohl es nicht gewünscht ist, durch eine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass mögliche Mechanismen zur Überwindung von Arzneimittelresistenz sind:

1. Hyaluronan bindet an Rezeptoren auf der resistenten Zelle und tritt in die Zelle mittels Massenendozytose (bulk endocytosis) ein, was dazu führt, dass das mitgerissene oder gebundene Mittel in die Zelle abgegeben wird, wodurch dem Mittel ermöglicht wird, therapeutisch wirksam zu werden.
2. Hyaluronan bindet an die Oberfläche der resistenten Zelle, wodurch das mitgerissene oder gebundene Mittel aus dem Hyaluronan-Maschenwerk in die Zelle diffundiert, wobei das dazu führt, dass das Mittel an die resistente Zelle abgegeben wird.
3. Hyaluronan und andere Mucopolysaccharide nehmen eine spiralisierte Konfiguration ein, welche das Mittel mitreißt, und auch verschiedene Mittel binden kann.

Obwohl es nicht erwünscht ist, durch eine Theorie gebunden zu sein, kann es auch sein, dass eine Kombination von Hyaluronan mit einem Arzneimittel dazu führt, dass das Arzneimittel über einen längeren Zeitraum in der Zelle gehalten wird, wodurch eine andauernde Freisetzung ermöglicht wird und dem Arzneimittel mehr Zeit gegeben wird, seinen pharmakologischen Effekt auszuüben.
In einem Aspekt ist die Arzneimittelresistenz Multiarzneimittelresistenz.
Durch die Beschreibung und die Ansprüche dieser Patentschrift hindurch bedeutet das Wort „umfassen" und Variationen des Wortes, wie beispielsweise „umfassend" und „umfasst", „umfassend, aber nicht beschränkt auf" und soll andere Additive, Komponenten, ganze Zahlen oder Schritte auszuschließen nicht ausschließen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt dass HA bei höheren Konzentrationen ein dreidimensionales Maschenwerk bildet, welches kleine Moleküle, wie beispielsweise Methotrexat mitreißen kann. Das HA/Arzneimittel-Targeting von pathologischen Stellen wird dadurch erreicht, dass HA schnell an spezifische Zellrezeptoren bindet, woran sich die Diffusion des Arzneimittels vom HA anschließt und/oder durch Co-Internalisierung von sowohl HA als auch dem Arzneimittel über HA- und/oder Arzneimittelrezeptoren.
2A zeigt die möglichen molekularen Wechselwirkungen zwischen Methotrexat und HA. Diese umfassen (i) ionische Bindung, (ii) Wasserstoffbindung oder (iii) hydrophobe Bindung.
2B ist eine Diagrammdarstellung der Verfilzung von Methotrexat in HA. Bei höheren Konzentrationen bildet HA ein dreidimensionales Maschenwerk, welches durch das große geknäuelte Molekül dargestellt wird. (*) stellt das Methotrexat dar, welches ein Molekulargewicht von nur 454 D aufweist, und welches leicht im 400–900 kD HA Molekül mitgerissen wird.
3 zeigt die allgemeine Pathologie von humanen Brustkrebstumoren, welche in Nacktmäusen wuchsen. Panel A zeigt die allgemeine Morphologie eines humanen Tumors des Grades II-III. Panel B zeigt eine mikroskopische Aufnahme eines anderen Abschnitts des Tumors, welcher in 3A dargestellt ist. Dieser Abschnitt zeigt den umgebenden Mausmuskel (M), die Tumorkapsel (C), nekrotische Bereiche des Tumors (N), infiltrierenden Tumor (T) und (→) zeigt ein übliches Phänomen, welches als „Gänsemarsch-Formation" („Indian files") bekannt ist, wobei sich Karzinomzellen in Reihen anordnen, welche oftmals mit einem infiltrierendem Karzinom assoziiert sind (Carter, 1990).
4 zeigt die klassischen pathologischen Merkmale von bösartigem Brusttumor. Panel A zeigt einen Abschnitt eines charakteristischen infiltrierenden Duktuskarzinoms mit großen Nekrosebereichen (N), wodurch der aggressivere Verlauf des Tumors gezeigt wird. Panel B zeigt das Vorliegen von Blutzellen (→), wodurch gezeigt wird, dass der Tumor vaskularisiert ist und deshalb lebensfähig ist. In enger räumlicher Nähe zum Blutgefäß befinden sich einige beobachtete Dukti (D). Panel C zeigt Zellen, welche als (A) markiert sind, die Apoptose durchmachen, wobei das durch die Kernfragmentierung gezeigt wird.
5 zeigt die immunohistochemische Identifizierung von HA-Rezeptoren auf den humanen Brustkrebstumoren, welche in Nacktmäusen wuchsen. Panel A zeigt die Lokalisierung von carcinoembryonalem Antigen (CEA) im Tumor. Panel B zeigt die RHAMM-Expression auf humanem Brustkarzinom. Panel C zeigt die ICAM-1-Expression auf humanem Brustkarzinom. Die Lokalisierung von HA-Rezeptor, ICAM-1 befindet sich hauptsächlich um Endothelialgewebe herum (→). Panel D zeigt die CD44-Expression auf humanem Brustkarzinom. CD44H wurde auf etwa 95% der Tumorzellen detektiert. H: Zellen mit humanem Ursprung; M: Zellen mit murinem Ursprung.
6 zeigt die Ergebnisse einer Molekulargewichtsanalyse von Hyaluronan, welches als Träger für das Methotrexat-Targeting von Tumoren verwendet wurde.
7 zeigt Methotrexat-Targeting von humanen Brustkrebstumoren, wobei HA als Träger verwendet wird.
8 zeigt eine verbesserte Aufnahme von Methotrexat in der Leber in Gegenwart von HA.
9 zeigt eine verringerte Aufnahme von Methotrexat im Magen-Darm-Trakt, wenn das Arzneimittel mit HA verabreicht wird.
10 zeigt eine Diagrammdarstellung von möglichen physikalischen Wechselwirkungen zwischen MTX/HA und anschließend die Fähigkeiten der Arzneimittel-/HA-Kombinationstherapie zum Tumor-Targeting.
11 zeigt den zytotoxischen synergistischen in vitro-Effekt der Kombination von HA mit 5-FU.
12 zeigt 5-FU-Targeting von humanen Brustkrebstumoren unter Verwendung von HA als Träger.
13 zeigt die Eliminierungswege von HA in Menschen.
14 zeigt eine erhöhte Aufnahme von 5-FU im Magen, dem Gehirn und den Lungen.
15 zeigt den Effekt von HA auf die pharmakokinetische Eliminierung von 5-FU des Plasmas.
16 zeigt die Kriterien für die Definition eines experimentellen Endpunkts. Kriterium 2 (Panel A) und Kriterium 3 (Panel B) sind gezeigt.
17 zeigt die Wirksamkeit einer 5-FU/HA-Adjuvanstherapie (6 Wochen Behandlungskur): Effekt auf das anfängliche Tumorvolumen.
18 zeigt die Wirksamkeit einer 5-FU/HA-Adjuvanstherapie (6 Wochen Behandlungskur): Effekt auf die Körpermasse.
19 zeigt die Wirksamkeit einer 5-FU/HA-Adjuvanstherapie (6 Wochen Behandlungskur): Effekt auf die Ausbreitung von Krebslymphknoten und die Bildung von neuen Tumoren.
20 zeigt das allgemeine Auftreten von Tumoren der 6-monatigen Wirksamkeitsstudie.
21 zeigt den Effekt einer HA/5-FU-Adjuvanstherapie auf das Überleben von Patienten.
22 zeigt die %-Veränderung hinsichtlich der Körpermasse in Mäusen, welche mit einer CMF/HA-Therapie über einen 6-wöchigen Zeitraum hinweg behandelt worden waren.
23 zeigt die %-Veränderung hinsichtlich des Tumorvolumens in Mäusen, welche mit einer CMF/HA-Therapie über einen 6-wöchigen Zeitraum hinweg behandelt worden waren.
24 zeigt das ¹H NMR-Spektrum von MTX, welches in H₂O gelöst ist. Dieses Spektrum identifiziert leicht jede Wasserstoffgruppe in MTX.
25 zeigt die möglichen Wechselwirkungen von MTX mit HA.
26 zeigt das 600 MHz Spektrum von Hyaluronsäure bei 600 MHz und 298 K.
27 zeigt das 600 MHz ¹H NMR-Spektrum von MTX allein und MTX mit steigenden Zugaben an HA (50 kDa) von 2 nmol, 10 nmol, 20 nmol und 80 nmol bei 298 K.
28 zeigt die 600 MHz ¹H NMR-Spektren von 5-FU und 5-FU (1,25 mg/ml, 1,6 mg/ml und 6,4 mg/ml) mit HA (750 kDa, 3 mg/ml) zwischen 70,0 und 8,5 ppm bei 298 K.
ABKÜRZUNGEN

BSA: Rinderserumalbumin
Ci: Curie
CMF: Cyclophosphamid, Methotrexat und 5-Fluoruracil
Cyc: Cyclophosphamid
DNA: Deoxyribonukleinsäure
Dpm: Schädigungen pro Minute
DTTP: Deoxythymidintriphosphat
ECM: extrazelluläre Matrix
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA: Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay
FCS: fötales Kälberserum
5-FU: 5-Fluoruracil
GAG: Glycosaminoglycan
GIcNAc: N-Acetylglucosamin
GIcUA: Glucuronsäure
HA: Hyaluronan/Hyaluronsäure
HABP: Hyaluronan-bindendes Protein
HAase: Hyaluronidase
HBSS: Salzlösung nach Hanks
HRP: Meerrettichperoxidase
h: Stunde
K_av: verfügbares Verteilungsvolumen innerhalb des Gels
l: Liter
min: Minute
PBS: Phosphat-gepufferte Salzlösung
PM: Plasmamembran
RHAMM: Rezeptor für HA-vermittelte Beweglichkeit
RMCa: Ratten-Brustkarzinom
RNA: Ribonukleinsäure
RT: Raumtemperatur
S-Phase: Synthesephase
S. D.: Standardabweichung
SEM: Standardfehler
V_e: Elutionsvolumen
V_o: Leervolumen
V_t: Gesamtvolumen
TGD: Tumorwachstumsverzögerung
TDT: Tumorverdopplungszeit

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird nun nur unter Bezugnahme auf die nachfolgenden nicht-einschränkenden Beispiele weiter beschrieben. Es ist aber selbstverständlich, dass die nachfolgenden Beispiele nur veranschaulichend sind und in keinerlei Weise als eine Einschränkung der vorausgehend beschriebenen allgemeinen Erfindung verstanden werden sollen. Insbesondere ist es selbstverständlich, obwohl die Erfindung in Bezug auf Krebs ausführlich beschrieben wird, dass die hierin gezeigten Ergebnisse nicht auf die Behandlung von Krebs beschränkt sind. Beispielsweise können zytotoxische Mittel zur Behandlung anderer Zustände verwendet werden; Methotrexat wird weit verbreitet zur Behandlung von schwerer rheumatoider Arthritis verwendet.
Beispiel 1 Validierung von humanen Brustkrebstumoren in Nacktmäusen und Identifizierung von Hyaluronanrezeptoren auf den Brusttumoren in situ
Um ein geeignetes Tiermodell für humanen Brustkrebs zu etablieren, war es notwendig, pathologische Untersuchungen durchzuführen. Für einen Tumor ist Neovaskularisierung essentiell, um physiologisch lebensfähig zu sein, da das Kapillarnetzwerk dem Tumor Nährstoffe zuführt. Das Vorliegen von Vaskularisierung, duktale Invasion, Nekrose, Apoptose, ein hoher mitotischer Index und Kernabnormalitäten sind alle für ein Brustkarzinom charakteristisch.
Es wurde die humane Brustkarzinomzelllinie MDA-MB-468 (American Tissue Culture Collection, Rockville, U. S. A.) auf Grundlage ihrer Expression der HA-Rezeptoren, CD44, RHAMM und ICAM-1 ausgewählt. Die Zellen wurden routinemäßig aufgezogen und als Monoschicht in 175 cm² Kulturflaschen in Leibovitz L-15 Medium kultiviert, welches supplementiert war mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 10 μ/l Gentamicin. Zur Injektion in Mäuse wurden die Zellen bis zu 100% Konfluenz aufgezogen, in 0,05% Trypsin/0,01% EDTA-Lösung trypsinisiert, zweimal mittels Zentrifugation in einer Beckman TJ-6 Arbeitsbank-Zentrifuge (Beckman, Australien) bei 400 g_av für 10 Min gewaschen, unter Verwendung einer Coulter-Zellvorrichtung Modell-ZM (Coulter Electronics, England) ausgezählt und in serumfreiem Leibovitz L-15-Medium mit 1 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert.
85 athymische Balb/c/WEHI weibliche Nacktmäuse (Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne, Australien), 6 bis 8 Wochen alt, wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit sterilisierter Nahrung und Wasser, welches nach Belieben verfügbar war, gehalten. Es wurden zehn Millionen MDA-MB 468-Zellen wie vorausgehend beschrieben hergestellt und direkt in das Fettkissen unter der Brustwarze einer jeden Maus injiziert. Es wurde Tumorwachstum in 96% der Mäuse beobachtet. Wenn das Tumorwachstum visuell detektierbar war, wurde die Tumorprogression durch wöchentliche Messungen des Tumorvolumens überwacht. Die Tumorvolumen wurden aus 3 zueinander senkrechten Durchmessern berechnet, wobei die Gleichung: V = (1/6)p(d1d2d3)verwendet wurde, wobei:

V: das Tumorvolumen (in mm³) ist,
d₁: der erste Durchmesser des Tumors (in mm) ist,
d₂: der zweite Durchmesser des Tumors (in mm) ist und
d₃: der dritte Durchmesser des Tumors (in mm) ist (Lamszus et al, 1997).

Acht Wochen nach der Tumorinokulation betrug die mittlere Tumorgröße 482,2 mm³ (SEM, 39,8 mm³).
Etwa 8 Wochen nach der Tumorinduktion wurden zwei Tumortragenden Mäusen eine tödliche Mäuse Nembutal verabreicht. Innerhalb von 3 Min nach dem Töten der Mäuse wurden die Tumore chirurgisch entfernt und sofort in 10% gepuffertem Formalin für 12 Stunden fixiert. Der fixierte Tumor wurde über Nacht in einer Reihe von 70–100% Ethanol-Waschschritten dehydriert, woran sich Einbetten in Paraffin anschloss, von welchem 2–4 μm Schnitte abschnitten wurden. Die Schnitte wurden auf Objektträgern platziert, entwachst und in Wasser eingebracht. Die Objektträger wurden 3 × 5 Min in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Heterophile Proteine wurden durch Inkubation mit 10% fötalem Kälberserum für 10 Min blockiert, wobei sich einmal Spülen mit PBS anschloss. Die Detektionsantikörper wurden für 60 Min bei Raumtemperatur (RT) appliziert. Die Antiseren oder Antikörper waren gerichtet gegen RHAMM (Applied Bioligands Corporation (Manitoba, Kanada)), ICAM-1, CD44v6, CD44v10, Gesamt-CD44H und CAE. Alle anderen Detektionsantikörper wurden von Zymed (Kalifornien, U.S.A.) bezogen. Die Objektträger wurden 3 × 5 Min in PBS gewaschen und endogene Peroxidaseaktivität wurde durch Eintauchen in 0,3% H₂O₂/Methanol für 20 Min blockiert. Im Anschluss an einen weiteren Waschschritt mit PBS wurde Peroxidase-konjugiertes Anti-Hase-Sekundärantiserum aus Schwein (Dako, Dänemark) für 60 Min bei RT appliziert, wobei sich 3 × 5 Min Waschen in PBS anschloss. Sigma Fast DAB (3,3'-Diaminobenzidin, Sigma, St. Louis, U.S.A.)-Tabletten wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert und die DAB-Lösung wurde für 5–10 Min bei RT appliziert. Die Objektträger wurden in Leitungswasser für 10 Min gewaschen, mit Hämatoxylin kontrastgefärbt, dehydriert und montiert.
Eine Untersuchung der Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Brustkrebsschnitte zeigte alle der üblichen Merkmale, welche mit lebensfähigen Tumoren assoziiert sind, wie es in den 3 und 4 gezeigt ist, wodurch bestätigt wird, dass das Wirtstier erfolgreich ein humanes Brustkarzinom vom Grad II erhalten hat. Es gibt einige Merkmale, welche für bösartige Tumore charakteristisch sind. Der Abschnitt der Objektträger, welcher mit (B) markiert ist, zeigt diese Merkmale. Es werden im Abschnitt (B) alle pathologischen Merkmale für einen bösartigen Tumor beobachtet, d. h.

i) hohe Kern-/Zytoplasma-Verhältnisse
ii) eckiges Chromatin und Kernkörperchen
iii) eine unregelmäßige Kernmembran

Es wurde die Schlußfolgerung, dass ein Grad II-III-Level-Tumor von dem Nacktmaus-Modell versorgt werden kann. Ein Grad II-III-Level-Tumor führt im Allgemeinen zu einer prognostizierten Überlebensrate von etwa 47% (Bloom und Richardson, 1957). Ein Grad II-III-Level-Tumor ist charakterisiert durch:

i) einen moderaten Kernpleomorphismus, Hyperchromatin und mitotische Aktivität, wobei es sich um Merkmale handelt, welche überall im gezeigten Schnitt des Tumors beobachtet werden; und
ii) geringe oder keine Duktusbildung.

Große Nekrosebereiche (N) können korreliert werden mit der Tumorausbreitung, wodurch ein aggressiverer invasiver Verlauf nahegelegt wird (Carter, 1990). Das infiltrierende Ende des Tumors ist angezeigt durch ( ).
Ein Hauptziel des Experiments war die Validierung, dass das histologische und zytologische Verhalten der Tumore, welche in diesen Mäusen etabliert worden waren, vergleichbar war mit dem Verhalten derartiger Tumore in ihren natürlichen menschlichen Wirten. Durch Erreichen dieses Ziels haben wir auch gezeigt, dass die Tumorzellen in den Mäusen von humanem Ursprung sind und dass sie hoch-relevante HA-Rezeptoren, wie beispielsweise RHAMM, CD44 und mutmaßlich ICAM-1 exprimieren. Da die Hypothese aufgestellt wurde, dass Tumor-Targeting mittels Rezeptor-vermittelter Internalisierung oder Bindung stattfinden könnte, war es notwendig, die Expression von HA-Rezeptoren, ICAM-1, CD44 und RHAMM zu bestätigen. Die 5B-D zeigen, dass alle diese Rezeptoren vorlagen. Tabelle 1 listet den Grad der Rezeptorexpression in den zwei untersuchten Tumoren auf.
Tabelle 1: Expression von Hyaluronan-Rezeptoren auf humanen Brusttumorxenotransplantaten

Der Klassifizierungsindex für den Prozentsatz an Epitopexpression auf dem Tumor wurde quantifiziert als:

0%	–
1–25%	+
26–50%	++
51–75%	+++
76–100%	++++

HA-Rezeptor	Funktion	Verteilung auf dem Tumor	%-Epitop-Expression auf dem Tumor
CD44H	Isoform, welche hauptsächlich HA bindet und internalisiert (Culty et al., 1992)	Exprimiert auf allen Zellen mit Ausnahme von einigen Bindegewebszellen	++++
CD44v6	Rolle bei Krebs unbekannt, wird aber oftmals als Prognosefaktor verwendet. Umso höher die Expression, umso niedriger die Überlebenswahrscheinlichkeit (Friedrichs et al., 1995)		+
CD44v3	Bei Brustkarzinom oft überexprimiert (Friedrichs et al., 1995)		–
RHAMM	Wird zur Transformation und Tumorzellinvasion benötigt (Hall et al., 1995)	Gruppen infiltrierender Tumorzellen, mit hoher Expression auf Zellen, welche nekrotische Bereiche umgeben	+++
ICAM-1	Bindet und internalisiert HA, mutmaßlicher metabolischer Rezeptor (McCourt et al., 1994)	Liegt auf Bindegewebszellen vor	++
CEA	Ein fötales Antigen, welches auf bösartigen Zellen exprimiert wird (Haskell, 1990)	Liegt auf allen Tumorzellen vor	++++

Der humane Ursprung der Tumorzellen wurde durch Färben des Tumors und des umgebenden Gewebes mit einem humanspezifischen Krebsmarker bestätigt. Das Vorliegen von CEA zeigte deutlich, dass der Tumor human war, obwohl er durch das kardiovaskuläre System des murinen Wirts erhalten wurde (5A). Die polyklonalen CEA-Antiseren wurden ausgewählt, da sie ausschließlich mit humanem CEA reagieren. Die mikroskopische Aufnahme zeigt, dass der Tumor vollständig von humanem Ursprung (H) war, wobei dies durch die Braunfärbung gezeigt wird. Die umgebende Tumorkapsel und das Fettgewebe sind eindeutig murinen Ursprung, wobei dies durch ein Fehlen von Färbung mit den Antiseren (M) gezeigt wird. Die Braunfärbung zeigt die starke Expression von RHAMM auf den Tumorzellen. Die größte Färbungsintensität wird in den Bereichen, welche Gewebenekrose und Tumorinfiltration umgeben, beobachtet.
Beispiel 2 Herstellung und Injektion von Methotrexat/Hyaluronan-Arzneimittelkombinationen
Nachdem die Anwendbarkeit des Nacktmaus-Modells etabliert worden war, konnte es nun verwendet werden, um die Effektivität einer HA/MTX-Präparation zu untersuchen.
Es wurde eine MTX-Stammlösung hergestellt durch Auflösen von gepulvertem MTX in 0,5% w/v Natriumcarbonat (pH 9) und auf eine Konzentration von 24,5 mg/ml mit 0,9% w/v NaCl eingestellt. Die Stammlösung wurde durch einen 0,22 μm Filter filtriert, um die Sterilität vor Zugabe von [³H]Methotrexat und vor Verdünnung auf eine Injektionskonzentration mit Natriumchlorid von Injektionsgüteklasse sicherzustellen. Vergleichsdaten hinsichtlich der Pharmakokinetik von MTX sind bereits für die Nacktmaus und Menschen publiziert worden (Inaba et al, 1988) und wurden bei der Konzeption dieser Studie verwendet, um humane therapeutische Dosierungen so genau wie möglich zu simulieren. Es wurden individuelle Injektionen gemäß den individuellen Körpermassen der Mäuse hergestellt, mit dem Ziel, 15 mg/kg MTX in 50 μl abzugeben (entsprechend einer humanen therapeutischen Dosis von 0,42 mg/kg für ein mittleres Körpergewicht von 60 kg; Inaba et al, 1988).
Getrocknetes HA (modal Mr 8,9 × 10⁵ kDa) wurde zu einem Teil der 24,5 mg/ml MTX-Stammlösung zugeben und über Nacht unter Vortexen gelöst, um eine Endkonzentration von 21 mg/ml zu ergeben. Um die Sterilität sicherzustellen, wurde Gentamicin bis zu einer Konzentration von 50 μg/ml zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Im Anschluss an die Zugabe von [³H]Methotrexat wurde das HA/MTX-Stammgemisch mit Natriumchlorid von Injektionsgüteklasse auf Injektionskonzentration verdünnt. Die Injektionen wurden individuell gemäß den Körpergemassen der Mäuse durchgeführt, um 15 mg/kg MTX und 12,5 mg/kg HA in 50 μl abzugeben. Bei dieser in den Körper injizierten HA-Menge wird für die Dauer des Experiments eine Sättigungskinetik beobachtet (Fraser et al, 1983).
Um sicherzustellen, dass HA während der Herstellung des Methotrexat/HA-Injektionsgemischs sein Molekulargewicht beibehalten hatte, wurde die Injektionslösung analysiert auf einem Sephacryl S-1000-Größenausschlussgel (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit Säulenspezifizierungen von 1,6 cm × 70 cm, Probengröße 2 ml, Flussrate 18 ml/h und 2 ml Fraktionsgröße. 6 zeigt, dass HA während des Mischungsarbeitsverfahrens sein Molekulargewicht beibehielt.
Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen von 40 Tieren aufgeteilt. Gruppe I empfing nur MTX und Gruppe 2 empfing eine MTX/HA-Kombinationstherapie. Die Tiere wurden einzeln in einer Injektionsbox platziert und die Injektionen wurden über die Schwanzvene verabreicht. Mit Tritium markiertes Methotrexat (mittlere injizierte Zerfallsereignisse pro Minute (dpm) ± Standardfehler (SEM): 19,159,146 ± 1,336,819), welches in 15 mg/kg MTX ± 12,5 mg/kg HA enthalten war, wurde in jeder Injektion abgegeben. Die Mäuse waren einzeln in weichen, nicht-benetzbaren Kunststoffgehäusen untergebracht, so dass Urin gesammelt werden konnte. 30 Min, 1 h, 2 h, 4 h oder 8 h nach der Injektion wurden die Mäuse durch 0,1 ml intraperitoneale Injektion von Nembutal (Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australien) anästhesiert und es wurde Blut aus dem Herz oder den großen Gefäßen unter Verwendung einer Nadel und einer Spritze gewonnen. Nach der Blutgewinnung wurden die Tiere durch Halswirbelverrenkung getötet.
Das Blut wurde in EDTA-beschichtete Glasröhrchen abgegeben und es wurde Plasma durch Zentrifugation bei 14000 g_av für 10 Min hergestellt. Nach Entfärbung mit 100 μl 30% v/v Wasserstoffperoxid und der Zugabe von 3 ml HiSafeII-Szintillationsmittel wurde die Radioaktivität in 50 μl Aliquoten ausgezählt. Um Chemi- und Photolumineszenz auzuräumen, wurden die Proben für 2 Min in einer Wallac 1410 β-Zählvorrichtung in Abhängigkeit von der Probenquelle über einen 3-, 7- oder 20-Tageszeitraum ausgezählt. Während der Zeiträume zwischen den Zählungen wurden die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. Alle Berechnungen wurden an stabilisierten Proben durchgeführt, aus welchen die vollständige Chemi- und Photolumineszenz entfernt worden war.
Um den Prozentsatz an injiziertem MTX im Plasma zu bestimmen, war es notwendig, das Gesamtplasmavolumen einer jeden Maus zu berechnen (ml), wobei die Standardformel: Mausmasse (g) × Mausblutvolumen (0,07) × Plasmaanteil des Bluts (0,59)verwendet wurde.
Der Prozentsatz an injiziertem MTX im Plasma wurde anschließend berechnet als:
Um eine präzise Quantifizierung der Menge an MTX sicherzustellen, welche in den Blutstrom abgegeben wird, wurde die Injektionsstelle in der Schwanzvene analysiert und das MTX quantifiziert. Der mittlere Prozentanteil der MTX-Injektion, welche an der Injektionsstelle verblieb, betrug 3,78% (SEM: 0,57%). Die Menge an MTX, welche an den Blutstrom abgegeben wurde (MTX, welches zur Verteilung in den Geweben und dem Tumor verfügbar ist) wurde berechnet als:
Die Menge an MTX, welche an den Blutstrom abgegeben wird, wird von jetzt an als „injizierte Dosis" bezeichnet.
Um präzise Vergleiche zwischen der Probenpopulation durchzuführen und um leichte Variationen hinsichtlich der Organ- und Tumormassen zu normalisieren, wurde die Konzentration an MTX in den Körperorganen und dem Tumor und Körperfluid ausgedrückt als% injizierter Dosis/Gramm an Gewebe.
Die mittlere Prozentanteil der MTX-Injektion, welche an der Injektionsstelle verblieb, betrug 3,78% (SEM: 0,57%). Um solche Variationen zu normalisieren, wird der Prozentanteil an dpm, welcher in Tumor und Geweben vorgefunden wurde, berechnet als Prozentanteil an injiziertem dpm minus das dpm, welches als an der Injektionsstelle verbleibend vorgefunden wurde. Diese Menge wird von nun an als verfügbare dpm oder verfügbares Methotrexat bezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Plasmamengen von MTX festgestellt, wenn das Arzneimittel mit HA co-injiziert wurde. Die Bruttopharmakokinetik von MTX blieb unverändert, wobei MTX-Plasma-Höchstmengen innerhalb von 0,5 bis 2 h im Anschluss an die intravenöse Verabreichung erreicht wurden (MIMS, 1997).
Soweit möglich, wurde Urin aus den nicht-benetzbaren Kunststoffgehäusen mit einer Spritze und einer Nadel gesammelt. Der Urin wurde durch Zentrifugation bei 14000 g_av für 10 Min geklärt. Sein radioaktiver Gehalt wurde nach der Zugabe von 3 ml HiSafeII-Szintillationsmittel zu den Proben, welche sich im Bereich von 8 bis 30 μl bewegten, gemessen. Trotz der technischen Schwierigkeiten bei der präzisen Bestimmung des Urinvolumens, welches von jeder Maus erzeugt wurde, berechneten wir den Prozentanteil an injizierter MTX-Dosis im Urin durch die folgende Formel:
Aufgrund von Variationen hinsichtlich der Harnabgangsrate war es nicht möglich, Urin von jeder Maus zu sammeln. Wenn drei oder mehr Urinproben pro Zeitpunkt pro Behandlung zur Verfügung standen, wurde eine nicht-parametrische statistische Analyse dieser Daten zu diesen Zeitpunkten durchgeführt. Eine Stunde nach Verabreichung befand sich 50% (p = 0,043) mehr MTX im Urin von Mäusen, welche MTX/HA empfingen (siehe Tabelle 2).
Sofort nach dem Töten der Maus wurde der Tumor, die Leber, das Herz, die Milz, die Harnblase, die linke und die rechte Niere, der Uterus, die Lungen, der Magen, die Eingeweide, das Gehirn und die Lymphknoten operativ entfernt und hinsichtlich ihrer Gesamtradioaktivität analysiert. Die Gesamtradioaktivität in jedem Gewebe wurde bestimmt durch Lösen von 100–400 mg Gewebe in 3–6 ml OptiSolv (ACC, Melbourne, Australien) für 36 h, 22°C. Nach Vervollständi gung der Lösung wurde die Radioaktivität im Gewebe nach Zugabe von 10 ml Hi-SafeIII-Szintillationsmittel ausgezählt. Um wiederum Chemi- und Photolumineszenz auszuräumen, wurden die Proben für 2 Min in einer Wallac 1410 β-Zählvorrichtung in Abhängigkeit von der Probenquelle über einen 3-, 7- oder 20 d-Zeitraum ausgezählt. Während der Zeiträume zwischen den Zählungen wurden die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. Alle Berechnungen wurden an stabilisierten Proben durchgeführt, aus welchen die vollständige Chemi- und Photolumineszenz entfernt worden war. Die Figuren stellen einen Mittelwert ± SEM (n = 8) dar.
Es war wichtig zu etablieren, dass metabolisch aktive Organe wie beispielsweise die Leber, die Milz und die Nieren kein hohes Maß an Arzneimittel-Targeting erfuhren, welches jeglichen positiven Aspekten von verbessertem Tumor-Targeting entgegenwirken könnte. Tabelle 2 listet die Methotrexat-Aufnahme eines jeden Gewebes zu den verschiedenen untersuchten Zeitpunkten auf.
Unter Verwendung des Rangsummentests nach Mann-Whitney und dem t-Test nach Student lag kein statisch signifikanter Unterschied hinsichtlich MTX-Konzentration/g Gewebe vor, wenn MTX mit HA co-injiziert wurde. Aufgrund der kleinen Zahl an Tieren zu jedem Zeitpunkt wurde der Mann-Whitney-Test statisch hinfällig, wenn ein Datenpunkt überlappte, aber in der Leber, dem Uterus und dem Darm konnte ein bestimmter Trend beobachtet werden.
In der Leber schien eine kurzzeitige Zunahme hinsichtlich der Aufnahme von MTX vorzuliegen, wenn es mit HA kombiniert wurde, wobei dies in 7 gezeigt ist.
Bei 30 Min und 1 h enthielt die Leber eine mittlere Zunahme hinsichtlich der MTX-Konzentration von 65% bzw. 26%. Unabhängig von der Behandlung wurde nach 2 h kein Unterschied hinsichtlich der MTX-Menge in der Leber beobachtet. Wie in 8 gezeigt, trat ein interessanter Trend nach 4 h auf, wenn weniger MTX in der Leber vorgefunden wurde, wenn es mit HA co-injiziert wurde (4 h: 68% weniger MTX und 8 h: 75% weniger MTX), wobei dies in 8 gezeigt ist.
Wie in 9 gezeigt, lag ein signifikanter Trend im Darm vor, wo die Kombination von HA und MTX zu einer erniedrigten Aufnahme des Arzneimittels zu jedem Zeitpunkt führte.
Der Darm wurde vollständig homogenisiert, mit anschließender Lösung von etwa 400 mg Gewebe in 3–6 ml OptiSolv für 24 h bei 22°C, mit anschließender Zugabe von 10 ml Hisafe-3-Szintillationsmittel. Um Chemi- und Photolumineszenz auszuräumen wurden die Proben für 2 Min in einer Wallac 1410 β-Zählvorrichtung in Abhängigkeit von der Probenquelle über einen 3-, 7- oder 20 d-Zeitraum ausgezählt. Während der Zeiträume zwischen den Zählungen wurden die Proben im Dunkeln bei Umgebungstemperatur gelagert. Alle Berechnungen wurden an stabilisierten Proben durchgeführt, aus welchen die vollständige Chemi- und Photolumineszenz entfernt worden war.
Die Figuren stellen einen Mittelwert ± SEM (n = 8) dar. Eine Analyse der Daten mit dem nicht-parametrischen Randomisierungstest für übereinstimmende Paare zeigte, dass die Co-Verabreichung von HA die Ausscheidung des Arzneimittels in den Magen-Darm-Trakt signifikant verringerte (p = 0,031, einseitiger Test).
Die Abnahme der MTX-Konzentration reichte von 43 bis 67%. Der nicht-parametrische Randomisierungstest für übereinstimmende Paare zeigte, dass die Co-Verabreichung von HA die Ausscheidung des Arzneimittels in den Magen-Darm-Trakt signifikant reduzierte (p = 0,031, einseitiger Test).
In den Lungen lag bei 4 h bei einer mittleren Abnahme von 52% (p = 0,014) signifikant weniger MTX vor, wenn es mit HA co-verabreicht wurde. Zu anderen Zeitpunkten wurden aber keine Unterschiede gezeigt, so dass die Signifikanz dieser Beobachtung unsicher bleibt.
In der Milz, dem Uterus, dem Gehirn, dem Herz, den Lymphknoten, dem Magen und den Nieren wurden keine beobachtbaren Trends detektiert.
Es gibt zwei mögliche Mechanismen für HA-Targeting von Methotrexat zu Tumorzellen (10).
Es lag ein signifikanter Targeting-Effekt vor, wenn HA mit MTX kombiniert wurde (7). Die größte relative Zunahme hinsichtlich Tumorretention des Arzneimittels wurde bei 0,5 h (mittlere 24% Zunahme), 1 h (mittlere 30% Zunahme) und 2 h (mittlere 119% Zunahme) beobachtet, wohingegen bei 4 h und 8 h die Zunahme vernachlässigbar war. Aufgrund der kleinen Populationsgröße und der nicht-parametrischen Verteilung der Daten wurde der Rangsummentest nach Mann-Whitney verwendet und enthüllte eine deutliche Zunahme hinsichtlich der Tumoraufnahme an Arzneimittel, wenn HA co-injiziert wurde. Bei 1 h betrug die statistische Signifikanz p = 0,021 und bei 2 h p = 0,050. Die anderen Zeitpunkte zeigten keinen statisch signifikanten Unterschied, aber der Trend hinsichtlich MTX-Konzentration/g Tumor war bei Co-Injektion mit HA konsistent größer.
Die in 7 gezeigten Daten zeigen eindeutig, dass die Co-Verabreichung mit HA die Aufnahme von MTX durch den Tumor innerhalb von 30 Min nach der Injektion in großem Ausmaß verbessert hat. Darüber hinaus hält die Co-Verabreichung auch während dem nachfolgendem Abklingen der Arzneimittelkonzentration innerhalb des Tumors eine deutlich höhere Menge aufrecht. Bei 1 h war der Unterschied signifikant mit p = 0,021 (n₁ = 8, n₂ = 8) und bei 2 h mit p = 0,05 (n₁ = 8, n₂ = 8), wobei dies durch nicht-parametrische Tests berechnet wurde.
HA, welches eingeschlossenes MTX enthält, bindet an die Rezeptoren (CD44 und/oder I-CAM-1) und wird mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose internalisiert, wobei so das Arzneimittel in die Tumorzelle freigesetzt wird.
Das molekulare HA-Maschenwerk behindert eine Diffusion nach außen, so dass, nachdem HA an Rezeptoren bindet (CD44, RHAMM und/oder ICAM-1), das mitgerissene MTX in die Tumorzellen diffundieren kann. Während es an der Oberfläche der Zellen durch die HA-Matrix festgehalten wird, weist das MTX für den aktiven Transportmechanismus, welcher üblicherweise zum MTX-Transport in die zugrunde liegende Zelle verwendet wird, eine erhöhte Verfügbarkeit auf.
Die Nebenwirkungen und die Verteilung eines Arzneimittels an Gewebe, welche sich von den gewünschten Wirkungsstellen unterscheiden, können ebenfalls durch seine Assoziierung mit HA beeinflusst werden. Beispielsweise wird HA üblicherweise aus dem Blutstrom durch Rezeptor-vermittelte zelluläre Aufnahme und den Katabolismus in der Leber (80–90%), den Nieren (10%), der Milz und dem Knochenmark entfernt, wobei es einige kleinere Speziesvariationen hinsichtlich der letzten beiden Stellen gibt. Wie erwartet scheint HA die Abgabe des Arzneimittels an die Leber wenigstens für eine kurze Zeit zu erhöhen. Bei 30 Min und 1 h zeigte die Leber eine mittlere Zunahme hinsichtlich der MTX-Konzentration von 65% bzw. 26%. Bei 2 h wurde hinsichtlich der MTX-Menge in der Leber unabhängig von der Behandlung kein Unterschied beobachtet. Ein interessanter Trend trat nach 4 h auf, wenn weniger MTX in der Leber vorgefunden wurde, wenn es mit HA co-injiziert wurde (4 h: 68% weniger MTX und 8 h: 75% weniger MTX). Nach intravenöser Verabreichung wird MTX im Körperwasser weit verbreitet verteilt und kann in der Leber für Monate zurückgehalten werden (McEvoy, 1988); deshalb könnte die erniedrigte mittlere Konzentration von MTX in der Leber bei 4 und 8 h, wenn es mit HA co-injiziert wird, ein verändertes Gleichgewicht hinsichtlich der Wege des pharmakokinetischen Abbaus zeigen. Unter Berücksichtigung dass HA in den Leber-Endothelialzellen (LEC) schnell metabolisiert wird, folgt, dass MTX, welches mit HA co-internalisiert wird, in die die Leber sinusoidal auskleidenden Zellen freigesetzt wird, wo es entweder in Hepatozyten zur Sekretion in die Galle und anschließend in den Magen-Darm-Trakt diffundieren kann oder wieder der Zirkulation zur weiteren Verteilung in Körperwasser oder zur Urinausscheidung wird oder beidem zugeführt.
Es könnte ein therapeutischer Vorteil im kurzfristigem Leber-Targeting liegen. Im Falle von Leber-Metastasenbildung könnte eine schnelle, hohe Exposition gegenüber MTX günstig sein und, da das beobachtete Targeting nur für eine Stunde vorliegt, würde dies jeglichen Langzeit-Toxizitätsproblemen entgegenwirken. Leber-Targeting könnte mit Arzneimitteln verwendet werden, welche einer Bioaktivierung bedürfen, wie beispielsweise Mitomycin C, Doxorubicin, wobei das Arzneimittel/HA-Gemisch auf die LEC ausgerichtet würde. Wenn das inaktive Arzneimittel in den LEC konzentriert vorliegt, könnte es in die Hepatozyten zur Aktivierung diffundieren, wodurch dies als ein Aktivierungstargetingmechanismus wirkt.
Eine der Hauptstellen für Toxizität von MTX ist der Magen-Darm-Trakt. Die Co-Verabreichung von MTX mit HA erniedrigte die Menge des Arzneimittels, welche an den GI-Trakt abgegeben wird, signifikant. Es könnten einige Mechanismen mit der erniedrigten MTX-Konzentration im Darm assoziiert sein.
Methotrexat ist ein sehr kleines Molekül, von welchem man normalerweise annehmen würde, dass es durch die meisten Kapillarwände hindurch tritt, wohingegen eine Assoziierung mit HA seine Passage mittels dieses Weges in großem Ausmaße verringern würde.
Ein schneller Abbau von HA in den Leber-Endothelialzellen führte zu einer schnellen Freisetzung von MTX in die Leber und zur Wiederzuführung in den Blutstrom, wo es in erhöhtem Ausmaße durch die Niere abgebaut wird, wie gezeigt nach 1 h, und es wurden 50% mehr MTX in den Urin von Mäusen ausgeschieden, welche MTX/HA-Präparationen empfingen.
Der Hauptweg zur endgültigen Entfernung von MTX aus dem Körper ist die Urinausscheidung. Es scheint eine kleine Zunahme hinsichtlich des Gehalts des Arzneimittels mit HA in der Niere zu geben, aber wir glauben aufgrund von anderen Beweisen, dass HA durch die Nieren schnell aufgenommen und katabolisiert wird, so dass seine Verweilzeit kurz ist, und assoziiertes Arzneimittel wird schnell in den Urin freigesetzt.
Schlussfolgerung
Die hierin beschriebenen Ergebnisse stellen die erste Stufe einer vorklinischen Studie zur Untersuchung des Vorschlags dar, dass die Verabreichung von therapeutischen Mitteln zusammen mit Hyaluronan deren selektive Abgabe an das gewünschte Ziel aus pathologischem Gewebe erhöht, wodurch eine höhere und effektivere Konzentration an diesen Punkten erreicht wird. Im vorliegenden Fall wurde Methotrexat, ein zytotoxisches Arzneimittel, welches in gegenwärtig angewandten Behandlungskuren für humanen Brustkrebs und andere humane bösartige Krebsarten und für rheumatoide Arthritis verwendet wird, mittels des intravenösen Verabreichungswegs mit und ohne Hyaluronan untersucht.
Wir haben herausgefunden, dass das Nacktmaus-Modell ein besonders geeignetes Modell für die Untersuchung von humanem Brustkrebs in einem lebenden Wirt ist und um einige grundlegende Dinge bei der Verwendung von HA zur Steuerung von therapeutischen Mitteln an die Stellen mit erkranktem Gewebe zu lösen und um so deren günstige Effekte zu verbessern. Unsere Ergebnisse wurden mit einem Arzneimittel mit geringem Molekulargewicht erhalten, welches keine spezifische Form der Assoziierung mit HA zeigt, wodurch gezeigt wird, dass HA ein derartiges Arzneimittel in erhöhten Mengen an pathologisches Gewebe noch immer abgeben kann, wenn es in den Blutstrom injiziert wird. Diese Studie zeigt, dass unter den Bedingungen, welche im Körper vorliegen, das MTX ausreichend von HA zurückgehalten wird, um sowohl eine signifikante Verbesserung der Abgabe an humanen Brustkrebs zu bewirken als auch eine mögliche Verringerung des unerwünschten Nebeneffekts der Magen-Darm-Toxizität.
Beispiel 3 Herstellung und Injektion von Paclitaxel/Hyaluronan-Arzneimittelkombinationen
Nachdem die Verwendbarkeit des Nacktmaus-Modells für HA/Paclitaxel etabliert worden war, konnte es nun verwendet werden, um die Effektivität anderer Chemotherapeutika zu untersuchen. Aufgrund seiner therapeutischen Bedeutung wurde entschieden, Paclitaxel (auch bekannt als Taxol) zu verwenden.
Paclitaxel wird isoliert aus der kurzblättrigen Eibe Taxus brevifolia (Wani et al 1971) und ist gegenüber fortgeschrittenem Eierstock- und Brustkrebs klinisch wirksam (Rownisky et al 1990; McGuire et al 1989) und ist gegenwärtig Gegenstand von klinischen Untersuchungen zur Behandlung von verschiedenen anderen Krebsarten. Das Hauptproblem, welches mit Paclitaxel verbunden ist, sind jedoch seine extremen lipophilen Eigenschaften und in der Folge seine schlechte wässrige Löslichkeit. Versuche zur Lösung dieses Problems führten zur Synthese von Paclitaxelanaloga und -arzneimittelvorläufern zusammen mit intensiven Anstrengungen, sichere und biokompatible Formulierungen zu entwickeln. Bis heute haben keine Arzneimittelvorläufer ausreichende Stabilität, Löslichkeit oder Aktivität gezeigt, welche eine klinische Entwicklung rechtfertigen würden (Mathew et al 1992; Vyas et al 1993). Semisynthetische Taxane zeigen aber eine größere Löslichkeit und Wirksamkeit als Paclitaxel (Bissery et al 1991) und für eine Form, Taxoter, haben Versuche am Menschen begonnen (Bisset et al 1993).
Die gegenwärtig verwendete klinische Formulierung von Paclitaxel, welche zur intravenösen Abgabe eingesetzt wird, verwendet Ethanol und Cremophor EL in einem 1:1 (v/v)-Verhältnis, wobei das Arzneimittel mit 6 mg/ml vorliegt. Cremophor EL ist eigentlich polyethoxyliertes Kastoröl; ein klares, ölig viskoses, gelbes oberflächenaktives Mittel. Stabilitätsuntersuchungen haben gezeigt, dass die ursprüngliche Formulierung eine Haltbarkeitsdauer von 5 Jahren bei 4°C aufweist. Die Präparation wird vor der Verwendung mit 0,9% Salzlösung oder 5% Dextrose auf Konzentrationen von 0,3–1,2 mg/ml verdünnt und die physikalische und chemische Stabilität des Materials unter diesen Bedingungen beträgt ca. 27 h. Die Verdünnung des Vehikels auf diese Mengen kann jedoch zu einer supergesättigten Lösung führen (Adams et al 1993), welche zur Präzipitierung neigt, wenn sie nicht im Rahmen der etablierten Richtlinien verwendet wird. Deshalb ist während der Verabreichung die Verwendung eines Inline-Filters als Schutzmaßnahme gegen die Infusion von partikelförmigen Teilchen notwendig. Es wird auch empfohlen, dass verdünnte Paclitaxel-Lösungen nach der Herstellung innerhalb von 24 Stunden verwendet werden sollten. Es wurde auch eine Trübung der vorausstehend beschriebenen Lösungen beschrieben und der Extraktion von Weichmachern durch Cremophor aus den Infusionsbeuteln und dem Infusionsschlauchmaterial zugeschrieben (Waugh et al 1991).
Zusätzlich zu den Problemen der physikalischen Instabilität, welche vorausstehend beschrieben worden sind, stellt die Tatsache, dass für Cremophor pharmakologische Aktivität beschrieben wird, das größte Problem dar. Eine Vielzahl von Arzneimitteln wird unter Verwendung von Cremophor EL verabreicht, umfassend Cyclosporin, Tacrolymus und Teniposid. Jedoch ist die Dosierung an Cremophor EL, welche mit Paclitaxel verabreicht wird, höher als die mit einem jeden anderen vertriebenen Arzneimittel. Von Cremophor wurde beobachtet, dass es ernste oder fatale Überempfindlichkeitsepisoden verursacht. Die Vehikeltoxizität kann auch zum großen Teil für fatale oder lebensbedrohliche anaphylaktische Reaktionen verantwortlich sein, welche infolge einer schnellen Infusion von Paclitaxel in Tiere oder Menschen beobachtet wurden (Dye & Watkins 1980; Lorenz et al 1977; Weiss et al 1990).
Eine Stammlösung an Paclitaxel wird hergestellt und individuelle Injektionen werden hergestellt gemäß den individuellen Körpermassen von Mäusen.
Getrocknetes HA (modal MR 8,9 × 10⁵ kDa) wird zu einem Teil der 24,5 mg/ml Paclitaxel-Stammlösung zugegeben und über Nacht unter Vortexen gelöst, um eine Endkonzentration von 21 mg/ml zu ergeben. Um Sterilität sicherzustellen, wird Gentamicin bis zu einer Konzentration von 50 μg/ml zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Im Anschluss an die Zugabe von [³H]Paclitaxel wird das HA/Paclitaxel-Stammgemisch auf Injektionskonzentration mit Natriumchlorid von Injektionsgüteklasse verdünnt. Injektionen werden gemäß den Mauskörpermassen individuell durchgeführt, um 15 mg/kg Paclitaxel und 12,5 mg/kg HA in 50 μl abzugeben. Bei dieser in den Körper injizierten Menge an HA wird für den Zeitraum des Experiments eine Sättigungskinetik beobachtet (Fraser et al. 1983).
Um sicherzustellen, dass das HA während der Herstellung des Paclitaxel/HA-Injektionsgemischs sein Molekulargewicht beibehalten hat, wird die Injektionslösung auf einem Sephacryl S-1000-Größenausschlussgel (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit Säulenspezifikationen von 1,6 cm × 70 cm, Probengröße 2 ml, Flussrate 18 ml/h und 2 ml Fraktionsgröße analysiert. 4 zeigt, dass HA während des Mischungsarbeitsverfahrens sein Molekulargewicht beibehalten hatte.
Die Mäuse werden nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen von 40 Tieren eingeteilt. Gruppe I empfing nur Paclitaxel und Gruppe 2 empfing eine Paclitaxel/HA-Kombinationstherapie. Die Tiere werden einzeln in einer Injektionsbox platziert und die Injektionen werden über die Schwanzvene verabreicht. Mit Tritium versehenes Paclitaxel (mittlere injizierte Zerfallsereignisse pro Minute (dpm) ± Standardfehler (SEM): 19,159,146 ± 1,336,819) wird in jede Injektion abgegeben. Die Mäuse werden einzeln in weichen, nicht-benetzbaren Kunststoffbehältern untergebracht, so dass Urin gesammelt werden kann. 30 Min, 1 h, 2 h, 4 h oder 8 h nach der Injektion werden die Mäuse durch 0,1 ml intraperitoneale Injektion von Nembutal (Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australien) anästhesiert und Blut wird aus dem Herz oder den großen Gefäßen unter Verwendung einer Nadel und einer Spritze gesammelt. Nach der Blutgewinnung werden die Tiere durch Halswirbelverrenken getötet.
Das Blut wird in EDTA-beschichtete Glasröhrchen abgegeben und das Plasma wird mittels Zentrifugation bei 14000 g_av für 10 Min präpariert. Die Radioaktivität wird ausgezählt in 50 μl Aliquoten nach Entfärbung mit 100 μl 30% v/v Wasserstoffperoxid und Zugabe von 3 ml HiSafeII-Szintillationsmittel. Um Chemi- und Photolumineszenz auszuräumen, werden die Proben für 2 Min in einer Wallac 1410 β-Zählvorrichtung in Abhängigkeit von der Probenquelle für einen Zeitraum von 3, 7 oder 20 d ausgezählt. Während der Zeiträume zwischen den Zählungen werden die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. Alle Berechnungen werden an stabilisierten Proben durchgeführt, aus denen die vollständige Chemi- und Photolumineszenz entfernt worden ist.
Um den Prozentanteil an injiziertem Paclitaxel im Plasma zu bestimmen, ist es notwendig, das Gesamtplasmavolumen einer jeden Maus (ml) zu berechnen, wobei die Standardformel: Mausmasse (g) × Mausblutvolumen (0,07) × Plasmaanteil des Bluts (0,59)verwendet wird.
Der Prozentanteil an injiziertem Paclitaxel im Plasma wird dann berechnet als:
Um eine präzise Quantifizierung der Menge an Paclitaxel, welche in den Blutstrom abgegeben wird, sicherzustellen, wird die Injektionsstelle in der Schwanzvene analysiert und das Paclitaxel quantifiziert. Der mittlere Prozentanteil der Paclitaxel-Injektion, welche an der Injektionsstelle verbleibt, wird ebenfalls bestimmt. Die Menge an Paclitaxel, welche an den Blutstrom abgegeben wird (Paclitaxel, welches zur Verteilung an die Gewebe und den Tumor zur Verfügung steht) wird berechnet als:
Die Menge an Paclitaxel, welche an den Blutstrom abgegeben wird, wird von nun an als „injizierte Dosis" bezeichnet.
Um präzise Vergleiche zwischen der Probenpopulation durchzuführen und um leichte Variationen hinsichtlich der Organ- und Tumormassen zu normalisieren, wird die Konzentration an Paclitaxel in den Körperorganen und dem Tumor und Körperfluid ausgedrückt als % injizierte Dosis/Gramm an Gewebe.
Der mittlere Prozentanteil der Paclitaxel-Injektion, welcher an der Injektionsstelle verbleibt, wird berechnet. Um solche Variationen zu normalisieren, wird der Prozentanteil an dpm, welcher im Tumor und in Geweben vorgefunden wird, berechnet als Prozentanteil an injiziertem dpm minus dpm, für welche ein Verbleiben an der Injektionsstelle festgestellt wird. Diese Menge wird bezeichnet als verfügbares dmp oder verfügbares Paclitaxel.
Soweit es möglich ist, wird Urin aus den nicht-benetzbaren Kunststoffbehältnissen mit einer Spritze und einer Nadel gesammelt. Der Urin wird durch Zentrifugation bei 14000 g_av für 10 Min geklärt. Sein radioaktiver Gehalt wird nach Zugabe von 3 ml HiSafeII-Szintillationsmittel zu Proben, welche im Bereich von 8–30 μl liegen, gemessen.
Sofort nach dem Töten der Mäuse werden der Tumor, die Leber, das Herz, die Milz, die Harnblase, die linke und die rechte Niere, der Uterus, die Lungen, der Magen, die Eingeweide, das Gehirn und die Lymphknoten operativ entfernt und hinsichtlich ihrer Gesamtradioaktivität analysiert. Die Gesamtradioaktivität in jedem Gewebe wird bestimmt durch lösen von 100–400 mg Gewebe in 3–6 ml OptiSolv (ACC, Melbourne, Australien) für 36 h, 22°C. Nach Vervollständigung der Auflösung wird die Radioaktivität im Gewebe nach Zugabe von 10 ml HiSafeIII-Szintillationsmittel ausgezählt. Um wiederum Chemi- und Photolumineszenz auszuräumen werden die Proben für 2 Minuten in einer Wallac 1410 β-Zählvorrichtung in Abhängigkeit von der Probenquelle über einen Zeitraum von 3, 7 oder 20 d ausgezählt. Während der Zeiträume zwischen den Zählungen, werden die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. Alle Berechnungen werden an stabilisierten Proben durchgeführt, aus welchen die vollständige Chemi- und Photolumineszenz entfernt worden war.
Beispiel 4 Verwendung von 5-Fluoruracil und HA-Einführung
5-Fluoruracil (5-FU) ist ein Antimetabolit, welcher üblicherweise bei der Behandlung von Brustkrebs und Krebs des Magen-Darm-Trakts verwendet wird (Piper & Fox, 1982). 5-FU wird intrazellulär in seine aktive Nukleotidform umgewandelt, wo es sowohl mit DNA- als auch RNA-Synthese wechselwirkt. Das Arzneimittel wirkt in vivo mittels zweier Mechanismen:

(i) FdUMP bindet eng an Thymidylatsynthase, wodurch die Bildung von Thymidylat unterbunden wird, wobei es sich um einen wesentlichen Vorläufer von Deoxythymidin-Triphosphat (dTTP) handelt, welches eines der vier Deoxyribonukleotide ist, welche zur DNA-Synthese notwendig sind. Der Thymin-reduzierte Zustand der durch diese Hemmung erzeugt wird, ist für sich aktiv teilende Zellen toxisch (Pinedo & Peters, 1988).
(ii) Die zweite Art und Weise, auf welche 5-FU wirkt, ist, dass der Einbau von FUTP in RNA mit der RNA-Funktion wechselwirkt. Die Hemmung von Thymidylatsynthase, welche durch Fdurd verursacht wird und der 5-FU-Einbau in RNA kann zytotoxische Effekte auf Zellen ausüben. Sowohl die Konzentration als auch die Dauer der Exposition mit 5-FU sind entscheidende Determinanten für die Zytotoxizität. Dabei überwiegen bei einer verlängerten Expositionsdauer wahrscheinlich RNA-vermittelte Effekte, wohingegen DNA-vermittelte Effekte bei kurzzeitiger Exposition von Zellen in der S-Phase wichtiger sein könnten.

Mehrere Studien haben die Verwendung von HA als Arzneimittel-Abgabesystem für Anti-Krebsarzneimittel untersucht. Coradini et al (1999) banden Natriumbutyrat kovalent an HA, um zu bestimmen, ob diese HA/Natrium-Butyrat-Kombination die Arzneimittelaufnahme durch Brustkrebszellen in vitro erhöht. Diese Untersuchung zeigte, dass der Wirkungsmechanismus von HA als Arzneimittel-Abgabevehikel das HA-Butyrat-Ester-Derivat umfassen könnte, welches den CD44-Rezeptoren zugetragen wird. Der HA/Arzneimittelkomplex wurde internalisiert, woran sich zytoplasmatische Hydrolyse des HA/Arzneimittelkomplexes anschloss, mit anschließender Freisetzung des Butyrats, welches einen antiproliferativen Effekt ausübte. Es wurde eine in vivo-Studie durchgeführt, welche Mitomycin C kovalent mit HA verknüpfte als Mittel zur Behandlung von murinen Lewis-Lungenxenotransplantaten (Akima et al, 1996). Es wurde herausgefunden, dass der HA-MMC-Komplex in einer niedrigen Dosierung von 0,01 mg/kg zu Anti-Tumoraktivität führte, wohingegen das Mittel allein, Mitomycin C, keine Anti-Tumoraktivität zeigte.
Beispiel 5 Untersuchung der synergistischen Wirkung von 5-FU und HA in humanen Brustkrebszellen

Es wurden die humanen Brustadenokarzinomzelllinien MDA-MB-468, MDA-MB-435 und MDA-MB-231 auf Grundlage von HA-Bindungsaffinität (Culty et al. 1994) und der Expression der HA-Rezeptoren auf CD44 und RHAMM (Wang et al. 1996) ausgewählt. Zusammenfassungen der Zelllinieneigenschaften sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Hyaluronan-Bindung und Rezeptorexpression von humanen Brustkarzinomzelllinien

Zelllinie	Art des Brustkrebs	Grad an HA-Bindung^a	HA-Rezeptorexpression^b
			CD44	RHAMM
MDA-MB-231	Adenokarzinom	++	+++	+++
MDA-MB-468	Adenokarzinom	++++	++++	++
MDA-MB-435	Duktales Karzinom	+	+++	ND

a: Culty et al. 1994
b: Wang et al. 1996

Die Zelllinien MDA-MB-468, MDA-MB-435 und MDA-MB-231 wurden wie in Beispiel 1 beschrieben routinemäßig kultiviert.

Tabelle 4 kann entnommen werden, dass Brustkrebszellen, welche in Medium aufgezogen wurden, welches 0 nM 5-FU + 100 nm HA enthielt, keinen statistisch signifikanten proliferativen oder zytotoxischen Effekt im Vergleich mit unbehandelten Zellen zeigten. Tabelle 4: Effekt von Hyaluronan auf die Proliferation von Brustkrebszellen

Zelllinie	0 nM 5-FU (mittlere Zellzahl ± 1 S. D.)	0 nM 5-FU + 100 nM HA (mittlere Zellzahl ± 1 S. D.)
MDA-MB-231 (n = 4)	34,206 ± 3,206	29,470 ± 4,452
MDA-MB-468 (n = 4)	36,751 ± 2,814	37,607 ± 3,325
MDA-MB-435 (n = 4)	117,760 ± 2,175	121,918 ± 7,851

Statistische Untersuchungen wurden durchgeführt, wobei sowohl der nicht-parametrische Rangsummentest und der parametrische t-Test nach Student verwendet wurden.
Deshalb wurden alle Ergebnisse ausgedrückt als Prozentanteil der 0 nM 5-FU/0 nM HA-Zellzählung. Es wurden deutliche Unterschiede hinsichtlich der Wachstumsmuster zwischen den Zelllinien bemerkt, wobei beispielsweise MDA-MB-231- und MDA-MB-468-Zellen eine mäßige Plattierungsseffizienz zeigten, wobei zahlreiche flottierende Zellen vor der Auftragung des Testmediums vorlagen. Die MDA-MG-435-Zelllinie zeigte eine hohe Plattierungseffizienz und eine sehr schnelle Wachstumsrate.
Wenn HA mit 5-FU kombiniert wurde, wurde ein synergistischer zytotoxischer Effekt bei der MDA-MB-468-Zelllinie beobachtet, aber nicht bei den MDA-MB-231- oder MDA-MB-435-Brustkrebszelllinien. Dies ist in 11 gezeigt. Der IC₅₀ von 5-FU allein betrug > 50 μm, aber wenn es mit HA kombiniert wurde, betrug der IC₅₀ 40 nM, eine bis zu 1250-fache Reduktion hinsichtlich der Arzneimitteldosierung.
Die Ergebnisse aus den in vitro-Experimenten zeigten einen Anstieg des Zelltods, wenn 5-FU in Gegenwart von HA an Brustkrebszellen verabreicht wurde. Die MDA-MB-468-Zellen zeigten die größte Empfänglichkeit für die 5-FU/HA-Therapie, wobei der IC₅₀ von > 50 μM auf 40 nM abnahm, wohingegen sowohl MDA-MB-231 als auch MDA-MB-435 durch die 5-FU/HA-Kombination nicht in großem Maße beeinflusst wurden. Alle Brustkrebszelllinien exprimierten große Mengen des CD44-Rezeptors mit MDA-MB-468 (60–80%), MDA-MB-231 (40–60%) und MDA-MB-435 (40–60%), wie bestimmt von Culty et al (1994). Es ist gezeigt worden, dass alle drei Zelllinien, welche in diesen Experimenten verwendet wurden, HA abbauen können, wodurch impliziert wird, dass es die Funktion von CD44 in Tumorzellen sein kann, den Abbau von HA zu vermitteln (Culty et al, 1994).
Ein anderer zu berücksichtigender Faktor ist die vorherige Exposition der Zellen gegenüber chemotherapeutischen Arzneimitteln. Bevor eine Krebszelllinie aus einem Patienten isoliert wird, hat sich der unter Krebs Leidende oftmals einer Chemotherapie oder einer Bestrahlung unterzogen, was dazu führen kann, dass der Tumor behandlungsresistente Zellen enthält. In den Fallen von MDA-MB-435 und MDA-MB-231 waren die Patienten, von welchen diese Zelllinien stammen, beide zuvor gegenüber 5-FU exponiert gewesen (Cailleau et al, 1974). Da Krebszellen mehrere Adaptionsmechanismen enthalten, um Arzneimittelzytotoxizität zu überwinden, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Tumormasse, welche nach der Behandlung übrig blieb, gegenüber 5-FU resistent war, wodurch anschließend die Empfänglichkeit der Zellen gegenüber dem Arzneimittel in vitro verändert wurde.
Im Hinblick darauf, beliebige in vivo-Daten, welche für Mäuse erhalten wurden, auf die Behandlung von humanen Gegenstücken zu extrapolieren, wurden das experimentelle Modell und die experimentelle Konzeption sorgfältig entwickelt. Um eindeutig das in vivo-Targeting und die therapeutische Wirksamkeit der 5-FU/HA-Adjuvanstherapie auf humane Brustkrebsxenotransplantate zu zeigen, wurden die folgenden Faktoren untersucht:
Es wurden humane Brustkrebstumore in einem gut validierten Nacktmausstamm vom Walter und Eliza Hall Institute etabliert, wobei es sich um ein weithin akzeptiertes Modell für derartige Studien handelt, welches eine Immunreaktion gegenüber allogenen Zellen vermeidet.
Vergleichsdaten für die Pharmakokinetik von 5-FU sind bereits für die Nacktmaus und Menschen publiziert worden (Inaba et al, 1988) und wurden zur Konzeption dieser Studie herangezogen, um humane therapeutische Dosen so genau wie möglich zu simulieren.
Ein Hauptziel war die Validierung, dass das histologische und zytologische Verhalten der Tumore, welche in diesen Mäusen etabliert worden waren, vergleichbar war zu dem derartiger Tumore in ihren natürlichen menschlichen Wirten. Durch Erreichen dieses Ziels haben wir auch gezeigt, dass die Tumorzellen in den Mäusen humanen Ursprungs sind und dass sie hochrelevante HA-Rezeptoren, wie beispielsweise RHAMM und CD44 exprimieren.
Beispiel 6 Herstellung von HA- und 5-FU-Lösungen
Es wurde eine HA-Stammlösung (10 μM, 7 mg/ml) hergestellt durch Lösen von getrocknetem HA (modal M_r 7 × 10⁵ kDa) in 0,9% w/v Pyrogen-freiem NaCl mit Injektionsgüteklasse. Um eine homogene Lösung sicherzustellen, wurde das HA über Nacht bei 4°C gelöst, wobei sich gründliches Vortexen anschloss. Um sicherzustellen, dass das HA während der Präparation der Stammlösung sein Molekulargewicht beibehalten hatte, wurde die Lösung auf einem Sephacryl S-1000 Größenausschlussgel mit den Säulenspezifikationen 1,6 cm × 70 cm, Probengröße 2 ml, Flussrate 18 ml/h und 2 ml Fraktionsgröße analysiert. Das HA wurde mit einer Endkonzentration von 100 nM verwendet, wobei alle Verdünnungen in geeignetem Wachstumsmedium durchgeführt wurden.
Die 5-FU-Stammlösung wurde hergestellt durch Lösen von 5-FU in 0,1 M Natriumhydroxid und auf eine Konzentration von 20 mg/ml mit 0,9% w/v Pyrogen-freiem NaCl von Injektionsgüteklasse eingestellt. Die Stammlösung wurde durch einen 0,22 μm Filter filtriert, um die Sterilität vor der Zugabe von [³H]-FU und vor Verdünnung auf Injektionskonzentration mit Natriumchlorid von Injektionsgüteklasse sicherzustellen. Individuelle Injektionen wurden entsprechend den individuellen Mausmassen hergestellt, wobei 30 mg/kg 5-FU in 50 μl abgegeben werden sollten (entsprechend einer humanen therapeutischen Dosis von 10,5 mg/kg für ein mittleres Körpergewicht von 60 kg; Inaba et al, 1988). Es wurde eine Pyrogen-freie HA-Stammlösung (10 mg/ml; modal M_r 7 × 10⁵ Da) zu einem Teil der 20 mg/ml 5-FU-Stammlösung zugegeben und über Nacht unter Vortexen inkubiert, bis zu einer HA-Endkonzentration äquivalent zu 12,5 mg/kg Mausmasse. Die Injektionen wurden individuell entsprechend den Mausmassen durchgeführt um 30 mg/kg 5-FU und 12,5 mg/kg HA in 50 μl abzugeben. Bei dieser in den Körper injizierten HA-Menge wird für die Dauer des Experiments eine Sättigungskinetik beobachtet (Fraser et al, 1983). Um sicherzustellen, dass das HA während der Herstellung des Injektionsgemischs sein Molekulargewicht beibehalten hatte, wurde die Injektionslösung analysiert auf einem Sephacryl S-1000 Größenausschlussgel mit Säulenspezifikationen von 1,6 cm × 70 cm, Probengröße 2 ml, Flussrate 18 ml/h und 2 ml Fraktionsgröße. Hyaluronan wurde in Säulenfraktionen durch den Uronsäureassay detektiert.
Der Uronsäureassay wurde verwendet, um das Vorliegen von Hyaluronan quantitativ in den Fraktionen zu detektieren, welche aus dem Gelfiltrationschromatographieverfahren erhalten wurden. Ein 25 μl Aliquot einer jeden Fraktion wurde anschließend auf eine 96 Well-Platte überführt. Anschließend wurden 250 μl eines Carbazolreagens (3 M Carbazol/0,025 M Borat in H₂SO₄) zu diesen Fraktionen zugegeben. Die 96 Well-Platte wurde für 45–60 Min bei 80°C inkubiert. Es wurde eine Dynatech MR700-Plattenlesevorrichtung mit einem 550 nM Filter verwendet, um die 96 Well-Platte auszulesen. Das Absorptionsvermögen wurde als signifikant angesehen, wenn es > 3 Standardabweichungen über dem Hintergrundabsorptionsvermögen lag. Der Hintergrund wurde berechnet durch Heranziehen einer gleichen Zahl an Probenpunkten vor und nach V_o und V_t, wobei die durchschnittliche herangezogene Zahl 16 war (Fraser et al. 1988).
Die Formulierung von HA und 5-FU (10 mg/ml HA und 20 mg/ml 5-FU in 0,5% NaCl, pH 8,9) zeigte keinen Abbaueffekt hinsichtlich des Molekulargewichts von HA. Die chromatographische Analyse in einem Größenausschlussgel zeigte den Erhalt des modalen Molekulargewichts von 700000 Da.
Beispiel 7 Assay zur Arzneimittelzytotoxizit: Experimentelle Konzeption
Beim Konzipieren von Arzneimitteltitrationsexperimenten in vitro ist es wünschenswert, Arzneimittelkonzentrationen zu verwenden, welche ähnlich zu den Konzentrationen sind, die im Plasma nach intravenöser Verabreichung erreicht werden. Wenn 5-FU therapeutisch auf intravenösem Weg (iv) mit 10,5 mg/kg (400 mg/m²) verabreicht wird, ist der Plasmamengenhöchstwert innerhalb von 30 Min 8 μ/ml [61 μM] (Kubo, 1990). Auf Grundlage dieser Plasmakonzentrationen in vivo wurden die folgenden Arzneimittelkonzentrationen ausgewählt: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100 μM 5-FU ± 100 nM HA. Die Zelllinien MDA-MB-468, MDA-MB-231 und MDA-MB-435 wurden wie vorausstehend in den Beispielen 4 bis 5 spezifiziert aufgezogen. Wenn die Kulturen Konfluenz erreichten, wurden die Zellen aus den Flaschen in 0,25% Trypsin, 0,05% EDTA entfernt. Die Einzelzellsuspension wurde mit einer Coulter-Zählvorrichtung (ZM1-Modell) ausgezählt und die Zellen wurden auf 100000 Zellen/ml in zellspezifischem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden in 24 Well-Platten (2 cm² Oberfläche) ausplattiert durch Zugabe von 0,5 ml Zellsuspension pro Well, wodurch sich 50000 Zellen/Well ergaben. Man ließ die Kulturen für 24 Stunden anhaften, bevor das Medium entfernt wurde, Monoschichten wurden mit HBSS gewaschen und das Testmedium (5-FU + HA) wurde aufgetragen. Nach 4 Tagen Wachstum im Testmedium wurden die Kulturen mit HBSS gewaschen, die Zellen wurden aus dem Well durch Trypsinisierung mit 0,25% Trypsin/0,05% EDTA entfernt und die Zellen wurden mit einer Coulter-Zählvorrichtung ausgezählt.
Beispiel Bewertung von HA als ein Arzneimittelabgabe- und Tumor-Targeting-Vehikel
Auf Grundlage der Ergebnisse aus den in vitro-Experimenten zur Arzneimittelsensitivität, wie sie in den Beispielen 5 bis 7 beschrieben werden, und der Expression der HA-Rezeptoren CD44 und RHAMM wurde die humane Brustkarzinomzelllinie MDA-MB-468 als Krebszellinokulationsmittel zur Erzeugung von beliebigen Nacktmaus-Humantumorxenotransplantaten ausgewählt. Die Zellen wurden routinemäßig aufgezogen und wie vorausgehend in Beispiel 5 beschrieben subkultiviert. Zur Injektion in Mäuse wurden die Zellen bis zu 100% Konfluenz aufgezogen, trypsinisiert in 0,025% Trypsin/0,01% EDTA-Lösung, zweimal durch Zentrifugation in einer Beckman TJ-6-Arbeitsbank-Zentrifuge bei 400 g_av für 10 Min gewaschen, unter Verwendung einer Modell-ZM-Coulter-Zählvorrichtung ausgezählt und in serumfreiem Leibovitz L-15-Medium zu 1 × 10⁸ Zellen/ml resuspendiert.
Die weiblichen athymischen CBA/WEHI-Nacktmäuse, 6 bis 8 Wochen alt, wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten, wobei sterilisiertes Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung stand. Jede Maus empfing eine Injektion, welche 5 × 10⁶ Zellen in 50 μl enthielt. Die Zellen wurden injiziert mit einer 26 Gauge-Nadel in das Brustfettpolster direkt unter der ersten Brustwarze (Lamszus et al, 1997). Es wurden wöchentlich Tumormessungen durch Messen von drei senkrechten Durchmessern (d₁d₂d₃) durchgeführt. Das Tumorvolumen wurde abgeschätzt unter Verwendung der Formel: (1/6)π(d1d2d3)

Die Behandlung mit 5-FU ± HA wurde etwa 4–8 Wochen nach der Krebszellinokulation begonnen. Die mittlere Tumorgröße für die Mäuse, welche in jeder Studie verwendet wurden, ist in Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5: Zusammenfassung der humanen Brustkrebstumore bei Beginn einer jeden Studie

Studie	Tumorvolumen (Mittelwert ± SEM)	Tumor als % der Nettokörpermasse (Mittelwert ± SEM)
5-FU-Targeting	0,41 ± 0,01 mm³	0,22 ± 0,10 mm³
Wirksamkeit: 6-Wochen	0,37 ± 0,20 mm³	0,19 ± 0,10 mm³
Wirksamkeit: 6-Monate	0,61 ± 0,36 mm³	0,28 ± 0,17 mm³

Um die Tumorgenizität der Brustkrebszelllinie MDA-MB-468 und ihre Fähigkeit, Tumore nach Injektion in ein geeignetes Wirtstier zu erzeugen, zu etablieren, war es notwendig, pathologische Tests durchzuführen. Für einen Tumor ist Neovaskularisierung essentiell, um physiologisch lebensfähig zu sein, wobei das Kapillarnetzwerk dem Tumor Nährstoffe zuführt. Das Vorliegen von Vaskularisierung, duktaler Invasion, Nekrose, Apoptose, einem hohen mitotischen Index und Kernabnormalitäten sind für ein Brustkarzinom alle charakteristisch. Eine Untersuchung der Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Brusttumorschnitte zeigte alle dieser Merkmale, wodurch bestätigt wurde, dass der tierische Wirt ein humanes Brustkarzinom vom Grad II erfolgreich erhielt.
Etwa 8 Wochen nach Tumorinduktion wurde zwei Tumor-tragenden Mäusen eine letale Dosis Nembutal verabreicht. Innerhalb von 3 Min nach dem Töten der Mäuse wurden die Tumore chirurgisch entfernt und sofort in 10% gepuffertem Formalin für 12 h fixiert. Der fixierte Tumor wurde über Nacht in einer Reihe von 70–100% Ethanol dehydriert, woran sich Einbetten in Paraffin anschloss, woraus 2–4 μm Abschnitte geschnitten wurden. Die Schnitte wurden auf Objektträgern platziert, entwachst und gewässert. Die Objektträger wurden 3 × 5 Min in PBS gewaschen. Heterophile Proteine wurden durch Inkubation mit 10% fötalem Kälberserum für 10 Min blockiert, woran sich eine Spülung mit PBS anschloss. Die Detektionsantikörper wurden für 60 Min bei Raumtemperatur angewendet. Die Detektionsantiseren oder Antikörper waren gegen RHAMM, CD44H und CAE gerichtet. Die Objektträger wurden 3 × 5 Min in PBS gewaschen und endogene Peroxidaseaktivität wurde blockiert durch Eintauchen in 0,3% H₂O₂ in Methanol für 20 Min. Im Anschluss an einen weiteren PBS-Waschschritt wird das Peroxidase-konjugierte Anti-Kaninchen-Sekundärantiserum aus Schwein für 60 Min bei Raumtemperatur angewendet, wobei sich 3 × 5 Min Waschschritte in PBS anschlossen. Sigma Fast 3,3'-Diaminobenzidin-Tabletten (DAB) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert und die DAB-Lösung wurde für 5–10 Min bei Raumtemperatur verwendet. Die Objektträger wurden in Leitungswasser für 10 Min gewaschen, mit Hämatoxylin kontrastgefärbt, dehydriert und montiert.

Der humane Ursprung des Tumors wurde bestätigt durch Färben des Tumors und von umgebendem Gewebe mit einem human-spezifischen Krebsmarker. Das Vorliegen von CEA zeigte deutlich, dass der Tumor human war, obwohl er durch das kardiovaskuläre System des murinen Wirts erhalten wurde. Da die Hypothese aufgestellt worden war, dass Tumor-Targeting aufgrund von Rezeptor-vermittelter Internalisierung oder Bindung stattfinden könnte, war es notwendig, die Expression von HA-Rezeptoren, CD44 und RHAMM zu etablieren. Tabelle 6 listet den Grad der Rezeptorexpression auf den humanen Brustkrebsxenotransplantaten auf. Tabelle 6: Verteilung von HA-Rezeptoren auf humanen Brustkrebstumoren, welche in Nacktmäusen aufgezogen wurden

HA-Rezeptor	Funktion	Verteilung auf dem Tumor	%-Epitop-Expression auf dem Tumor
CD44H	Isoformen, welche HA binden und internalisieren (Culty et al, 1992)	Exprimiert auf allen Zellen mit Ausnahme einiger Bindegewebszellen	++++
CD44v6	Funktionale Rolle bei Krebs unbekannt, wobei aber die höhere Expression zu einer erniedrigten Überlebenswahrscheinlichkeit führt (Friedrichs et al, 1995)	Einige infiltrierende Tumorzellen	+
CD44v3	Überexpression wird oftmals in Brustkarzinom gefunden (Friedrichs et al, 1995)		–
RHAMM	Notwendig zur Transformation und Tumorzellinvasion (Hall et al, 1995)	Gruppen infiltrierender Tumorzellen, mit hoher Expression auf Zellen, welche nekrotische Bereiche umgeben	+++
CEA	Ein fötales Antigen, welches auf bösartigen Zellen exprimiert wird (Haskell, 1990)	Exprimiert auf allen Tumorzellen	++++

Klassifizierungsindex für den Prozentanteil an Epitopexpression auf einem Tumor:

0% –

1–25% +

26–50% ++

51–75% +++

76–100% ++++
Beispiel 9 Verwendung von 5-FU und HA im Nacktmaus-Modell Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 2 Gruppen von 25 Tieren aufgeteilt. Gruppe 1 empfing nur [³H]5-FU und Gruppe 2 empfing die [³H]5-FU/HA-Kombination. Die Behandlungen wurden über die Schwanzvene quantitativ verabreicht, wobei die Injektionsspritze vor und nach der Injektion gewogen wurde. Mit Tritium markiertes 5-FU (mittlere injizierte dpm ± SEM: 31,313,002 ± 131,348), welches enthalten war in 30 mg/kg 5-FU ± 12,5 mg/kg HA, wurde in jede Injektion abgegeben.
Um eine präzise Quantifizierung der Menge an [³H]5-FU sicherzustellen, welche in den Blutstrom abgegeben wurde, wurde die Injektionsstelle an der Schwanzvene analysiert und ihr [³H]5-FU-Gehalt gemessen. Die Menge an 5-FU, welche an den Blutstrom abgegeben wurde (5-FU, welches zur Verteilung an die Gewebe und den Tumor zur Verfügung steht), wurde berechnet als:
Die Menge an 5-FU, welche an den Blutstrom abgegeben wurde, wurde als die „injizierte Dosis" bezeichnet.
Um genaue Vergleiche zwischen der Probenpopulation durchzuführen und leichte Variationen hinsichtlich Organ- und Tumormassen zu normalisieren, wurde die Konzentration an 5-FU in den Körperorganen und dem Tumor und Körperfluid ausgedrückt als % injizierte Dosis/Gramm an Gewebe.
Die Mäuse wurden einzeln untergebracht in weichen, nicht-benetzbaren Kunststoffbehältern, so dass Urin gesammelt werden konnte. 10 Min, 20 Min, 30 Min, 1 h oder 2 h nach der Injektion wurden die Mäuse durch 0,1 ml intraperitoneale Injektion von Nembutal anästhesiert.
Nach der Anästhesierung der Tiere wurde Blut aus dem Herz oder den großen Gefäßen unter Verwendung einer Nadel und einer Spritze gewonnen. Das Blut wurde in EDTA-Glasröhrchen gesammelt und es wurde Plasma durch Zentrifugation bei 14000 g_av für 10 Min präpariert. Die Radioaktivität wurde in 50 μl nach Entfärbung mit 100 μl Wasserstoffperoxid, 30% v/v und der Zugabe von 3 ml HiSafeII-Szintillationsmittel ausgezählt. Um Chemi- und Photolumineszenz auszuräumen, wurden die Proben in einer Wallac 1410 β-Zählvorrichtung in Abhängigkeit von der Probenquelle für einen Zeitraum von 3, 7 oder 20 d ausgezählt. Während der Zeiträume zwischen den Zählungen wurden die Proben bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert. Alle Berechnungen wurden durchgeführt an stabilisierten Proben, in welchen die vollständige Chemi- und Photolumineszenz verschwunden waren. Um den Prozentanteil an injiziertem 5-FU im Plasma zu bestimmen, war es notwendig, das Gesamtplasmavolumen einer jeden Maus (ml) zu berechnen. Die Standardformel war:
Der Prozentanteil an injiziertem 5-FU im Plasma wurde berechnet durch:
Soweit möglich wurde Urin aus den nicht-benetzbaren Kunststoffbehältern mit einer Spritze und einer Nadel gesammelt. Der Urin wurde geklärt durch Zentrifugation bei 14000 gav für 10 Min. Sein radioaktiver Gehalt wurde gemessen nach Zugabe von 3 ml HiSafeII-Szintillationsmittel zu Proben, welche im Bereich von 8–30 μl lagen. Trotz der technischen Schwierigkeiten bei der genauen Bestimmung des Volumens an Urin, welcher von jeder Maus erzeugt wurde, wurden die % der injizierten 5-FU-Dosierung im Urin berechnet durch die folgende Formel:
Sobald das Blut entnommen worden war, wurden die Mäuse durch Halswirbelverrenkung getötet. Sofort nach dem Töten der Maus wurden der Tumor, die Leber, das Herz, die Milz, die Harnblase, die linke und rechte Niere, der Uterus, die Lungen, der Magen, die Eingeweide, das Gehirn und die Lymphknoten operativ entfernt und hinsichtlich Gesamtradioaktivität analysiert. Die Gesamtradioaktivität pro Gewebe wurde bestimmt durch Lösen von 100–400 mg Gewebe in 3–6 ml für 36 h, 22°C. Nach Vervollständigung der Lösung wurde das Gewebe nach Zugabe von 10 ml HiSafeIII-Szintillationsmittel ausgezählt. Die Proben wurden wie zuvor beschrieben ausgezählt, um Chemilumineszenz zu vermeiden.
Wie in 12 gezeigt, lag ein signifikanter Targeting-Effekt vor, wenn HA mit 5-FU kombiniert wurde. Die größte relative Steigerung hinsichtlich der Tumorretention für ein Arzneimittel wurde bei 10 Minuten beobachtet, wobei HA die Arzneimittelaufnahme hier um den Faktor 2,42 verbesserte (p = 0,001, t-Test nach Student). 20 Min und 30 Min nach Verabreichung des HA/5-FU wurden ebenfalls statisch signifikante Zunahmen hinsichtlich der Tumoraufnahme von 5-FU beobachtet, mit einer 1,5- bzw. 2-fach erhöhten Arzneimittelaufnahme (p < 0,001, t-Test nach Student). Die anderen Zeitpunkte zeigten keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen 5-FU verabreicht als bloßes Mittel im Vergleich zur Co-Injektion mit HA.
Es war wichtig, zu etablieren, dass Stoffwechselorgane wie beispielsweise die Leber, die Milz und die Nieren kein großes Ausmaß an Arzneimittel-Targeting erfuhren, was jeglichen positiven Aspekten eines verbesserten Tumor-Targetings entgegenwirken könnte. Tabelle 7 listet die [³H]5-FU-Aufnahme eines jeden Gewebes zu den verschiedenen untersuchten Zeitpunkten auf.
13 zeigt, dass die primären Stoffwechselorgane von HA die Leber, die Lymphknoten und die Milz sind, während 5-FU in beträchtlichem Ausmaß in der Leber metabolisiert wird.
Diese Organe zeigten keine signifikante Zunahme hinsichtlich der 5-FU-Aufnahme, wenn es mit HA co-injiziert wurde. Jedoch zeigten die Nieren 10 Minuten nach Verabreichung (1,8-fache Zunahme, p = 0,004) mit HA einen signifikanten Anstieg von 5-FU-Targeting. Nach diesem Zeitpunkt hielt, auch wenn statistisch nicht signifikant, dieser Trend einer verbesserten Arzneimittelaufnahme bis zum Ende des Probennahmezeitraums an.
Die Harnblase, die Eingeweide und das Knochenmark, zeigten keine erhöhte Aufnahme von 5-FU. In Geweben, wie beispielsweise dem Uterus, kam es zu einer kurzzeitigen Erhöhung der Arzneimittelaufnahme nach 10 Minuten (1,8-facher Anstieg, p = 0,032), aber es traten zu anderen Zeitpunkten keine Unterschiede auf, so dass die Signifikanz dieser Beobachtung unsicher bleiben muss.
Der Magen, das Gehirn und die Lungen zeigten an einem oder zwei Probennahmepunkten eine erhöhte 5-FU-Aufnahme. Jedoch war es aufgrund der kleinen Zahl an Tieren zu jedem Zeitpunkt (n = 5) nicht möglich, eine statistische Signifikanz zu substanziieren, auch wenn wie in 14A-C gezeigt ein deutlicher Trend beobachtet werden konnte.
Bei den späteren Probennahmepunkten bei 1 h und 2 h wurde eine signifikante 5-FU-Abnahme im Herz beobachtet, wobei die Co-Verabreichung mit HA zu einer Abnahme von 59% (p = 0,003) bzw. 53% (p = 0,021) führte.
Aufgrund von Variationen hinsichtlich der Harnablassrate war es nicht möglich, Urin von jeder Maus zu sammeln; es wurde deshalb nicht ausreichend Urin gewonnen, um eine statistische Analyse zu ermöglichen.
Wenn 5-FU mit HA co-injiziert wurde, kam es zu einer frühen Abnahme hinsichtlich der Durchflussmengen von 5-FU (Tabelle 7). Hyaluronan reduzierte 5-FU im Plasma um 55% (p = 0,001). Die Pharmakokinetikplasmahalbwertszeit wurde von 28 Min auf 56 Min in Mäusen verändert, welche 5-FU/HA empfingen, wobei dies in 15 gezeigt ist.
Beispiel 10 Verabreichung von Behandlungskuren an Mäuse

Eine der am häufigsten verwendeten Behandlungskuren für humanen Brustkrebs ist Cyclophosphamid, Methotrexat und 5-Fluorouracil, welche an Tag 1 und Tag 8 eines 28-tägigen Zyklus verabreicht wird. Bei humanem Brustkrebs umfasst die anfängliche Behandlungskur 6 Zyklen, wobei zu diesem Zeitpunkt der Zustand der Patienten wieder bewertet wird, weshalb wir versuchten, die humane Behandlungskur so genau wie möglich zu simulieren durch Exponieren der Mäuse für 6 Zyklen (6 Monate) einer Behandlung in einer Langzeitwirksamkeitsstudie und 6 Zyklen (6 Wochen) einer Kurzzeitwirksamkeitsstudie. Unter Berücksichtigung, dass der Lebenszyklus einer Maus etwa 2 Jahre beträgt, begannen wir, die Kurzzeit- und Langzeitbehandlungsprotokolle wie in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8: Behandlungsverabreichungsprotokolle

Behandlungsgruppe	Dosierung	6-Wochen-Studie: Behandlungskur Bolusinjektion an den Tagen	6-Monats-Studie: Behandlungskur
1. Salzlösung	0,1 ml einer 0,9% Salzlösung (Injektionsgüteklasse)	1 & 2 eines 7-tägigen Zyklus	1 & 8 eines 28-tägigen Zyklus
2. 5-FU/HA	0,1 ml enthaltend: 30 mg/kg 5-FU + 12,5 mg/kg HA	1 & 2 eines 7-tägigen Zyklus	1 & 8 eines 28-tägigen Zyklus
3. HA	0,1 ml enthaltend: 12,5 mg/kg HA	1 & 2 eines 7-tägigen Zyklus	1 & 8 eines 28-tägigen Zyklus
4. 5-FU	0,1 ml enthaltend: 30 mg/kg 5-FU	1 & 2 eines 7-tägigen Zyklus	1 & 8 eines 28-tägigen Zyklus
5. HA gefolgt von 5-FU	0,1 ml enthaltend: 12,5 mg/kg HA oder 30 mg/kg 5-FU	1: HA 2: 5-FU 3: HA 4: 5-FU eines 7-tägigen Zyklus	1: HA 2: 5-FU 8: HA 9: 5-FU eines 28-tägigen Zyklus
6. HA	0,1 ml enthaltend: 12,5 mg/kg HA	1: HA 3: HA eines 7-tägigen Zyklus
7. 5-FU	0,1 ml enthaltend: 30 mg/kg 5-FU	2: HA 4: HA eines 7-tägigen Zyklus

Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 7 Gruppen mit 8 Tieren pro Gruppe für die Kurzzeitstudie und 5 Gruppen mit 8 Tieren für die Langzeitstudie aufgeteilt (siehe Tabelle 8 hinsichtlich der Dosierung und dem Behandlungsverabreichungsplan).
Die Behandlung wurde nicht über die 6-monatige Kur hinaus ausgedehnt, da gezeigt worden war, dass eine Chemotherapie, welche mehr als 6 Monate andauert, im Allgemeinen nicht mit einem größeren Vorteil verbunden ist (Harris et al, 1992).
Die Tiere wurden gewogen und es wurden die Tumorvolumen am Tag der Behandlungsapplikation für die Langzeitstudie wie in Beispiel 8 beschrieben bestimmt. In der 6-Wochen-Studie wurden die Tiere gewogen und es wurden die Tumorvolumen täglich bestimmt. Die Tiere wurden einzeln in einer Injektionsbox platziert und die Injektionen wurden mittels der Schwanzvene verabreicht. Es ist experimentell nachgewiesen worden, dass Stress ein wichtiger Faktor bei der Reaktion eines Patienten auf eine Chemotherapie sein kann (Shackney et al, 1978), weshalb wir sicherstellten, dass eine gleiche Zahl an Mäusen jedem Käfig zugewiesen wurde, wobei die Tierzahl pro Käfig in Abhängigkeit vom Stadium des Experiments zwischen 5 und 8 variierte.
Der Endpunkt des Experiments wurde erreicht, wenn die Tiere aufgrund des Ausmaßes des Krankheitsfortschritts eingeschläfert werden mussten oder wenn die 6-monatige (Langzeit)- oder 6-wöchige (Kurzzeit)-Behandlungskur abgeschlossen waren. Aufgrund der Ethikrichtlinien für Tiere wurden die Tiere alle 14 Tage durch einen unabhängigen Beamten für Tierethik überwacht, der das Ausmaß der Erkrankungsprogression bewertete. Wie in 16 gezeigt, wurden die im Folgenden beschriebenen Kriterien verwendet, um zu bestimmen, ob ein Tier das Stadium des Endpunkts des Experiments aufgrund von notwendigem Tod erreicht hatte:

1. Das Tier fraß nicht oder trank nicht und hatte einen dramatischen Gewichtsverlust erlitten;
2. die Tumorgröße war größer als 10% des Körpergewichts (Panel A);
3. die Tumormasse war so groß, dass das Tier bewegungsunfähig war (Panel B).

Am Endpunkt des Experiments wurden die Tiere durch eine 0,1 ml intraperitoneale Injektion Nembutal (60 mg/ml) anästhesiert, wobei Blut im Anschluss an das Töten der Tiere unter Verwendung von Halswirbelverrenkung gesammelt wurde.
Am Ende der 6-wöchigen Studie wurde die Tumormasse bestimmt und sowohl die 5-FU-Therapie als auch die 5-FU/HA-Therapie wies signifikant kleinere Tumore als die Salzlösungsgruppe auf (p = 0,005) wie 17 entnommen werden kann. Es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich des Tumorvolumens zwischen den 5-FU- und HA/5-FU-Behandlungsgruppen, wodurch gezeigt wird, dass beide Therapien die gleiche Wirksamkeit gegenüber dem Primärtumor zeigten. Es wurde kein statistischer Unterschied zwischen dem Primärtumorvolumen von Salzlösung und HA festgestellt.
Sofort nach dem Töten der Maus wurden der Tumor, die Leber, das Herz, die Milz, die Harnblase, die linke und die rechte Niere, der Uterus, die Lungen, der Magen, die Eingeweide, das Gehirn und die Lymphknoten operativ entfernt und in 4% Formalin platziert, welches gepuffert war mit 0,06 M Phosphat pH 7,5 und Cetylpyridiniumchlorid, 1,0% w/v. Das Gewebe wurde für 16–20 h vor der histologischen Verarbeitung fixiert. Fixiertes Gewebe wurde schrittweise zu 100% Ethanol dehydriert und in Paraffinblöcken eingebettet, von welchen 2–4 μm Schnitte auf Mikroskoptglasobjekträgern platziert wurden. Färben der Gewebeschnitte mit einer Hämatoxylin-Kernfärbung und einer Eosin-zytoplasmatischen Färbung hob alle pathologischen Merkmale hervor, welche eine Behandlungstoxizität anzeigen könnten.
Es wurden neun bis 11 Lymphknoten pro Tier gesammelt, um sicherzustellen, dass alle Knoten, welche den Tumorbereich entwässerten, gesammelt wurden. Es werden gegenwärtig zwei Verfahren zur Detektion von Lymphknotenmetastasenbildung verwendet:

i. routinemäßige Hämatoxylin- und Eosinfärbung einer makroskopischen Organstruktur
ii. Immunohistochemie unter Verwendung eines Krebsmarkers, wie beispielsweise carcinoembryonalem Antigen

In dieser Studie wurden beide Verfahren zur Metastasendetektion verwendet. Nicht alle kommerziell erhältlichen CEA-Antikörper reagieren mit humanen Brustkrebszellen, so dass wir die Reaktivität von 5 unterschiedlichen Antikörpern untersuchten (DAKO, Amersham und KPL).
Die Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Lymphknoten wurden von Dr. P. Allen (zertifizierter Pathologe) untersucht, wobei jeder Knoten hinsichtlich des Vorliegens von Tumorzellen mikroskopisch untersucht wurde. Die CEA-immunogefärbten Lymphknoten wurden mikroskopisch untersucht, wobei alle positiv gefärbten Knoten ausgezählt wurden und hinsichtlich Lymphknotenmetastasenbildung als positiv eingestuft wurden.
Das Tumorvolumen wurde täglich oder wöchentlich durch Messungen mit Messgreifern überwacht und das Tumorvolumen wurde wie vorausgehend in Beispiel 8 beschrieben berechnet.
Einer der häufigsten toxischen Effekte von 5-FU betrifft den Magen-Darm-Trakt, wo hämorrhagische Darmentzündung und Darmdurchbruch auftreten können (Martindale, 1993). Die Tiere wurden täglich hinsichtlich Magen-Darm-Trakt-Störungen, wie beispielsweise Diarrhö, überwacht und wöchentlich hinsichtlich schwererer Toxizitätserscheinungen, wie beispielsweise Gewichtsverlust. Der Gewichtsverlust wurde überwacht durch Berechnen des Nettokörpergewichts, wie es abgeschätzt wird durch Substrahieren des Tumorgewichts, welches berechnet wurde als 1 g × Tumorvolumen (cm³), wie in Shibamoto et al, 1996, zitiert. Zur Demonstration jeglicher Gewichtsveränderungen wurde das Tierkörpergewicht hinsichtlich des Körpergewichts zum Zeitpunkt des Behandlungsbeginns normalisiert zu:
Unabhängig von der Behandlungskur wurde in keinem der Tiere eine tägliche Magen-Darm-Störung wie beispielsweise Diarrhö bemerkt. Schwere Magen-Darm-Trakt-Toxizität für jede Behandlungskur wurde abgeschätzt unter Verwendung des Körpergewichtverlusts (ausschließlich des Tumorgewichts) als Indikator. Zum Todeszeitpunkt eines Tieres wurde die prozentuale Veränderung der Körpermasse wie vorausgehend beschrieben berechnet. Es lag ein statistisch signifikanter Unterschied hinsichtlich des normalisierten Körpergewichts zwischen der Salzlösungs-, HA- und 5-FU-Behandlungsgruppe im Vergleich mit der 5-FU/HA-Gruppenbehandlungsgruppe vor (18). Die Mäuse, welche die 5-FU/HA-Adjuvanstherapie empfingen, zeigten einen 16%-Anstieg des Körpergewichts (t-Test nach Student, p = 0,025) über die Behandlung hinweg im Vergleich mit der unbehandelten Gruppe, welche eine Nettogewichtszunahme von 2% erfuhren.
Die Kombination immunohistochemischer Detektion von carcinoembryonalem Antigen (CEA) mit klassischer diagnostischer Pathologie stellte eine hervorragende Quantifizierung von Lymphknotenmetastasen bereit. Die durch schnittliche Maus enthält 15–19 Lymphknoten (Lamszus et al, 1997), weshalb in dieser Studie etwa 60–70% der Lymphknoten der Tiere untersucht wurden. Es wurde ein sorgfältiges Arbeitsverfahren eingehalten, um sicherzustellen, dass alle Knoten, welche das Brustfettpolster und den Brustbereich entwässern, entfernt und untersucht wurden. Wie in Tabelle 9A gezeigt, zeigten alle Tiere Lymphknotenmetastasen.
19A zeigt, dass der Prozentsatz der betroffenen Lymphknoten (Zahl metastatischer Knoten pro Tier) durch die 5-FU-, 5-FU/HA- und HA-Behandlung stark beeinflusst wurde, wohingegen die Salzlösungsgruppe einen 6-fachen Anstieg hinsichtlich der Menge an betroffenen Lymphknoten zeigte. Wiederum zeigte HA, dass es einen therapeutischen Wert haben könnte.
Während das Tier am Ende der Studie seziert wurde, wurde jedes Gewebe mikroskopisch und makroskopisch hinsichtlich Tumorknoten untersucht. Mit Ausnahme der Mäuse, welche die HA/5-FU- oder HA-Therapie empfingen, wurden neue Tumore um den Hals- oder den Achselhöhlenbereich des Abschnitts beobachtet, welcher nahe am Primärtumor lag. Die Aufnahme von HA in die Behandlungskur hemmte Tumorneubildung, wie es in 19B gezeigt ist.
Unabhängig von der Behandlung gab es keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich des Gesamtüberlebens von Patienten (Tabelle 9), wobei Tiere aus allen Gruppen die Behandlungskuren abschlossen.
Da eine der Haupttoxizitäten, welche mit einer 5-FU-Behandlung assoziiert sind, eine Depression des Knochenmarks mit nachfolgender Abnahme weißer Blutkörperchen ist, war es notwendig, jede Behandlung, welche mit Bluttoxizität assoziiert ist, zu bewerten. Nach dem Anästhesieren der Tiere wurde Blut aus dem Herzen oder den großen Gefäßen gesammelt, wobei eine Nadel und eine Spritze verwendet wurden. Eine Abschätzung der Zahl an weißen Blutkörperchen wurde durch Herstellen einer 1/10 Blutverdünnung in Maustenazitätssalzlösung (M) und Auszählen auf einem Hämozytometer durchgeführt. Eine differenzielle Blutzählung wurde durchgeführt durch Zählen von Neutrophilen, Lymphozyten und Erythrozyten. Die Gesamtabschätzung der Blutzellsubpopulationen wurde mit zu Mausblut publizierten Daten verglichen.
Um sicherzustellen, dass die Behandlungen keine Organathrophie oder -vergrößerung induzierten, wurden die Organe postmortem entfernt und gewogen. Die Masse eines jeden Organs wurde berechnet als Prozent des Gesamtnettokör pergewichts und verglichen mit den Organmassen der Gruppe, welche nur Salzlösung empfing (Gruppe 1).
Beispiel 11 Langzeit-Behandlung: 6-Monats-Kur
Obwohl diese Studie noch immer andauert, sind signifikante Daten erzeugt worden.
TDT bezeichnet die Zeit (Tage), welche ein Tumor benötigt, um sich hinsichtlich seiner Masse oder der Zellzahl zu verdoppeln, wobei es sich um einen Parameter zum Tumorwachstum handelt, welcher leicht zu messen ist und welcher mit verständlichen Begriffen leicht mit klinischen Tumorverhalten in Beziehung gesetzt werden kann (Shackney et al, 1978). Durch Überwachen der Tumorverdopplungszeit ist es oftmals möglich, die Reaktion eines Tumors auf Chemotherapeutika zu bewerten, da langsam wachsende Tumore dazu neigen, auf Chemotherapeutika gemäßigt zu reagieren (Schabel, 1975).
Die Tumorverdopplungszeit für jede Behandlung ist in Tabelle 9B gezeigt.
Es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der TDT zwischen der 5-FU/HA- und der 5-FU-Behandlung. Wie im Rahmen der 6-Wochen-Studie zeigte die Verabreichung von HA auch einen therapeutischen Effekt auf den Primärtumor, wobei eine TDT von 26 ± 1,75 gegenüber 13 ± 4 Tagen für Salzlösung gezeigt wurde. Die Verabreichung von HA 24 h vor 5-FU schien jedem therapeutischen Wert von 5-FU in Relation zur Retardation von Tumorwachstum entgegenzuwirken.
Die Tumormasse und das Tumorvolumen sind nützliche Parameter bei der Überwachung von Tumorbehandlungsreaktion und -progression, zeigen aber letztendlich nicht die zytotoxischen Effekte, welche von einer Therapie ausgehen. Wir wollten etablieren, ob die HA/5-FU-Therapie mehr Tumorzellen tötete, sowie die Lokalisierung der Zellen. Sterbende Zellen können pathologisch manifestiert werden durch

i. Disintegration des Kerns (Apoptose)
ii. Lyse der Zellen (Nekrose)

Durch Scannen der vollständigen Tumorabbildung in einen MCID-Computer, welcher den vollständigen Tumorabschnitt berechnete, wurde die Zahl der sterbenden Zellen quantifiziert. Die Zellen mit fragmentierten Kernen oder lysierte Zellen wurden abgegrenzt und gescannt, wobei diese Abschnitte anschließend digitalisiert werden und der exakte Bereich mit sterbenden Zellen berechnet wird. Die Prozentanteil des Tumors, welcher toten Zellen zugeschrieben wurde, wurde berechnet durch:
Eine lebensfähige Zelle enthält mehr Wasser als eine sterbende oder tote Zelle, weshalb es durch Bestimmen des Verhältnisses von Trockentumor masse zu Feuchttumormasse möglich ist, den Gesamtbereich lebensfähiger Zellen gegenüber nicht lebensfähigen Zellen abzuschätzen. Die Tumore wurden in zwei Teile zergliedert, wobei eine Hälfte für die Tumorpathologie verarbeitet wurde und die verbleibende Hälfte vor und nach Trocknen bei 50°C für 48 h gewogen wurde. Die Trockenmasse als Prozentanteil der Feuchttumormasse wurde berechnet durch:
Die Gesamtpatientenüberlebenszeit wurde berechnet als die Zeit (Tage oder Wochen), welche das Tier nach Beginn der Behandlung noch lebte.
Die Tumorverdopplungszeit für jede Behandlung ist in Tabelle 9A gezeigt. Es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der TDT zwischen den 5-FU/HA- und 5-FU-Behandlungen. Jedoch zeigte die Verabreichung von HA einen therapeutischen Effekt auf den Primärtumor auf, wobei die TDT signifikant größer war als in der Salzlösungsgruppe (p, 0,05, Tukey-Mehrfachvergleichstest). Die Verabreichung von HA 24 vor 5-FU. schien jeglichem therapeutischen Wert von 5-FU in Relation zur Retardation von Tumorwachstum entgegenzuwirken.
Die zitierte Heilungsrate für 5-FU ist 26% (Inaba et al, 1989), aber die Tiere, welche 5-FU empfingen, erfuhren keine „Heilung". Zwei Mäuse, welche die HA/5-FU-Adjuvanstherapie empfingen, erfuhren eine „Heilung", wobei die Tumore vollständig nekrotisierten und nach etwa 12 Behandlungswochen abfielen. 20B zeigt das charakteristische Auftreten von geringer Schorfbildung auf Mäusen, welche die Behandlung mit HA und HA/5-FU empfingen, während 20C das Auftreten von kleinen Nekrosebereichen zeigt, mit anschließender Bildung großer Schorfbereiche. Eine der Mäuse erfuhr ein neuerliches Wachsen eines kleinen Knötchens, aber die zweite Maus war nach 22 Wochen noch immer tumorfrei. Wie in 20A gesehen werden kann, wiesen Mäuse, welche 5-FU- oder Salzlösung empfingen, große Tumore auf, welche letztendlich dazu führten, dass das Tier aufgrund der Masse der Tumorlast starb (Tabelle 9B), wohingegen aber Mäuse, welche HA ± 5-FU empfingen, eine charakteristische Tumorerscheinung zeigten, wobei ein kleiner Bereich nekrotisierte, woran sich die Bildung von Schorf anschloss.
In der 22. Woche lebten noch immer 37,5% der 5-FU/HA-Mäuse und der hauptsächliche Todesgrund für die Mäuse der 5-FU/HA-Adjuvanstherapie war Gewichtsverlust und metabolischer Stress (Tabelle 9B).
Es scheint ein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Gesamtpatientenüberlebens vorzuliegen, wenn HA ± 5-FU an Mäuse verabreicht wird, welche humane Brustkrebsxenotransplantate tragen. In der 22. Woche einer 24-wöchigen Studie sind die einzigen überlebenden Gruppen die 5-FU/HA-Gruppe und die HA-Gruppe, wie es in 21 gezeigt ist.
Schlussfolgerungen
Die Daten aus dem 5-FU-Targeting zeigen, dass eine statistisch signifikante Zunahme der 5-FU-Aufnahme durch Tumore stattfand, wenn 5-FU mit HA zu den Zeitpunkten 10, 20 und 30 Minuten injiziert wurde mit einer 2,4-, 1,5- bzw. 2-fachen Zunahme hinsichtlich der 5-FU-Aufnahme (Tabelle 7). Dies zeigte, dass 5-FU durch das HA auf den Tumor zielgerichtet worden war. Es gibt zwei mögliche Mechanismen für HA-Targeting von 5-FU zu Tumorzellen:
HA, welches assoziiertes 5-FU enthält, bindet an den Rezeptoren (CD44) und wird mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose internalisiert, wodurch das Arzneimittel in die Tumorzelle abgegeben wird.
Das molekulare HA-Maschenwerk wirkt als Drossel hinsichtlich einer Diffusion nach außen, so dass, nachdem HA an Rezeptoren bindet (CD44 und RHAMM), das eingeschlossene 5-FU in die Tumorzellen diffundieren kann. Wäh rend es an der Oberfläche der Zellen durch die HA-Matrix festgehalten wird, weist das 5-FU eine gesteigerte Verfügbarkeit für den aktiven Transportmechanismus auf, welcher normalerweise für den 5-FU-Transport in die zugrunde liegende Zelle verwendet wird.
Der Katabolismus von HA findet hauptsächlich in den Lymphknoten (Fraser et al, 1988) und der Leber (Laurent et al, 1986) statt. HA wird üblicherweise aus dem Blutstrom durch Rezeptor-vermittelte zelluläre Aufnahme und den Katabolismus in der Leber (80–90%), den Nieren (10%), der Milz (0,1%) und dem Knochenmark (0,1%) beseitigt (Fraser et al, 1983). Zirkulierendes HA wird durch den metabolischen Rezeptor aufgenommen, welcher auch als der Leber-Endothelzell (LEC)-Rezeptor bekannt ist (Eriksson et al, 1983), wohingegen der CD44-Rezeptor bei der HA-Internalisierung eine Rolle zu spielen scheint, welche assoziiert ist mit zellulären Prozessen anstelle des Metabolismus, wohingegen der RHAMM-Rezeptor nur bei der Zellbeweglichkeit eine Rolle spielt. Die Kombination von HA mit 5-FU könnte zu großen Mengen an 5-FU führen, welche zielgerichtet sind auf die Stellen des HA- oder 5-FU-Metabolismus. Die Daten aus den Targeting-Experimenten (Tabelle 6) zeigen, dass es keine signifikante Zunahme hinsichtlich 5-FU-Targeting zur Leber gab, wenn es mit HA verabreicht wurde. Da kein erhöhtes Targeting zur Leber beobachtet wurde, könnte nahegelegt werden, dass der LEC-Rezeptor auf der Leber eine niedrigere Bindungsaffinität für HA im Vergleich zum CD44-Rezeptor aufweist. Eine andere Möglichkeit ist, dass die CD44-Isoform, welche auf Leberzellen exprimiert wird (Stamenkovic et al, 1991) HA nicht mit hoher Affinität bindet. Wie bei der Leber wurde kein erhöhtes Targeting von 5-FU in den anderen Metabolismusorganen der Milz, des Knochenmarks und der Lymphknoten festgestellt.
Es gab eine signifikante 1,8-fache Zunahme hinsichtlich des 5-FUs, welches auf die Nieren innerhalb eines 10-Minuten-Zeitfensters zielgerichtet war. Obwohl die anderen 4 Zeitpunkte keine signifikante Zunahme hinsichtlich der 5-FU-Aufnahme durch die Niere zeigten, wenn HA/5-FU co-verabreicht wurde, schien es, dass ein allgemeiner Trend auftrat, wonach mehr 5-FU an die Nieren bei Verabreichung mit HA abgegeben wurde. Der Hauptweg zur endgültigen Eliminie rung von 5-FU aus dem Körper ist die Urinausscheidung. Obwohl nur eine kleine Zunahme hinsichtlich des Arzneimittelgehalts mit HA in der Niere vorzuliegen scheint, glauben wir aber aufgrund von anderen Belegen, dass HA von den Nieren sehr schnell aufgenommen und katabolisiert wird, so dass seine Verweilzeit kurz ist und ein assoziiertes Arzneimittel schnell in den Urin abgegeben wird.
In Geweben wie beispielsweise dem Magen, dem Gehirn, den Lungen und dem Uterus wurde zu einem oder mehreren Zeitpunkten Kurzzeit-Targeting beobachtet. Es wurden keine konsistenten pharmakokinetischen Muster erzeugt, was anzeigen könnte, dass wir die Probenpopulationszahl erhöhen müssen, wodurch definitiv gezeigt werden könnte, ob diese Beobachtungen echt sind. Im Falle des erhöhten Targetings zum Gehirn bei 10–30 Minuten kann dies erklärt werden durch die kürzlich beschriebene Beobachtung, dass HA mit einer Steigerung der Fähigkeit von Arzneimitteln zum Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke assoziiert worden ist (Nelson & Falk, 1994).
Es lag eine signifikante Erhöhung der 5-FU-Mengen in den Lungen infolge von Verabreichung mit HA zu den Zeitpunkten 30 Min und 1 h vor. Es wurde berichtet, dass Lungenmakrophagen große Mengen der HA-bindenden CD44-Isoform enthalten (Underhill et al, 1993), wodurch das verbesserte Targeting begründet werden könnte. Dies könnte mit einem therapeutischen Vorteil bei der Behandlung von Lungenkarzinomen in Verbindung gebracht werden, wobei von kleinen und großen Zelllungenkarzinomen beschrieben worden ist, dass sie eine Überexpression an CD44 und RHAMM enthalten (Horst et al, 1990).
Es lag eine signifikante Abnahme an 5-FU, welches auf das Herz zielgerichtet war, zu den Zeitpunkten 1 und 2 h vor, wenn HA mit 5-FU co-injiziert wurde. Da eine 5-FU-Verabreichung zu Kardiotoxizität führen kann (MIMS, 1997), kann die Verabreichung von 5-FU mit HA den Toxizitätsgrad für das Herz im Vergleich mit 5-FU, welches allein verabreicht wird, reduzieren.
Bei der Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit der HA/5-FU-Adjuvanstherapie waren einige Beobachtungen sowohl während der Langzeit- als auch Kurzzeit-Behandlungsprotokolle konsistent.
Es schien, dass Mäuse, welche HA/5-FU oder HA allein empfingen, mehr Energie hatten und ihre Körpermasse beibehielten oder steigerten, wobei diese Beobachtungen durch die gesteigerte Überlebenszeiten von HA/5-FU-Mäusen in der 6-Monats-Studie unterstützt wurden.
Tumore von Mäusen, welche 5-FU/HA oder HA empfingen, entwickelten Bereiche mit äußerlicher Nekrose bis zu einem Ausmaß, bei welchem 2 Tumore abfielen.
Die Zugabe von HA zu 5-FU schien keinen signifikanten Effekt auf das Volumen der Primärbehandlung aufzuweisen, wenn die Therapie für 6 Wochen verabreicht wurde, aber dies könnte an der Gefäßbildung des Tumors liegen. Tumore bestehen aus drei Bereichen. Wenn HA mit und ohne 5-FU verabreicht wurde, erreicht es den Tumor, und tritt in gut vaskularisierte und halb-nekrotische Bereiche mittels der großen offenen Zellkontakten der beschädigten Blutgefäße ein. Aufgrund der Fähigkeit von HA, Wasser zu adsorbieren, könnte dies zu einem Einfluss von extrazellulärem Fluid zum nekrotischen Bereich des Tumors führen, mit nachfolgender Zunahme des Tumorvolumens und unter Verursachung von weiterem Schaden an der Tumorgefäßbildung. Diese Hypothese ist konsistent mit der Beobachtung, dass Tumore, welche mit HA ± 5-FU behandelt wurden, üblicherweise Nekrose zeigten und ein Auslaufen von Tumor-intrazellulärem Fluid. Wenn die Berechnung der nekrotischen Zellbereiche gegenüber lebensfähigen Zellbereichen und des Trocken: Feucht-Massenverhältnisses vervollständigt ist, werden wir diese Hypothese verifizieren können.
Die Langzeitwirksamkeitsstudie zeigte eine erhöhte Überlebensrate für Mäuse, welche eine HA/5-FU-Behandlung empfangen, wie in 21 gezeigt. Das mittlere Tumorvolumen dieser Mäuse schien im Vergleich mit der anderen Behandlungsgruppe reduziert zu sein. Es wurde auch in der Langzeitstudie bemerkt, dass der Grund für den Tod der HA/5-FU-Gruppe meistens bei metabolischem Stress lag, wohingegen der Grund für den Tod der 5-FU-Gruppe mehr bei Unbeweglichkeit aufgrund von zu großer Tumorgröße lag. Alle Mäuse, welchen nur HA verabreicht wurde, starben an Unbeweglichkeit, da der Tumor zu groß war, und nicht aufgrund von Toxizität. Deshalb wurde HA, welches keine toxischen Effekte aufzuweisen scheint, verabreicht. Aufgrund der Targeting-Ergebnisse wurde herausgefunden, dass ein verbessertes Targeting von 5-FU auftrat, wenn HA mit 5-FU zum Tumor kombiniert wurde (12). Die Fähigkeit von HA, 5-FU zum Tumor hin mittels HA-Bindung an die HA-spezifischen Rezeptoren CD44 und RHAMM auszurichten, für welche gezeigt worden ist, dass sie an Tumorstellen in erhöhten Mengen vorliegen (Culty et al, 1994; Wang et al, 1996), könnte widerspiegeln, dass die Verwendung von HA mit 5-FU und anderen zytotoxischen Arzneimitteln helfen könnte, das Problem zu überwinden, dass nicht ausreichend Arzneimittel den Tumor erreicht, um einen therapeutischen Einfluss zu haben. Es wurde in der Kurzzeitstudie auch herausgefunden, dass die 5-FU/HA-Mäuse im Vergleich mit allen anderen Gruppen eine signifikante Zunahme der Körpermasse zeigten (21). Folglich kann die Targeting-Fähigkeit von HA zu Tumorstellen die Menge an 5-FU erniedrigen, welches zu anderen Organen, wie beispielsweise den Eingeweiden, geht, und dadurch die Behandlungsnebeneffekte, welche mit einer 5-FU-Therapie verbunden sind, insbesondere die Magen-Darm-Trakt-Toxizität, verringern.

Im Vergleich mit der früheren Bewertung der MTX/HA-Adjuvanstherapie, welche in den Beispielen 1–3 offenbart ist, stellten wir einige bestimmte gemeinsame Ergebnisse und Unterschiede, wie sie in Tabelle 10 zusammengefasst sind, fest. Tabelle 10: Gemeinsame Ergebnisse und Unterschiede zwischen der Adjuvanstherapie mit MTX/HA und 5-FU/HA

Studie	Ähnliche Ergebnisse	Unterschiedliche Ergebnisse
MTX/HA: 6 Monate gegenüber 5-FU/HA: 6 Wochen	Mäuse, welche HA/Arzneimittel empfingen, erfuhren eine signifikante Gewichtszunahme; Keine markante Zunahme hinsichtlich des Patientenüberlebens; Gehemmte Bildung von neuen Tumoren; Zeigten eine längere TDT; Reduzierte Lymphknoten-Metastasenbildung;
MTX/HA 6 Monate gegenüber 5-FU/HA: 6 Monate	Zeigten eine längere TDT	5-FU/HA-Mäuse zeigten gesteigertes Überleben
HA-Kontrolle für MTX/HA: 6 Monate gegenüber HA-Kontrolle für 5-FU/HA: 6 Wochen & 6 Monate		HA-Mäuse in der 5-FU/HA-Studie zeigten, dass HA einen therapeutischen Effekt durch eine Verringerung der TDT ausübte; HA reduzierte Lymphknoten-Metastasenbildung und Tumorbildung

Der Hauptunterschied in den zwei Studien war die Ausgangsmasse der Tumore, wobei in der MTX/HA-Studie das mittlere Tumorvolumen 175,13 mm³ im Vergleich zu 61,63 mm³ in der 5-FU/HA-Studie betrug. Durch die Dynamik der Partikelbewegung in zu den Tumoren und die Reaktion eines Patienten auf die Tumormasse könnte dies die unterschiedlichen Ergebnisse, welche in Relation zu den TDT-Berechnungen erhalten wurden, erklären.
Beispiel 12 Therapeutische Wirksamkeit einer Kombinationstherapie mit Hyaluronan
Eine der am häufigsten verwendeten Behandlungskuren für humanen primären und metastasierenden Brustkrebs ist die Kombinationschemotherapie mit Cyclophosphamid (Cyc), MTX und 55-FU, welche an Tag 1 und Tag 8 eines 28-tägigen Zyklus verabreicht wird. Die Kombinationstherapie, welche oftmals als CMF bezeichnet wird, wird üblicherweise in 6 Zyklen verabreicht, wobei der Zustand des Patienten zu diesem Zeitpunkt nochmals bewertet wird. Von der Antitumorreaktionsrate bei CMF-Therapie wurde beschrieben, dass sie etwa 50% beträgt (Bonadonna, 1981; Bonadonna, 1988), aber die Therapie weist viele damit verbundene Nebeneffekte auf, wie beispielsweise Erschöpfung, Übelkeit, Leukopenie und Erbrechen (Bonadonna, 1976; Meyerowitz, 1979). Aufgrund des Erfolgs bei der Verwendung von HA als Arzneimittelabgabevehikel für sowohl MTX als auch 5-FU bewerteten wir die therapeutische Wirksamkeit und die Toxizität der HA/CMF-Adjuvanstherapie über eine 6-wöchige und eine 6-monatige Behandlungskur hinweg.
Das MTX und 5-FU wurden wie zuvor in den Beispielen 2 bzw. 6 beschrieben hergestellt. Die Stammlösung für Cyc wurde hergestellt durch Lösen von 1 g lyophilisiertem Arzneimittel in 1 ml Pyrogen-freiem destilliertem Wasser von Injektionsgüteklasse und auf 50 ml mit 0,9% Natriumchlorid von Injektionsgüteklasse aufgefüllt. Die Stammlösung wurde in kleine Volumen aliquotiert und bei –20°C bis zur Verwendung eingefroren.
Eine CMF-Injektion wurde hergestellt durch Heranziehen des geeigneten Volumens an Arzneimittelstammlösung, um die endgültige Arzneimittelkonzentrationen von:

30 mg/kg 5-FU (Stammlösung: 20 mg/ml)
15 mg/kg MTX (Stammlösung: 24,5 mg/ml)
26 mg/kg Cyc (Stammlösung: 20 mg/ml)
12,5 mg/kg HA (Stammlösung: 10 mg/ml) zu erreichen.

Um die therapeutische Wirksamkeit und andere mögliche Toxizitäten der CMF/HA-Adjuvanstherapie zu etablieren, wurden humane Brusttumorxenotransplantate in Nacktmäusen verwendet. Um die humane Behandlungskur so gut wie möglich zu simulieren, wurden die Mäuse in 6 Behandlungszyklen (6 Monate) in einer Langzeitwirksamkeitsstudie und 6 Zyklen (6 Wochen) in einer Kurzzeitwirksamkeitsstudie behandelt. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 7 Gruppen mit 8 Tieren pro Gruppe für die Kurzzeitstudie und 5 Gruppen mit 8 Tieren für die Langzeitstudie eingeteilt.

Die Mäuse wurden behandelt mit 30 mg/kg 5-FU; 15 mg/kg MTX; 26 mg/kg Cyc ± 12,5 mg/kg entweder an den Tagen 1 und 2 einer 7-tägigen Kur für 6-Wochen oder an den Tagen 1 und 8 einer 28-tägigen Kur für 6-Monate. Kontrollgruppen bestanden aus der Verabreichung von Salzlösung, 12,5 mg/kg HA oder aus Mäusen, welchen 12,5 mg/kg HA an Tag 1 und anschließend CMF an Tag 2 verabreicht wurde. Die Mäuse wurden täglich hinsichtlich jeglicher Behandlungstoxizität überwacht und es wurde die Tumormasse auf einer täglichen oder wöchentlichen Grundlage gemessen (siehe Tabelle 11). Tabelle 11: Behandlungsverabreichungsprotokolle

Behandlungsgruppe	Dosierung	6-Wochen-Studie: Behandlungskur Bolusinjektion an den Tagen	6-Monats-Studie: Behandlungskur
1. Salzlösung	0,1 ml an 0,9% Salzlösung (Injektionsgüteklasse)	1 & 2 eines 7-tägigen Zyklus	1 & 8 eines 28-tägigen Zyklus
2. CMF/HA	0,1 ml enthaltend: 30 mg/kg 5-FU 15 mg/kg MTX 26 mg/kg Cyc + 12,5 mg/kg HA	1 & 2 eines 7-tägigen Zyklus	1 & 8 eines 28-tägigen Zyklus
3. HA	0,1 ml enthaltend: 12,5 mg/kg HA	1 & 2 eines 7-tägigen Zyklus	1 & 8 eines 28-tägigen Zyklus
4. CMF	0,1 ml enthaltend: 30 mg/kg 5-FU 15 mg/kg MTX 26 mg/kg Cyc	1 & 2 eines 7-tägigen 1 Zyklus	1 & 8 eines 28-tägigen Zyklus
5. HA mit anschließend CMF	0,1 ml enthaltend: 12,5 mg/kg HA oder .30 mg/kg 5-FU 15 mg/kg 5 MTX 26 mg/kg Cyc	1: HA 2: CMF 3: HA 4: CMF eines 7-tägigen Zyklus	1: HA 2: CMF 8: HA 9: CMF eines 28-tägigen Zyklus
6. HA	0,1 ml enthaltend: 12,5 mg/kg HA	1: HA 3: HA eines 7-tägigen Zyklus

Wie in den Tabellen 12a und 12b gezeigt, wurde in der 6-wöchigen Studie das Folgende beobachtet:

1. Mäuse, welche eine HA-enthaltende Behandlungskur empfingen (CMF/HA, HA mit anschließendem CMF oder nur HA) zeigten eine gesteigerte Überlebensrate von 50% gegenüber der Gruppe mit nur CMF. Die mittlere Überlebenszeit für die CMF-Behandlungsgruppe betrug 40,4 Tage gegenüber 42 Tagen für alle anderen Gruppen.
2. Tiere, welche mit einer Kombination aus HA und CMF behandelt wurden, zeigten alle eine signifikante Gewichtszunahme (t-Test, p < 0,001) gegenüber Tieren, welche nur mit CMF oder nur mit HA behandelt worden waren, und zeigten ein verbessertes Wohlbefinden (siehe 22).
3. Die Tumorverdopplungszeit der mit Salzlösung behandelten Mäuse (Kontrollgruppe ohne Behandlung) war signifikant geringer als die der anderen Behandlungsgruppen (t-Test, p < 0,001), aber es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den anderen Behandlungsgruppen (siehe 23).
4. Es lag ein signifikanter Unterschied (t-Test, p =< 0,001) zwischen den CMF- und den CMF/HA-Behandlungsgruppen hinsichtlich der Endpunktvolumen der Primärtumore vor, wobei CMF zu einer Verringerung der Tumormasse in 7/8 Tieren führte, wohingegen CMF/HA das primäre Tumorvolumen in nur 3/8 Tieren reduzierte.
5. Es wurden keine Behandlungstoxizitäten festgestellt, wenn Mäuse mit HA ± CMF behandelt wurden, wohingegen Mäuse, welche nur mit CMF behandelt wurden, Zeichen von Erschöpfung, Konjunktivitis, schlechter allgemeiner Gesundheit zeigten.

Wenn die CMF/HA- oder HA-Therapie an Tag 1 und Tag 8 eines 28-tägigen Zyklus verabreicht wurde, wurde das Folgende beobachtet: Es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Überlebenszeit zwischen den Behandlungsgruppen.

1. Es gab keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der Gewichtszunahme zwischen den Behandlungsgruppen.
2. Der Primärtumor von Mäusen, welche HA ± CMF empfingen, zeigte kleine Bereiche mit Nekrose und Schorfbildung.
3. Bei der Behandlung des Primärtumors zeigte CMF als ein bloßes Mittel keine therapeutische Wirksamkeit gegenüber den Salzlösung- und HA-Behandlungen. Die Zugabe von HA zu CMF führte zu signifikant größeren (t-Test, p = 0,001) Primärtumoren.

Es können die folgenden Schlussfolgerungen aus dieser Studie gezogen werden:

1. Die Langzeitverabreichung (6 Monate) einer HA/CMF-Adjuvanstherapie zeigte keinen Anstieg der therapeutischen Wirksamkeit oder eine Verringerung von Behandlungsnebeneffekten.
2. Eine Kurzzeitverabreichung (6-Wochen) einer HA/CMF-Adjuvanstherapie zeigt mehrere Vorteile gegenüber der Verabreichung von CMF als einziger Behandlung.
3. Signifikante Gewichtszunahme.
4. 50% Zunahme hinsichtlich der Zahl an Tieren, welche die Behandlung abschlossen.
5. Aufhebung von Nebenwirkungen wie beispielsweise Erschöpfung, Konjunktivitis, Gewichtsverlust.
6. Mäuse, welche HA empfingen, zeigten keine Anzeichen für Toxizität.

Beispiel 13 NMR-Untersuchungen zur Art der Wechselwirkung von chemotherapeutischen Arzneimitteln und HA
Um die Art der Wechselwirkung zwischen HA und chemotherapeutischen Arzneimitteln weiter zu untersuchen, wurde ¹H Kernmagnetresonanz (NMR)-Spektroskopie verwendet. Deuteriumoxid (²H₂O (99,96%)) wurde von den Cambridge Isotope Laboratories erhalten. MTX wurde von Faulding Pharmaceuticals erhalten und 5-FU- und HA-Stammlösungen wurden wie vorausgehend beschrieben hergestellt.
Spektren wurden aufgenommen bei 298 K auf einem Brüker DRX-Spektrometer, welches bei 600 MHz mit einer abgeschirmten Gradienteneinheit betrieben wurde. Die 2D-Experimente wurden im Phasen-sensitiven Modus unter Verwendung von Zeit-proportionaler Phasenikrementation zur Quadraturdetektion in der t₁-Dimension aufgenommen (Marion & Wüthrich, 1983). Die 2D-Experimente umfassten eine TOCSY-Sequenz unter Verwendung einer MLEV-17-Spin lock- Sequenz (Bax & Davis, 1985) mit einer Mischzeit von 120 ms; NOESY (Kumar et al., 1980) mit Mischzeiten von 250 und 400 ms und ROESY-Spektrum mit einer Mischzeit von 250 ms. Die Temperaturkalibrierung der Sonde wurde durch Vergleich mit den chemischen Verschiebungen von Ethylenglycol erreicht. Alle chemischen Verschiebungen (ppm) wurden mit der Methylresonanz von 4,4-Dimethyl-4-silapentan-1-sulfonat (DSS, 0 ppm) in Bezug gesetzt.
Die Lösungsmittelsuppression für das Wassersignal für NOESY-, ROESY- und TOCSY-Experimente wurden unter Verwendung einer modifizierten WATERGATE-Sequenz (Piotto et al., 1992) erreicht, in welcher zwei Gradientenpulse mit 1 ms auf beide Seiten eines binomialen 3-9-19-Pulses angelegt wurden. Die Spektren wurden über 6024 Hz mit 4096 Komplexdatenpunkten in F₂ und 512 Inkrementen in der F₁-Dimension aufgenommen, bei 32 Scans pro Inkrement für die TOCSY-Experimente und 80 Scans für die NOESY-Experimente. Langsam austauschende NH-Protonen wurden detektiert durch Aufnehmen einer Serie eindimensionaler (1 D) Spektren, welche über 16 K Datenpunkte und mit 32 Scans aufgenommen wurden.
NMR-Diffusionsexperimente wurden durchgeführt auf einem Brüker AMX-Spektrometer, welches mit einer Gradientenkontrolleinheit ausgestattet war, wobei bei 500 MHz gearbeitet wurde. Alle Experimente wurden mit 16 oder 64 Scans bei 268 K über 16 K von Datenpunkten und 7575 Herz durchgeführt. Es wurde eine Gradientenstärke von 15,44 G/cm für die Diffusionsexperimente verwendet. Jedes Diffusionsexperiment wurde erhalten aus einer Serie von 12 PF-GLED-Spektren, in welchen die Verzögerungen (τ = 20 ms, Δ = 50 ms, T = 30 ms und T_e = 14 ms) und in welchen die Größenordnung von G konstant gehalten wurde, aber die Länge des Feldgradientenpulses (δ) inkrementiert wurde in 1 ms-Schritten von 0,2 ms bis 12,2 ms im Endspektrum.
Alle Spektren wurden auf einer Silicon Graphics Indigo Workstation unter Verwendung von Xwinnmr (Bruker)-Software bearbeitet. Für die 2D-Experimente wurde die t₁-Dimension nullgefüllt auf 2048 realen Datenpunkten und 90° Phasen-verschobene Sinusglockenfensterfunktionen wurden vor der Fourier-Transformation verwendet.
Die NMR-Experimente wurden entworfen, um die Veränderungen des ¹H NMR-Spektrums von MTX infolge der Zugabe von HA zu verfolgen. Durch Verfolgen von spezifischen Veränderungen im Spektrum des Arzneimittels MTX, wie beispielsweise der Verbreiterung oder der Bewegung von Peaks, ist es möglich zu sehen, welche Regionen des Arzneimittelmoleküls, wenn es welche gibt, mit HA Wechselwirken. 24 zeigt das ¹H NMR-Spektrum von MTX gelöst in H₂O. Dieses Spektrum identifiziert auf einfache Weise jede Gruppe an Wasserstoffen in Methotrexat.
Methotrexat
Methotrexat weist mehrere funktionelle Gruppen auf, welche möglicherweise mit dem Hyaluronan-Molekül Wechselwirken könnten. Die primären Aminreste am aromatischen 2,4-Aminopteridin-Ring von MTX könnten eine ionische Assoziierung mit den Carboxylgruppen am Hyaluronan-Molekül bilden. Wasserstoff-bindende Wechselwirkungen zwischen Amingruppen am Methotrexat und der Hydroxylgruppe an den Kohlenhydrat-Ringen von Hyaluronan sind eine andere Möglichkeit. Hydrophobe Wechselwirkungen sind auch möglich zwischen den hydrophoben aromatischen Ringen von MTX und hydrophoben Stellen des gefalteten Hyaluronan-Polymers. Diese Wechselwirkungen sind in 25 gezeigt.
Um die Frage zu adressieren, ob es eine spezifische Wechselwirkung zwischen dem Methotrexat und HA gab, wurden NMR-Experimente konzipiert, um die Veränderungen im ¹H NMR-Spektrum von MTX infolge von HA-Zugabe zu verfolgen. 26 zeigt das 600 Mhz-Spektrum von Hyaluronsäure bei 600 MHz und 298 K.
27 zeigt das 600 MHz ¹H NMR-Spektrum von MTX allein und MTX mit steigenden Zugaben von HA (50 kDa) von 2 nmol, 10 nmol und 20 nmol sowie 80 nmol bei 298 K. Diese Spektren zeigen, dass es keine Veränderung hinsichtlich der chemischen Verschiebungsposition von irgendeinem der Peaks in Methotrexat gibt. Zusätzliche Peaks, welche im Spektrum auftreten, wenn sukzessive HA-Mengen zugegeben werden, stimmen mit Resonanzen aufgrund von Hyaluronsäure vollständig überein. Da es keine Veränderung hinsichtlich der chemischen Verschiebungsposition irgendeiner der Resonanzen von MTX in diesen Spektren gibt, scheint es, dass es keine spezifische Region des MTX-Moleküls gibt, welche mit dem HA-Molekül wechselwirkt.
Ein Weg zur Bestimmung, ob es eine starke Wechselwirkung zwischen den NH-Gruppen am MTX und den Säuregruppen am HA gibt, ist es, die Austauschrate der NH-Protonen zu messen. Diese Wasserstoffe sind labil und können mit dem Massenlösungsmittel (bulk solvent) schnell austauschen. Wenn sie jedoch bei einer starken Wechselwirkung mit dem HA-Molekül eine Rolle spielen, dann würden sie vor dem Massenlösungsmittel geschützt und ihre Austauschrate würde erniedrigt. In diesem Experiment tauschen die Aminwasserstoffe von MTX mit dem Deuterium aus dem D₂O aus und die Austauschrate sollte eine qualitative Abschätzung der Stärke der Wechselwirkung zwischen dem MTX und HA bereitstellen. Eine ¹H NMR-Analyse einer Lösung, welche hergestellt wurde durch Zugabe von Deuteriumoxid zu einer Lösung von MTX und HA gelöst in 0,5% w/v Na₂CO₃ (pH 9) zeigte, dass innerhalb von 4 Minuten alle Aminwasserstoffe von MTX mit dem Deuterium in der Probe ausgetauscht hatten. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Aminwasserstoffe in MTX nicht vor einem Austausch mit dem Massenlösungsmittel geschützt sind.
Der Grund, dass die Aminwasserstoffpeaks aus dem ¹H NMR-Spektrum verschwinden, ist der, dass Deuterium im Vergleich zum Wasserstoff eine deutlich unterschiedliche Resonanzfrequenz aufweist und deshalb nicht in ¹H NMR-Spektren erscheint. Analoge Experimente werden routinemäßig verwendet, um zu untersuchen, ob Amidwasserstoffe des Rückgrats in einem Polypeptid oder Proteinen vor Lösungsmittel geschützt sind. Wenn Amidwasserstoffe von Protei nen bei Wasserstoffbindungsanordnungen eine Rolle spielen, welche eine α-Helix- oder β-Faltblatt-Sekundärstruktur stabilisieren, ist die Austauschrate dieser Wasserstoffe oftmals drastisch verringert. In einigen Fällen können die Wasserstoffsignale, welche bei diesen Wechselwirkungen eine Rolle spielen, für Stunden, Tage oder sogar Monate bestehen, wobei dies von der Stärke der Wechselwirkung und ihrem Schutz vor dem Massenlösungsmittel (beispielsweise im hydrophoben Kern eines Proteins) abhängig ist.
Es wurden Diffusionsexperimente mit MTX allein und in Gegenwart von HA durchgeführt. Diese Experimente könnten zeigen, ob die Diffusion des eingeschlossenen MTX durch die Gegenwart des HA-Gerüsts verzögert ist. Die Ergebnisse von zweifach durchgeführten ¹H NMR-Diffusionsexperimenten zeigten, dass für die große Mehrheit der MTX-Moleküle keine Verzögerung der MTX-Diffusionsrate vorlag, da ein vernachlässigbarer Unterschied zwischen den Diffusionskoeffizienten von MTX und MTX in Gegenwart von HA vorlag. Diese Feststellung könnte nahelegen, dass es im HA-Gerüst zwischen den HA-Molekülen große Lösungsmittelhohlräume gibt, wobei es dies dem Arzneimittel erlaubt, frei in diesem Medium zu diffundieren.
Die Diffusionsexperimente legten nahe, dass die Masse der MTX-Moleküle frei durch das HA-Gerüst diffundieren kann. Dieses Szenario berücksichtigt nicht, ob ein kleiner Anteil (wie beispielsweise 5% der MTX-Moleküle) schwach in einer nicht-spezifischen Weise mit den HA-Molekülen wechselwirkt.
Aus vorausgehend beschriebenen Experimenten wird deutlich, dass MTX nicht stark mit HA wechselwirkt und dass, falls eine Wechselwirkung stattfindet, diese nicht spezifisch ist. Ein Weg zum Testen von schwach-bindenden Liganden (10^–3–10^–7 M) hinsichtlich einer nicht-spezifische Bindung ist es, Transfer-NOESY-Experimente durchzuführen. In diesen 2D-Experimenten treten Crosspeaks auf, wenn der Ligand schwach an das Makromolekül HA bindet. Ein Transfer-NOESY-Spektrum von MTX/HA zeigte keine Crosspeaks aufgrund der Bin dung von MTX an HA, wodurch eine vernachlässigbare Wechselwirkung zwischen MTX und HA nahegelegt wird.
Als weitere Überprüfung, ob ein kleiner Teil (beispielsweise 5% MTX-Moleküle) schwach mit den HA-Molekülen in einer spezifischen Art und Weise wechselwirkt. Die Peaks in einem ROESY-Spektrum sollten zeigen, ob sich sogar ein kleiner Anteil MTX-Moleküle im chemischen Austausch zwischen freien und gebunden Zuständen mit HA befindet. Ein 250 ms ROESY-Spektrum zeigte gar keine chemischen Austauschpeaks, wodurch nahegelegt wird, dass nicht einmal ein kleiner Prozentsatz von MTX mit HA wechselwirkt.
5-Fluoruracil
28 zeigt die 600 MHz ¹H NMR-Spektren von 5-FU und 5-FU (1,25 mg/ml, 1,6 mg/ml und 6,4 mg/ml) mit HA (750 kDa, 3 mg/ml) zwischen 70,0 und 8,5 ppm bei 298 K. Anfängliche Experimente zur Untersuchung, ob eine Wechselwirkung vorliegt, wurden mit 50 kDa Hyaluronsäure durchgeführt. Es wurde keine Wechselwirkung zwischen 5-FU und HA beobachtet (Daten nicht gezeigt). Um zu untersuchen, ob eine Wechselwirkung vom Molekulargewicht von HA abhängig war, wurden ferner Titrationsexperimente mit 750 kDa Hyaluronan durchgeführt. Die Konzentrationen des verwendeten 5-FU sind äquivalent zu den HA/5-FU-Adjuvanstherapie-Formulierungsstudien des Kings College London, welche bei der Vorbereitung für die schwedischen klinischen Studien gehandhabt wurden. Diese Konzentrationen wurden konzipiert, um die Konzentrationen zu simulieren, welche verwendet werden beim Mischen von HA/5-FU, im Infusionsbeutel und auch die HA/5-FU-Konzentration, welche im Plasmageschätzt werden. Unglücklicherweise tauschen die Aminresonanzen von 5-Fluoruracil schnell mit dem Massenlösungsmittel Wasser beim pH (8,8 bis 9,1) dieser Formulierungen aus und daher sind die Resonanzen im Spektrum von 5-FU nicht sichtbar. Es ist nur eine Resonanz von CH im Spektrum von 5-FU sichtbar. Ein Absenken des pH-Werts dieser Lösungen ist nicht möglich, da 5-FU bei niedrigen pH-Werten aus der Lösung ausfällt. Diese Spektren zeigen, dass kein Austausch hinsichtlich der chemischen Verschiebung der Position des CH-Peaks von 5-FU stattfindet. Diese Spektren zeigen, dass 5-FU nicht mit dem HA-Molekül wechselzuwirken scheint.

Es wurden Diffusionsexperimente mit 5-FU allein und in Gegenwart von HA durchgeführt. Die Ergebnisse von zweifach durchgeführten ¹H NMR-Diffusionsexperimenten, welche in Tabelle 13 gezeigt sind, zeigen, dass die 5-FU-Diffusion durch das Vorliegen von Hyaluronan nicht verzögert ist, da es einen vernachlässigbaren Unterschied zwischen den Diffusionskoeffizienten für 5-FU allein und 5-FU in Gegenwart von HA gibt. Tabelle 4: NMR-Diffusionskoeffizienten

Probe	HA-Stammlösung (750 kDa, 10 mg/ml)	5-FU (20 mg/ml)	Diffusionskoeffizienten m²/s
4		62,5 μl	9,245 × 10^–10/8,900 × 10^–10
1	300 μl	62,5 μl	8,701 × 10^–10/9,030 × 10^–10
5		80 μl	9,141 × 10^–10/9,204 × 10^–10
2	300 μl	80 μl	8,948 × 10^–10/9,021 × 10^–10
6	–	320 μl	9,004 × 10^–10/8,997 × 10^–10
3	300 μl	320 μl	8,851 × 10^–10/8,833 × 10^–10

2D-Experimente, NOESY und ROESY: 2D-Experimente zu 5-FU sind nicht möglich, da in seinem ¹H NMR-Spektrum nur eine Resonanz sichtbar ist.
Die NMR-Analyse von MTX und 5-FU in Gegenwart von Hyaluronan unter Verwendung von Titrationsexperimenten, Deuterium-Austauschexperimenten, Diffusionsexperimenten und Transfer-NOESY-Experimenten für MTX und Ti trationsexperimenten und Diffusionsexperimenten für 5-FU haben gezeigt, dass keine Wechselwirkung zwischen den chemotherapeutischen Arzneimitteln und Hyaluronan detektiert werden konnte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Einschluss der chemotherapeutischen Arzneimittel durch das Hyaluronan-Netzwerk ausreichend ist, um die Menge an Arzneimittel, welche an die pathologische Stelle abgegeben wird, zu erhöhen. Diese Ergebnisse sind in absoluter Übereinstimmung mit vorausgehenden Untersuchungen unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie, Gleichgewichtsdialyse und CD-Spektroskopie der molekularen Wechselwirkung zwischen Hyaluronan und MTX und 5-FU, welche ebenfalls keine Wechselwirkung detektierten.
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Claims

Verwendung von Hyaluronan zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in Kombination mit oder zur gleichzeitigen Verabreichung mit einem Arzneimittel zur Behandlung einer Krebsart, die arzneimittelresistent ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel ein cytotoxisches oder ein antineoplastisches Mittel ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Hyaluronan ein modales Molekulargewicht von 890.000 Da aufweist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Hyaluronan eine Polydispersität von 1,78 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Hyaluronan ein modales Molekulargewicht von 750.000 Da aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das cytotoxische und/oder antineoplastische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methotrexat, Paclitaxel, 5-Fluoruracil und Cyclophosphamid oder Kombinationen davon.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das cytotoxische und/oder antineoplastische Mittel Methotrexat oder 5-Fluoruracil ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das cytotoxische Mittel Methotrexat ist und das Hyaluronan ein modales Molekulargewicht von 890.000 Da aufweist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das cytotoxische Mittel Paclitaxel ist und das Hyaluronan ein modales Molekulargewicht von 890.000 Da aufweist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das cytotoxische Mittel 5-Fluoruracil ist und das Hyaluronan ein modales Molekulargewicht von 750.000 Da aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Hyaluronan, welches ein modales Molekulargewicht von 890.000 Da aufweist, sowie ein cytotoxisches oder antineoplastisches Mittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das cytotoxische und/oder antineoplatische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methotrexat, Paclitaxel, 5-Fluoruracil und Cyclophosphamid oder Kombinationen davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das cytotoxische und/oder antineoplatische Mittel Methotrexat ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das cytotoxische und/oder antineoplatische Mittel Paclitaxel ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Hyaluronan, welches ein modales Molekulargewicht von 750.000 Da aufweist, sowie ein cytotoxisches oder antineoplatisches Mittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das cytotoxische und/oder antineoplatische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methotrexat, Paclitaxel, 5-Fluoruracil und Cyclophosphamid oder Kombinationen davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das cytotoxische und/oder antineoplatische Mittel 5-Fluoruracil ist.