KR20010113642A - 약물의 효능을 증대시키기 위한 조성물 및 증대 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약물의 효능 증대 방법, 및 보다 특히 세포 또는 생물의 약물 내성 극복에 의한 증대 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 히아루로난과의 공동 투여에 의해 세포독성제 또는 항종양제의 암 세포-사멸 능력이 증대되는, 상기 약제와 히아루로난과의 공동 투여 단계를 포함하는 상기 약제의 유효성 증대 방법을 제공한다.

Description

약물의 효능을 증대시키기 위한 조성물 및 증대 방법{A composition and method for the enhancement of the efficacy of drugs}

임의의 화학요법제 또는 약물의 임상적인 유용성은 상기 약물에 대한 세포의 내성에 의해 심각하게 영향을 받을 수 있다. 따라서, 약물 내성과 관련된 세포 기전 뿐만 아니라 이러한 내성을 극복하는 방법을 밝히고자 상당히 많은 연구가 시도되어 왔다. 지금까지 약물 내성과 관련하여 다수의 추정적인 세포 기전들이 제시되었다. 여기에는

(i) 약물의 감소된 활성화 또는 증가된 탈활성화를 포함할 수 있는, 상기 약물들의 변경된 대사;

(ii) 유효 화합물에 대한 표적 세포 또는 생물의 불침투성;

(iii) 억제된 효소의 변경된 특이성;

(iv) 표적 분자의 증가된 생산;

(v) 세포독성 병변의 증가된 보수; 및

(vi) 또 다른 생화학 경로들에 의한 억제된 반응의 우회가 포함된다.

약물 내성과 관련된 세포 기전들은 복잡하며, 따라서 약물 내성을 극복하기 위해 일반적으로 적용될 수 있는 방법의 개발이 거의 진행되지 않았다. 추가의 복잡한 인자는 약물 내성이 거의 모든 화학요법 용도와 관련된 문제인 동시에, 상기 내성은 다수의 공동작용 약물들을 사용하여 진행되고 연장되는 치료를 요하는 질병들과도 보다 종종 관련이 있다는 것이다.

일례로, 암 치료에서 암 세포의 유효 화합물에 대한 불침투성이 종종 관찰된다. 더욱이, 하나의 약물에 대한 내성이 다른 생화학적으로 별개인 약물들에 대해 내성을 부여할 수도 있음이 종종 발견된다. 이를 다중약물 내성이라 칭하였다. 전형적으로 상기 다중약물 내성 문제에 영향을 받는 약물들로는 독소루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신 및 액티노마이신 D가 있다. 적어도 몇몇 경우에, 다중약물 내성은 MdrI 단백질(P-당단백질이라고도 칭함)이라 칭하는 세포막 약물 유출 운반자의 높은 발현 수준과 이어지는 복잡한 표현형이다. 이러한 세포막 “펌프”는 광범위한 특이성을 가지며 세포로부터 광범위하게 다양한 화학적으로 관련되지 않은 독소들을 제거하는 작용을 한다(문헌[Endicott et al., 1989]을 참조하시오).

최근에, 유사한 기전의 광범위한 약물 내성이 몇몇 미생물에 대해 보고되었다. 이러한 결과는 포유동물 세포의 다중약물 내성 펌프와 유사한 대단히 광범위한 기질 특이성을 갖는 세균 유출 시스템의 존재를 가리킨다(문헌[Nikaido,1993]을 참조하시오).

다중약물 내성을 역전시키는 물질은 내성 변경제(RMA)로서 공지되어 있으며, 인간의 암을 내성으로 만드는 화학요법제의 세포독성을 강화시키는데 중요하다. 많은 약제들이 생체 외에서 RMA로서 동정되었지만, 이들 중 다수는 다중약물 내성의 역전에 필요한 용량에서 생체 내의 높은 독성으로 인해 치료 가능성이 거의 또는 전혀 없다. 예를 들어, 아지드와 같은 대사성 독물은 생체 외에서 다중약물 내성을 역전시킬 수 있으나, 생체 내에서는 쓸모가 없다. 대부분의 다른 고도로 효과적인 RMA들, 예를 들어 PSC833은 상기 MdrI 단백질 상의 약물-결합 부위에 대해 경쟁적인 길항물질로서 작용하는 듯 하다. 이들 약제들 중 다수는 또한 생체 내에서 그들의 유용성을 제한하는 독성을 갖는다. 결과적으로, 약물 내성을 역전시키기 위해서는 대체적인 약리학적 전략을 개발할 필요가 있다.

항종양성 약물의 불량한 종양 흡수를 극복하고 전신적인 독성을 감소시키고자(Singh et al., 1991), 연구가들은 메토트렉세이트(MTX)와 같은 항종양성 약물을 악성 조직의 병소에 표적화(target)하고자 하였다. 화학요법제들을 종양 친화성 때문에 선택된 중합체들에 결합시킴으로써 상기 약제들을 종양에 표적화하려는 다수의 연구들이 이미 시도되었다(Hudecz et al., 1993; Klein et al., 1994; Akima et al., 1996). 그러나, 이러한 중합체들은 유효 약제들을 그들의 표적 조직으로 전달하는 것을 도울 수는 있지만, 상기 약물 내성의 문제점을 반드시 극복할 수 있는 것은 아니다.

종양 표적화제로서 제안되었던 하나의 중합체가 히아루로난(HA)이다. 히아루론산으로도 알려진 HA는 선행 쇄 중합체를 포함하는 천연 폴리사카라이드로, 전 동물계를 통해 어디에서나 발견된다. HA는 대단히 수용성이며, 따라서 상기는 생물계에 이상적인 약물 전달 비히클이다.

본 출원인들은 놀랍게도 본 발명에 이르러 HA가 약물 담체로서 약물의 유용성을 증대시킬 뿐만 아니라 약물 내성의 극복을 돕는 독특한 구조적 및 물리화학적 성질을 나타냄을 발견하였다. ∼1 g/ℓ의 고 농도에서, HA는 분자 질량에 비해 파격적인 부피를 차지하는 경직된 랜덤 코일 형태를 차용하며(Laurent, 1970), 이 수준 이하에서는 거대분자 네트워크에 느슨한 결합을 형성한다(도 1). 임의의 특정한 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 본 발명자들은 HA의 물리적 특징을 기본으로, 폴리사카라이드와 메토트렉세이트와 같은 약제간의 상호 작용 기전이 하기 두 형태들 중 하나 또는 이들 모두를 취할 수 있음을 고려한다:

(i) 화학적 상호 작용(도 2A)

MTX 아민 그룹과 HA 카복실 그룹 간에 이온 결합이 일어날 수 있으나, 이러한 상호 작용은 침전을 유발할 수 있다. 또 다른 가능한 상호 작용은 상기 약물 상의 이용가능한 아민 그룹과 HA의 하이드록실 그룹간의 수소 결합을 통해서이나, 이는 메토트렉세이트가 비교적 수 불용성이므로 가능하지 않을 듯 하며; 따라서 이러한 작용이 일어난다면 매우 약한 상호 작용일 것이다. MTX와 HA간의 가장 그럴듯한 결합은 MTX의 다수의 소수성 그룹들과 HA의 2 차 구조의 소수성 패치간의 소수성 상호 작용을 통해서 일 것이다(Scott et al., 1989).

(ii) 분자 회합

MTX가 특정한 화학 결합을 형성하지 않고 단지 HA 겔에 “혼합된” 경우(도 2B), MTX는 보다 고 농도의 HA에 의해 형성된 3 차원 그물내에 포집될 수 있으며(Mikelsaar and Scott, 1994), 따라서 상기 약물은 투여 후에 상기 HA로부터 간단히 확산된다. HA가 특이적인 세포 수용체에 의해 급속하게 흡수되고 결합되는 경우, 상기 약물은 HA 수용체를 갖는 지점들, 예를 들어 림프절, 간, 골수, 종양 세포에서 보다 고 농도로 방출될 것이다.

다시 임의의 특정한 이론에 얽매이려는 것은 아니지만, HA가 유효 약제의 표적화를 돕는 하나의 기전은 다수의 종양 유형들에서 HA 수용체의 특징적인 과 발현을 통해서일 수 있다(Stamenkovic et al., 1991; Wang et al., 1998). 히아루로난 매개된 운동성에 대한 수용체(RHAMM)인 HA 수용체 CD44 및 ICAM-1은 종양 발생(Bartolazzi et al., 1994) 및 진행(Gunthert 1993; Arch et al., 1992)과 결부되었다. RHAMM은 종양 세포 운동성과 침습의 매개에 있어서 주요 인자이다(Hardwick et al., 1992). RHAMM은 상기 수용체를 종양 형성 및 성장에 잠재적으로 관여하게 만드는 섬유아세포의 H-ras 형질전환에 필요하다(Hall et al., 1995). HA 대사에 가설적으로 결부된 수용체인 ICAM-1은 마우스 비만세포종(Gustafson et al., 1995a)과 같은 형질전환된 조직 및 인간 유방 암종 종양 세포의 기질 및 군(Ogawa et al., 1998)에서 고도로 발현된다.

종양 세포 상에서의 HA 수용체의 증가된 발현은 HA를 화학요법적 치료 섭생에 결부시키는데 합리적이다. 그러나, 지금까지 수득된 매우 제한된 데이터는 실제로 본 발명에 청구된 방법과 별개의 교시를 한다. 예를 들어, HA를 미토마이신 C 및 에피루비신에 화학적으로 착체시킴으로써 제한된 성공을 거두었고; 연구가들은 결장 암종의 성장을 0.8 내지 25%까지 억제시킬 수 있었다(Akima et al., 1996). 클라인(Klein)과 그의 동료들(1994)은 상기 약물의 이식된 래트 유방내로의 증가된 흡수를 보고하였으며, 피셔(Fischer)는 단지 HA를 5-FU와 혼합시킴으로써 방광 암종이 형성되었음을 보고하였다. 마우스 비만세포종은 또한 정맥내로 주입된 HA에 대해 친화성을 가짐이 입증되었다(Gustafson et al., 1995b).

그러나, 일부의 HA 연구가 HA를 약물 담체로서 사용할 수 있음을 나타낸 반면, 이들 연구 중 어느 것도 HA가 세포의 약물 내성을 극복할 수 있음을 보이지 않았다.

발명의 요약

본 발명은 히아루로난과의 공동 투여가 세포 독성제 또는 항종양제의 암 세포 사멸 능력을 증대시키는, 상기 약제를 히아루로난과 공동 투여하는 단계를 포함하는 상기 약제의 유효성 증대 방법을 제공한다.

전형적으로, 세포독성제 또는 항종양제의 히아루로난과의 공동 투여는 상기 약제의 암 세포 사멸 능력을 증대시킨다. 즉, 통상적으로 약물 내성인 암 세포가 상기 약물에 감수성으로 된다.

바람직하게는, 상기 약제는 메토트렉세이트, 패클리탁셀(탁솔) 또는 5-플루오로우라실(5-FU)이다.

본 발명의 두 번째 태양에 따라, 히아루로난 및 세포독성제 또는 항종양제를포함하는 세포독성 또는 항종양성 약학 조성물을 제공한다. 임의로, 통상적인 약학 보조제들을 상기 약학 조성물에 포함시킬 수도 있다.

전형적으로는 상기 약물이 히아루로난 내에 수용되거나 또는 결합된다.

본 발명의 세 번째 태양에 따라, 히아루로난 및 세포독성제 또는 항종양제를 포함하는 약학 조성물의 투여 단계를 포함하는, 상기 약제의 유효성 증대 방법을 제공한다.

이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 약물 내성을 극복하는데 가능한 기전들로 여겨지는 것은 하기와 같다:

1. 히아루로난은 대량 세포 이물 흡수를 통해 내성인 세포 상의 수용체에 결합하거나 상기 세포 내로 들어가, 수용되거나 결합된 약제를 상기 세포 내로 전달함으로써 상기 약제를 치료 활성으로 만든다.

2. 히아루로난은 내성인 세포의 표면 상에 결합하며, 여기에서 수용되거나 결합된 약제가 상기 히아루로난 그물로부터 상기 세포 내로 확산됨으로써 상기 내성인 세포로 전달된다.

3. 히아루로난 및 다른 뮤코폴리사카라이드는 상기 약제를 수용하며 또한 다양한 약제들과 결합할 수도 있는 꼬인 형태를 차용한다.

네 번째 실시태양에 따라, 본 발명은 세포독성제 또는 항종양제를 수용하고/하거나 상기와 결합할 수 있고 대량 세포 이물 흡수를 통해 내성 세포 상의 수용체에 결합하거나 또는 상기 세포 내로 들어갈 수 있는 뮤코폴리사카라이드와 함께 상기 약제를 공동 투여하는 단계(여기에서 상기 약제는 상기 세포 내로 전달되어 치료 활성으로 된다)를 포함하는, 약물 내성의 감소 또는 극복 방법을 제공한다.

이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 히아루로난과 약물을 결합시켜 보다 장 기간동안 세포 내에서 유지되는 약물을 생성시킴으로써, 상기 약물이 연장되게 보다 오래도록 그의 약리학적 효과를 발휘하게 할 수도 있다.

따라서, 본 발명의 다섯 번째 태양에서 상기 약물을, 상기가 단독 투여되는 경우 보다 더 오랜 기간 동안 세포내에 유지되도록 하는 방식으로 상기 약물과 회합하는 뮤코폴리사카라이드와 함께 투여하는 공동 투여 단계를 포함하는, 상기 약물의 유효성 증대 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 약물이 세포독성 약물인 경우, 상기 약물은 보다 오랜 기간 동안 세포 내에서 유지됨으로써, 연장되게 보다 오래도록 그의 독성 효과를 발휘하게 될 것이다.

본 발명의 여섯 번째 태양에 따라, 히아루로난과 약물을 약물 내성 질병의 치료가 필요한 환자에게 공동 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질병의 치료 방법을 제공한다.

하나의 실시태양에서, 본 발명의 상기 태양은 히아루로난과 약물을 포함하는 조성물을 약물 내성 질병의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질병의 치료 방법을 제공한다.

특히, 약물 내성 질병의 치료 방법을 약물 내성 암 환자에게 적용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 암은 메토트렉세이트 또는 5-FU에 내성이다.

보다 바람직하게는, 상기 약물 내성은 다중약물 내성이다.

본 발명의 일곱 번째 태양에 따라, 상기 약물을, 상기 약물이 단독 투여되는경우보다 더 오랜 기간 동안 암 세포 내에서 유지되도록 하는 방식으로 상기 약물과 회합하고/하거나 상기 약물을 수용하거나 상기 약물과 결합할 수 있는 뮤코폴리사카라이드와 공동 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 여덟 번째 태양에 따라, 상기 약물을, 상기 약물이 감소된 위장 독성을 갖도록 하는 방식으로 상기 약물과 회합하고/하거나 상기 약물을 수용하거나 또는 상기 약물과 결합할 수 있는 뮤코폴리사카라이드와 공동 투여하는 단계를 포함하는, 약물의 위장 독성 감소 방법을 제공한다.

본 명세서의 상세한 설명 및 청구의 범위 전체를 통해, “포함하다”라는 용어 및 그의 어미 변화 용어, 예를 들어 “포함하는”은 “비 제한적으로 포함하는”을 의미하며, 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계들을 제외시키고자 하는 것은 아니다.

본 발명은 약물의 효능 증대 방법, 및 보다 특히 세포 또는 생물의 약물 내성 극복에 의한 증대 방법에 관한 것이다.

도 1은 HA가 보다 고 농도에서 메토트렉세이트와 같은 작은 분자들을 수용할 수 있는 3 차원 그물을 형성함을 도시한다. 발병 부위의 HA/약물 표적화는 상기 HA를 특이적인 세포 수용체에 신속히 결합시킨 다음 약물을 상기 HA로부터 확산시키고/시키거나 상기 HA 및 약물 모두를 HA 및/또는 약물 수용체를 통해 공동-내면화(internalization)시킴으로써 수행된다.

도 2A는 메토트렉세이트와 HA간의 가능한 분자 상호작용을 도시한다. 여기에는 (i) 이온 결합, (ii) 수소 결합 또는 (iii) 소수성 결합이 포함된다.

도 2B는 HA 중의 메토트렉세이트의 얽힘을 도식적으로 나타낸다. 보다 고 농도에서 HA는 커다란 꼬인 분자로 나타내는 3 차원 그물을 형성한다. (*)는 단지 454D의 분자량을 가지며 400 내지 900 kD의 HA 분자 내에 쉽게 수용되는 메토트렉세이트를 나타낸다.

도 3은 누드 마우스에서 증식된 인간 유방암 종양의 일반적인 병리 상태를 도시한다. 패널 A는 등급 II-III 인간 종양의 일반적인 형태를 나타낸다. 패널 B는 도 3A에 나타낸 종양의 또 다른 부분에 대한 현미경 사진이다. 이 부분은 주변의 마우스 근육(M), 종양 캡슐(C), 종양의 괴사 영역(N), 침윤 종양(T)을 나타내며, (→)는 암종 세포가 종종 침윤 암종과 연합하여 일렬로 늘어선 “인디안 열”로서 공지된 통상적인 현상을 가리킨다(Carter, 1990).

도 4는 악성 유방 종양의 전형적인 병리학적 특징을 나타낸다. 패널 A는 보다 공격적인 종양 진행 과정을 나타내는 큰 괴사 영역(N)을 갖는 특징적인 침윤 맥관 암종 부분을 나타낸다. 패널 B는 혈액 세포의 존재(→)를 나타내며, 이는 종양이 혈관화되며, 따라서 생육이 가능함을 입증한다. 상기 혈관의 근접 부분에 약간의 맥관(D)이 관찰된다. 패널 C는 핵 단편화로 나타나는 바와 같이, (A)로 표지된 세포 소멸 중인 세포를 나타낸다.

도 5는 누드 마우스에서 증식된 인간 유방암 종양 상의 HA 수용체의 면역조직학적 동정을 나타낸다. 패널 A는 종양의 태아성 암 항원(CEA)의 편재화를 나타낸다. 패널 B는 인간 유방 암종 상의 RHAMM 발현을 나타낸다. 패널 C는 인간 유방 암종 상의 ICAM-1 발현을 나타낸다. HA 수용체인 ICAM-1의 편재화는주로 내피 조직(→) 둘레에서 이루어진다. 패널 D는 인간 유방 암종 상의 CD44 발현을 나타낸다. CD44H는 종양 세포의 약 95%에서 검출되었다(H: 인간 기원 세포; M: 쥐 기원 세포).

도 6은 종양의 메토트렉세이트 표적화에 담체로서 사용된 히아루로난의 분자량 분석 결과를 나타낸다.

도 7은 담체로서 HA를 사용하는, 인간 유방 암 종양의 메토트렉세이트 표적화를 나타낸다.

도 8은 HA 존재하의 간에서의 메토트렉세이트의 증대된 흡수를 나타낸다.

도 9는 약물을 HA와 함께 투여할때 위장관에서 메토트렉세이트의 감소된 흡수를 나타낸다.

도 10은 MTX/HA와 약물/HA 복합 요법의 후속적인 종양 표적화 능력간에 가능한 물리적 상호작용을 도식적으로 나타낸다.

도 11은 생체 외에서의 HA와 5-FU의 결합에 대한 세포독성 상승 효과를 나타낸다.

도 12는 담체로서 HA를 사용하는 인간 유방 암 종양의 5-FU 표적화를 나타낸다.

도 13은 인간에서의 HA의 제거 경로를 나타낸다.

도 14는 위, 뇌 및 폐에서의 5-FU의 증가된 흡수를 나타낸다.

도 15는 혈장 5-FU의 약물 동력학적 제거에 대한 HA의 효과를 나타낸다.

도 16은 실험 종료점을 한정하는 기준을 나타낸다. 기준 2(패널 A) 및기준 3(패널 B)을 도시한다.

도 17은 5-FU/HA 보조 요법의 효능(6 주 치료 섭생): 1 차 종양 부피에 대한 효과를 나타낸다.

도 18은 5-FU/HA 보조 요법의 효능(6 주 치료 섭생): 체 질량에 대한 효과를 나타낸다.

도 19는 5-FU/HA 보조 요법의 효능(6 주 치료 섭생): 암 림프절의 확산 및 새로운 종양의 형성에 대한 효과를 나타낸다.

도 20은 6 개월 효능 연구에 대한 종양의 일반적인 외관을 나타낸다.

도 21은 환자의 생존에 대한 HA/5-FU 보조 요법의 효과를 나타낸다.

도 22는 6 주의 기간에 걸쳐 CMF/HA 요법으로 치료된 마우스의 체 질량 변화%를 나타낸다.

도 23은 6 주의 기간에 걸쳐 CMF/HA 요법으로 치료된 마우스의 종양 부피 변화%를 나타낸다.

도 24는 HO에 용해된 MTX의 H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 이 스펙트럼은 MTX 중의 각 수소 그룹들을 쉽게 확인시킨다.

도 25는 MTX의 HA와의 가능한 상호작용을 나타낸다.

도 26은 600 MHz 및 298 K에서의 히아루론산의 600 MHz 스펙트럼을 나타낸다.

도 27은 298 K에서 MTX 단독, 및 2 나노몰, 10 나노몰, 20 나노몰 및 80 나노몰의 증가량으로 HA(50 kDa)가 첨가되는 MTX의 600 MHz¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.

도 28은 298 K에서 5-FU, 및 70.0 내지 8.5 ppm의 HA(750 kDa, 3 ㎎/㎖)를 갖는 5-FU(1.25 ㎎/㎖, 1.6 ㎎/㎖ 및 6.4 ㎎/㎖)의 600 MHz¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다.

약어

BSA 소 혈청 알부민

Ci 퀴리

CMF 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실

Cyc 사이클로포스파미드

DNA 데옥시리보핵산

Dpm 분당 분해속도

DTTP 데옥시티미딘 트리포스페이트

ECM 세포 외 기질

EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산

ELISA 효소 결합된 면역흡착 분석

FCS 송아지 태아 혈청

5-FU 5-플루오로우라실

GAG 글리코스아미노글리칸

GlcNAc N-아세틸 글루코스아민

GlcUA 글루쿠론산

HA 히아루로난/히아루론산

HABP 히아루로난 결합 단백질

HAase 히아루로니다제

HBSS 행크스(Hanks) 평형 염 용액

HRP 당근과산화 효소

h 시간

K_av겔 내에서 분포에 이용할 수 있는 부피

ℓ 리터

분 분

PBS 인산염 완충 염수

PM 혈장 멤브레인

RHAMM HA-매개된 운동성에 대한 수용체

RMCa 래트 유방 암종

RNA 리보핵산

RT 실온

S-기 합성기

S.D. 표준 편차

SEM 평균의 표준 오차

V_e용출 부피

V_o공극 부피

V_t전체 부피

TGD 종양 성장 지연

TDT 종양 배가(doubling) Ti

이제 본 발명을 단지 하기의 비 제한적인 실시예만을 참고로 추가로 개시할 것이다. 그러나, 하기 실시예들은 단지 예시적인 것이며, 상술한 본 발명의 일반성을 어떠한 방식으로도 제한하고자 하는 것이 아님은 물론이다. 특히, 본 발명을 암과 관련하여 상세히 개시하겠지만, 본 발명의 발견들이 암 치료로 국한되는 것은 아님은 물론이다. 예를 들어, 세포독성제를 다른 증상들의 치료에 사용할 수 있으며; 메토트렉세이트는 중증 류머티스성 관절염의 치료에 널리 사용된다.

실시예 1

누드 마우스에서의 인간 유방암 종양의 확인 및 동일 계에서의 유방 종양에 대한 히아루로난 수용체의 동정

인간 유방암에 대한 적합한 동물 모델을 세우기 위해서, 병리학적 시험을 수행하는 것이 필요하였다. 종양을 생리학적으로 생육 가능하게 하기 위해서는 혈관신생이 필수적인데, 그 이유는 모세관 네트워크가 상기 종양에 영양분을 공급하기 때문이다. 혈관신생, 관 침윤, 괴사, 세포소멸, 높은 유사분열 지수 및 핵 이상의 존재는 유방 암종의 모든 특징이다.

인간 유방 암종 세포주 MDA-MB-468(아메리칸 티슈 컬쳐 콜렉션, Rockville, U.S.A)을 HA 수용체들인 CD44, RHAMM 및 ICAM-1의 발현을 기준으로 선택하였다. 세포들을 통상적으로 증식시키고 10% 송아지 태아 혈청(FCS) 및 10 ㎍/㎖의 젠타마이신이 보충된 라이보비츠(Leibovitz) L-15 배지에서 175 ㎠의 배양 플라스크에서 단층으로 계대배양하였다. 마우스 내에 주입하기 위해서, 세포들을 100% 융합성으로 증식시키고, 0.05% 트립신/0.01% EDTA 용액으로 트립신 처리하고, 벡크만 TJ-6 벤치 원심분리기(Beckman, Australia)에서 400 g에서 10 분간 원심분리에 의해 2 회 세척하고, 모델-ZM 쿨터 계수기(Coulter Electronics, England)를 사용하여 세포 수를 세고, 혈청-비 함유 라이보비츠 L-15 배지에 1 x 10⁸세포/㎖로 재현탁시켰다.

6 내지 8 주된 85 마리의 흉선없는 Balb/c/WEHI 암컷 누드 마우스(Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Melbourne, Australia)를 특정한병원균이 없는 조건 하에서 멸균된 음식과 물을 자유롭게 공급하면서 유지시켰다. 1000 만개의 MDA-MB 468 세포를 상술한 바와 같이 제조하고, 각 마우스의 젖꼭지 아래 지방 패드 내로 직접 주입하였다. 종양 성장이 마우스의 96%에서 관찰되었다. 종양 성장을 가시적으로 검출할 수 있는 경우, 상기 종양의 진행을 종양 부피를 매주 측정함으로써 감시하였다. 종양 부피를 하기 식을 사용하여 3 개의 직교하는 직경들로부터 계산하였다:

<수학식>

V=(1/6)_p(d₁d₂d₃)

상기 식에서,

V는 종양 부피(㎣)이고,

d₁은 종양의 제 1 직경(㎜)이고,

d₂는 종양의 제 2 직경(㎜)이고,

d₃는 종양의 제 3 직경(㎜)이다(Lamszus et al., 1997).

종양 접종 8 주 후에, 평균 종양 크기는 482.2 ㎣(SEM, 39.8 ㎣)이었다.

종양 유발 후 대략 8 주 째에, 2 마리의 종양 함유 마우스에게 치사량의 넴부탈을 공급하였다. 상기 마우스를 죽인지 3 분 이내에, 종양을 외과적으로 회수하고 즉시 10% 완충된 포르말린에 12 시간 동안 고정시켰다. 상기 고정된 종양을 일련의 70 내지 100% 에탄올 세척 액에서 밤새 탈수시킨 다음 파라핀에 묻고 이로부터 2 내지 4 ㎛의 조각을 잘라내었다. 상기 조각들을 슬라이드 상에 놓고, 왁스질을 제거하고, 물에 넣었다. 슬라이드를 인산염 완충 염수(PBS)에서 3 x 5 분 세척하였다. 이종항원 친화성 단백질을 10% 송아지 태아 혈청과 함께 10 분간 배양한 다음, PBS로 세정함으로써 차단시켰다. 검출용 항체를 실온(RT)에서 60 분간 적용시켰다. 항혈청 또는 항체들을 RHAMM(Applied Bioligands Corporation, Manitoba, Canada), ICAM-1, CD44v6, CD44v10, 전체 CD44H 및 CAE에 대향시켰다. 다른 검출 항체들을 모두 지메드(Zymed, California, U.S.A)로부터 구입하였다. 슬라이드를 PBS에서 3 x 5 분 세척하고 내생적인 퍼옥시다제 활성을 0.3% H₂O₂/메탄올에 20 분간 담가 차단시켰다. 추가로 PBS 세척한 다음, 퍼옥시다제-접합된 돼지 항-토끼 2 차 항혈청(Dako, Denmark)을 RT에서 60 분간 적용시킨 다음 PBS로 3 x 5 분 세척하였다. 시그마 패스트(Sigma Fast) DAB(3,3'-디아미노벤지딘, Sigma, St. Louis, U.S.A) 정제를 제조사의 지시에 따라 제조하고 DAB 용액을 RT에서 5 내지 10 분간 적용하였다. 슬라이드들을 10 분간 수돗물로 세척하고, 헤마톡실린으로 대조염색시키고, 탈수시켜 올려놓았다.

상기 헤마톡실린 및 에오신-염색된 유방 종양 부분들에 대한 검사는 생육가능한 종양들과 관련된 통상적인 특징들 모두가 도 3 및 4에 도시된 바와 같이 입증되었으며, 이는 동물 숙주가 등급 II의 인간 유방 암종을 성공적으로 유지함을 확인시킨다. 악성 종양의 특징인 여러가지 특징들이 존재한다. 표지된 슬라이드의 부분(B)이 이러한 특징들을 나타낸다. 모든 악성 종양의 병리학적 특징들, 즉 i) 높은 핵/세포질 비율, ii) 수척한 크로마틴 및 핵소체, iii) 불규칙적인 핵막이 (B) 부분에서 관찰된다.

등급 II-III 수준의 종양이 누드 마우스 모델에서 유지될 수 있는 것으로 결론지었다. 등급 II-III 수준의 종양은 일반적으로 약 47%의 예후 생존율을 제공한다(Bloom and Richardson, 1957). 등급 II-III 수준의 종양은 i) 나타난 종양 부분 전체를 통해 관찰되는 보통의 핵 다형성, 높은 크로마틴 및 유사분열 활성의 특징; 및 ii) 맥관 형성이 거의 없거나 전혀 없음을 특징으로 한다. 넓은 괴사 영역(N)은 종양 확산과 상관될 수 있으며, 이는 보다 공격적인 침습 과정을 시사한다(Carter, 1990). 종양의 침윤 테두리를 (→)로 나타낸다.

상기 실험의 주 목적은 이들 마우스에서 확립된 종양들의 조직학적 및 세포학적 양상이 천연 인간 숙주에서의 상기와 같은 종양들에 대한 양상에 필적할만함을 확인시키는 것이었다. 이러한 목적을 성취함에 있어서, 본 발명자들은 또한 마우스의 종양 세포들이 인간 기원의 것이며 이들 세포가 RHAMM, CD44 및 추정적인 ICAM-1과 같은 고도로 관련된 HA 수용체들을 발현함을 밝혔다. 종양 표적화는 수용체-매개된 내면화 또는 결합을 통해서 일어날 수 있다고 가정되었기 때문에, HA 수용체인 ICAM-1, CD44 및 RHAMM의 발현을 확인하는 것이 필요하였다. 도 5B 내지 D는 이들 수용체들이 모두 존재함을 입증한다. 표 1은 시험된 2 개의 종양 상에서의 수용체 발현 정도를 열거한다.

인간 기원의 종양 세포는 상기 종양 및 주변 조직을 인간-특이적인 암 마커로 염색시킴으로써 확인하였다. CEA의 존재는 상기 종양이 인간임과 동시에, 상기 종양이 쥐 숙주의 심혈관계에 의해 유지됨을 분명히 입증하였다(도 5A). 다클론성 CEA 항혈청을 선택하였는데, 그 이유는 상기가 오로지 인간 CEA와 독점적으로 반응하기 때문이다. 이러한 현미경 사진은 상기 종양이 갈색 염색에 의해 나타나는 바와 같이 전적으로 인간 기원(H)임을 입증하는 것이다. 주변의 종양 캡슐 및 지방 조직은 항혈청에 의한 염색의 결여가 가리키는 바와 같이 확실히 마우스 기원이다. 갈색 염색은 종양 세포 상에서의 RHAMM의 고 발현을 입증한다. 최대 강도의 염색은 조직 괴사 및 종양 침윤 주변의 영역 상에서 볼 수 있다.

실시예 2

메토트렉세이트/히아루로난 복합 약물의 제조 및 주입

누드 마우스 모델의 유용성이 확립되었으면, 이제 상기를 HA/MTX 제제의 유효성을 시험하기 위해 사용할 수 있다.

분말 MTX를 0.5% w/v 탄산 나트륨(pH 9)에 용해시켜 MTX의 모액을 제조하고, 0.9% w/v NaCl을 사용하여 농도를 24.5 ㎎/㎖로 만들었다. 상기 모액을 0.22 ㎛ 필터에 여과시켜 확실히 멸균시킨 후에 [³H] 메토트렉세이트를 가하고 주입 등급의 염화 나트륨을 사용하여 주입 농도로 희석하였다. MTX의 약물 동력학에 대한 비교 데이터는 이미 누드 마우스 및 인간에 대해서 공개되어 있으며(Inaba et al., 1988), 이를 본 연구의 고안에 이용하여 인간 치료 용량을 가능한한 가깝게 모사하였다. 50 ㎕ 중의 MTX 15 ㎎/㎏을 전달하기 위해서 개별적인 주입액을 개별적인 마우스 체중에 따라 제조하였다(60 ㎏의 평균 체중에 대해 0.42 ㎎/㎏의 인간 치료 용량과 동량; Inaba et al., 1988).

건조된 HA(모달 Mr 8.9x10⁵kDa)를 24.5 ㎎/㎖의 MTX 모액의 일부에 가하고 와동시키면서 밤새 용해시켜 21 ㎎/㎖의 최종 농도를 얻었다. 확실히 멸균시키기 위해서 젠타마이신을 50 ㎍/㎖의 농도로 가하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. [³H] 메토트렉세이트를 가한 다음, HA/MTX 모 혼합물을 주입 등급의 염화 나트륨을사용하여 주입 농도로 희석하였다. 50 ㎕ 중의 MTX 15 ㎎/㎏ 및 HA 12.5 ㎎/㎏을 전달하기 위해서 주입액을 마우스 체 질량에 따라 개별적으로 제조하였다. 체내로 주입된 상기 HA의 양에 따라, 실험 기간 동안 포화 동력학이 관찰될 것이다(Fraser et al., 1983).

HA가 메토트렉세이트/HA 주입 혼합물을 제조하는 동안 그의 분자량을 유지하게 하기 위해서, 상기 주입액을 1.6 ㎝ x 70 ㎝, 샘플 크기 2 ㎖, 유량 18 ㎖/h 및 분획 크기 2 ㎖의 컬럼 명세를 갖는 세파크릴(Sephacryl) S-1000 크기 배제 겔(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 상에서 분석하였다. 도 6은 HA가 혼합 과정 동안 그의 분자량을 유지함을 나타낸다.

마우스 40 마리를 랜덤하게 두 그룹으로 분할하였다. 그룹 I에는 MTX 만을 공급하고, 그룹 2에는 MTX/HA 복합 요법을 제공하였다. 동물들을 주입 상자에 개별적으로 놓고 주입액을 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. MTX 15 ㎎/㎏ ± HA 12.5 ㎎/㎏ 중에 함유된 삼중 수소화된 메토트렉세이트(평균 주입된 분해/분(dpm) ± 상기 평균의 표준 오차(SEM): 19,159,146 ± 1,336,819)를 각 주입액으로 전달하였다. 마우스를 뇨를 수거할 수 있도록 부드럽고 비 습윤성인 플라스틱 울타리내에서 개별 수용하였다. 주입 후 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 또는 8 시간 째에 마우스를 넴부탈(Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australia) 0.1 ㎖을 복강내 주입하여 마취시키고, 주사 바늘을 사용하여 심장 또는 대 혈관으로부터 채혈하였다. 채혈 후에, 상기 동물들을 경부 탈구에 의해 죽였다.

혈액을 EDTA-코팅된 유리 관으로 옮기고 14,000 g에서 10 분간 원심분리시켜 혈장을 준비하였다. 30% v/v 과산화 수소 100 ㎕로 탈색시키고 HiSafeII 섬광제 3 ㎖을 가한 후에 50 ㎕의 분액들에서 방사능을 카운트하였다. 화학- 및 광루미네슨스를 극복하기 위해서, 샘플들을 상기 샘플의 공급원에 따라 3, 7 또는 20 일의 기간에 걸쳐 왈락(Wallac) 1410 β-카운터에서 2 분간 카운트하였다. 상기 카운트 사이의 기간 동안 샘플들을 주변 온도의 암실에서 보관하였다. 모든 계산은 화학- 및 광루미네슨스가 모두 제거된 안정화된 샘플에 대해서 수행하였다.

혈장 중의 주입된 MTX의 퍼센트를 측정하기 위해서, 하기 표준 식을 사용하여 각 마우스의 전체 혈장 부피(㎖)를 계산할 필요가 있었다:

<수학식>

마우스 질량(g) x 마우스혈액 부피(0.07) x 혈액의 혈장 비율(0.59)

이어서 혈장 중의 주입된 MTX의 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다.

<수학식>

(혈장 부피(㎖) x 혈장의 dpm/㎖ x 100)/주입된 전체 dpm = 혈장중의 주입된 MTX%

혈류로 전달된 MTX의 양을 정확하게 정량화하기 위해서, 꼬리 정맥 상의 주입 부위를 절개하고 MTX를 정량분석하였다. 주입 부위에 남아있는 평균 MTX 주입%는 3.78%(SEM: 0.57%)였다. 혈류로 전달된 MTX(조직 및 종양에 분배시키는데 이용할 수 있는 MTX)의 양을 하기와 같이 계산하였다:

<수학식>

혈류로 전달되는 MTX의 양(Dpm) = 주사기의 질량 차(㎎) x 주입 물질의 Dpm/㎎ -주입 부위에 남아있는 DPm

이후부터는 혈류로 전달된 MTX의 양을 “주입된 용량”이라 칭할 것이다.

기관 및 종양 질량에서 샘플 집단과 표준에서 약간 변형된 집단 간의 정확한 비교를 위해서, 체 기관 및 종양 및 체액 중의 MTX의 농도를 주입된 용량/조직 g의 %로서 나타내었다.

주입 부위에 남아있는 평균 MTX 주입%는 3.78%(SEM: 0.57%)이었다. 이러한 변화를 표준화시키기 위해서, 종양 및 조직에서 발견된 dpm%를 주입된 dpm - 주입 부위에 남아있는 것으로 발견된 dpm의 %로서 계산하였다. 이러한 양을 이후부터는 이용가능한 dpm 또는 이용가능한 메토트렉세이트라 칭한다. 결과를 표 2에 요약한다.

약물을 HA와 공동 주입한 경우 MTX의 혈장 수준은 통계학적으로 의미있는 차이가 없었다. MTX의 전체 약물 동력학은 변경되지 않은 채로 유지되었으며, 이때 MTX 혈장 수준은 정맥 내 투여 후 0.5 내지 2 시간 내에 최대값에 도달하였다(MIMS, 1997).

가능하다면 상기 비 습윤성 플라스틱 울타리로부터 주사기를 사용하여 뇨를 수거하였다. 상기 뇨를 14,000 g에서 10 분간 원심분리시켜 등명화하였다. 그의 방사능 함량을 8 내지 30 ㎕ 범위의 샘플에 3 ㎖의 HiSafeII 섬광제를 가한 후에 측정하였다. 각각의 마우스에 의해 생산된 뇨의 부피를 정확하게 정량분석함에 있어서 기술적인 어려움에도 불구하고, 본 발명자들은 하기 식에 의해 뇨 중의 주입된 MTX 용량%를 계산하였다:

<수학식>

(수거 시간(h) x 42㎕ x 뇨의 dpm/㎕ x 100)/주입된 전체 dpm = 뇨 중의 주입된 MTX%

배뇨율의 차이로 인해 각각의 마우스로부터 뇨를 수거하는 것은 가능하지 않았다. 3 개 이상의 뇨 시편을 시간/처리 당 입수할 수 있었던 경우, 상기 시점에서의 데이터에 대해 비 파라메트릭한 통계 분석을 수행하였다. 투여 후 1 시간 째에 MTX/HA를 투여한 마우스의 뇨 중에는 50%(p=0.043) 이상의 MTX가 존재하였다(표 2 참조).

상기 마우스를 죽인 직후에, 종양, 간, 심장, 비장, 방광, 좌측 및 우측 신장, 자궁, 폐, 위, 장, 뇌 및 림프절을 절제하고 전체 방사능에 대해 분석하였다.각 조직의 총 방사능을 22 ℃에서 36 시간 동안 조직 100 내지 400 ㎎을 OptiSolv(ACC, Melbourne, Australia) 3 내지 6 ㎖에 용해시킴으로써 측정하였다. 용해의 완료 시, 조직 중의 방사능을 HiSafeIII 섬광제 10 ㎖을 가한 후에 카운트하였다. 다시 화학- 및 광루미네슨스를 극복하기 위해서, 샘플들을 샘플 공급원에 따라 3, 7 또는 20 일의 기간에 걸쳐 왈락 1410 β-카운터에서 2 분간 카운트하였다. 상기 카운트 사이의 기간 동안 샘플들을 주변 온도의 암실에서 보관하였다. 모든 계산은 화학- 및 광루미네슨스가 모두 제거된 안정화된 샘플에 대해서 수행하였다. 숫자들은 중간값 ± SEM(n=8)을 나타낸다.

간, 비장 및 신장과 같이 대사적으로 활성인 기관들이 증가된 종양 표적화의 임의의 긍정적인 태양을 방해할 수 있는 높은 수준의 약물 표적화를 경험하지 않도록 하는 것이 중요하였다. 표 2는 시험된 다양한 시점들에서의 각 조직의 메토트렉세이트 흡수를 열거한다.

만-휘트니 랭크 총계 시험 및 스튜던츠 τ-시험을 이용한 경우 MTX를 HA와 공동 투여했을 때 MTX 농도/조직 g에 있어서 통계학적으로 의미있는 차이는 없었다. 각 시점에서 적은 동물 수로 인해, 상기 만-휘트니 시험은 하나의 데이터 값이 중복된 경우 통계학적으로 무효했으나, 간, 자궁 및 장에서 뚜렷한 경향을 관찰할 수 있었다.

간에서, 도 7에 나타낸 바와 같이 MTX가 HA와 결합된 경우 상기 MTX의 흡수가 단기간에 증가된 것으로 나타났다.

30 분 및 1 시간 째에 상기 간은 각각 65% 및 26%의 MTX 농도의 중간 증가율을 나타냈다. 2 시간 째에, 처리에 관계없이 간 중의 MTX의 양에는 차이가 없었다. 도 8에 나타낸 바와 같이 관심있는 경향은 4 시간 후에 명확해졌으며, MTX를 HA와 공동 주입한 경우 상기 4 시간 째에 간에서 적은 MTX가 발견되었다(4 시간: 68% 미만의 MTX 및 8 시간: 75% 미만의 MTX).

장에서 현저한 경향이 있었으며, 상기 장에서 HA와 MTX를 복합 투여한 결과 도 9에 나타낸 바와 같이 매 시점에서의 약물의 흡수가 감소하였다.

장을 완전히 균질화시킨 다음, 대략 400 ㎎의 조직을 22 ℃에서 24 시간 동안 3 내지 6 ㎖의 OptiSolv에 용해시키고, 이어서 10 ㎖의 Hisafe-3 섬광제를 가하였다. 화학- 및 광루미네슨스를 극복하기 위해서, 샘플들을 샘플 공급원에 따라 3, 7 또는 20 일의 기간에 걸쳐 왈락 1410 β-카운터에서 2 분간 카운트하였다. 상기 카운트 사이의 기간 동안 샘플들을 주변 온도의 암실에서 보관하였다. 모든 계산은 화학- 및 광루미네슨스가 모두 제거된 안정화된 샘플에 대해서 수행하였다. 숫자들은 중간값 ± SEM(n=8)을 나타낸다.

짝을 이룬 쌍에 대해 비 파라메트릭한 랜덤화 시험을 사용하여 데이터를 분석한 결과 HA의 공동 투여가 약물의 GI 관내로의 분비를 현저하게 감소시키는 것으로 나타났다(p=0.031, 1-테일드 시험).

MTX의 농도 감소 범위는 43 내지 67%이었다. 짝을 이룬 쌍에 대한 비 파라메트릭한 랜덤화 시험은 HA의 공동 투여가 약물의 위장관내로의 분비를 현저하게 감소시킴을 보였다(p=0.031, 1-테일드 시험).

폐에서, HA를 공동 투여한 4 시간 째에 현저하게 적은 MTX가 존재하였으며,이때 중간 감소율은 52%였다(p=0.014). 그러나, 다른 시점에서는 차이가 없는 것으로 나타났으며, 따라서 이러한 관찰에 대한 유의수준은 불명확하다.

비장, 자궁, 뇌, 심장, 림프절, 위 및 신장에서는 관찰가능한 경향이 탐지되지 않았다.

메토트렉세이트의 종양 세포에 대한 HA 표적화에 2 개의 가능한 기전이 존재한다(도 10).

HA를 MTX와 결합시켰을 때 현저한 표적화 효과가 나타났다(도 7). 약물의 종양 잔류에서 최대의 상대적인 증가는 0.5 시간(평균 24% 증가), 1 시간(평균 30% 증가) 및 2 시간(평균 119% 증가) 째에 관찰된 반면, 4 시간 및 8 시간째의 증가는 무시할 정도였다. 작은 집단 크기 및 상기 데이터의 비 파라메트릭한 분포로 인해, 만-휘트니 랭크 총계 시험을 사용하였으며, HA를 공동 주입한 경우 약물의 종양 흡수가 현저하게 증가된 것으로 밝혀졌다. 1 시간 째에 통계학적 유의수준은 p=0.021이고, 2 시간 째에 p=0.050이었다. 다른 시점들은 통계학적으로 현저한 차이를 나타내지 않았으나, MTX 농도/종양 g의 경향은 HA와 공동 주입 시 일관되게 보다 컸다.

도 7에 나타낸 데이터는 HA와의 공동 투여가 주입 후 30 분내에 종양에 의한 MTX의 흡수를 크게 증가시켰음을 분명히 입증한다. 더욱이, 공동 투여는 또한 상기 종양 내의 약물 농도가 연속적으로 감소하는 동안 분명하게 보다 높은 수준을 지속한다. 1 시간 째에 상기 차이는 비 파라메트릭한 시험에 의해 평가 시p=0.021(n₁=8, n₂=8), 및 2 시간 째에 p=0.05(n₁=8, n₂=8)로 유의수준이었다.

포집된 MTX를 함유하는 HA는 수용체(CD44 및/또는 I-CAM-1)에 결합하고 수용체-매개된 세포 이물 흡수를 통해 내면화되며, 따라서 상기 약물을 종양 세포 내로 방출한다.

HA 분자 망은 외부로의 확산에 방해물로서 작용할 것이며, 따라서 HA가 수용체(CD44, RHAMM 및/또는 ICAM-1)에 결합한 후에, 수용된 MTX는 종양 세포내로 확산될 수 있다. HA 매트릭스에 의해 세포 표면 상에서 유지되는 동안 MTX는 하부 세포 내로의 MTX 수송에 통상적으로 이용되는 능동 수송 기전에 대한 유용성이 증가된다.

목적하는 활성 부위 이외의 조직으로의 약물의 분배 및 부작용들은 또한 HA와의 회합에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, HA는 수용체-매개된 세포 흡수 및 간(80-90%), 신장(10%), 비장 및 골수에서의 대사에 의해 혈류로부터 통상적으로 제거되며, 일부 소수는 최종 2 개 부위에서 변형된다. 예견되는 바와 같이, HA는 적어도 단 시간 동안 상기 약물의 간 전달을 증가시키는 듯 하다. 30 분 및 1 시간 째에 간은 각각 65% 및 26%의 MTX 농도의 중간 증가율을 나타냈다. 2 시간 째에는 처리에 관계없이 간 중의 MTX의 양의 변화가 관찰되지 않았다. 관심을 갖는 경향은 4 시간 후에 명백해지는데, 이때 HA와 공동 주입 시 간에서 적은 MTX가 발견되었다(4 시간: 68% 미만의 MTX 및 8 시간: 75% 미만의 MTX). 정맥내 투여 후 MTX는 체 액 중에 널리 분포되며, 수개월간 간에서 유지될 수 있고(McEvoy, 1988); 따라서, HA와의 공동 주입 시 4 시간 및 8 시간 째에 감소된 간의 MTX의 중간 농도는 약물 동력학적 제거 경로의 균형이 변경되었음을 가리킬 수 있다. HA가 간 내피 세포(LEC) 내에서 급속히 대사된다고 생각하는 경우, HA와 공동내면화된 MTX는 간 시누소이드 내층 세포 내에서 방출되며, 여기에서 담즙으로 분비되는 간세포 내에 이어서 위장관 내로 확산되거나 또는 체액내로의 추가적인 분배 및 배뇨, 또는 이들 모두를 위해 다시 순환될 수 있다.

단 시간 간-표적화에 치료 이점이 있을 수 있다. 간 전이의 경우에, MTX에 대해 빠르고 많은 노출이 유리할 수 있으며, 관찰된 표적화는 단지 1 시간 동안 이므로, 이는 임의의 장기간 독성 문제들을 중화시킬 것이다. 간 표적화를 생물 활성화가 필요한 약물, 예를 들어 미토마이신 C, 독소루비신과 함께 사용할 수 있으며, 이때 상기 약물/HA 혼합물은 LEC를 표적화할 것이다. 상기 LEC 중에 농축된 불활성 약물을, 활성화를 위해 간세포 내로 확산시킬 수 있으며, 따라서 상기는 활성화 표적화 기전으로서 작용할 것이다.

MTX에 대한 하나의 주요 독성 부위는 위장관이다. MTX를 HA와 공동 투여하여 GI 관으로 전달되는 약물의 양을 현저하게 감소시켰다. 소화관에서의 감소된 MTX 농도와 관련하여 다수의 기전들이 있을 수 있다.

메토트렉세이트는 매우 작은 분자로, 통상적으로 대부분의 모세관 벽을 통과할 것으로 예상되는 반면, HA와의 회합은 상기 경로를 통한 상기 약물의 통과를 크게 감소시킬 것이다.

간 내피 세포에서 HA의 급속한 분해로 MTX가 간 내로 급속히 방출되고 혈류로 반환되며, 여기에서 상기는 1 시간 째에 나타나는 바와 같이 증가된 신장 제거를 겪을 것이며 50% 이상의 MTX가 MTX/HA 제제를 투여한 마우스의 뇨에 분비되었다.

신체로부터 주요한 MTX의 최종 제거 경로는 배뇨이다. HA를 갖는 약물의 신장 함량의 증가는 거의 없는 듯하나, 본 발명자들은 다른 증거로부터 HA가 신장에 의해 흡수되어 매우 신속히 대사되며, 따라서 그의 체류 시간이 짧아지고 회합된 약물이 뇨 내로 급속히 방출될 것이라 여긴다.

결론

본 실시예에 보고된 결과들은 치료제들을 히아루로난과 함께 투여하여 목적하는 표적 병리 조직으로 이들을 선택적으로 전달하고; 따라서 상기 지점에서 보다 높고 보다 효과적인 농도를 얻으려는 제안을 검토하기 위한 임상전 연구의 첫 번째 단계를 나타낸다. 이 경우에, 인간 유방암 및 다른 인간 악성 종양들, 및 류머티스성 관절염에 대한 현행 치료 섭생에 널리 사용되는 세포독성 약물인 메토트렉세이트를 히아루로난과 함께 또는 상기 없이 정맥내 경로로 투여함으로써 연구하였다.

본 발명자들은 누드 마우스 모델이 살아있는 숙주에서 인간 유방암의 연구, 및 질병 조직의 부위로 치료제를 배향시켜 그의 유리한 효과를 증대시키기 위해 HA를 사용함에 있어서 일부 근본적인 문제들을 해결하는데 특히 적합한 모델임을 발견하였다. 본 발명의 결과는 HA와의 특정한 회합 형태를 보이지 않는 작은 분자량을 갖는 약물에 의해 성취되었으며, 이는 HA가 혈류내로 주입 시 여전히 상기와 같은 약물을 병리 조직에 증가된 양으로 전달할 수 있음을 입증한다. 이러한 연구는 체내에 만연한 조건 하에서 MTX가 HA와 충분하게 유지되어 인간 유방암으로의 전달을 현저하게 증대시킬뿐만 아니라 위장 독성의 바람직하지 않은 부작용을 잠재적으로 감소시킴을 입증한다.

실시예 3

패클리탁셀/히아루로난 복합 약물의 제조 및 주입

누드 마우스 모델이 HA/패클리탁셀에 유용한 것으로 입증되었으면, 이제 상기를 다른 화학요법에 대한 유효성을 시험하는데 사용할 수 있다. 패클리탁셀(또한 탁솔로도 공지됨)은 그의 치료학적 중요성으로 인해 사용이 결정되었다.

패클리탁셀은 서부 주목인 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)로부터 단리되며(Wani et al, 1971) 진행된 난소 및 유방암에 대해 임상적으로 활성이고(Rownisky et al, 1990; McGuire et al 1989) 현재 다양한 다른 암들의 치료에 임상 시험 중이다. 그러나, 패클리탁셀과 관련된 주요 문제점은 그의 극단적인 친지성 및 그에 따른 불량한 수 용해도이다. 안전하고 생체 적합성인 제형을 발명하기 위한 광범위한 노력과 함께 상기 문제점을 해결하고자 노력하여 패클리탁셀 동족체 및 전구약물을 합성하게 되었다. 지금까지 어떠한 전구약물도 임상적인 개발을 보증하는 충분한 안정성, 용해도 또는 활성을 나타내지 않았다(Mathew et al 1992; Vyas et al 1993). 그러나, 반합성적인 탁산이 패클리탁셀보다 더 큰 용해도와 효능을 보이고 있으며(Bissery et al 1991) 하나의 탁소테레 형태가 인간 시도에 착수되었다(Bisset et al 1993).

정맥내 전달에 사용되는 현재의 패클리탁셀의 임상적 제형은 에탄올과 크레모포어(Cremophor) EL을 1:1(v/v)의 비로 상기 약물 6 ㎎/㎖과 함께 사용한다. 크레모포어 EL은 실제로 폴리에톡실화된 피마자유로, 등명하고 유질 점성인 황색 계면활성제이다. 안정성 연구는 원래의 제형이 4 ℃에서 5 년의 저장 수명을 가짐을 보였다. 상기 제제를 사용전에 0.9% 염수 또는 5% 덱스트로즈로 0.3 내지 1.2 ㎎/㎖의 농도로 희석하며, 이러한 조건 하에서 상기 물질의 물리적 및 화학적 안정성은 약 27 시간이다. 그러나, 상기 비히클의 이러한 수준으로의 희석은 설정된 지침 밖에서 사용되는 경우 침전하는 것으로 입증된 과포화된 용액(Adams et al 1993)을 생성시킬 수 있다. 따라서, 미립자 주입에 대한 보호 수단으로서 투여 중 직렬 필터가 요구된다. 또한 희석된 패클리탁셀 용액을 제조 후 24 시간 내에 사용할 것이 권장된다. 상기 용액의 혼탁이 또한 관찰되었으며, 이는 주입 주머니 및 튜빙으로부터 크레모포어에 의한 가소제의 추출에 기인하였다(Waugh et al 1991).

앞서 언급한 물리적인 불안정성의 문제 이외에, 크레모포어와 관련된 가장 중대한 문제는 상기가 약리학적 활성을 갖는 것으로 보고되었다는 사실이다. 다양한 약물들, 예를 들어 사이클로스포린, 타크로리무스 및 테니포시드가 크레모포어 EL을 사용하여 투여된다. 그러나, 패클리탁셀과 함께 제공된 크레모포어 EL의 용량은 어떠한 다른 시판 약물에 대해서 보다도 더 높다. 크레모포어는 심각하거나 또는 치명적인 과민성 삽화를 일으킴이 관찰되었다. 비히클 독성은 또한 패클리탁셀을 동물 또는 인간에게 고속 주입할 때 관찰되는 치명적이거나 생명 위협적인 과민성 반응들의 주된 원인이 될 수도 있다(Dye & Watkins 1980; Lorenz et al 1977; Weiss et al 1990).

패클리탁셀의 모액을 제조하고 개별적인 주입액을 개별적인 마우스 체 질량에 따라 제조한다.

건조된 HA(모달 Mr 8.9x10⁵kDa)를 24.5 ㎎/㎖의 패클리탁셀 모액의 일부에 가하고 와동시키면서 밤새 용해시켜 21 ㎎/㎖의 최종 농도를 얻었다. 확실히 멸균시키기 위해서 젠타마이신을 50 ㎍/㎖의 농도로 가하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. [³H] 패클리탁셀을 가한 다음, HA/패클리탁셀 모 혼합물을 주입 등급의 염화 나트륨을 사용하여 주입 농도로 희석한다. 50 ㎕ 중의 패클리탁셀 15 ㎎/㎏ 및 HA 12.5 ㎎/㎏을 전달하기 위해서 주입액을 마우스 체 질량에 따라 개별적으로 제조하였다. 체내로 주입된 상기 HA의 양에 따라, 실험 기간 동안 포화 동력학이 관찰될 것이다(Fraser et al., 1983).

HA가 패클리탁셀/HA 주입 혼합물을 제조하는 동안 그의 분자량을 유지하게 하기 위해서, 상기 주입액을 1.6 ㎝ x 70 ㎝, 샘플 크기 2 ㎖, 유량 18 ㎖/h 및 분획 크기 2 ㎖의 컬럼 명세를 갖는 세파크릴 S-1000 크기 배제 겔(Pharmacia, Uppsala, Sweden) 상에서 분석하였다. 도 4는 HA가 혼합 과정 동안 그의 분자량을 유지함을 나타낸다.

마우스 40 마리를 랜덤하게 두 그룹으로 분할하였다. 그룹 I에는 패클리탁셀 만을 공급하고, 그룹 2에는 패클리탁셀/HA 복합 약물을 공급하였다. 동물들을 주입 상자에 개별적으로 놓고 주입액을 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 삼중 수소화된 패클리탁셀(평균 주입된 분해/분(dpm) ± 상기 평균의 표준 오차(SEM): 19,159,146 ± 1,336,819)을 각 주입액으로 전달하였다. 마우스를 뇨를 수거할 수 있도록 부드럽고 비 습윤성인 플라스틱 울타리내에서 개별 수용하였다. 주입 후 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 또는 8 시간 째에 마우스를 넴부탈(Glaxo, Australia Pty. Ltd., Melbourne, Australia) 0.1 ㎖을 복강내 주입하여 마취시키고, 주사 바늘을 사용하여 심장 또는 대 혈관으로부터 채혈하였다. 채혈 후에, 상기 동물들을 경부 탈구에 의해 죽였다.

혈액을 EDTA-코팅된 유리 관으로 옮기고 14,000 g에서 10 분간 원심분리시켜 혈장을 준비하였다. 30% v/v 과산화 수소 100 ㎕로 탈색시키고 3 ㎖의 HiSafeII 섬광제를 가한 후에 방사능을 50 ㎕의 분액들에서 카운트하였다. 화학- 및 광루미네슨스를 극복하기 위해서, 샘플들을 상기 샘플의 공급원에 따라 3, 7 또는 20 일의 기간에 걸쳐 왈락 1410 β-카운터에서 2 분간 카운트하였다. 상기 카운트 사이의 기간 동안 샘플들을 주변 온도의 암실에서 보관하였다. 모든 계산은 화학- 및 광루미네슨스가 모두 제거된 안정화된 샘플에 대해서 수행하였다.

혈장 중의 주입된 패클리탁셀의 퍼센트를 측정하기 위해서, 하기 표준 식을 사용하여 각 마우스의 전체 혈장 부피(㎖)를 계산할 필요가 있다:

<수학식>

마우스 질량(g) x 마우스혈액 부피(0.07) x 혈액의 혈장 비율(0.59)

이어서 혈장 중의 주입된 패클리탁셀의 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다.

<수학식>

(혈장 부피(㎖) x 혈장의 dpm/㎖ x 100)/주입된 전체 dpm = 혈장중의 주입된 패클리탁셀%

혈류로 전달된 패클리탁셀의 양을 정확하게 정량화하기 위해서, 꼬리 정맥 상의 주입 부위를 절개하고 패클리탁셀을 정량분석하였다. 주입 부위에 남아있는 평균 패클리탁셀 주입%를 또한 측정한다. 혈류로 전달된 패클리탁셀(조직 및 종양에 분배시키는데 이용할 수 있는 패클리탁셀)의 양을 하기와 같이 계산하였다:

<수학식>

혈류로 전달되는 패클리탁셀의 양(Dpm) = 주사기 질량 차(㎎) x 주입 물질의 Dpm/㎎ - 주입 부위에 남아있는 Dpm

이후부터는 혈류로 전달된 패클리탁셀의 양을 “주입된 용량”이라 칭할 것이다.

기관 및 종양 덩어리에서 샘플 집단과 표준에서 약간 변형된 집단 간의 정확한 비교를 위해서, 체 기관 및 종양 및 체액 중의 패클리탁셀의 농도를 주입된 용량/조직 g의 %로서 나타내었다.

주입 부위에 남아있는 패클리탁셀의 평균 주입%를 계산한다. 이러한 변화를 표준화시키기 위해서, 종양 및 조직에서 발견된 dpm%를 주입된 dpm - 주입 부위에 남아있는 것으로 발견된 dpm의 %로서 계산하였다. 이러한 양을 이용가능한 dpm 또는 이용가능한 패클리탁셀이라 칭한다.

가능하다면 상기 비 습윤성 플라스틱 울타리로부터 주사기를 사용하여 뇨를 수거하였다. 상기 뇨를 14,000 g에서 10 분간 원심분리시켜 등명화하였다. 그의 방사능 함량을 8 내지 30 ㎕ 범위의 샘플에 3 ㎖의 HiSafeII 섬광제를 가한 후에 측정하였다.

상기 마우스를 죽인 직후에, 종양, 간, 심장, 비장, 방광, 좌측 및 우측 신장, 자궁, 폐, 위, 장, 뇌 및 림프절을 절제하고 전체 방사능에 대해 분석하였다. 각 조직의 총 방사능을 22 ℃에서 36 시간 동안 조직 100 내지 400 ㎎을 OptiSolv(ACC, Melbourne, Australia) 3 내지 6 ㎖에 용해시킴으로써 측정하였다. 용해의 완료 시, 조직 중의 방사능을 HiSafeIII 섬광제 10 ㎖을 가한 후에 카운트하였다. 다시 화학- 및 광루미네슨스를 극복하기 위해서, 샘플들을 샘플 공급원에 따라 3, 7 또는 20 일의 기간에 걸쳐 왈락 1410 β-카운터에서 2 분간 카운트하였다. 상기 카운트 사이의 기간 동안 샘플들을 주변 온도의 암실에서 보관하였다. 모든 계산은 화학- 및 광루미네슨스가 모두 제거된 안정화된 샘플에 대해서 수행하였다.

실시예 4

5-플루오로우라실의 용도 및 HA의 도입

5-플루오로우라실(5-FU)은 유방 및 위장관 암의 치료에 통상적으로 사용되는 대사길항물질이다(Piper & Fox, 1982). 5-FU는 세포 내에서 그의 활성 뉴클레오티드 형태로 전환되며, 여기에서 DNA와 RNA의 합성을 모두 방해한다. 상기약물은 생체 내에서 2 개의 기전을 통해 작용한다:

(i) FdUMP가 티미딜레이트 신타제에 단단히 결합하여, DNA 합성에 필요한 4 개의 데옥시리보뉴클레오티드들 중 하나인 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP)의 필수 전구체인 티미딜레이트의 형성을 방지한다. 이러한 억제에 의해 생산된 무-티미딘 상태는 능동적으로 분할하는 세포에 독성이다(Pinedo & Peters, 1988).

(ii) 5-FU가 작용하는 두 번째 방식은 FUTP의 RNA에의 결합이 RNA 기능을 방해한다는 것이다. Fdurd 및 RNA에의 5-FU의 결합에 의해 야기된 티미딜레이트 신타제의 억제는 세포에 대해 세포독성 효과를 일으킬 수 있다. 5-FU의 농도 및 노출 지속 기간은 모두 세포독성의 중요한 결정 인자이다. 추정상 RNA-조정된 효과가 노출 지속 기간의 연장에 따라 우세한 반면, DNA-조정된 효과는 S 기에서 세포의 단기간 노출 동안 보다 중요할 것이다.

다수의 연구들이 항암 약물용 약물 전달 시스템으로서 HA의 용도를 검토하였다. 코라디니(Coradini) 등(1999)은 HA/부티르산 나트륨 조합이 생체 외에서 유방암 세포에 의한 약물 흡수를 증대시키는 지의 여부를 결정하기 위해서 부티르산 나트륨을 HA에 공유 결합시켰다. 상기 연구는 약물 전달 비히클로서 HA의 작용 기전이 상기 HA-부티레이트-에스테르 유도체를 CD44 수용체로 운반함을 포함할 수 있음을 지적하였다. 상기 HA/약물 착체는 내면화된 다음, 상기 HA/약물 착체의 세포질 가수분해에 이어서, 증식 억제 효과를 발휘하는 부티레이트를 방출한다. 미토마이신 C를 쥐의 루이스 폐 이종 이식편 치료 수단으로서 HA에 공유 결합시키는 하나의 생체 내 연구가 수행되었다(Akima et al, 1996). 상기 HA-MMC 착체는 유일한 약제인 미토마이신 C가 항종양 활성을 나타내지 않는 0.01 ㎎/㎏의 낮은 용량에서 항종양 활성을 생성시키는 것으로 나타났다.

실시예 5

인간 유방암 세포에서 5-FU 및 HA의 상승 작용에 대한 조사연구

인간 유방 선암종 세포 주 MDA-MB-468, MDA-MB-435 및 MDA-MB-231을 HA 결합 친화성(Culty et al, 1994), 및 CD44 및 RHAMM의 HA 수용체의 발현(Wang et al, 1996)을 기준으로 선택하였다. 세포주 특징들을 표 3에 요약한다.

세포 주 MDA-MB-468, MDA-MB-435 및 MDA-MB-231을 실시예 1에 개시된 바와 같이 통상적으로 배양하였다.

표 4로부터 0 nM 5-FU + 100 nm의 HA를 함유하는 배지에서 증식시킨 유방 암 세포들은 비 처리된 세포에 비해 통계학적으로 의미있는 증식 또는 세포독성 효과를 나타내지 않음을 알 수 있다.

따라서, 모든 결과들을 0 nM 5-FU/0 nM HA 세포 수의 %로서 나타내었다. 세포주들 간에 분명한 증식 패턴의 차이가 있었다, 예를 들어 MDA-MB-231과 MDA-MB-468은 불량한 도말 효율을 나타내었으며, 이때 시험 배지의 도포 전에 다수의 부유 세포들이 존재하였다. MDA-MB-435 세포 주는 높은 도말 효율 및 매우 빠른 증식율을 나타내었다.

HA를 5-FU와 결합시킨 경우, MDA-MB-468 세포 주에서는 상승적인 세포 독성 효과가 나타났으나, MDA-MB-231 또는 MDA-MB-435 유방암 세포 주에서는 나타나지 않았다. 이를 도 11에 나타낸다. 5-FU 단독의 IC₅₀은 >50 μm이었으나, HA와 결합 시 IC₅₀은 40 nM이었고, 약물 용량이 1250 배까지 감소되었다.

생체 외 실험으로부터의 결과들은 5-FU를 HA의 존재 하에서 유방암 세포에 적용 시 세포 소멸이 증가됨을 입증하였다. MDA-MB-468 세포는 상기 5-FU/HA 요법에 대해 최대의 감수성(이때 IC₅₀이 >50 μM에서 40 nM로 감소하였다)을 보인반면, MDA-MB-231 및 MDA-MB-435는 모두 상기 5-FU/HA 조합에 의해 그다지 영향을 받지 않았다. 모든 유방암 세포 주들은 쿨티(Culty) 등(1994)에 의해 측정된 바와 같이 MDA-MB-468(60-80%), MDA-MB-231(40-60%) 및 MDA-MB-435(40-60%)로, 높은 수준의 CD44 수용체를 발현하였다. 이들 실험에 사용된 3 개의 세포 주들은 HA를 분해시킬 수 있음이 입증되었으며, 이는 종양 세포에서 CD44의 기능이 HA의 분해를 매개하는 것일 수 있음을 함축한다(Culty et al, 1994).

또 다른 고려 인자는 세포를 화학요법제에 미리 노출시키는 것이다. 암 세포 주를 환자로부터 단리시키기 전에, 상기 암으로 고생하는 사람은 종종 화학요법 또는 방사선을 받으며, 이는 치료 내성 세포를 함유하는 종양을 생성시킬 수 있다. MDA-MB-435 및 MDA-MB-231의 경우에 상기 세포 주들이 유래된 환자들은 모두 이미 5-FU에 노출되었다(Cailleau et al, 1974). 암 세포들은 약물 세포독성을 극복하기 위해서 다수의 적응 기전을 함유하므로, 치료 후에 남아있던 종양 덩어리들은 5-FU에 내성일 가능성이 매우 크며, 후속적으로 생체 외에서 상기 세포의 상기 약물에 대한 감수성이 변경된다.

인간 대응물의 치료에 대해 수득된 마우스의 임의의 생체 내 데이터의 외삽법에 의한 추정에 비추어, 실험 모델 및 디자인을 조심스럽게 개발하였다. 인간 유방암 이종 이식편에 대한 5-FU/HA 보조 요법의 생체 내 표적화 및 치료 효능을 명확하게 입증하기 위해서, 하기의 인자들을 검토하였다:

인간 유방암 종양을 동종 이형 세포에 대한 면역 반응을 피하는 상기와 같은 연구에 광범위하게 허용되는 모델인, 상당히 타당한 월터 앤드 엘리자 홀연구소(Walter and Eliza Hall Institute) 가계의 누드 마우스에 형성시켰다.

이미 누드 마우스 및 인간에 대해 공개된 5-FU의 약물 동력학에 대한 비교 데이터(Inaba et al, 1988)를 인간 치료 용량을 가능한한 가깝게 모사하기 위해서 본 연구의 디자인에 사용하였다.

주요 목적은 상기 마우스에 설정된 종양의 조직학적 및 세포학적 양상이 천연 인간 숙주에서 상기와 같은 종양의 양상에 필적할만함을 확인하는 것이다. 이러한 목적을 성취함에 있어서, 본 발명자들은 또한 마우스의 종양 세포가 인간 기원의 것이며 이들 세포가 RHAMM 및 CD44와 같은 매우 유관된 HA 수용체를 발현함을 보였다.

실시예 6

HA 및 5-FU 용액의 제조

건조된 HA(모달 Mr 7 x 10⁵kDa)를 0.9% w/v의 발열원이 없는 주입 등급의 NaCl에 용해시켜 HA 모액(10μM, 7 ㎎/㎖)을 제조하였다. 용액을 균질하게 하기 위해서, HA를 4 ℃에서 밤새 용해시킨 다음 철저히 와동시켰다. HA가 상기 모액의 제조 기간 동안 그의 분자량을 유지하도록 하기 위해서, 상기 용액을 1.6 ㎝ x 70 ㎝, 샘플 크기 2 ㎖, 유량 18 ㎖/시간 및 2 ㎖의 분획 크기의 컬럼 명세를 갖는 세파크릴 S-1000 크기 배제 겔 상에서 분석하였다. HA를 적합한 증식 배지로 희석시키면서 최종 농도 100 nM로 사용하였다.

5-FU를 0.1 M 수산화 나트륨에 용해시켜 5-FU 모액을 제조하고 0.9% w/v의발열원이 없는 주입 등급의 NaCl을 사용하여 20 ㎎/㎖의 농도로 만들었다. 상기 모액을 확실히 멸균시키기 위해서 0.22 ㎛의 필터를 통해 여과시킨 후에 [³H]5-FU를 가하고 주입 등급의 염화 나트륨으로 주입 농도로 희석시켰다. 개별적인 주입액을 50 ㎕ 중의 5-FU 30 ㎎/㎏(평균 체중 60 ㎏에 대해 10.5 ㎎/㎏의 인간 치료 용량과 동일함; Inaba et al, 1988)을 전달할 목적으로 개별적인 마우스 질량에 따라 제조하였다. 발열원이 없는 HA 모액(10 ㎎/㎏; 모달 Mr 7 x 10⁵Da)을 상기 5-FU 모액 20 ㎎/㎖의 분취량에 가하고 밤새 와동시키면서 배양하여 마우스 질량의 12.5 ㎎/㎏에 해당하는 최종 HA 농도를 얻었다. 50 ㎕ 중의 5-FU 30 ㎎/㎏ 및 HA 12.5 ㎎/㎏을 전달하기 위해서 주입액을 마우스 질량에 따라 개별적으로 제조하였다. 체내로 주입된 상기 HA의 양에 따라, 실험 기간 동안 포화 동력학이 관찰될 것이다(Fraser et al., 1983). HA가 주입 혼합물을 제조하는 동안 그의 분자량을 유지하게 하기 위해서, 상기 주입액을 1.6 ㎝ x 70 ㎝, 샘플 크기 2 ㎖, 유량 18 ㎖/h 및 분획 크기 2 ㎖의 컬럼 명세를 갖는 세파크릴 S-1000 크기 배제 겔 상에서 분석하였다. 유론산 분석에 의해 컬럼 분획들에서 히아루로난이 검출되었다.

유론산 분석을 사용하여 상기 겔 여과 크로마토그래피 과정으로부터 수거된 분획들로부터 히아루로난의 존재를 정성적으로 검출하였다. 이어서 각 분획의 25 ℓ 분액을 96 웰 플레이트로 옮겼다. 이어서 250 ℓ의 카르바졸 시약(H₂SO₄중의 3 M 카르바졸/0.025 M 보레이트)을 상기 분획들에 가하였다. 상기 96 웰플레이트를 80 ℃에서 45 내지 60 분간 배양하였다. 550 ㎚의 필터를 갖는 다아나테크(Dynatech) MR7000 플레이트 판독기를 사용하여 상기 96 웰 플레이트를 판독하였다. 흡광도는 상기가 백그라운드 흡광도 이상에서 >3의 표준 편차일 때 의미있는 것으로 간주되었다. 상기 백그라운드는 평균 수를 16으로 취했을 때 V_o및 V_t전 후의 동일한 수의 샘플 지점들을 취하여 계산하였다(Fraser et al. 1988).

HA 및 5-FU(0.5% NaCl 중의 HA 10 ㎎/㎖ 및 5-FU 20 ㎎/㎖, pH 8.9)는 상기 HA의 분자량에 대해 하락 효과를 나타내지 않았다. 크기 배제 겔에서의 크로마토그래피 분석은 700,000 Da의 모달 분자량의 지속을 나타냈다.

실시예 7

약물 세포독성 분석: 실험 구상

생체 외에서 약물 적정 실험을 구상함에 있어서, 정맥내 투여 후 혈장에서 달성되는 농도와 유사한 약물 농도를 적용하는 것이 바람직하다. 5-FU를 정맥내 경로(iv)로 10.5 ㎎/㎏(400 ㎎/㎡)을 치료학적으로 투여하는 경우, 30 분 내의 정점 혈장 수준은 8 ㎍/㎖(61 μM)이다(Kubo, 1990). 생체 내의 이러한 혈장 농도를 기준으로, 다음과 같은 약물 농도를 선택하였다: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100 μM 5-FU ± 100 nM HA. 세포 주 MDA-MB-468, MDA-MB-231 및 MDA-MB-435를 실시예 4 내지 5에 상술한 바와 같이 증식시켰다. 배양액들이 융합점에 도달하면, 세포들을 0.25% 트립신/0.05% EDTA로 플라스크로부터 회수하였다. 단-세포 현탁액을 쿨터 계수기(ZM1 모델)로 카운트하고 세포-특이적인 배지에서 100,000 세포/㎖로 재현탁시켰다. 세포들을 웰당 0.5 ㎖의 세포 현탁액을 가함으로써 24-웰 플레이트(표면적 2 ㎠)에 도말하여 50,000 세포/웰을 얻었다. 배양액을 24 시간 동안 부착시킨 다음, 배지를 제거하고, 단층을 HBSS로 세척하고 시험 배지(5-FU+HA)를 도포하였다. 시험 배지에서 4 일 증식시킨 후에, 배양액을 HBSS로 세척하고, 세포들을 0.25% 트립신/0.05% EDTA로 트립신처리하여 상기 웰로부터 회수하고, 상기 세포들을 쿨터 계수기로 카운트하였다.

실시예 8

약물 전달 및 종양-표적화 비히클로서 HA의 평가

실시예 5 내지 7에 개시된 바와 같은 생체 외 실험에서의 약물 감도 및 CD44 및 RHAMM의 HA 수용체의 발현에 대한 결과를 기준으로, 인간 유방 암종 세포 주 MDA-MB-468을 임의의 누드 마우스 인간 종양 이종 이식편의 생성을 위한 암세포 접종물로서 선택하였다. 세포들을 통상적으로 증식시키고 실시예 5에서 상술한 바와 같이 계대배양하였다. 마우스에 주입하기 위해서, 세포들을 100% 융합점으로 증식시키고 0.025% 트립신/0.01% EDTA 용액으로 트립신처리하고, 벡크만 TJ-6 벤치 원심분리기에서 400 g에서 10 분간 원심분리시켜 2 회 세척하고, 모델-ZM 쿨터 계수기로 카운트하고 혈청 비 함유 라이보비츠 L-15 배지에서 1 x 10⁸세포/㎖로 재현탁시켰다.

6 내지 8 주된 흉선없는 CAB/WEHI 암컷 누드 마우스를 특정한 병원균이 없는 조건 하에서 살균된 음식과 물을 마음껏 공급하면서 유지시켰다. 각각의 마우스에 50 ㎕ 중의 5 x 10⁶세포를 함유하는 1 회 주입액을 공급하였다. 세포들을 26 게이지의 주사기로 제 1 젖꼭지 바로 아래의 유방 지방 패드에 주입하였다(Lamszus et al, 1997). 3 개의 직교 변수들(d₁d₂d₃)을 측정함으로써 종양을 매주 측정하였다. 종양 부피를 하기 식에 따라 평가하였다:

<수학식>

(1/6)(d₁d₂d₃)

5-FU±HA에 의한 처리를 암세포 접종 후 대략 4 내지 8 주째에 개시하였다. 각 연구에 사용된 마우스의 평균 종양 크기를 표 5에 요약한다.

유방암 세포 주 MDA-MB-468의 종양원성 및 적합한 동물 숙주내로 주입 시 종양을 발생시키는 그의 능력을 확립시키기 위해서, 병리학적 시험을 수행할 필요가 있었다. 종양의 생리학적으로 생육가능한 혈관신생을 위해서는 모세관 네트워크가 상기 종양에 영양분을 공급하는 것이 필수적이다. 혈관신생, 맥관 침습, 괴사, 세포소멸, 높은 유사분열 지수 및 핵 이상의 존재는 유방 암종의 모든 특징이다. 헤마톡실린 및 에오신 염색된 유방 종양 조각들을 검사한 결과 이들 특징들이 모두 입증되었으며, 따라서 이는 동물 숙주가 등급 II의 인간 유방 암종을 성공적으로 유지함을 확인시킨다.

종양 유발 후 대략 8 주 째에 2 마리의 종양 함유 마우스에게 치사량의 넴부탈을 공급하였다. 마우스를 죽인 지 3 분 이내에, 종양을 외과적으로 제거하고 즉시 10% 완충된 포르말린에 12 시간 동안 고정시켰다. 고정된 종양을 일련의 70 내지 100% 에탄올에서 밤새 탈수시킨 다음, 파라핀에 묻고 이로부터 2 내지 4 ㎛ 조각들을 잘라내었다. 상기 조각들을 슬라이드 상에 놓고 왁스질을 제거하고 물에 담갔다. 슬라이드를 PBS로 3 x 5 분 세척하였다. 이종 항원 친화성 단백질을 10% 송아지 태아 혈청과 함께 10 분간 배양한 다음, PBS로 세정함으로써 차단시켰다. 검출 항체를 RT에서 60 분간 적용시켰다. 검출 항혈청 또는 항체들을 RHAMM, CD44H 및 CAE에 대향시켰다. 슬라이드를 PBS에서 3 x 5 분 세척하고 내생적인 퍼옥시다제 활성을 0.3% H₂O₂/메탄올에 20 분간 담가 차단시켰다. 추가로 PBS 세척한 다음, 퍼옥시다제-접합된 돼지 항-토끼 2 차 항혈청을 RT에서 60 분간 적용시킨 다음 PBS로 3 x 5 분 세척하였다. 시그마 패스트 3,3'-디아미노벤지딘 정제(DAB)를 제조사의 지시에 따라 제조하고 DAB 용액을 RT에서 5 내지 10 분간 적용하였다. 슬라이드들을 10 분간 수돗물로 세척하고, 헤마톡실린으로 대조염색시키고, 탈수시켜 올려놓았다.

상기 종양의 인간 기원을 상기 종양과 주변 조직을 인간 특이적인 암 마커로염색하여 확인하였다. CEA의 존재는 상기 종양이 쥐 숙주의 심혈관계에 의해 유지되는 인간 기원의 것임을 분명히 입증하였다. 종양 표적화가 수용체-매개된 내면화 또는 결합을 통해서 일어난다고 가정되었기 때문에, HA 수용체인 CD44 및 RHAMM의 발현을 확립시킬 필요가 있었다. 표 6은 인간 유방암 이종 이식편 상에서의 수용체 발현 정도를 나타낸다.

실시예 9

누드 마우스 모델에서 5-FU 및 HA의 용도

25 마리의 마우스를 2 그룹으로 랜덤하게 나누었다. 그룹 1에는 [³H]5-FU 만을 공급하고 그룹 2에는 [³H]5-FU/HA 조합을 공급하였다. 처리제를 주입 전과 후에 주사기를 칭량하면서 꼬리 정맥을 통해 정량적으로 투여하였다. 5-FU 30㎎/㎏ ± HA 12.5 ㎎/㎏에 함유된 삼중수소화된 5-FU(평균 주입된 dpm±SEM: 31,313,002±131,348)를 각 주입액으로 전달하였다.

혈류로 정확한 양의 [³H]5-FU를 전달하기 위해서, 꼬리 정맥 상의 주입 부위를 절개하고 그의 [³H]5-FU 함량을 측정하였다. 혈류로 전달된 5-FU(조직 및 종양으로의 분배에 이용할 수 있는 5-FU)의 양을 하기와 같이 계산하였다:

<수학식>

혈류로 전달된 5-FU의 양(dpm) = 주사기 질량차(㎎) x 주입 물질의 Dpm/㎎ - 주입 부위에 남아있는 Dpm

혈류로 전달된 5-FU의 양을 “주입된 용량”이라 칭하였다.

기관 및 종양 덩어리에서 샘플 집단과 표준에서 약간 변형된 집단 간의 정확한 비교를 위해서, 체 기관 및 종양 및 체액 중의 5-FU의 농도를 주입된 용량/조직 g의 %로서 나타내었다.

마우스를 뇨를 수거할 수 있도록 부드럽고 비 습윤성인 플라스틱 울타리에서 개별적으로 수용하였다. 주입 후 10 분, 20 분, 30 분, 1 시간 또는 2 시간 째에 넴부탈 0.1 ㎖을 복강내 주입하여 마우스를 마취시켰다.

동물들을 마취 시, 주사기를 사용하여 심장 또는 대 혈관으로부터 채혈하였다. 혈액을 EDTA 유리 관으로 모으고 14,000 g에서 10 분간 원심분리시켜 혈장을 준비하였다. 30% v/v 과산화 수소 100 ㎕로 탈색시키고 3 ㎖의 HiSafeII 섬광제를 가한 후에 방사능을 50 ㎕의 분액들에서 카운트하였다. 화학- 및 광루미네슨스를 극복하기 위해서, 샘플들을 상기 샘플의 공급원에 따라 3, 7 또는 20 일의 기간에 걸쳐 왈락 1410 β-카운터에서 2 분간 카운트하였다. 상기 카운트 사이의 기간 동안 샘플들을 주변 온도의 암실에서 보관하였다. 모든 계산은 화학- 및 광루미네슨스가 모두 제거된 안정화된 샘플에 대해서 수행하였다. 혈장 중의 주입된 5-FU의 퍼센트를 측정하기 위해서, 하기 표준 식을 사용하여 각 마우스의 전체 혈장 부피(㎖)를 계산할 필요가 있었다:

<수학식>

마우스 질량(g) x 마우스 혈액 부피(0.07) x 혈액의 혈장 비율(0.59)¹

혈장 중의 주입된 5-FU의 퍼센트를 하기와 같이 계산하였다.

<수학식>

(혈장 부피(㎖) x 혈장의 dpm/㎖) x 100/주입된 총 dpm

가능하다면 상기 비 습윤성 플라스틱 울타리로부터 주사기를 사용하여 뇨를 수거하였다. 상기 뇨를 14,000 g에서 10 분간 원심분리시켜 등명화하였다. 그의 방사능 함량을 8 내지 30 ㎕ 범위의 샘플에 3 ㎖의 HiSafeII 섬광제를 가한 후에 측정하였다. 각각의 마우스에 의해 생산된 뇨의 부피를 정확하게 정량분석함에 있어서 기술적인 어려움에도 불구하고, 하기 식에 의해 뇨 중의 주입된 5-FU 용량%를 계산하였다:

<수학식>

(수거 시간(h) x 42㎕ x 뇨의 dpm/㎕ x 100)/주입된 전체 dpm

일단 채혈이 완료되면, 마우스를 경부 탈구에 의해 죽였다. 상기 마우스를 죽인 직후에, 종양, 간, 심장, 비장, 방광, 좌측 및 우측 신장, 자궁, 폐, 위, 장, 뇌 및 림프절을 절제하고 전체 방사능에 대해 분석하였다. 조직 당 전체 방사능을 22 ℃에서 36 시간 동안 조직 100 내지 400 ㎎을 3 내지 6 ㎖에 용해시킴으로써 측정하였다. 용해의 완료 시, 조직을 HiSafeIII 섬광제 10 ㎖을 가한 후에 카운트하였다. 샘플들을 앞서 화학루미네슨스를 피하기 위해서 개시된 바와 같이 카운트하였다.

도 12에서 알 수 있는 바와 같이, HA와 5-FU의 결합 시 현저한 표적화 효과가 있었다. 상기 HA가 약물 흡수를 2.42 인자까지 증대시킨 때인 10 분 째에 약물의 종양 잔류에 있어서 최대의 상대적인 증가가 관찰되었다(p=0.001, 스튜던츠 t-시험). HA/5-FU 투여 후 20 분 및 30 분 째에 5-FU의 종양 흡수가 통계학적으로 상당히 증가된 것이 또한 주목되었으며, 이때 약물 흡수의 증가는 각각 1.5 및 2 배였다(p<0.001, 스튜던츠 t-시험). 다른 시점에서는 단독 약제로서 투여된 5-FU와 HA와의 공동 주입간에 통계학적으로 의미 있는 차이가 나타나지 않았다.

간, 비장 및 신장과 같이 대사적으로 활성인 기관들이 증가된 종양 표적화의 임의의 긍정적인 태양을 방해할 수 있는 높은 수준의 약물 표적화를 경험하지 않도록 하는 것이 중요하다. 표 7은 시험된 다양한 시점들에서의 각 조직의 [³H]5-FU흡수를 열거한다.

도 13은 HA의 1 차 대사 기관이 간, 림프절 및 비장인 반면, 5-FU는 간에서 광범위하게 대사됨을 나타낸다.

이러한 기관들은 5-FU가 HA와 공동 주입되었을 때 그의 흡수가 상당히 증가된 것을 나타내지는 않았다. 그러나, 신장은 HA와 함께 투여 후 10 분 째에 5-FU 표적화의 상당한 증가를 나타내었다(1.8 배 증가, p=0.004). 이 시점 후에, 비록 통계학적으로 유의수준은 아니지만, 약물 흡수의 증대 경향은 샘플링 기간이 끝날 때 까지 계속되었다.

방광, 장 및 골수는 5-FU의 증가된 흡수를 나타내지 않았다. 자궁과 같은 조직에서, 10 분째에 약물의 단 기간 증가(1.8 배 증가, p=0.032)가 있었으나, 다른 시점들에서는 차이가 없었고, 따라서 이러한 관찰의 유의수준은 불명확한 채로 있게 된다.

위, 뇌 및 폐는 1 회 또는 2 회의 샘플링 시점에서 증가된 5-FU 흡수를 나타내었다. 그러나, 각 시점에서 작은 동물 수(n=5)로 인해, 비록 도 14A-C에 나타낸 바와 같이 명확한 경향을 관찰할 수는 있었지만 통계학적 유의수준을 실증할 수는 없었다.

1 시간 및 2 시간의 나중의 샘플링 시점에서, 심장 5-FU의 상당한 감소가 주목되었으며, 이때 HA와 공동 투여된 결과 각각 59%(p=0.003) 및 53%(p=0.021) 감소되었다.

배뇨 속도의 차로 인해 각 마우스로부터 뇨를 수거할 수 없었으며; 따라서 통계학적 분석이 가능하기에는 불충분한 뇨가 수거되었다.

5-FU를 HA와 공동 주입한 경우, 5-FU의 순환 수준이 조기 감소되었다(표 7). 히아루로난은 혈장 5-FU를 55%까지 감소시켰다(p=0.001). 약물 동력학적 혈장 반감기가 도 15에 나타낸 바와 같이 5-FU/HA를 투여한 마우스에서 28 분에서 56 분으로 변경되었다.

실시예 10

마우스에의 치료 섭생의 제공

인간 유방암에 가장 통상적으로 사용되는 치료 섭생들 중 하나는 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(28 일 주기의 1 일 및 8 일에 투여됨)이다. 인간 유방암에서, 초기 치료 섭생은 환자의 상태가 재 평가되는 6 주기 동안이며, 따라서 본 발명자들은 마우스를 장기간 효능 연구에서 6 주기(6 개월)의 치료 및 단기간 효능 연구에서 6 주기(6 주)의 처리에 노출시킴으로써 가능한 한 인간 치료 섭생에 가깝게 모사하고자 하였다. 마우스의 생활사를 대략 2 년이라고 생각할 때 단기간 및 장기간 치료 프로토콜 모두를 표 8에 나타낸 바와 같이 개시하였다.

마우스를 단기간 연구를 위해서 그룹 당 8 마리씩 7 그룹과 장기간 연구를 위해서 8 마리씩 5 그룹으로 랜덤하게 나누었다(표 8에 투여량 및 치료 투여 스케줄을 언급하였다).

치료를 6 개월의 섭생 이상 연장시키지 않았는데, 그 이유는 6 개월 이상 지속되는 화학요법은 일반적으로 보다 큰 이점과 무관한 것으로 나타났기 때문이다(Harris et al, 1992).

실시예 8에 개시된 바와 같이 장기간 연구를 위해 치료 적용 일에 동물들의 체중과 종양 부피를 측정하였다. 6-주 연구에서는 동물들을 1 일 기준으로 체중과 종양 부피를 측정하였다. 동물들을 개별적으로 주입 상자에 넣고 주입액을 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 화학요법에 응하는 환자들에서 스트레스가 주요 인자일 수 있음이 실험적으로 입증되었으며(Shackney et al, 1978), 따라서 동수의 마우스를 각각의 우리에 배분하고, 우리당 동물 수를 실험 단계에 따라 5 내지 8로 변화시켰다.

질병의 진행 정도로 인해 동물들을 안락사시켜야 하거나 또는 6 개월(장기간) 또는 6 주(단기간) 치료 섭생이 완료되었을 때 실험을 종료하였다. 동물 윤리 지침에 기인하여, 질병 진행 정도를 평가하는 독립적인 동물 윤리 관리인이 동물들을 격주로 감시하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 동물을 죽일 필요가 있는 실험 종료 단계에 도달했는지를 결정하기 위해서 하기의 기준을 사용하였다:

1) 동물이 먹거나 마시지 않고 체중이 극적으로 감소하였다;

2) 종양 크기가 체 질량의 10% 이상이었다(패널 A);

3) 종양 덩어리가 너무 커서 동물이 움직일 수 없었다(패널 B).

실험 종료점에서, 동물들을 넴부탈(60 ㎎/㎖) 0.1 ㎖을 복강내 주입에 의해 마취시키고, 채혈한 다음 경부 탈구에 의해 동물들을 죽였다.

6 주 연구의 끝에서 종양 질량을 측정하였으며 이는 5-FU 및 5-FU/HA 요법 모두 도 17에 나타낸 바와 같이 염수 그룹보다 상당히 작았다(p=0.005). 5-FU와 HA/5-FU 처리 그룹간에 종양 부피의 현저한 차이는 없었으며, 이는 상기 두 요법이 모두 1 차 종양에 대해서 동등한 효능을 나타내었음을 가리킨다. 염수와 HA의 1 차 종양 부피간에는 통계학적 차이가 주목되지 않았다.

마우스를 죽인 직 후에, 종양, 간, 심장, 비장, 방광, 좌측 및 우측 신장, 자궁, 폐, 위, 장, 뇌 및 림프절을 절제하고 0.06 M 인산염(pH 7.5)으로 완충시킨 4% 포르말린 및 1.0% w/v의 세틸피리디늄 클로라이드에 넣었다. 조직을 16 내지 24 시간 동안 고정시킨 후에 조직학적으로 처리하였다. 고정된 조직을 100% 에탄올로 단계적으로 탈수시키고 파라핀 블록에 파묻고 이로부터의 2 내지 4 m 조각들을 유리 현미경 슬라이드 상에 놓았다. 상기 조직 조각들을 헤마톡실린 핵 착색제 및 에오신 세포질 착색제로 염색시켜 치료 독성을 나타낼 수 있는 임의의 병리학적 특징들을 돋보이게 하였다.

9 내지 11 개의 림프절을 동물 당 수거하여 종양 면적을 고갈시킨 모든 결절들을 확실히 수거하였다. 현재 림프절 전이를 탐지하는데 사용되는 2 가지 방법이 존재한다:

i) 전체 기관 구조물의 통상적인 헤마톡실린 및 에오신 염색

ii) 태아성 암 항원과 같은 암 마커를 사용하는 면역조직화학.

상기 두 전이 탐지 방법 모두 본 연구에 사용하였다. 상업적으로 입수할 수 있는 CEA 항체들이 모두 인간 유방암 세포와 반응하는 것은 아니며, 따라서 본 발명자들은 5 개의 상이한 항체들의 반응성을 시험하였다(DAKO, Amersham and KPL).

헤마톡실린 및 에오신 염색된 림프절을 피 알렌(P. Allen) 박사(허가된 병리학자)에 의해 검사하였으며, 이때 각 결절을 종양 세포의 존재에 대해 현미경으로 검사하였다. CEA 면역염색된 림프절을 현미경으로 검사하였으며, 이때 임의의양성 염색된 결절들을 카운트하고 이들을 림프절 전이에 대해 양성으로 간주하였다.

종양 부피를 캘리퍼스 측정에 의해 매일 또는 매주 감시하였으며 종양 부피를 실시예 8에 전술한 바와 같이 계산하였다.

5-FU의 가장 통상적인 독성 효과들 중 하나는 위장관에서 일어나며, 여기에서 출혈성 장염 및 장 천공이 일어날 수 있다(Martindale, 1993). 동물들을 설사와 같은 GI 관 연동 이상 항진에 대해 매일 감시하고, 체중 손실과 같은 보다 심각한 독성 징후에 대해서 매주 감시하였다. 체중 손실을 문헌[Shibamoto et al, 1996]에 인용된 바와 같이 평가된 전체 체중에서 종양 중량(1g x 종양 부피(㎤)로서 계산됨)을 감하여 계산함으로써 감시하였다. 임의의 체중 변화를 입증하기 위해서, 동물 체중을 하기와 같이 치료 개시 시의 체중으로 표준화하였다:

<수학식>

[체질량(종양 제외) - 치료 개시 시의 체 질량(종양 제외)]/치료 개시시의 체질량(종양제외) x 100

설사와 같은 매일의 GI 관 연동 이상 항진은 치료 섭생에 관계없이 어떠한 동물들에서도 주목되지 않았다. 각 치료 섭생에 대한 심각한 위장 독성을 체중(종양 중량 제외) 손실을 지표로 사용하여 평가하였다. 각각의 동물이 죽었을 때 체 질량 변화%를 전술한 바와 같이 계산하였다. 5-FU/HA 그룹 처리 그룹에 비해 염수, HA, 5-FU 처리 그룹들 간의 표준화된 체중에 통계학적으로 현저한 차이가 있었다(도 18). 5-HU/HA 보조 요법을 받은 마우스는 비 처리된 그룹(체중이 총 2% 증가하였다)에 비해 처리 기간 전체를 통해 체중이 16% 증가한 것으로 나타났다(스튜던츠 t-시험, p=0.025).

태아성 암 항원(CEA)의 면역조직학적 검출과 전통적인 진단적 병리학과의 조합으로 림프절 전이에 대한 탁월한 정량분석이 제공되었다. 평균적인 마우스는 15 내지 19 개의 림프절을 함유하며(Lamszus et al, 1997), 따라서 본 연구는 동물 림프절의 대략 60 내지 70%를 검사하였다. 유방 지방 패드와 가슴 부위를 고갈시킨 모든 결절들을 조심스럽게 회수하여 검사하였다. 표 9A에 나타낸 바와 같이, 모든 동물들이 림프절 전이를 나타내었다.

도 19A는 림프절 침범%(동물 당 전이성 결절의 수)가 5-FU, 5-FU/HA 및 HA 처리에 의해 크게 영향을 받음을 보이며, 이때 염수 그룹은 림프절 침범 양에 있어서 6 배 증가된 것으로 나타났다. 다시 한번, HA가 치료 가치가 있음이 입증되었다.

상기 연구의 끝에서 동물을 해부하는 동안 모든 조직을 종양 결절에 대해 미시적 및 거시적으로 검사하였다. HA/5-FU 또는 HA 요법을 받은 마우스를 제외하고, 새로운 종양이 1 차 종양에 인접한 영역의 목 부근 또는 겨드랑이 밑 부분에서 관찰되었다. HA의 치료 섭생에의 결합은 도 19B에 나타낸 바와 같이 새로운 종양 형성을 억제하였다.

치료에 관계없이 전체 환자 생존에 있어서 현저한 차이는 없었으며(표 9A), 이때 모든 그룹의 동물들은 치료 섭생을 마쳤다.

5-FU 처리와 관련된 주요 독성들 중 하나로서 골수 기능 억제 및 후속적인 백혈구 감소가 있으며, 혈액 독성과 관련된 임의의 치료를 평가할 필요가 있다. 동물들이 마취되면, 주사기를 사용하여 심장 또는 대 혈관으로부터 혈액을 수거하였다. 혈액을 마우스 점착성 염수(M)로 1/10 희석하고 이를 혈구계에서 카운트하여 백혈구 수를 평가하였다. 호중구, 림프구 및 적혈구 수를 세어 차별적인 혈액 카운트를 수행하였다. 부차적인 혈구 집단들에 대한 전체 평가를 마우스 혈액에 대해 공개된 데이터와 비교하였다.

처리가 기관 위축 또는 비대를 유발시키지 않게 하기 위해서, 상기 기관들을 회수하여 해부하는 동안 칭량하였다. 각 기관의 질량을 전체 총 체중의 %로서 계산하고 염수 단독 그룹(그룹 1)의 기관 질량과 비교하였다.

실시예 11

장기간 치료: 6-개월 섭생

본 연구는 여전히 진행중이지만 상당한 데이터가 얻어진다.

TDT는 종양이 질량 또는 세포 수에 있어서 배가되는데 걸리는 시간(일수)으로, 간단히 측정되며 개념적인 용어로 임상적인 종양 양상과 쉽게 연관시킬 수 있다(Shackney et al, 1978). 서서히 성장하는 종양은 화학요법에 불충분하게 반응하는 경향이 있으므로, 종종 상기 종양 배가 시간을 감시함으로써 종양 화학요법적인 반응을 평가할 수 있다(Schabel, 1975).

각 치료에 대한 종양 배가 시간을 표 9B에 나타낸다.

5-FU/HA와 5-FU 처리 간에 TDT의 현저한 차이가 없었다. 6-주 연구에서와 같이, HA의 투여는 또한 1 차 종양에 대해 치료 효과를 나타내었으며, 이는 26±1.75의 TDT 대 13±4 일의 염수에 의해 입증된다. 5-FU 투여 24 시간 전의 HA의 투여는 종양 성장의 지연과 관련하여 5-FU의 임의의 치료 가치를 방해하는 것으로 나타났다.

종양 질량과 부피는 종양 치료 반응 및 진행을 감시하는데 유용한 변수이나, 궁극적으로는 치료에 의해 보답되는 세포독성 효과를 입증하지 못한다. 본 발명자들은 HA/5-FU 요법이 보다 많은 종양 세포를 죽이는지의 여부와 세포의 위치를 정하기를 원했다. 죽은 세포들을 하기에 의해 병리학적으로 나타낼 수 있다: i) 핵의 붕괴(세포소멸), ii) 세포의 용균(괴사).

전체 종양 영상을 MCID 컴퓨터로 스캐닝하여 전체 종양 면적을 계산함으로써 죽은 세포의 수를 정량분석하였다. 단편화된 핵을 갖는 세포 또는 용균된 세포를 어림잡아 스캐닝하고, 이어서 상기 면적을 디지털화하여 죽은 세포의 정확한 면적을 계산하였다. 세포 사멸에 기여하는 종양%를 하기 식에 의해 계산하였다:

<수학식>

(세포소멸 및 괴사 세포의 면적/전체 유방 종양의 면적)x100

생육가능한 세포는 죽어가는 세포 또는 죽은 세포보다 많은 물을 함유하며, 따라서 건조 종양 질량 대 습윤 종양 질량의 비를 측정함으로써 생육가능한 세포 대 그렇지 못한 세포의 전체 면적을 추정할 수 있다. 종양을 좌우 양측으로 절개하고 한쪽 반은 종양 상태에 대해서 분석하고 다른 반은 건조 전 및 50 ℃에서 48 시간 동안 건조시킨 후에 칭량하였다. 습윤 종양 질량의 %로서 건조 질량을 하기의 식에 따라 계산하였다:

<수학식>

(건조 종양 질량/습윤 유방 종양의 질량)x100

전체적인 환자 생존 시간을 동물이 치료 개시 후에 살아있는 시간(일수 또는 주수)으로서 계산하였다.

각 처리에 대한 종양 배가 시간을 표 9A에 나타낸다. 5-FU/HA와 5-FU 처리 간에 TDT의 현저한 차이는 없었다. 그러나, HA의 투여는 1 차 종양에 대해 치료 효과를 나타내었으며, 이때 TDT는 염수 그룹보다 상당히 더 컸다(p, 0.05, 다중 비교 터키(Tukey) 시험). 5-FU 투여 24 시간 전에 HA를 투여한 결과 종양 성장의 지연과 관련하여 5-FU의 임의의 치료 가치가 방해되는 것으로 나타났다.

5-FU에 대해 인용된 치료율은 26%(Inaba et al, 1989)이나, 5-FU를 공급받은 동물들은 “치유”를 경험하지 못했다. HA/5-FU 보조 요법을 제공받은 2 마리의 마우스는 종양이 완전히 괴사되고 대략 치료 12 주 후에 종양이 떨어져 나가는 “치유”를 경험했다. 도 20B는 HA와 HA/5-FU로 처리된 마우스에서 작은 딱지가 형성되는 특징적인 외관을 보인 반면, 도 20C는 작은 영역의 괴사에 이어서 넓은 영역의 딱지가 형성되는 외관을 보인다. 상기 마우스들 중 하나는 소 결절의 재 성장을 경험했으나, 두 번째 마우스는 22 주 째에도 여전히 종양이 없었다. 도 20A에서 보이는 바와 같이, 5-FU 또는 염수를 공급받은 마우스는 궁극적으로 무거운 종양 덩어리로 인해 상기 마우스를 죽게 하는 커다란 종양을 가졌지만(표 9B), HA±5-FU를 공급받은 마우스는 작은 영역이 괴사된 후에 딱지가 형성되는 특징적인 종양 외관을 나타냈다.

22 주 째에, 상기 5-FU/HA 마우스의 37.5%가 여전히 생존해 있었으며, 상기 5-FU/HA 보조 요법 마우스에 대한 주요 사망 원인은 체중 손실과 대사 스트레스였다(표 9B).

HA±5-FU를 인간 유방암 이종이식편을 갖는 마우스에게 투여하는 경우 전체적인 환자의 생존율은 상당한 차이가 있는 것으로 보인다. 24 주의 연구 중 22 주 째에, 유일한 생존 그룹은 도 21에 나타낸 바와 같이 5-FU/HA 및 HA 그룹이다.

결론

5-FU 표적화 데이터는 5-FU를 HA와 10, 20 및 30 분 시점으로 주입했을 때 종양에 의한 5-FU의 흡수가 각각 2.4, 1.5 및 2 배로 통계학적으로 상당히 증가했음을 나타낸다(표 7). 이는 5-FU가 HA에 의해 종양을 표적화 했음을 가리킨다. 5-FU의 종양 세포에 대한 HA 표적화에 2 개의 가능한 기전이 존재한다:

5-FU와 회합된 HA는 수용체(CD44)와 결합하여 수용체-매개된 세포 이물 흡수를 통해 내면화되어 약물을 종양 세포내로 방출한다.

HA 분자 망은 밖으로 확산시키는 임피던스로서 작용할 것이며, 따라서 HA가 수용체(CD44 및 RHAMM)에 결합한 후에 수용된 5-FU가 종양 세포 내로 확산될 수 있다. HA 기질에 의해 세포 표면 상에 유지되는 동안 5-FU는 상기 5-FU가 하부의 세포로 운반되는데 통상적으로 이용되는 능동 수송 기전에 대해 증가된 유용성을 갖는다.

HA의 대사는 주로 림프절(Fraser et al, 1988)과 간(Laurent et al, 1986)에서 일어난다. HA는 통상적으로 수용체-매개된 세포 흡수, 및 간(80-90%),신장(10%), 비장(0.1%) 및 골수(0.1%)에서의 대사에 의해 혈류로부터 통상적으로 제거된다(Fraser et al, 1983). 순환하는 HA는 간 내피 세포 (LEC) 수용체라고도 알려진 대사 수용체에 의해 흡수되는 반면(Eriksson et al, 1983), CD44 수용체는 대사 대신에 세포 진행 과정과 관련된 HA 내면화에 관련되며, 반면에 RHAMM 수용체는 세포 운동성에만 관련된다. HA와 5-FU가 결합된 결과 HA 또는 5-FU 대사 부위에 표적화되는 5-FU의 수준이 높아질 수 있다. 표적화 실험 데이터(표 6)는 HA와 함께 투여될 때 간에 표적화되는 5-FU는 현저하게 증가되지 않았음을 나타낸다. 간에 대한 표적화의 증가가 관찰되지 않았기 때문에, 이는 간 상의 LEC 수용체가 CD44 수용체에 비해 HA에 대한 결합 친화도가 낮음을 시사할 수 있다. 또 다른 가능성은 간 세포 상에서 발현되는 CD44 동형(Stamenkovic et al, 1991)이 HA와 높은 친화성으로 결합하지 않는다는 것이다. 간에서와 같이, 비장, 골수 및 림프절의 다른 대사 기관들에서도 5-FU의 표적화의 증가가 주목되지 않았다.

10 분의 시간 틀내에서 신장에 대해 표적화된 5-FU가 1.8 배 현저하게 증가하였다. 다른 4 개의 시점들이 HA/5-FU를 동시 투여했을 때 신장에 의한 5-FU 흡수의 현저한 증가를 보이지 않았지만, HA와 함께 투여 시 보다 많은 5-FU가 신장으로 전달되는 일반적인 경향이 발생하는 것으로 나타났다. 5-FU의 신체로부터의 주요 최종 제거 경로는 배뇨이다. HA를 갖는 상기 약물의 신장 함량이 거의 증가되지 않은 듯 하지만, 다른 증거로부터 HA가 신장에 의해 흡수되고 매우 급속히 대사되어 그의 체류 시간이 짧을 것이며 회합된 약물은 뇨내로 신속히 방출될것이라 여겨진다.

위, 뇌, 폐 및 자궁과 같은 조직에서, 단기간 표적화는 1 회 이상의 시점에서 주목되었다. 관찰 결과들이 사실인지를 명확하게 가리킬 수 있고, 집단 샘플 수를 증가시킬 필요성을 지적할 수 있는 일관되는 약물 동력학적 패턴이 생성되지 않았다. 10 내지 30 분 째에 뇌에 대한 표적화가 증가된 경우, 이는 선행 관찰에 의해 설명될 수 있었다. HA는 혈액-뇌 차단층을 가로지르는 약물의 능력을 증대시키는 것과 관련있다(Nelson & Falk, 1994).

30 분 및 1 시간의 시점에서 H와 함께 투여 시 폐에서 5-FU의 수준이 상당히 증가하였다. 폐 대식 세포는 증가된 표적화의 원인일 수 있는 높은 수준의 HA-결합 CD44 동형(Underhill et al, 1993)을 함유하는 것으로 보고되었다. 이는 소 세포 및 대 세포 폐 암종이 CD44 및 RHAMM을 과 발현하는 것으로 보고된(Horst et al, 1990) 폐 암종의 치료에 있어서 치료학적 이점과 관련될 수 있다.

HA가 5-FU와 공동 주입된 1 및 2 시간 시점에서 심장에 대해 표적화된 5-FU는 상당히 증가되었다. 5-FU 투여가 심장독성을 생성시킬 수 있지만(MIMS, 1997), 5-FU를 HA와 함께 투여하는 것은 5-FU를 단독으로 투여하는 경우에 비해 심장에 대한 독성 정도를 감소시킬 수 있다.

HA/5-FU 보조 요법의 치료 효능을 평가할 때, 다수의 관찰 결과들이 장기간 및 단기간 치료 프로토콜 전체를 통해 일관되었다.

HA/5-FU 또는 HA 만을 공급받은 마우스는 보다 많은 에너지를 가지며 체 질량이 유지 또는 증가된 것으로 보였으며, 이러한 관찰은 6-개월 연구에서 HA/5-FU마우스의 증가된 생존 시간에 의해 지지된다.

5-FU/HA 또는 HA를 공급받은 마우스의 종양은 외부적인 괴사 영역을 2 개의 종양이 떨어져 나간 정도로 나타냈다.

5-FU에 대한 HA의 첨가는 상기 요법을 6 주간 공급한 경우 1 차 치료 부피에 대해 상당한 효과를 보이지 않았으나, 이는 종양의 맥관 구조에 기인할 수 있었다. 종양은 3 개의 영역으로 이루어진다. HA를 5-FU와 함께 또는 상기 없이 투여하는 경우, 종양은 손상된 혈관의 넓은 틈 접합부를 통해 맥관 구조가 잘 형성되고 반-괴사된 영역으로 들어간다. HA의 수 흡수 능력으로 인해, 세포외 유체가 상기 종양의 괴사 영역으로 유입되며, 결과적으로 상기 종양의 부피가 증가하게 되고 종양 맥관 구조가 추가로 손상을 일으킬 수 있다. 이러한 가설은 HA±5-FU로 처리된 종양이 괴사 및 종양 세포 내 유체의 누출을 통상적으로 나타내는 관찰 결과와 일치한다. 괴사 대 생육가능한 세포 면적 및 건조:습윤 질량 비의 계산이 완성되면 이러한 가설을 입증할 수 있을 것이다.

장기간 효능 연구는 도 21에 나타낸 바와 같이 HA/5-FU 치료를 받은 마우스에 대해서 증가된 생존율을 보였다. 이들 마우스의 평균 종양 부피는 또한 다른 치료 그룹에 비해 감소된 것으로 나타났다. 또한, 장기간 연구에서 HA/5-FU 그룹에 대한 사망 원인의 대부분이 대사 스트레스로 인한 것인 반면, 5-FU 그룹의 사망 원인은 보다 종양 크기가 커짐에 기인한 고정화에 기인한 것임이 주목되었다. HA만을 공급받은 마우스들은 모두 독성에 기인한 것이 아닌 너무 큰 종양에 기인한 고정화에 의해서 사망하였다. 따라서 HA는 어떠한 독성 효과도 제공하지 않는듯 하다. 표적화 결과로부터, 5-FU의 증가된 표적화는 HA를 5-FU와 함께 종양에 투여하는 경우 일어나는 것으로 밝혀졌다(도 12). 5-FU를 HA 특이적인 수용체인 CD44 및 RHAMM에 대한 HA의 결합을 통해 종양에 표적화시키는 HA의 능력(이는 종양 부위에서 증가된 양의 존재로 나타났다)(Culty et al, 1994; Wang et al, 1996)은 HA를 5-FU 및 다른 세포독성 약물과 함께 사용하는 것이 임의의 치료 충격으로 종양을 치료하기에 충분치 못한 약물의 문제점을 극복하는데 도움을 줄 수도 있음을 반영한다. 또한 단기간 연구에서, 5-FU/HA 마우스는 모든 다른 그룹들에 비해서 체 질량이 상당히 증가한 것으로 나타났다(도 21). 결과적으로, HA의 종양 부위로의 표적화 능력은 장과 같은 다른 기관으로 가는 5-FU의 양을 감소시킬 수 있으며, 이렇게 함으로써 특히 위장 독성에서 5-FU 요법과 관련된 치료 부작용들을 감소시킬 수 있다.

실시예 1 내지 3에 개시된 MTX/HA 보조 요법에 대한 선행의 평가에 비해, 본 발명자들은 표 10에 개략된 바와 같은 약간 독특한 공통적인 결과와 차이점들에 주목했다.

상기 두 연구에서 주요 차이점은 종양의 출발 질량으로, MTX/HA 연구에서는 평균 종양 부피가 5-FU/HA 연구의 61.63 ㎣에 비해 175.3 ㎣이었다. 종양으로의 입자 운동의 동력학 및 환자의 종양 부피에 대한 반응을 통해, 상기는 TDT 평가와 관련하여 수득된 상이한 결과들을 설명할 수 있다.

실시예 12

히아루로난과의 복합 요법의 치료 효능

인간의 1 차 및 전이성 유방암에 대해 가장 통상적으로 사용되는 치료 섭생들 중 하나는 28 일 주기의 1 일 및 8 일에 투여되는 사이클로포스파미드(Cyc), MTX 및 5-FU와의 복합 화학요법이다. 종종 CMF라 칭하는 상기 복합 요법은 대개 환자의 상태를 재평가하는 6 주기로 제공된다. CMF 요법에 의한 항종양 반응율은 대략 50%인 것으로 보고되었으나(Bonadonna, 1981; Bonadonna, 1988), 상기 요법은 피로, 오심, 백혈구 감소증 및 구토와 같은 많은 관련 부작용들을 갖는다(Bonadonna, 1976; Meyerowitz, 1979). MTX 및 5-FU 모두에 대한 약물 전달 비히클로서의 HA의 성공적인 사용으로 인해, 6-주 및 6-개월 치료 섭생에 대한 HA/CMF 보조 요법의 치료 효능 및 독성을 평가하였다.

상기 MTX 및 5-FU를 각각 실시예 2 및 6에 전술한 바와 같이 제조하였다. 모액 농도의 Cyc를 동결건조된 약물 1 g을 주입 등급의 발열원 비 함유 증류수 1 ㎖에 용해시켜 제조하고 주입 등급의 0.9% 염화 나트륨으로 50 ㎖로 만들었다. 상기 모액을 소 분량들로 나누고 사용할 때 까지 -20 ℃에서 동결시켰다.

적합한 부피의 약물 모액을 하기의 최종 약물 농도로 만들어 CMF 주입액을 제조하였다:

5-FU 30 ㎎/㎏(모액: 20 ㎎/㎖)

MTX 15 ㎎/㎏(모액: 24.5 ㎎/㎖)

Cyc 26 ㎎/㎏(모액: 20 ㎎/㎖)

HA 12.5 ㎎/㎏(모액: 10 ㎎/㎖)

상기 CMF/HA 보조 요법의 치료 효능 및 임의의 가능한 독성을 확립시키기 위해서, 누드 마우스 중의 인간 유방 종양 이종 이식편을 사용하였다. 인간 치료 섭생을 가능한 한 가깝게 모사하기 위해서, 마우스를 6 주기(6 개월)의 장기간 효능 연구 및 6 주기(6 주)의 단기간 효능 연구에서 6 주기로 처리하였다. 마우스를 단기간 연구에 대해서 그룹 당 8 마리씩 7 그룹 및 장기간 연구에 대해서는 8 마리씩 5 그룹으로 랜덤하게 나누었다.

마우스를 6 주 동안의 7 일 섭생 중 1 일 및 2 일에, 또는 6 개월 동안의 28 일 섭생 중 1 일 및 8 일에 5-FU 30 ㎎/㎏; MTX 15 ㎎/㎏; Cyc 26 ㎎/㎏±12.5 ㎎/㎏으로 처리하였다. 대조군은 염수, HA 12.5 ㎎/㎏, 또는 1 일에 HA 12.5 ㎎/㎏에 이어서 2 일에 CMF 12.5 ㎎/㎏을 투여하는 것으로 이루어졌다. 마우스를 임의의 치료 독성에 대해서 매일 감시하고 종양 질량을 매일 또는 매주 기준으로 측정하였다(표 11 참조).

표 12a 및 12b에 나타낸 바와 같이, 6-주 연구에서 하기의 결과들이 관찰되었다:

1). HA(CMF/HA, HA에 이은 CMF, 또는 HA 단독)를 함유하는 치료 섭생을 제공받은 마우스는 CMF 단독 그룹에 비해 50%의 증가된 생존율을 나타냈다. CMF 처리 그룹에 대한 평균 생존 시간은 다른 모든 그룹들의 42 일에 대해 40.4 일이었다.

2). HA와 CMF가 함께 처리된 동물들은 모두 CMF 단독 또는 HA 단독으로 처리된 동물들에 비해 상당한 체중 증가(t-시험, p<0.001)를 나타냈으며, 건강도 향상된 것으로 나타났다(도 22 참조).

3). 염수 처리된 마우스(처리 대조 그룹이 아님)의 종양 배가 시간이 다른 처리 그룹들 보다 현저하게 작았으나(t-시험, p<0.001), 다른 처리 그룹들 간에는 통계학적으로 현저한 차이가 없었다(도 23 참조).

4). 1 차 종양의 최종 부피와 관련하여 CMF와 CMF/HA 처리 그룹들간에 상당한 차이가 있었으며(t-시험, p<0.001), 이때 CMF는 동물의 7/8에서 종양 질량을 감소시킨 반면, CMF/HA는 단지 동물의 3/8에서 1 차 종양 부피를 감소시켰다.

5). 마우스를 HA±CMF로 처리한 경우 치료 독성들이 주목되지 않은 반면, 마우스를 CMF 만으로 처리한 경우 피로, 결막염, 일반적인 불량한 건강 상태의 징후가 나타났다.

CMF/HA 또는 HA 요법을 28 일 주기의 1 일 및 8 일에 제공하는 경우, 하기의 결과들이 관찰되었다:

처리 그룹들 간의 생존 시간은 현저한 차이가 없었다.

1). 처리 그룹들 간의 체중 증가는 현저한 차이가 없었다.

2). HA±CMF를 공급받은 마우스의 1 차 종양은 작은 괴사 영역과 딱지의 형성을 나타냈다.

3). 1 차 종양의 치료에서, 단독 약제로서의 CMF는 염수 및 HA 처리에 비해 치료 효능을 나타내지 않았다. HA를 CMF에 첨가한 결과 1 차 종양이 상당히 커졌다(t-시험, p=0.001).

상기 연구로부터 하기의 결론을 이끌어낼 수 있다:

1). HA/CMF 보조 요법의 장기간 투여(6-개월)는 치료 효능을 증가시키거나치료 부작용을 감소시키지 못했다.

2). HA/CMF 보조 요법의 단기간 투여(6-주)는 단독 처리로서 CMF의 투여에 비해 많은 이점들을 나타낸다.

3). 현저한 체중 증가.

4). 치료 완료 동물 수의 50% 증가.

5). 피로, 결막염, 식욕 부진과 같은 부작용의 제거.

6). HA를 공급받은 마우스는 어떠한 독성 징후도 나타내지 않았다.

실시예 13

화학요법 약물과 HA와의 상호작용 성질에 대한 NMR 연구조사

HA와 화학요법 약물간의 상호작용 성질을 추가로 조사하기 위해서, H 핵 자기 공명(NMR) 분광분석법을 사용하였다.

중수소 옥사이드(²H₂O(99.96%))를 캠브리지 아이소토프 레보라토리즈(Cambridge Isotope Laboratories)로부터 입수하였다. MTX를 파울딩 파마슈티칼스(Faulding Pharmaceuticals)로부터 입수하고 5-FU 및 HA 모액은 전술한 바와 같이 제조하였다.

스펙트럼을 차폐된 구배 유니트와 함께 600 MHz에서 작동하는 브뤼커(Bruker) DRX 분광계 상에서 298 K에서 기록하였다. 2D 실험을 t₁차원으로 구적법 탐색을 위해 시간 비례적인 위상 증분을 사용하여 위상-민감한 방식으로 기록하였다(Marion & Wuthrich, 1983). 상기 2D 실험은 혼합 시간이 120 ms인MLEV-17 회전 차단 시퀀스를 사용하는 TOCSY 시퀀스(Bax&Davis, 1985); 혼합 시간이 250 및 400 ms인 NOESY(Kumar et al., 1980) 및 혼합 시간이 250 ms인 ROESY 스펙트럼을 포함하였다. 탐침의 온도 눈금 측정은 에틸렌 글리콜 화학 이동과 비교하여 성취하였다. 모든 화학 이동(ppm)은 4,4-디메틸-4-실라펜탄-1-설포네이트(DSS, 0 ppm)의 메틸 공명을 기준으로 하였다.

NOESY, ROESY 및 TOCSY 실험에 대한 수 신호의 용매 차단은 1 ms의 2 구배 펄스를 2 항 3-9-19 펄스의 어느 한쪽에 적용시키는 변형된 WATERGATE 시퀀스(Piotto et al, 1992)를 사용하여 성취되었다. 스펙트럼은 F₂차원의 4096 복합 데이터 점들 및 F₁차원의 512 증분과 함께 6024 Hz 상에서 통상적으로 얻어졌으며, 이때 TOCSY 실험에 대해서는 32 스캔/증분이, NOESY에 대해서는 80 스캔이 사용되었다. 느리게 교환되는 NH 양자들이 16K 데이터 점들에 대해서 32 스캔으로 획득된 일련의 1 차원(1D) 스펙트럼을 획득함으로써 검출되었다.

NMR 확산 실험은 500 MHz에서 작동하는 구배 조절 유니트가 장착된 브뤼커 AMX 분광계 상에서 성취되었다. 모든 실험들은 16K의 데이터 점들 및 7575 Hz 상에서 298K에서 16 또는 64 스캔을 사용하여 성취되었다. 15.44 G/㎝의 구배 강도를 상기 확산 실험에 사용하였다. 각각의 확산 실험은 지연되고(τ=20 ms, Δ=50 ms, T=30 ms 및 T_e=14 ms) G의 크기가 일정하게 유지되지만 장 구배 펄스(δ)의 길이는 최종 스펙트럼에서 0.2 ms에서 12.2 ms까지 1 ms 단계로 증분되는 일련의 12 PFGLED 스펙트럼으로부터 성취되었다.

모든 스펙트럼을 Xwinnmr(브뤼커) 소프트웨어를 사용하는 실리콘 그래픽스 인디고 워크스테이션(Silicon Graphics Indigo workstation) 상에서 처리하였다. 2D 실험을 위해서, t₁차원을 2048개의 실제 데이터 점들에 제로-충전시키고, 90 위상-이동된 사인-벨 윈도우 기능을 푸리에 변환 전에 적용시켰다.

상기 NMR 실험은 HA의 첨가에 대한 MTX의 H NMR 스펙트럼의 변화를 감시하기 위해서 고안되었다. 상기 약물 MTX의 특정한 스펙트럼 변화, 예를 들어 피크의 확장 또는 이동을 감시함으로써 상기 약물 분자의 어떤 부분(존재하는 경우)이 HA와 상호 작용하는지를 볼 수 있게 한다. 도 24는 H₂O 중에 용해된 MTX의¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 이 스펙트럼은 메토트렉세이트 중의 각 수소 그룹들을 쉽게 확인시킨다.

메토트렉세이트

메토트렉세이트는 히아루로난 분자와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 다수의 작용기들을 갖는다. MTX의 2,4-아미노-프테리딘 방향족 고리 상의 1 급 아민 잔기는 히아루로난 분자 상의 카복실 그룹과 이온 결합을 형성할 수 있다. 또 다른 가능성으로는 메토트렉세이트 상의 아민 그룹과 히아루로난의 탄수화물 고리 상의 하이드록실 그룹 간의 수소 결합 상호작용이 있다. MTX의 소수성 방향족 고리와 중첩된 히아루로난 중합체 상의 소수성 패치 간에 소수성 상호작용이 또한 가능하다. 이러한 상호작용들이 도 25에 예시되어 있다.

메토트렉세이트와 HA간에 특정한 상호작용이 존재하는지에 대한 문제를 다루기 위해서 HA 첨가 시 MTX의¹H NMR 스펙트럼의 변화를 감시하는 NMR 실험을 고안하였다. 도 26은 600 MHz 및 298 K에서의 히아루론산의 600 MHz 스펙트럼을 나타낸다.

도 27은 HA(50 kDa)를 298K에서 HA가 2 나노몰, 10 나노몰, 20 나노몰 및 80 나노몰로 증분 첨가되는 MTX와 MTX 단독에 대한 600 MHz¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 이들 스펙트럼은 메토트렉세이트의 어떠한 피크도 화학적 이동 위치의 변화가 없음을 나타낸다. 연속 첨가되는 HA의 양에 따라 스펙트럼에 나타나는 추가의 피크들은 히아루론산으로 인한 공명과 완전히 일치한다. 이러한 스펙트럼에서 MTX의 임의의 공명의 화학적 이동 위치의 변화가 없기 때문에, HA 분자와 상호작용하는 MTX 분자의 특정한 부분은 없는 것으로 보인다.

MTX 상의 NH 그룹과 HA 상의 산 그룹 간의 강한 상호작용이 있는지의 여부를 결정하기 위한 하나의 방식은 NH 양자들의 교환속도를 측정하는 것이다. 이들 수소는 불안정하며 벌크 용매와 쉽게 교환될 수 있다. 그러나, 이들이 HA 분자와 강한 상호작용을 수반하는 경우, 이들은 상기 벌크 용매로부터 보호되고 이들의 교환 속도는 감소할 것이다. 이러한 실험에서, MTX의 아민 수소는 D₂O의 중수소와 교환되고 교환 속도는 MTX와 HA 간의 상호작용 강도에 대한 정성적인 추정을 제공할 것이다. 0.5% w/v Na₂CO₃(pH 9)에 용해된 MTX와 HA의 용액에 중수소 산화물을 가하여 제조된 용액의¹H NMR 분석은 4 분 내에 MTX의 모든 아민 수소들이 샘플 중의 중수소와 교환됨을 나타내었다. 이러한 결과는 MTX의 아민 수소가 벌크 용매와의 교환을 차단하지 않음을 시사한다.

아민 수소 피크가¹H NMR 스펙트럼에서 사라지는 이유는 중수소가 수소와 매우 다른 공명 진동수를 가지며 따라서¹H NMR 스펙트럼에 나타나지 않기 때문이다. 폴리펩티드 중의 아미드 수소 주쇄와 단백질이 용매로부터 보호되는지의 여부를 시험하기 위해서 유사한 실험들을 통상적으로 사용한다. 단백질의 아미드 수소가 α-나선 및 β-시이트 2 차 구조를 안정화시키는 수소 결합 배열과 관련되는 경우, 이들 수소의 교환 속도는 종종 극적으로 감소된다. 몇몇 경우에 이러한 상호작용에 관련된 수소 신호들은 상기 상호작용의 강도 및 그의 벌크 용매로부터의 보호(예를 들어 단백질의 소수성 코어)에 따라 수 시간, 수일 또는 심지어 수 개월간 지속될 수 있다.

확산 실험을 MTX 단독 및 HA의 존재 하에서 수행하였다. 이들 실험은 포집된 MTX의 확산이 HA 틀 구조의 존재에 의해 지연되는지를 가리킬 수 있다. 중복적인¹H NMR 확산 실험의 결과는 거의 대다수의 MTX 분자에 대해서 MTX 확산 속도의 지연이 존재하지 않는데, 그 이유는 MTX와 HA 존재 하의 MTX의 확산 계수 간의 차이가 무시할만한 것이기 때문임을 지적하였다. 이러한 발견은 HA 틀 구조에 상기 약물이 상기 매질내에 자유롭게 확산되도록 하는 HA 분자들 간의 넓은 용매 공간이 존재함을 시사할 수 있다.

상기 확산 실험은 MTX 분자의 부피가 HA 틀 구조 전체를 통해 자유 확산됨을시사한다. 이러한 시나리오는 작은 비율(말하자면 MTX 분자의 5%)이 HA 분자에 비-특이적인 방식으로 약하게 상호작용함을 고려하지 않은 것이다.

선행 실험들로부터, MTX가 HA와 강하게 상호작용하지 않으며, 상호작용은, 존재하는 경우, 특이적이지 않은 것이 분명하다. 비-특이적인 결합에 대한 리간드의 약한 결합(10^-3내지 10^-7M)을 시험하기 위한 한가지 방식은 모사된 NOESY 실험을 실행하는 것이다. 상기 2D 실험에서 리간드가 거대분자 HA에 약하게 결합하는 경우 교차피크가 나타날 것이다. MTX/HA의 모사된 NOESY 스펙트럼은 MTX와 HA 간의 무시할만한 상호작용을 암시하는 HA에 대한 MTX의 결합에 기인하는 교차피크가 없음을 나타내었다.

작은 비율(말하자면 MTX 분자의 5%)이 HA 분자에 비-특이적인 방식으로 약하게 상호작용하는지의 여부를 추가로 검사한다. ROESY 스펙트럼의 피크는 심지어 자유 상태와 HA에 결합된 상태 간의 MTX 분자의 화학적 교환이 작은 비율로 존재하는지의 여부를 보여준다. 250 ms ROESY 스펙트럼은 MTX의 작은 퍼센트 조차도 HA와 상호작용하지 않음을 암시하는 임의의 화학적 교환 피크를 나타내지 않았다.

5-플루오로우라실

도 28은 298K에서 70.0과 8.5 ppm 사이의 5-FU 및 HA(750 kDa, 3 ㎎/㎖)를 갖는 5-FU(1.25 ㎎/㎖, 1.6 ㎎/㎖ 및 6.4 ㎎/㎖)의 600 MHz¹H NMR 스펙트럼을 나타낸다. 상호작용의 여부를 조사하기 위한 초기의 실험들을 50 kDa 히아루론산을사용하여 수행하였다. 5-FU와 HA간에 상호작용은 관찰되지 않았다(데이터 없음). 상호작용이 사용된 HA의 분자량에 따라 변하는지를 조사하기 위해서, 추가의 적정 실험을 750 kDa 히아루로난을 사용하여 수행하였다. 사용된 5-FU의 농도는 스웨덴 임상 실험 제법에 수행되었던 킹스 칼리지 런던 제형화 연구(Kings College London formulation studies)의 HA/5-FU 보조 요법과 동일하다. 이러한 농도는 주입 주머니에서 HA/5-FU의 혼합에 사용되는 농도 및 또한 추정되는 혈장 중의 HA/5-FU 농도를 모사하기 위해서 고안되었다. 불행하게도, 5-플루오로우라실의 아민 공명은 이들 제형의 pH(8.8 내지 9.1)에서 벌크 용매 수와 급속히 교환되며, 따라서 이러한 공명들은 5-FU의 스펙트럼에서 볼 수 없다. 오직 하나의 CH 공명만을 5-FU의 스펙트럼에서 볼 수 있다. 상기 용액의 pH를 낮추는 것은 가능하지 않은데, 그 이유는 상기 5-FU가 보다 낮은 pH 값에서는 상기 용액으로부터 석출될 것이기 때문이다. 상기 스펙트럼은 5-FU의 CH 피크의 화학적 이동 위치가 변하지 않음을 나타낸다. 이러한 스펙트럼은 상기 5-FU가 HA 분자와 상호작용하지 않음을 가리킨다.

확산 실험을 5-FU 단독 및 HA의 존재 하에서 수행하였다. 표 13에 나타낸 중복적인¹H NMR 확산 실험의 결과는 5-FU 단독과 HA 존재 하의 5-FU의 확산 계수 간의 차이가 무시할만한 것이기 때문에 5-FU의 확산이 히아루로난의 존재에 의해 지연되지 않음을 가리킨다.

2D 실험, NOESY 및 ROESY: 5-FU에 대한 2D 실험들은 가능하지 않은데, 그 이유는 그의¹H NMR 스펙트럼에서 오직 하나의 공명만을 볼 수 있기 때문이다.

히아루로난 존재 하의 MTX 및 5-FU의 NMR 분석은 MTX에 대해서 적정 실험, 중수소 교환 실험, 확산 실험 및 모사된 NOESY 실험을 사용하며, 5-FU에 대한 적정 실험 및 확산 실험은 화학요법 약물과 히아루로난간에 어떠한 상호작용도 탐지될 수 없음을 나타내었다. 이러한 결과는 히아루로난 네트워크에 의한 화학요법 약물의 포집이 발병 부위로 전달되는 약물의 양을 증가시키기에 충분함을 시사한다. 이러한 결과는 또한 상호작용이 탐지되지 않은 겔 여과 크로마토그래피, 평형 투석 및 히아루로난과 MTX 및 5-FU 간의 분자 상호작용에 대한 CD 분광분석법을 사용하는 선행 연구들과 전적으로 일치된다.

참고문헌

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Claims (12)

1. 히아루로난과의 공동 투여에 의해 세포독성제 또는 항종양제의 암 세포-사멸 능력이 증대되는, 상기 약제와 히아루로난과의 공동 투여 단계를 포함하는

   상기 약제의 유효성 증대 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 약제가 메토트렉세이트, 패클리탁셀(탁솔), 5-플루오로우라실, 사이클로포스파미드 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
3. 전신적으로 투여되는, 히아루로난과 세포독성제 또는 항종양제를 포함하는 세포독성 또는 항종양성 약학 조성물.
4. 제 3 항에 따른 약학 조성물의 투여 단계를 포함하는, 세포독성제 또는 항종양제의 유효성 증대 방법.
5. 세포독성제 또는 항종양제를, 상기 약제를 수용하고/하거나 상기 약제와 결합할 수 있고 내성 세포 상의 수용체에 결합하거나 다량 세포 이물 흡수를 통해 상기 세포 내로 들어갈 수 있는 뮤코폴리사카라이드와 함께 공동 투여하는 단계를 포함하며, 이때 상기 약제가 상기 세포 내로 전달되어 치료학적으로 활성으로 되는

   약물 내성의 감소 또는 극복 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 뮤코폴리사카라이드가 내성 세포의 표면 상에 결합할 수 있으며, 수용되거나 결합된 약제가 상기 뮤코폴리사카라이드로부터 상기 세포내로 확산되는 방법.
7. 약물을, 상기 약물이 단독으로 투여되는 경우보다 더 오랜 기간 동안 세포 내에서 유지되도록 하는 방식으로 상기 약물과 회합되는 뮤코폴리사카라이드와 공동 투여하는 단계를 포함하는, 약물의 유효성 증대 방법.
8. 약물 내성 질병의 치료가 필요한 환자에게 히아루로난과 약물을 공동 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질병의 치료 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 약물 내성 질병이 약물 내성 암인 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 암이 메토트렉세이트, 패클리탁셀(탁솔), 5-플루오로우라실, 사이클로포스파미드 및 이들의 혼합물 중 하나 이상에 대해 내성인 방법.
11. 약물을, 상기 약물이 단독으로 투여되는 경우보다 더 오랜 기간 동안 암 세포 내에서 유지되도록 하는 방식으로 상기 약물과 회합되고/되거나 상기 약물을 수용하거나 또는 상기 약물과 결합할 수 있는 뮤코폴리사크라이드와 상기 약물을 공동 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
12. 약물을, 상기 약물이 감소된 위장 독성을 갖도록 하는 방식으로 상기 약물과 회합되고/되거나 상기 약물을 수용하거나 또는 상기 약물과 결합할 수 있는 뮤코폴리사카라이드와 공동 투여하는 단계를 포함하는, 약물의 위장 독성 감소 방법.