JP5027387B2 - ヒアルロナンオリゴマーにより多剤耐性を阻害する方法及び組成物 - Google Patents

Description

本発明は癌細胞の多剤耐性を阻害する組成物及び方法に関する。

癌細胞の多剤耐性には挫折した多くの化学療法がある。全ての組織の重要な部分は細胞外マトリックスである。このマトリックスは、組織や器官に構造的な完全性を与え、個々の細胞及び一群の細胞に支持性を与える。近年、細胞外マトリックス成分も細胞の振る舞いに難解な影響を与えることが明らかになってきた。特に興味深いのは、成熟組織において細胞を規格化する、すなわち、細胞が不適切な分化や移動を受けることを制限するという、その能力である。一方、細胞外マトリックスの他の組み合わせは、胎生期成長や傷の治癒の時期において動的な細胞の振る舞いを可能にする。したがって、細胞外マトリックスは、しばしば特別な環境下において正常な細胞のための「文脈（context）」を与えることが明らかになってきている。

最近の研究により、悪性の振る舞いの抑制における正常型の細胞−細胞外マトリックス相互作用の重要性と、悪性の特徴の発生と成長における異常型の細胞−細胞外マトリックス相互作用の潜在的な役割とに注目が集められている。ヒアルロナン（ hyaluronan ）（ヒアルロン酸又はＨＡとしても知られる）は、普遍的に存在する大きな細胞外のポリサッカライドであり、腫瘍成長に含まれる細胞外マトリックス成分である。

解決するための手段

＜要約＞
本発明は、第一に多剤耐性細胞の治療ための医薬組成物に関する。この組成物は「ｉｎ ｖｉｖｏで発生するＨＡ相互作用の競合剤（ＣＨＩ）」を含有する。例えば、ＣＨＩはＨＡ受容体のリガンドであり、又はＨＡに結合することが可能なデコイ（decoy）である。本発明は、薬剤に対する細胞の耐性を低下させる効果的な投与量のＣＨＩを提供する。

ここで、「ヒアルロナン受容体リガンド」は、組織中のヒアルロナンに高い親和性と特異性によって結合する薬剤と定義される。この薬剤としては、グリコサミノグリカン、小分子、又は抗体を挙げることができる。好適なグリコサミノグリカンの例としてＨＡオリゴマーが挙げられ、これは内因性ＨＡポリマーの受容体結合と競合する。ＨＡに結合することができるデコイの例としては、ＨＡ結合蛋白（ＨＡＢＰ）を挙げることができ、これは内因性ＨＡ受容体と相互作用することができる内因性ＨＡの濃度を低下させることによってｉｎ ｖｉｖｏでＨＡに結合する。ＨＡＢＰの例としては溶解性組換えＨＡ受容体を挙げることができ、これはＨＡ受容体をコードする遺伝子から標準的な方法によって遺伝子工学的に得ることができる。このような溶解性組換え受容体蛋白は、ｉｎ ｖｉｖｏで多剤耐性細胞に感受性を与え、次の投薬は内因性ＨＡに結合することによってＨＡデコイとして働き、内因性受容体と競合することによって、ＨＡオリゴマーの投薬に続くここで示される経路によりそれらの受容体からのシグナル伝達を減少させるために使用することができる。

ＨＡは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから構成されるジサッカライド・サブユニットの大きなポリマーとして内因性に生産される。ここで述べるように、市販の好適なＨＡオリゴマーは、少なくとも三つのこれらのジサッカライド・サブユニット、例えば、少なくとも六つのジサッカライド・サブユニットを含む。ＨＡポリマーは、抗癌剤に多剤耐性を有する細胞の耐性を低下させるように働かないので、オリゴマーは５，０００未満のジサッカライド・サブユニット、例えば、７５０未満のジサッカライド・サブユニット、さらには２００未満のジサッカライド・サブユニットを含む。

投薬した治療用薬剤としてｉｎ ｖｉｖｏで延長した半減期をもつ産生物を生成するため、または他の有利な特徴を与えるため、ＨＡオリゴマーを誘導化することができる。いずれの炭水化物ポリマーと同様に、例えば、アルキル化、アルコキシ化、及び還元されたＨＡ誘導体から、誘導化ＨＡオリゴマーを調製することができる。さらに、ＨＡは先ずオリゴ化し（例えば、ヒアルロニダーゼで消化し）、次に誘導化して消化することができる。

誘導化されたＨＡは、多くの異なる置換基が証明されている。すなわち、カルボジイミド（Ｋｕｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ ２（４）：２３２−４１）、Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ（Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １９（４）：３９６−４０２）、ステロイド性および非ステロイド性の抗炎症剤の共有結合が結合できるアミン様の官能基（Ｐｏｕｙａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ ５（４）：３３９−４７）、ＨＡのカルボン酸部分のヒドラジド修飾（Ｐｒｅｓｔｗｈｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３：９３−１０３）、及びポリプロピレン、ポリスチレン、及びポリテトラフルオロエチレン（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１：３１０６）である。

多剤耐性細胞は癌細胞または細菌細胞であり得る。したがって、細胞が耐性になり得る少なくとも一つの薬剤は一般的に抗癌剤である。有効投与量は薬剤に対する細胞の感受性をリガンドを持たない対照細胞と比較して４０％から９０％上昇させる。例えば、少なくとも９０％、例えば、有効投与量は薬剤に対する細胞の感受性をリガンドを持たない対照細胞と比較して９０％から９５％、９０％から９９％上昇させることをここに示す。

特定の有用な具体的態様において、抗癌に対する細胞の感受性を改善し、また抗癌剤を含有する組成物は、一方において追加的な治療剤を含有することができる。この追加的な治療剤は、抗不安剤、抗嘔吐剤、抗疲労剤、サイトカイン、降圧剤、及び抗感染剤からなる薬剤の群から選択される。一方、追加的な治療剤は増血剤または造赤血球剤であり、例えば、エリスロポエチンである。

さらに、追加的治療剤は多剤耐性の阻害剤であり得、例えば、ＨＡ受容体のリガンドではない。この阻害剤は、例えば、ベラパミル、シクロスポリンＡ、シクロスポリンＤ、レゼルピン・アナログ、トリフルオロペラジン、タモキシフェン、ベラパミルＲアイソマー、ＳＤＺ ＰＳＣ−８３３、ＭＳ−２０９、Ｓ−９７８８、ＧＦ１２０９１８、及びＬＹ３３３５９７９を挙げることができる。

例示的な多剤耐性癌細胞には、黒色腫（ melanoma ）、結腸癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、神経膠質腫のような脳腫瘍、肺癌、食道癌、乳癌、前立腺癌、頭と首の癌、卵巣癌、腎臓癌、及び肝臓癌に由来する癌からの細胞が含まれる。

前記細胞が細菌の具体的態様において、具体的な属には、アクチノバチルス（Actinobacillus）、バチルス（Bacllus）、ボレリア（Borrelia）、ブルセラ（Brucella）、カンピロバクター（Campylobacter）、クラミディア（Chlamydia）、クロストリディウム（Clostridium）、コシエラ（Coxiella）、エンテロコッカス（Enterococcus）、エシェリヒヤ（Escherichia）、フランシセラ（Francisella）、ヘモフィルス（Hemophilus）、レジオネラ（Legionella）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ネイセリア（Neisseria）、パストゥレラ（Pasteurella）、ニューモフィリア（Pneumophlia）、シュードモナス（Pseudomonas）、リケッチア（Rickettsia）、サルモネラ（Salmonella）、シゲーラ（Shigella）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、トレポネマ（Treponema）、及びエルシニア（Yersinia）が含まれる。

本発明に記載された組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重の有効投与量で投与することができる。有効投与量は、例えば、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えば、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇである。好ましい態様において、有効投与量は５ｍｇ／ｋｇ体重である。前記組成物は薬物学的に許容される佐薬を含有することができる。

ＨＡ受容体に高い特異性と親和性で結合する抗体である前記組成物は、例外なく、ＣＤ４４、ＣＤ１６８（ＲＨＡＭＭ）、ＨＡＲＥ（Ｗｅｉｇｅｌ ｅｔ ａｌ ２００２ ＢＢＲＣ ２９４：９１８−９２２）、ｌｙｖｅ−１（Ｂａｎｅｒｊｕｅｔ ａｌ．１９９９ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４４：７８９）、ｌａｙｌｉｎ（Ｂｏｎｏｅｔ ａｌ．２００１ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２：８９１）、Ｔｏｌｌ−４（Ｔｅｒｍｅｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９５：９９）のなどのＨＡ受容体にも特異的であり得る。さらに、これらのＨＡ受容体または他のどのＨＡ受容体でも溶解型の受容体をコードするように遺伝子組み換え操作を行うことができる。この溶解型の受容体はＨＡ相互作用の競合剤として、特にＨＡに結合し、ＨＡと内因性の膜結合型の受容体との間の相互作用の強さを減少させるデコイとして働くことができるＨＡＢＰである。

本発明において提供される他の態様は、抗癌療法における同時の、または分離した、または連続的な使用のための組み合わせ調製物としてのヒアルロナン受容体リガンド及び抗癌剤を含有する製品である。例えば、抗癌療法における同時の、または分離した、または連続的な使用のための組み合わせ調製物としてのヒアルロナン・オリゴマー調製物及び少なくとも一種の抗癌剤を含有する製品が挙げられる。関連する態様として、本発明はヒアルロナン受容体及び抗癌剤の組み合わせ、ヒアルロナン・オリゴマーと少なくとも一種の抗癌剤の組み合わせ、並びに、単一組成物として処方されたこれらのいずれかの組み合わせ、及び分離した組成物として処方されたこれらのいずれかの組み合わせを提供する。本発明は、また、これらのいずれかの組み合わせを含有する医薬を処方することを含む、癌患者治療用の医薬の調製方法を提供する。

本発明における他の態様は、多剤耐性癌の治療のための方法である。この方法は、耐性を獲得した細胞に、ヒアルロナン相互作用の競合剤と少なくとも一種の抗癌剤とを含有する組成物とともに、少なくとも一種の抗癌剤を接触させることを含む。この場合、前記競合剤は前記細胞に抗癌剤に対する感受性を与えることにより癌を治療する。

本発明において他の方法は、放射線に耐性の癌の治療に用いられる。この方法は、耐性を獲得した細胞に、ＨＡ相互作用の競合剤と少なくとも一種の抗癌性の放射線源を含有する組成物とともに少なくとも一種の抗癌性の放射線源を接触させることを含む。この場合、前記競合剤は前記細胞に抗癌剤に対する感受性を与えることにより癌を治療する。前記細胞は、被験者において癌細胞であり得る。さらに、前記競合剤はＨＡオリゴマーである。前記方法は癌の進行を評価することをさらに含む。これらの方法のいずれにおいても、ＨＡオリゴマーは抗癌剤に対する細胞の感受性を与え、細胞の成長と生存力を阻害するための有効量が投与される。また、ＨＡオリゴマーに接触させるということは、プログラム化された細胞死を誘導する十分な量を患者に投与することである。

関連する態様として、本発明は放射線に耐性の癌の治療薬の調製方法を提供する。この方法は、ヒアルロナン相互作用の競合剤を含有する医薬を処方し、耐性を獲得した細胞に、前記医薬と少なくとも一種の抗癌性の放射線とともに、少なくとも一種の抗癌性の放射線を接触させることを含む。この場合、前記競合剤は前記細胞に抗癌性の放射線に対する感受性を与えることにより癌を治療する。本発明はさらに、前記細胞が患者の中に存在する場合のこれらの方法も提供する。ヒアルロナン相互作用の前記競合剤は、例えば、ヒアルロナン・オリゴマーである。これらの方法とともに、さらに他の工程が癌の進行を評価することを含むことができる。ヒアルロナン・オリゴマーに細胞を接触させるということは、抗癌剤または抗癌性放射線に対する細胞の感受性を与え、細胞の成長及び生存力を阻害するための有効量を投与することである。例えば、前記投与量はプログラム化細胞死またはアポトーシスを誘導するのに十分な量のことである。

本発明において他の方法は、多剤耐性癌を治療するものである。この方法において、患者は、抗癌剤と、例えば、ヒアルロナン・オリゴマーなどのヒアルロナン受容体リガンドのようなヒアルロナン相互作用の競合剤とのそれぞれの治療有効量を投与される。本発明における他の方法は、抗癌剤とヒアルロナン・オリゴマーとのそれぞれの治療有効量を必要とする患者に投与することを含む、多剤耐性癌の治療に関するものである。前記抗癌剤とヒアルロン・オリゴマーとは、同時に投与することも、別々に投与することもでき、例えば、連続的に投与することもできる。前記癌としては、黒色腫、結腸癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、神経膠質腫、肺癌、食道癌、乳癌、前立腺癌、頭と首の癌、卵巣癌、腎臓癌、及び肝臓癌が挙げられる。

さらに他の態様として、本発明は多剤耐性癌を治療するための医薬を調製する方法を提供する。この方法は、抗癌剤とヒアルロナン相互作用の競合剤とのそれぞれの治療有効量を含有する医薬の処方を含む。この抗癌剤とヒアルロナン相互作用の競合剤は、例えば、同時に投与される。前記方法の他の態様において、抗癌剤とヒアルロナン相互作用の競合剤とは連続的に投与される。前記癌としては、黒色腫、結腸癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、神経膠質腫、肺癌、食道癌、乳癌、前立腺癌、頭と首の癌、卵巣癌、腎臓癌、及び肝臓癌が挙げられる。

本発明のさらなる他の態様は、抗癌剤に対する細胞の耐性の潜在的な阻害を評価する方法である。この方法は、抗癌性の治療剤および治療可能剤に対する耐性を獲得した癌細胞の第一試料に接触すること、及び前記抗癌性の治療剤および治療可能剤の存在下、前記細胞の第二試料を接触することを含む。この場合、第一試料における強度、及び抗癌剤の非存在下で生育させた細胞の第三対照試料と比較した、第二試料における抗癌性治療可能剤による細胞生存性パラメータの強度減少が、可能性を有する阻害剤が抗癌剤に対する細胞の耐性の治療に有効な組成物であることの指標である。測定すべき細胞生存性パラメータとして、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍サイズ、固定従属コロニーの生成、固定独立コロニーの生成、細胞の大分子合成、細胞数、プログラム化細胞死、細胞カスパーゼ（caspase）活性、細胞ＰＩ３キナーゼ活性、Ａｋｔリン酸化、ＢＡＤリン酸化、ＦＫＨＲリン酸化、Ｆａｓ発現、及びＰＴＥＮフォスファターゼ活性を挙げることができる。

本発明は、一つの態様としてＨＡ受容体リガンドまたはＨＡ受容体デコイ、容器、及び細胞治療用の説明書（ instructions ）を含む多剤耐性細胞の治療用のキットを提供する。細胞としては、例えば、癌細胞または細菌細胞を挙げられる。このキットは、さらに、少なくとも一種の抗癌剤、または少なくとも一種の抗菌剤を含むことができる。前記リガンドとしては、例えば、ＨＡオリゴマーを挙げることができ、前記抗癌剤としては、γ−放射線、アドリアマイシン、メトトレキセート、シスプラチン、パクリタキセル、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＢＣＮＵ（１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア）、カンプトサル、５−フルロウラシル、グリベック、ベルカデ（ＰＳ−３４１）、ＺＤ０４７３、及びオンコビンを挙げることができる。前記説明書は患者の細胞を治療するＨＡオリゴマーの投与を含むことができる。

好適な抗癌剤である追加的な薬剤を、本発明で示すＨＡオリゴマー組成物とともに、本発明の方法とキットを用いて投与することができる。そのような薬剤には、以下の承認薬が含まれるが、これらに限定されない。このような承認薬としては、パミドロネート［pamidronate］（アレディア［Aredia］）、アナストロゾール［anastrozole］（アリミデックス［Arimidex］）、エキセメスタン［exemestane］（アロマシン［Aromasin］）、ブレオマイシン（ブレノキサン［Blenoxane］）、イリノテカン（カンプトサル［Camptosar］）、ロイコボリン、ダウノルビシン、シタラビン（セポシット［CepoCyt］）、エピルビシン（エレンス［Ellence］）、エトポス０９９０１イデ［etopos09901ide］（エトポフォス［Etopophos］）、トレミフェン（タレストン［Tareston］）、レトロゾール（フェマラ［Femara］）、ジェムシタビン［gemcitabine］（ゲムザル［Gemzar］）、イマチニブ［imatinib］（グリベック［Gleevac］）、トポテカン（ヒカムチン［Hycamtin］）、タモキシフェン（ノルバテックス［Nolvadex］）、パクリタキセル［paclifaxel］（タキソール［Taxol］）、ドセタキセル［docetaxel］（タキソテール［Taxotere］）、カペシタビン［capecitabine］（ゼローダ［Xeloda］）、テモキソロミド［temoxolomide］（テモダル［Temodar］）、ニトロソウレア、プロカルバジン（マトラン［Matulane］）、バルルビシン［valrubicine］（ヴァルスター［Valstar］）、及びゴセレリン［goserelin］（ゾラデックス［Zoladex］）がある。例えば、ベルカデ［Velcade］（ＰＳ−３４１；ボルテゾミド［bortezomid］）のような現在臨床試験中の薬剤もＨＡオリゴマー組成物とともに投与することができる。

＜図面の説明＞
図１Ａは、ヒアルロナン・オリゴマーによるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害を示す棒グラフである。ＬＸ−１ヒト肺癌細胞（７日間実験については1.０×１０⁶／動物、１４日間実験については０．５×１０⁶／動物）をヌードマウスに皮下投与した。それぞれ１００μＬまたは２００μＬの、ＰＢＳ単独または１ｍｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマーを溶解したＰＢＳを含むＡＬＺＥＴポンプ（７日間または１４日間）を注射部位に埋め込んだ。これらのポンプは前記オリゴマーを〜０．５μｇ／０．５μＬ／時間の速度で放出した。７日間または１４日間の処置後に、これらの動物を二酸化炭素で安楽死させ、腫瘍重量を測定した。結果を独立した４実験の平均値±Ｓ．Ｄ．として示した。

図１Ｂは、ヒアルロナン・オリゴマーによるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害を示す棒グラフである。ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞（ＬＸ−１として０．５または１．０×１０⁶）を先天性Ａ／Ｊａｘマウスに皮下投与し、さらに図１Ａと同様に処置した。

図２は、ヒアルロナン・オリゴマーによるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害を示す棒グラフである。指数的増殖期カルチャーから回収した、ＬＸ−１ヒト肺癌細胞、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞またはＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞を１００μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマー（ｏ−ＨＡ）存在下または非存在下において、ウェル当たり〜２，５００細胞を６−ウェル・プレートの軟寒天に植えつけた。これらのカルチャーは、３７℃で１４日間インキュベートし、次に０．２ｍｍより大きなコロニーの数を計数した。結果を独立した３実験の平均値±Ｓ．Ｄ．として示した。

図３は、固定独立条件下におけるヒアルロナン・オリゴマーによるアポトーシスの誘導を示す棒グラフである。ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞を、５０または１５０μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマー（ｏ−ＨＡ）、１５０μｇ／ｍＬの分子量〜８０ｋＤａのヒアルロナン・ポリマー（ＨＡ−８０）、１５０μｇ／ｍＬのキチン・オリゴマー、１５０μｇ／ｍＬの硫酸コンドロイチン、または哺乳類ＰＩ３キナーゼ（フォスフォイノシチド ３−キナーゼ）の特異的阻害剤である５０ｎＭのワートマニン［wortmannin］（ＷＭ）の存在下２４時間、無血清培地にサスペンジョンで培養した。次に、アポトーシス細胞を、実施例の箇所で述べるように、分析し計数した。結果を独立した２実験の平均値で示し、総細胞の百分率±範囲として表した。

図４は、ヒアルロナン・オリゴマーによるＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞におけるカスパーゼ−３活性の活性化を示す棒グラフである。細胞を１０、５０または１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー（ｏ−ＨＡ）、１５０μｇ／ｍＬの硫酸コンドロイチン（ＣＳ）、または２０μＭの哺乳類ＰＩ３キナーゼの特異的阻害剤であるＬＹ２９４００２（ＬＹ）の存在下で２４時間、無血清倍地中においてサスペンジョンで培養し、次にカスパーゼ−３活性を分析した。結果を独立した３実験結果を独立した３実験の比活性の平均（４０５ｎｍにおける吸光度／ｍｇ／９０分）±Ｓ．Ｄ．として示した。

図４Ｂは、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞について、図４Ａと同様の測定を示した。

図５Ａは、ヒアルロナン・オリゴマーによるＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞におけるＰＩ３キナーゼ活性の阻害を示す棒グラフである。細胞を１−１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー（ｏ−ＨＡ）または１５０μｇ／ｍＬの硫酸コンドロイチン（ＣＳ）とともに２４時間、サスペンジョンで培養し、総ＰＩ３活性を分析した。ＰＩ３キナーゼ活性はＰＩＰ３への³²Ｐ−燐酸の取り込みとして測定した。結果を独立した３実験の平均値±Ｓ．Ｄ．として計算し、非処理細胞（３実験の平均値±Ｓ．Ｄ．）の百分率として表した。

図５Ｂは、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞について、図５Ａと同様の測定を示した。

図５Ｃは、ＰＩ３キナーゼのα−アイソフォームがキナーゼ活性の測定前に特異抗体によって免疫沈降したことを除いて、ＴＡ３／Ｓｔ細胞における図５Ａと同様の測定を示した。

図５Ｄは、５０及び１５０μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマー（ｏ−ＨＡ）、１５０μｇ／ｍＬのキチン・オリゴマー、１５０μｇ／ｍＬの硫酸コンドロイチン、１５０μｇ／ｍＬの分子量〜８０ｋＤａまたは〜２，０００ｋＤａのヒアルロナン・ポリマー（ＨＡ−８０またはＨＡ−２０００）、５０ｎＭのワートマニン（ＷＭ）、２０μＭのＬＹ２９４００２（ＬＹ）、及び１：５０希釈した抗ＣＤ４４抗体で処理したことを除き、細胞をＴＡ３／Ｓｔ細胞における図５Ｃと同様の測定を示した。図５Ｃ及び５Ｄにおけるものと同様の結果が、ＨＣＴ１１６細胞についても得られた。

図６Ａは、１−１５０μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマー（ｏ−ＨＡ）または１５０μｇ／ｍＬの硫酸コンドロイチン（ＣＳ）により処理したＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞における、ヒアルロナン・オリゴマーによるＡｋｔリン酸化の阻害を示す棒グラフである。細胞溶解産物はリン酸化Ａｋｔについてウェスタン・ブロッティングで分析し、デンシトメトリーにより定量した。Ａ及びＢにおける結果を独立した３実験の平均値で示し、非処理百分率±範囲として表した。

図６Ｂは、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞について、図６Ａと同様の測定を示した。

図６Ｃは、次に示すＴＡ３／Ｓｔ細胞からリン酸化されたＡｋｔのウェスタン・ブロットを示す。１．未処理 ２．１５０μｇ／ｍＬ硫酸コンドロイチン ３．１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・ポリマー（分子量〜８０ｋＤａ） ４．１５０μｇ／ｍＬキチン・オリゴマー ５．５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー ６．１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー ７．５０ｎＭワートマニン ８．２０μＭ ＬＹ２９４００２ ９．１：５０希釈抗ＣＤ４４抗体。結果を３実験について示した。図６Ｃにおけるものと同様の結果が、ＨＣＴ１１６細胞についても得られた。

図７Ａは、アポトーシスに含まれる蛋白質であるＢＡＤの、ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞におけるＨＡオリゴマーによるリン酸化の阻害を示すイムノブロットである。細胞をサスペンジョンで処理し、次にＢＡＤのイムノブロッティング処理を施した。結果を２実験について示した。次の各レーンの細胞中に現れたリン酸化ＢＡＤ：１．未処理 ２．１５０μｇ／ｍＬ硫酸コンドロイチン ３．１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・ポリマー（分子量〜８０ｋＤａ） ４．１５０μｇ／ｍＬキチン・オリゴマー ５．５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー ６．１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー ７．５０ｎＭワートマニン ８．２０μＭ ＬＹ２９４００２ ９．１：５０希釈抗ＣＤ４４抗体。

図７Ｂは、次の各レーンのＴＡ３／Ｓｔ細胞における核転写因子であるＦＫＨＲのリン酸化について、図７Ａと同様の測定を示した。１．未処理 ２．１５０μｇ／ｍＬ硫酸コンドロイチン ３．１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・ポリマー（分子量〜８０ｋＤａ） ４．１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー ５．５０ｎＭワートマニン ６．２０μＭ ＬＹ２９４００２ ７．１：５０希釈抗ＣＤ４４抗体。同様の結果が、ＨＣＴ１１６細胞を用いたリン酸化ＢＡＤ及びＦＫＨＲについて得られた。

図８Ａは、ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞における、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮの発現のヒアルロナン・オリゴマーによる活性化を示す棒グラフである。細胞をサスペンジョンで処理し、次にＰＴＥＮのイムノブロッティング処理を施した。棒は、１０−１５０μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマー（ｏ−ＨＡ）または１５０μｇ／ｍＬの硫酸コンドロイチン（ＣＳ）による処理後のイムノブロットのデンシトメトリーによる定量を示す。結果を独立した３実験の平均値で示し、未処理百分率±Ｓ．Ｄ．として表した。

図８Ｂは、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞について、図８Ａと同様の測定を示した。

図８Ｃは、次の各レーンのように処理したＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞を用いたイムノブロットである。１．未処理 ２．１５０μｇ／ｍＬ硫酸コンドロイチン ３．４．１５０μｇ／ｍＬキチン・オリゴマー ４．１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・ポリマー（分子量〜８０ｋＤａ） ５．５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー ６．１５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー。結果を独立した３実験の平均値で示した。図８Ｃと同様の結果が、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞についても得られた。

図９は、ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞における、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の成長の遅延を示す棒グラフである。Ｂ１６マウス黒色腫、ＬＸ−１ヒト肺癌、及びＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞を皮下投与により移植した。ＰＢＳ、１ｍｇ／ｍＬのＨＡオリゴマー（０．５μｇ／０．５μＬ／時間）、０．５μｇ／時間の硫酸コンドロイチン（ＣＳ）、０．５または３．０μｇ／時間の溶解性ＣＤ４４、または０．５μｇ／時間のＫＭ８１ ＣＤ４４抗体を含むＡＬＺＥＴポンプで７日間処理後に腫瘍重量を測定した。各点は、少なくとも６動物から得られたデータの平均値±Ｓ．Ｄ．を示す（Ｇｈａｔａｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７：３８０１３−２０，２００２における、対照により取り込まれた全体量も参照）。

図１０は、ＨＡオリゴマーまたは過剰発現した溶解性ＣＤ４４による、軟寒天における固定独立性増殖の阻害を示す棒グラフである。棒グラフの１−５は、１０−１００μｇ／ｍＬのＨＡオリゴマーにより抑制された軟寒天におけるＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞の増殖を示す。ＨＡのジサッカライド・サブユニットを含む１００μｇ／ｍＬのグルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンの混合物をネガティブ対照として用いた。コロニーを１−２週間後に計数した。結果は３実験の平均値±Ｓ．Ｄ．とした。棒グラフの６−１１：野生型ＴＡ３／Ｓｔ、組み換えベクター、及び変異溶解性ＣＤ４４（ＨＡ非結合性）組み換え細胞は多くのコロニーを形成するが、３つの分離した溶解性ＣＤ４４組み換えクローンはコロニーを形成しない。ＨＡオリゴマーも溶解性ＣＤ４４も固定従属性単層カルチャーにおける分化に有意な影響を与えない。

図１１は、ＨＡオリゴマーによる、ＰＴＥＮ（フォスファターゼとテンシン）の活性化を示す棒グラフである。ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞におけるＰＴＥＮ濃度はウェスタン・ブロッティングにより測定され、測定値はブロットのスキャニングによって得られた。５０−１００μｇ／ｍＬの濃度のＨＡオリゴマー（ｏｌｉｇｏ）は、未処理対照に比較してＰＴＥＮ濃度の〜６倍の上昇を引き起こした。硫酸コンドロイチン（ＣＳ）、ポリマー性ＨＡ、及びキチン・オリゴマーは、ＰＴＥＮ濃度を上昇させなかった。

図１１Ｂは、ＨＡオリゴマーによる、ＰＩ３キナーゼ活性の阻害を示す棒グラフである。ＴＡ３／Ｓｔ細胞は、ＨＡオリゴマー（ｏ−ＨＡ；１−１５０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で処理され、細胞のＰＩ３キナーゼ活性が、ＰＩ３キナーゼαを免疫沈降させ、次にＰＩＰ３に取り込まれた³²Ｐ−燐酸をアッセイすることにより測定された（Ｍｉｓｒａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６：５８１４−５８１９，１９９９；Ｓｕｓａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６７：３８０１３−２０，２００２）。１５０μｇ／ｍＬの硫酸コンドロイチン（ＣＳ）またはＨＡポリマー（分子量：２，０００ｋＤａ）は効果を示さなかった。ワートマニン（５０ｎＭ；Ｗｍ）及び抗ＣＤ４４抗体は、ＨＡオリゴマーと擬似的な効果を示した。総ＰＩ３キナーゼ活性は同様に影響を受けた。

図１２は、ＨＡオリゴマーによる、メトトレキセートへの逆行的な耐性を示す折れ線グラフである。ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞を、１００μｇ／ｍＬのＨＡオリゴマーの存在下および非存在下において、メトトレキセート（ＭＴＸ）濃度を増加させて処理した。細胞を１０％牛胎児血清で単層培養し、細胞数をコールター計数器で測定した。生存細胞のＭＴＴアッセイ（Ｄｅｎｉｚｏｔ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，８９：２７１−２７７，１９８６）によっても同様の結果が得られた。このような固定従属性条件下においては、ＨＡオリゴマー単独では細胞の分化及びアポトーシスに有意な影響を与えなかった。

図１３Ａは、ＨＡオリゴマー（１００μｇ／ｍＬ）及びＰＩ３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２（５０ｎｇ／ｍＬ）を用いた処理により、Ｈａｓ２（ＨＡシンテターゼをコードする）発現を促進するアデノウィルスに感染したＭＤＣＫ細胞による、０．２％軟寒天におけるコロニー形成の阻害を示す棒グラフである。阻害剤の非存在下においてＨａｓ２細胞は、ＨＡオリゴマー、ワートマニン、または非組み換え対照細胞あるいはβ−ガラクトシダーゼをコードした対照ベクターに感染した細胞のコロニー形成能を低下させたＬＹ２９４００２で処理する間に、最大のコロニー形成能を示した。

図１３Ｂは、Ｐ−Ａｋｔ合成が、非組み換え対照細胞に比較して、Ｈａｓ感染細胞において上昇することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。

図１４Ａは、ＨＧＦ刺激ＭＤＣＫまたはＭＤＣＫ−１０Ａ細胞をＨＡオリゴマー（１００μｇ／ｍＬ）で処理することにより、０．２％軟寒天において細胞の逆のコロニー形成能が生じることを示す棒グラフである。しかしながら、抗ＣＤ４４抗体（１０μｇ／ｍＬ）は同様な阻害効果をもち、キチン・オリゴマー処理（１００μｇ／ｍＬ）ではコロニー形成能を逆転しなかった。１５０μｍに満たないコロニーはこの分析からは除外された。未処理細胞に比較してｐ＜０．０５であった。

図１４Ｂは、β−カテニン過剰発現ＭＤＣＫまたはＭＤＣＫ−３７Ａ細胞をＨＡオリゴマーで処理することにより、０．２％軟寒天において逆行するコロニー形成能が生じることを示す棒グラフである。しかしながら、抗ＣＤ４４抗体同様な阻害効果をもち、キチン・オリゴマー処理ではコロニー形成能を逆転しない。他の条件は図１４Ａに示したものと同様である。

図１４Ｃは、ＨＧＦ刺激ＭＤＣＫまたはＭＤＣＫ−１０Ａ細胞をＨＡオリゴマーで図１５Ａで示すように処理することにより、マトリゲルで被覆した小胞を通して逆の細胞浸透能が生じることを示す棒グラフである。

図１４Ｄは、β−カテニン過剰発現ＭＤＣＫまたはＭＤＣＫ−３７Ａ細胞をＨＡオリゴマーで処理することにより、逆の細胞浸透能が生じることを示す棒グラフである。

図１５Ａは、ヒアルロナン・オリゴマーとともにカルチャー培養したＭＣＦ−７／Ａｄｒ薬物耐性ヒト乳癌細胞がドキソルビシン感受性になることを示す折れ線グラフである。細胞を２４時間、グルタメックス１（Glutamex 1）と１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地の２４穴プレートで５％二酸化炭素雰囲気下３７℃で培養した。次に様々な濃度のドキソルビシン（ｄｏｘｏ）を加え、細胞をさらに７２時間インキュベートし、続いて１００μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー（ｏ−ＨＡ）存在下または非存在下において、さらに２４時間までインキュベートした。これらのオリゴマーは３−８の長さのジサッカライドの繰り返し単位をもつ混合物である。次に、これらの細胞を回収し、生存細胞の数をコールター計数器で決定した。

図１５Ｂは、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞がＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞よりもさらにドキソルビシンに感受性となること、及びＨＡ処理が有意にＭＣＦ−７細胞を感受性を与えないことを示す折れ線グラフである。

図１６Ａは、癌細胞におけるヒアルロナンの発現増強が誘導したドキソルビシン耐性を示す折れ線グラフである。ＭＣＦ−７細胞は、既に記述されているように、組み換えＨａｓアデノウィルス、または対照β−ガラクトシダーゼ・アデノウィルス（β−ｇａｌ）で一晩感染して構築し、使用した（Ｏ‘Ｇｏｒｍａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ，２５：８０１−８１１，２００１．Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，９５：２９−３９，１９９８）。未処理ＭＣＦ−７細胞または組み換えＨａｓアデノウィルス、または対照β−ガラクトシダーゼ・アデノウィルス（β−ｇａｌ）で一晩感染した細胞を洗浄し、次に１−１０００ｎＭのドキソルビシンで４８時間培養し、細胞数を計数した。ＩＣ₅₀値はそれぞれ、未処理で１８ｎＭ、β−ガラクトシダーゼで２０ｎＭ、Ｈａｓ２で２１０ｎＭであった。

図１６Ｂは、ｏ−ＨＡ処理した組み換えＨａｓ−アデノウィルス感染ＭＣＦ−７細胞における、逆行ヒアルロナン誘導ドキソルビシン耐性を示す折れ線グラフである。細胞を１００μｇ／ｍＬのｏ−ＨＡ存在下または非存在下における１０−１０００ｎＭドキソルビシンで４８時間培養し、図１６Ａと同様に分析した。

図１６Ｃは、未処理ＭＣＦ−７細胞、または図１６Ｂで述べたのと同様に処理した組み換えエムプリン（emmprin）アデノウィルスまたは対照β−ガラクトシダーゼ・アデノウィルス（β−ｇａｌ）で一晩感染した細胞のドキソルビシン応答を示した折れ線グラフである。

図１６Ｄは、組み換えエムプリン・アデノウィルス感染ＭＣＦ−７細胞におけるエムプリン誘導された逆行した多剤耐性を示す。エムプリン・アデノウィルス感染ＭＣＦ−７細胞または対照β−ガラクトシダーゼ・アデノウィルス（β−ｇａｌ）感染細胞を図１６Ｂで述べたように１００μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマー（ｏ―ＨＡ）の存在下または非存在下において処理した。図１６Ｄの結果は、３回試行の独立した３実験の平均値（±Ｓ．Ｄ．）で表した。

図１７Ａは、ヒアルロナン・オリゴマーが細胞生存の経路を調節することを示すＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞抽出物のウェスタン・ブロットを表している。細胞を図１５Ａ及び表１のように１００μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマー（ｏ―ＨＡ）の存在下または非存在下において、各種薬剤の存在下で処理した。細胞はリン酸化Ａｋｔ（ｐ―Ａｋｔ）及びＰＴＥＮのウェスタン・ブロット処理を行った。同様の結果がタキソール及びビンクリスチン存在下のＰＴＥＮにおいて得られた（結果は示さず）。ドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）：レーン１、２０ｎＭ；レーン２、２０ｎＭ＋ｏ−ＨＡ；レーン３、１００ｎＭ；レーン４、１００ｎＭ＋ｏ−ＨＡ。タキソール：レーン１、２０ｎＭ；レーン２、２０ｎＭ＋ｏ−ＨＡ；レーン３、１００ｎＭ；レーン４、１００ｎＭ＋ｏ−ＨＡ。ビンクリスチン：レーン１、１０ｎＭ；レーン２、１０ｎＭ＋ｏ−ＨＡ；レーン３、１００ｎＭ；レーン４、１００ｎＭ＋ｏ−ＨＡ。総Ａｋｔはこの実験で変化しなかった（結果は示さず）。

図１７Ｂは、Ａのようにして処理し、ｐ−Ｅｒｋ及びｐ−ＢＡＤ１１２のウェスタン・ブロット（Ａと同様のレーン数）で処理したＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞の抽出物のウェスタン・ブロットを表している。同様の結果がｐ−Ｒａｆ−１についても得られたが、Ｒａｆ−１の総濃度に変化は見られなかった（結果は示さず）。

図１７Ｃは、組み換えＨａｓ２、またはβ−ガラクトシダーゼ・アデノウィルスで感染し、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−Ｅｒｋ、ｐ−ＢＡＤ１１２、及びｐ−ＦＡＫのウェスタン・ブロット分析で処理したＭＣＦ−７細胞を表している。レーン１−３、β−ガラクトシダーゼ；レーン４−６、Ｈａｓ２。レーン１及びレーン４、無添加；レーン２及びレーン５、２０ｎＭドキソルビシン；レーン３及び６、１００ｎＭドキソルビシン。

＜詳細な説明と具体的態様＞
ＨＡは、脊椎動物の組織に普遍的に分布する高分子量のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、多くの腫瘍タイプで高濃度に発現している。乳癌細胞において、ヒアルロナン濃度のレベルはネガティブな生存予測である。ここで、ＨＡ腫瘍細胞の相互作用は、フォスフォイノシタイド−３−キナーゼ／Ａｋｔ細胞の生存経路の活性を増強し、小さなヒアルロナン・オリゴサッカライドは内因性ヒアルロナン・ポリマー相互作用に拮抗し、フォスファターゼ及びテンシン（ＰＴＥＮ）発現を活性化し、細胞の生存経路を抑制する。固定独立性条件において、ＨＡオリゴマーは癌細胞における成長を阻害し、アポトーシスを誘導する。ＨＡオリゴマーは細胞の生存経路上への効果により薬物耐性に影響を与えるのだろう。

ＨＡオリゴマーがＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞のメトトレキセートに対する耐性を２桁の強度で減弱させることが実験により証明されている。ＨＡオリゴマーの癌患者の治療に通常使用されている数種類の薬剤への逆行耐性が臨床的に重要であるか否かということは、治療プロトコールの過程で細胞が耐性になる細胞の薬剤感受性を回復させるかどうかということである。

多剤耐性ＭＣＦ−７／ａｄｒＲヒト乳癌細胞は、ＨＡオリゴマーがドキソルビシン、パクリタキセル及びビンブラスチンによる治療のためにこれらの細胞を感受性にするかどうかを確かめるために使用される。これらの化学物質は、通常癌患者に使用され、ＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞が耐性をもつ３種のクラスの薬剤を代表している。耐性がしばしば増強される、単層カルチャー及び扁平球状カルチャーにおけるアポトーシスへの耐性がテストされる。さらに、ＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞におけるドキソルビシン、及びＭＢ２３１細胞におけるメトトレキセートの取り込みや放出は、前記オリゴマーが薬剤蓄積に影響を与えるがどうかを定量することにより測定される。結局、ＨＡオリゴマーの存在下または非存在下におけるドキソルビシン治療へのＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞の耐性は、ヌードマウスの異物移植（xenografts）においてカルチャーで得られた結果がｉｎ ｖｉｖｏに適用できることを確かめることによりテストされる。

癌細胞の多剤耐性は今日の治療に深刻な問題を残している。ＨＡオリゴマーは毒性がなく抗原性もないため、癌患者における化学療法の効果を改善するための新しい方法を提供することができる。ここで、ＨＡオリゴマーはｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍の成長を遅延させることが示されている。これらのオリゴマーが細胞の感受性を高めて化学療法剤への化学耐性を減する可能性は、現在の化学療法プロトコールを増強する新規な治療につながるだろう。

ここにおいてヒアルロナン量の増加により腫瘍細胞の生存が増強され、腫瘍細胞死が抑制され、したがって腫瘍の成長と転移が促進される。短い長さのＨＡポリマー（ＨＡ“オリゴマー”）は全サイズのポリマー性ＨＡの作用に拮抗する。ＨＡオリゴマーは化学療法への多剤耐性の促進に重要であり得る生化学反応を抑制することにより働くことが発見された。化学療法剤として広く使用されるメトトレキセートに対する細胞培養ヒト乳癌細胞の耐性へのＨＡオリゴマーの効果について言及する実施例は、ＨＡオリゴマーが薬物治療への耐性細胞を再度感受性にする。このことは他の化学療法剤にも当てはまり、多剤耐性が増強されることが知られている場合には、ＨＡオリゴマーは培養及び動物モデルのいずれにおいても耐性細胞を感受性にし、これはヒト患者の治療に極めて類似することが示されている。

ＨＡ発現はＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ細胞の生存経路活性を増強する。ＨＡの小さなオリゴマーは、ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ細胞の生存経路を抑制し、固定独立性条件におけるアポトーシスを誘導することにより、内因性ＨＡポリマーの効果に拮抗するＨＡ受容体リガンドである。ここで実施例はさらに、ＨＡオリゴマーが細胞の生存経路を抑制し、アポトーシス機序へ細胞を活性化することにより、化学耐性の癌細胞を感受性にすることを示している。

多剤耐性を含む、癌細胞における薬剤耐性は、細胞の生存とアポトーシスの経路における、特にＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ経路における変化と関係している。ＨＡオリゴマーは、この経路を抑制し化学療法剤に対して癌細胞を感受性にすることが、ここで示される。

＜ＨＡと悪性フェノタイプ＞
ＨＡは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンからなる２，０００−２５，０００のジサッカライド：［β１，４−ＧｌｃＵＡ−β１，３−ＧｌｃＮＡｃ−］_nを含む、分子量１０⁵から１０⁷ダルトン（Ｄａ）の直線状のグリコサミノグリカンである。ジサッカライドユニットは分子量４００Ｄａである。ヒアルロナン・シンテターゼ（Ｈａｓ１，Ｈａｓ２，Ｈａｓ３と呼ばれる。）は、活性部位が膜内部表面に位置する完全な血漿膜蛋白質である（Ｗｅｉｇｅｌ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７２：１３９９７−１４０００，１９９７）。新たに合成されたＨＡは、細胞表面に直接押し出され、前記シンテターゼ結合して固定され、また受容体との相互作用によりそこに残留するか、または細胞周辺または細胞外に放出される。このような様々な位置に送達するための調節は現時点でわかっていない。

ＨＡは、それ自身の生物物理学的及び相互作用的な性質により生じる多くの生理的な細胞機能をもっている（Ｔｏｏｌｅ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，１２：７９−８７，２００１；Ｔｏｏｌｅ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１２：３７Ｒ−４２Ｒ，２００２に総説されている）。ＨＡが正常及び異常な細胞の振る舞いに影響を与え得る三つの方法がある。第一に、その生物物理学的な特性のために遊離のＨＡは細胞が存在する細胞外または細胞周辺の生物物理的な性質に対する重要な作用をもっている。第二に、ヒアルロナンは、ほかの細胞周辺の大分子と特異的な相互作用をするための反復的なテンプレートを形成し、これによりこれらのマトリックスの集合、構造的完全性及び生理学的性質に寄与している。したがって、ＨＡは細胞の分割や運動に対して要求される細胞形状の変化により伝導性の細胞外マトリックスを形成する（Ｈａｌｌ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１２６：５７５−５８８，１９９４；Ｅｖａｎｋｏ，Ｓ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，１９：１００４−１０１３，１９９９）。第三に、ＨＡは細胞内シグナルを変換し、細胞の形態や行動に直接的に影響を与える細胞表面受容体と相互作用する（Ｔｕｒｌｅｙ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７：４５８９−４５９２，２００２）。

ＨＡシンテターゼであるＨａｓ２のＨＴ１０８０ヒト繊維肉腫の実験的な過剰発現は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの固定独立性（ anchorage-independent ）条件下におけるヒアルロナン合成を上昇させ、腫瘍細胞の分化を誘導する（Ｋｏｓａｋｉ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５９：１１４１−１１４５，１９９９）。同様の結果はＴＳＵヒト前立腺癌細胞におけるＨａｓ３の過剰発現に関しｉｎ ｖｉｖｏで得られる（Ｌｉｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６１：５２０７−５２１４，２００１）。高ＨＡ産生および低ＨＡ産生として選択されたマウス乳癌細胞系において、静脈注射後の肺における転移結節形成の減少は、低ＨＡ産生として選択された系に発生し、これらの細胞の転移能力はＨａｓ１の感染を介したＨＡ産生の増加により回復する（Ｉｔａｎｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５９：２４９９−２５０４，１９９９）。

内因性ＨＡ蛋白質の相互作用を動揺させるために用いられるアプローチとしては、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＡデコイの量を増加させるために溶解性ＨＡ結合蛋白質（ＨＡＢＰｓ）の過剰発現、ＨＡオリゴサッカライドのようなＨＡ受容体リガンドの投与、及びＨＡ結合をブロックする抗体が挙げられる。溶解性ＨＡＢＰｓは競合的にその内因性細胞表面受容体、例えばＣＤ４４及びＣＤ１６８（ＲＨＡＭＭ）をＨＡに置き換え、これにより推定上の下流現象を阻害する。いくつかの研究により、溶解性ＣＤ４４体による治療によって、腫瘍成長が抑制されることが証明されている（Ｓｙ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１７６：６２３−６２７，１９９２；Ｂａｒｔｏｌａｚｚｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８０：５３−６６，１９９４）。マウス乳癌細胞またはヒト悪性黒色腫細胞における溶解性ＣＤ４４の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける成長の阻害、局所浸潤や転移をもたらす（Ｙｕ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８６：１９８５−１９９６，１９９７；Ｙｕ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０：３３９９−３４０８，２００１）。もしＨＡ結合が変異ＣＤ４４において除かれるように、溶解性ＣＤ４４が変異したならば、この研究ではいかなる有意義な効果も得られなかった。溶解性ＣＤ１６８（ＲＨＡＭＭ）、ほかのＨＡＢＰも転移を阻害し（Ｍｏｈａｐａｔｒａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８３：１６６３−１６６８，１９９６）、軟骨に由来するＨＡ結合複合体は、腫瘍の成長と転移をともに阻害する（Ｌｉｕ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６１：１０２２−１０２８，２００１）。ＨＡオリゴマーは内因性のポリマー性ヒアルロナン受容体相互作用と競合し、受容体に多価、高親和性というよりもむしろ低価で低親和性となる（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２５８：８０８６−８０９１，１９８３）。

本発明において、医薬品組成物の体系的投与法としては次のものが挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、及び経口の経路が挙げられる。化合物はどの都合のよい経路によっても、例えば、注入または球塊投与によっても、上皮または粘膜linings（例えば、口腔粘膜、直腸及び小腸粘膜など）を通した吸収によっても、ほかの生物学的に活性な薬剤とともに投与してもよい。

本発明は、他の態様において、例えば、ＨＡ受容体リガンドのようなＨＡ相互作用の競合剤（ＣＨＩ）の治療有効量を単独で、または例えば、抗癌剤のような他の薬剤とともに含有する医薬組成物を提供する。さらに、医薬的に許容される担体や賦形剤を含むこともできる。そのような担体には、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。製剤は投与の方法に適合させることが必要である。

ここで前記組成物は、さらに、浸潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。前記組成物は、液体溶液、縣濁液、乳液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、または粉末であり得る。前記組成物は、従来から使用されるトリグリセリドのような結合剤及び担体とともに、坐剤として製剤とすることもできる。経口製剤は、医薬品品質のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグルシウムなどのような標準的な担体を含有することができる。様々な薬物送達システムが知られており、これらをリポソーム、微小粒子、マイクロカプセルへのカプセル化など、本発明の組成物の投与に用いることができる。

必要ならば、前記組成物は、可溶化剤及び注射部位の痛みを改善する局所麻酔剤を含んでもよい。一般に、これらの成分は、例えば、有効な薬剤量を示すなどの、アンプルまたは香料袋のような密封した容器に入れた乾燥、凍結乾燥、または脱水濃縮物のような単位投与形態で、別々にまたは混合して供給される。前記組成物は、注入により投与される場合には、無菌の医薬品質の水、緩衝液、または生理食塩水を含む注入瓶に調剤することができる。前記組成物が注射で投与される場合には、各成分を投与前に混合できるように、注射用の無菌の水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。

本発明の組成物は、中性または塩の形態で製剤することができる。医薬的に許容される塩は、塩酸、燐酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などから誘導される塩のような遊離のアミノ酸との塩を含み、また、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される塩のような遊離のカルボキシル基との塩も含む。

非要求性細胞の多剤耐性の治療に有効なＨＡＢＰ、ＨＡ受容体リガンドのようなＣＨＩ量は、病気や条件の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。製剤に用いる正確な投与量は、投与経路、疾患や病気の程度にも依存し、臨床家や各患者の状況の判断にしたがって決定されるべきである。化学療法剤への非要求性細胞の耐性の程度の日常的な判断は、その分野の当業者によって決定される。しかしながら、投与量は投与経路よっても決定され、例えば、皮下投与の好適な投与量の範囲は一般にｋｇ体重当たり有効化合物換算で約２０−５００μｇである。鼻腔内投与の好適な投与量の範囲は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重から１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効投与量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験系または動物試験系から得られた投与量−応答曲線から外挿して決定してもよい。

本発明は他の形態において、本発明の医薬品組成物のうちの一つまたは複数の成分を充填した一つまたは複数の容器を含む医薬包装またはキットを提供する。そのような容器とともに、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形態の、ヒトへの投与のための製造、使用、または販売についてのその期間の承認を示す、使用説明書またはお知らせ文書のような様々な記載資料も提供する。

本発明は、様々な形態において十分に記載し、さらに次の実施例によって具体的に説明するが、これらにより限定的に解釈されることを意図したものではない。すべての引用文献の内容は、ここでの参照のために適用される。

以下に示す試料及び方法は、本実施例を通して使用した。
＜細胞＞
ＬＸ−１ヒト肺癌細胞を既に報告されているようにして取得し、使用前にヌードマウス体内通過を行った（Ｂｉｓｗａｓ，Ｃ．（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２４，２０１−２０７）。ＨＣＴ１１６細胞は、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ博士から提供された。ＴＡ３／Ｓｔ細胞は、Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＨ．Ｆ．Ｄｖｏｒａｋ博士から取得し、我々の研究室で培養した（Ｙｅｏ，Ｔ．Ｋ．，Ｎａｇｙ，Ｊ．Ａ．，Ｙｅｏ，Ｋ．Ｔ．，Ｄｖｏｒａｋ，Ｈ．Ｆ．，及びＴｏｏｌｅ．Ｂ．Ｐ．（１９９６）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４８，１７３３−１７４０）。全ての細胞系をフェノールレッドを除き、１０％牛胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ−高グルコース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で培養した。これらの細胞系は３−４日ごとに動物体内通過させ、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で培養した。

＜試料＞
ヒアルロナン・オリゴマーは、既に報告されているように、接線流動濾過（ tangential flow filtration ）により（Ｚｅｎｇ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７７，３９６−４０１）精製したポリマーのヒアルロニダーゼ消化物から分画し、アニカセラピューティクス社（ Anika Therapeutics Inc ）（ウォバーン、マサチューセッツ州）から供給された。ヒアルロナン・ポリマー（分子量：〜８０ｋＤａ及び〜２，０００ｋＤａ）は、それぞれジェンザイム社（ Genzyme Inc ）及びアニカセラピューティクス社から供与を受けた。キチン・オリゴマーは米国生化学社（ Seikagaku America ）（ファルマウス、マサチューセッツ州）から取得し、硫酸コンドロイチンはシグマ社（セントルイス、マサチューセッツ州）から取得した。非吸着超低クラスター・プレート（コースター３４７１）はコーニング社（コーニング、ニューヨーク州）から取得した。ＡＬＺＥＴポンプはアルザ社（パルアルト、カリフォルニア州）から取得した。［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮＥＮライフサイエンス・プロダクツ社から、カスパーゼ−３アッセイに用いるＤＥＶＤ−ｐ−ニトロアニリド及び他の全ての試薬はバイオビジョン・リサーチ・プロダクツ社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）から、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に用いる試薬はバイオラッド社（リッチモンド、カリフォルニア州）から、増強化学発光試薬はアマシャム・ファルマシア・バイオテック社（バッキンガムシャイヤ、英国）から、リン酸化−ＡＫＴ経路サンプラー・キットはセル・シグナリング・テクノロジー社（ビバリー、マサチューセッツ州）から、抗ＰＴＥＮ抗体（Ａ２Ｂ１）、抗ＰＩ３キナーゼ・アイソフォーム抗体及びヒトＣＤ４４（ＤＦ１４８５）抗体はサンタクルツ・バイオテクノロジー社（サンタクルツ、カリフォルニア州）から購入した。抗マウスＣＤ４４（ＫＭ８１）抗体はＡＴＣＣ（ロックビル、メリーランド州）から入手し、他の全ての試薬はシグマ社から最高級グレード製品を入手した。

＜ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍成長＞
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるは腫瘍成長に対するヒアルロナン・オリゴマーの効果は、既知の方法同様に評価した（Ｚｅｎｇ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７７，３９６−４０１）。５−６週令のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ、雄；チャールズリバー・ブリーディング・ラボラトリー社）またはＡ／Ｊａｘマウス（ジャクソン・ラボラトリー社、バーハーバー、メイン州）を実験時点ごとに一群５匹にして用いた。ＰＢＳのみ、またはヒアルロナン・オリゴマーを溶解したＰＢＳを含むＡＬＺＥＴ浸透ポンプを、アルザ・サイエンティフィック・プロダクツ社により推奨され、動物研究委員会に承認された操作により、マウス背部の皮下に挿入した。ポンプの埋め込みの次の日に、０．５−１．０×１０⁵−１０⁶個の腫瘍細胞を含む０．１ｍＬＰＢＳをポンプの前面にじかに注入した。マウスは、治療の７または１４日後に二酸化炭素で安楽死させ、腫瘍重量によりその成長を測定した。

＜固定独立性成長アッセイ＞
既に公開された技術を改変して用いた（Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ，Ｊ．， ｅｔ ａｌ．（１９６９）Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２，１６１−１６５）。アッセイは、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）、１ｍＭグルタミン、及び１００単位ペニシリンと１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む０．６％寒天ＤＭＥＭ培地を含む基層の入った６−ウェルプレートで行った。この層の上に、１ｍＬの２５００細胞懸濁液を混合し、それぞれ１００μｇ／ｍＬヒアルロナン添加または非添加の１ｍＬの０．２％寒天（２０％牛胎児血清、２ｍＭグルタミン、及び２００単位ペニシリンと２００μｇストレプトマイシンを含む）ＰＢＳの第二層を重層した。プレートはを３７℃で１０−１４日間インキュベートし、腫瘍コロニーの直径を接眼レンズに視覚スケールを備えた顕微鏡で測定した。０．２ｍｍより大きな直径のコロニーを計数した。

＜腫瘍細胞の処理と生化学アッセイのための細胞溶解物の調製＞
ＴＡ３／Ｓｔ及びＨＣＴ１１６細胞を１４ｃｍ培養ディッシュで７２時間培養し、次にトリプシン消化により回収し、ＰＢＳで洗浄して１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁した。これらのカルチャーから２００万個の細胞を非吸着超−低クラスタープレートの各ウェルにとり、さらに３７℃で７２時間、懸濁液でインキュベートした。各ウェルからの細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、２％牛血清アルブミン（コーン・アナログ、シグマ社）を含む５ｍＬＤＭＥＭ培地に懸濁し、クラスタープレートに再度とり、３７℃で９６時間、懸濁液でインキュベートした。ほとんどの測定において、２４−９６時間のプレインキュベーションで同様の結果が得られた。ヒアルロナン・オリゴマーまたは他の試薬を次に加え、細胞を懸濁液でさらに２４時間インキュベートした。

上記のように処理した細胞を室温で遠心分離により回収した。ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、次に１％ノニデット（ Nonidet ）Ｐ−４０及びプロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液に溶解した。細胞溶解を高速で１５秒間の３回のボルテックス撹拌により行い、次に氷で冷却した。溶解物を４℃、１２，０００×ｇで１５分間、エッペンドルフ５４１５Ｒ遠心分離機を用いて遠心分離した。上清の蛋白質量を測定後、液体窒素中で急速冷凍し、下記のアッセイで使用するまで−８０℃で保存した。

＜アポトーシス・アッセイ＞
上記部分で述べたように培養したＴＡ３／Ｓｔ細胞を他の箇所で述べたようにしてアッセイした（ＭｃＧａｂｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４６：１５３−１８５，１９９５）。簡略には、１μＬの染料混合物（アクリジンオレンジ及び臭化エチジウム、各１ｍＬ中に１００μｇ）を倍地中でｍＬ当たり〜５×１０⁵細胞を含む２５μＬの細胞懸濁液と混合した。この懸濁液１０μＬを清浄なスライド上にとり、青色フィルターを取り付けた蛍光顕微鏡を用いて４０×対物レンズで検査した。生存細胞（緑色）及び断片化した核（赤色）を含むアポトーシス細胞を計数し、次にアポトーシス細胞の百分率を計算した。

＜カスパーゼ−３アッセイ＞
２００μｇの細胞溶解物の蛋白質を各アッセイに用いた。アッセイは製造会社の説明書（バイオビジョン・リサーチ・プロダクツ社）に従い、ラベル化基質のＤＥＶＤ−ｐ−ニトロアニリドからの解裂後、４０５ｎｍにおけるｐ−ニトロアニリド発色団の分光光学測定に基づいて実施した。

＜ＰＩ３キナーゼアッセイ＞
総ＰＩ３キナーゼのアッセイとして、２５０ｎｇの細胞溶解物を各アッセイに用いた。アッセイは、０．００１％ノニデットＰ−４０、１５０μＭのＡＴＰ、２５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのＥＧＴＡ、１５０μＭのＡＴＰ、２５μＣｉの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ、１２５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０及びホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール及びホスファチジルイノシトール−４，５ビスホスフェイトを超音波処理緩衝液（２５ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１ｍＭのＥＧＴＡ）中に１：１：１（ｖ：ｖ：ｖ）の比で含む０．２ｍｇ／ｍＬの超音波処理脂質を含有する５０μＬの反応混合物中で行った（Ｗｈｉｔｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５，２３９−２４２；Ｓｕｓａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７，２２９５１−２２９５６；Ｍｉｓｒａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３，２６６３８−２６６４４）。反応は３７℃で２０分間行い、１００μＬのメタノール／１Ｍ塩酸（１：１）を加えて反応を停止した。脂質は１００μＬのクロロホルムで２回抽出した。有機層を混合して、窒素雰囲気下に乾燥し、薄層クロマトグラフィーで分析した。³²Ｐ標識フォスフォイノシタイドを水／酢酸／ｎ−プロパノール（３４：１：６５）に溶解して、オートラジオグラフィーで検出した。フォスファチジルイノシトール３，５，５−フォスフェート（ＰＩＰ₃）への³²Ｐの取り込みは、掻き取りシンチレーション液に溶出した薄層クロマトグラフィーのスポットを液体シンチレーション計測により定量した。

特定のＰＩ３キナーゼ・アイソフォームのアッセイとして、全細胞溶解物を特定のアイスソフォームとプロテインＡ−セファロースに対する抗体とインキュベートした。次に、ビーズに不動化した酵素のＰＩ３キナーゼ活性を上記のようにして測定した。

＜イムノブロッティング＞
細胞溶解調製物を５分間６５℃で変性し、１０％ポリアクリルアミドゲルに載せた（１５−３０μｇ蛋白質／レーン）。電気泳動をバイオラッド社のミニゲル装置で行った。蛋白質をニトロセルロース膜に移し、５％の脂肪を含有しないドライミルクと０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝化生理食塩水で１時間ブロッキングした。次に、膜を洗浄し、５％牛血清アルブミン（ポリクローナル抗体用）または５％の脂肪を含有しないドライミルク（モノクローナル抗体用）を含有するトリス緩衝化生理食塩水で適当な抗体を希釈した。用いた二次抗体としては、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを結合した、抗ウサギＩｇＧ抗体（ニューイングランド・バイオラブ社）及びヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（バイオラッド社）であった。免疫活性を有するバンドを増強化学発光により検出し、蛋白質の大きさをプレステイン分子量標準を用いて評価した。免疫活性を有するバンドはデンシトメトリーにより定量した。１５％Ｈ₂Ｏ₂で中和、または５０℃で除去した後、膜を再利用した（アマシャム、ファルマシア・バイオテック社の製造者手順書に従った）。

＜実施例１＞ ヒアルロナン・オリゴマーはｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長を阻害する。
Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞の皮下埋め込み部位へのヒアルロナン・オリゴマーの投与は、投与のタイミングに依存して５０−５８％その成長を阻害した（Ｚｅｎｇ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７７，３９６−４０１）。この効果が他の腫瘍細胞に適用可能か否かを確かめるため、ヌードマウスにおいてＬＸ−１ヒト肺癌細胞を、先天性マウスにおいてＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞をもちいて実験を行った。各実験において腫瘍細胞は、対照５匹と処置５匹の群に対して皮下投与した。ヒアルロナン・オリゴマーは、注入部位付近に埋め込まれたＡＬＺＥＴ浸透ポンプから投与した。このオリゴマーは、７または１４日間にわたって〜０．５μｇ／０．５μＬ／時間の速度で放出された。対照動物はビーイクル（ＰＢＳ）のみを投与された。ヒアルロナン・オリゴマーは、この期間にわたって、ＬＸ−１腫瘍の成長を〜５０−８０％（図１Ａ）、ＴＡ３／Ｓｔ細胞の成長を〜６０−６５％（図１Ｂ）阻害した。この阻害はＢ６−Ｆ１０細胞におけるものと同程度であった。

さらなる実験において、ＬＸ−１細胞を注入した動物を７日間、未処置とし、次に１４日間処置した。このような二つの実験において、成長阻害は４０％及び７５％と変化した。反対にした場合、つまり１４日間処置した後に、７日間処置をしない場合には、６８％の阻害であった。７日間処置した後に、１４日間処置をしない場合では、５２％の阻害であった。

＜実施例２＞ ヒアルロナン・オリゴマーは固定独立性成長を阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する。
単層細胞カルチャー、すなわち、固定従属性条件下において、１００−１５０μｇ／ｍＬの濃度のヒアルロナン・オリゴマーは、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞、ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞、ＬＸ−１ヒト肺癌細胞、及びＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞の分化へほとんど効果を示さなかった。標準的な条件下で分化成長阻害を持たないということは、ヒアルロナン・オリゴマーが毒性をもたないということを示している。

しかしながら、腫瘍細胞の特質は固定独立性様式で成長できる能力である（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｖ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ｃｅｌｌ ３，３５５−３５９）。ヒアルロナン・オリゴマーは、軟寒天のコロニーとしての成長能力でアッセイされるように、腫瘍細胞の固定独立性成長を低下させることがここで示される。軟寒天アッセイに１５０μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマーを含有することにより、ＬＸ−１ヒト肺癌細胞、ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞、及びＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞によるコロニー形成が、それぞれ８０、６８、及び７２％阻害される（図２）。同様の結果がヒト神経膠質種細胞及び乳癌細胞を含む、他の数種の腫瘍細胞型においても得られた。

固定独立性成長の阻害がアポトーシスの誘導によるものかどうかについて次に試験した。このために、ヒアルロナン・オリゴマーの存在下及び非存在下において、ＴＡ３／Ｓｔ細胞を懸濁状態で、すなわち固定独立性条件下に、インキュベートした。アポトーシス濃度は、ヒアルロナン・オリゴマー非存在下の〜１３％から、５０−１５０μｇ／ｍＬのオリゴマー存在下の７０−７５％に上昇した（図３）。対照の未処理細胞は２５％未満のアポトーシスを示した。したがって、ここで観察されたヒアルロナン・オリゴマーが存在することによる効果は、アポトーシスの頻度を３倍以上に上昇させることである。

ヒアルロナン・オリゴマーに関連する様々な試薬の効果も試験した。ヒアルロナン・オリゴマーと大きさや化学組成で類似するため、ネガティブ対照としてキチン・オリゴマーを用いた。これらはヒアルナン・シンターゼがキチン・オリゴマーを産生できることに十分に密接に関係している（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｉｔａｎｏ．Ｎ．，Ｙａｍａｄａ，Ｙ．，ａｎｄ Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（２０００）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５，４９７−５０６）。それらは有意な効果をもっていない（図３）。ヒアルロナン・ポリマー及び硫酸コンドロイチンも有意な効果をもっていない（図３）。固定独立性性条件下の癌細胞の生存は、正常上皮細胞に反して、しばしばＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路レベルの上昇に影響されるため、ヒアルロナン・オリゴマーの効果とＰＩ３キナーゼ阻害剤であるワートマニンの効果を比較した。ヒアルロナン・オリゴマーにより誘導されるアポトーシスのレベルは、ワートマニン誘導のそれと同等であった（図３）。

カスパーゼ−３へのヒアルロナン・オリゴマーの効果を測定したところ、それがカスパーゼ−３活性をＴＡ３／Ｓｔ細胞（図４Ａ）及びＨＣＴ１１６細胞（図４Ｂ）において４−１０倍活性化していることがデータにより示された。硫酸コンドロイチンは、両方の細胞型においてカスパーゼ−３活性に有意な効果をもちなかった。アポトーシス・アッセイで示されたように、ヒアルロナン・オリゴマーの効果はＰＩ３キナーゼ阻害剤のそれと比較して同等または高いものであった（図４Ａ、４Ｂ）。

＜実施例３＞ ヒアルロナン・オリゴマーはＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ細胞生存経路を抑制する。
ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ細胞生存経路の活性は多くタイプの腫瘍細胞で上昇し（Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６，４２４０−４２４５；Ｋａｔｓｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １７，６１５−６７５）、この上昇は固定独立性成長にとって必要である（Ｄａｎｅｎ，Ｅ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １８９，１−１３；Ａｍｕｎｄａｄｏｔｔｉｒ，Ｌ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６，７３７−７４６；Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８，５２３９−５２４７；Ｓｈｅｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６，１４４９８−１４５０４）。例えばワートマニンまたはＬＹ２９４００２による、この経路の阻害は、固定独立性条件下におけるアポトーシスを誘導する（図３、４）。したがって、ヒアルロナン・オリゴマーがこの経路を抑制するか否かを試験した。

ＴＡ３／ＳｔまたはＨＣＴ１１６抽出物における総ＰＩ３キナーゼ活性へのヒアルロナン・オリゴマーの効果を初めに測定した。５０−１５０μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマーの添加により、これらの細胞の抽出物における総ＰＩ３キナーゼ活性〜６０％阻害され、１０μｇ／ｍＬではときどき部分的に阻害されることがわかった（図５Ａ、５Ｂ）。次に、個々のＰＩ３キナーゼ・アイソフォーム活性への効果を測定した。ＴＡ３／Ｓｔ細胞及びＨＣＴ１１６細胞における主成分のアイソフォームはαアイソフォームであることがわかった。また、５０−１５０μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマーに５０−７５％の阻害が観察され、１０μｇ／ｍＬではＴＡ３／Ｓｔ細胞（図５Ｃ）及びＨＣＴ１１６細胞において中間の効果が観察された。

ワートマニン及びＬＹ２９４００２には前記オリゴマーと実質的に同等の効果が認められた（ＴＡ３ １ｓｔ：図５Ｄ）。同様の結果はＨＣＴでも得られた。さらに、ヒアルロナン・オリゴマーに関連する様々な試薬の効果を測定した。ヒアルロナン・ポリマー、硫酸コンドロイチン、キチン・オリゴマーのいずれにも、ＴＡ３／Ｓｔ細胞（図５Ｄ）またはＨＣＴ細胞においてＰＩ３キナーゼへの有意な効果はなかった。異なる大きさのヒアルロナン・ポリマーに対して、異なるシクナリング活性が報告されているため（Ｔｕｒｌｅｙ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７，４５８９−４５９２；Ｎｏｂｌｅ，Ｐ．Ｗ．（２００２）Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ ２１，２５−２９）、小さな（〜８０ｋＤａ）及び大きな（〜２，０００ｋＤａ）ポリマーを試験した。いずれの調製物もいずれの細胞型においても有意な効果をもたないことがわかった。

ＰＩ３キナーゼ産生物として主要な目的物であるＰＩＰ３は、Ａｋｔ／プロテインキナーゼＢのリン酸化を順次引き起こす３−フォスフォイノシタイド依存性プロテインキナーゼ１（ＰＤＫ１）である（Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６，４２４０−４２４５）。ヒアルロナン・オリゴマーの添加は、ＴＡ３／Ｓｔ細胞及びＨＣＴ１１６細胞のいずれにおいてもＡｋｔリン酸化の５０−６０％の減少を引き起こす（図６Ａ、６Ｂ）。この効果は硫酸コンドロイチン、ヒアルロナン・ポリマー、またはキチン・オリゴマーによっては生じず、ヒアルロナン・オリゴマーによる阻害はその強さにおいてＰＩ３キナーゼ阻害剤のそれと類似のものである（ＴＡ３／Ｓｔ細胞：図６Ｃ）。同様の結果はＨＣＴ１１６細胞で得られた。総Ａｋｔのレベルへのこれらの試薬の効果も測定したが、いずれの細胞においても有意な効果は認められなかった。

アポトーシスの重要な調節因子はＢＡＤ及びＦＫＨＲであり、そのいずれもＡｋｔのリン酸化の結果として不活性になる（Ｋａｔｓｏ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １７，６１５−６７５；Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ９１，２３１−２４１；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０，８９６９−８９８２）。したがって、ヒアルロナン・オリゴマーで処理することでこれらの二つの成分のリン酸化が減少するか否かについて試験した。ＢＡＤとＦＫＨＲのリン酸化はウァートマニンまたはＬＹ２９４００２による程度と同程度ヒアルロナン・オリゴマーにより阻害される（〜６０％）ことがデータにより示された（図７Ａ、７Ｂ）。

何か特別の理論や機序に制限されることなく、ヒアルロナン・オリゴマーは内因性ヒアルロナンをその受容体であるＣＤ４４から取り除くように働き、その結果、シグナリングを減弱させる。もしこれが事実なら、抗ＣＤ４４抗体のブロッキングによりヒアルロナン・オリゴマーの効果を模倣することができるだろう。したがって、抗ＣＤ４４抗体の効果を試験し、ＰＩ３キナーゼ活性（図５Ｄ）、Ａｋｔリン酸化（図６Ｃ）、ＢＡＤリン酸化（図７Ａ）、及びＦＫＨＲリン酸化（図７Ｂ）の阻害が、ヒアルロナン・オリゴマーと同程度であることが認められた。

＜実施例４＞ ヒアルロナン・オリゴマーはＰＴＥＮレベルを活性化する。
ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路の重要な調節因子は、ＰＩ３キナーゼの産生物であるＰＩＰ３を脱リン酸化するフォスファターゼである、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮである（Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６，４２４０−４２４５；Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｃｅｌｌ ９５，２９−３９）。ここでは５０−１５０μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマーがＴＡ３／Ｓｔ細胞及びＨＣＴ１１６細胞においてＰＴＥＮを５倍以上に活性化することが認められた（それぞれ、図８Ａ及び８Ｂ）。類似の量のヒアルロナン・ポリマー、硫酸コンドロイチン、またはキチン・オリゴマーは、ＰＴＥＮのレベルを活性化しなかった（ＴＡ３／Ｓｔ細胞：図８Ｃ：ＨＣＴ１１６細胞についても類似のデータが得られた）。

＜実施例５＞ ＨＡオリゴマーによるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の遅延
６−１８の糖残基を含むオリゴマーＣＤ４４との相互作用において効果的に一価である（Ｌｅｓｌｅｙ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７５：２６９６７−２６９７５，２０００）。したがって、内因性のポリマー性ヒアルロナンのこの大きさのオリゴマーによる置換は潜在的にヒアルロナン誘導シグナリングの欠乏をもたらし得る。

ＨＡオリゴマー調製物はここで、ヌードマウス系においてｉｎ ｖｉｖｏで数種の腫瘍タイプの成長を遅延することがわかった。この腫瘍タイプには、マウス黒色腫、マウス乳癌、及びヒト肺癌が含まれる（ここで実施例１を参照、また図９には、それぞれＢ１６、ＴＡ３、及びＬＸ１で示される腫瘍タイプのデータ）。ＨＡオリゴマー処理マウスからの黒色腫の重量は、生理食塩水で処理した対照マウスの約２０％であり、他の腫瘍タイプのそれの３０％と４０％との間であった。さらに、ＣＤ４４に結合するヒアルロナンをブロックする抗体で処理すると、腫瘍の成長と浸潤が阻害された（図９；Ｇｕｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５４：１５６１−１５６５，１９９４；Ｚａｈａｌｋａ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５４：５３５４−５３５５，１９９５）。

＜実施例６＞ ＨＡオリゴマーまたは溶解性ＣＤ４４による軟寒天における固定独立性成長の阻害
例えば、軟寒天における固定独立性成長は形質転換無細胞の特質である（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｖ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，３：３５５−３５９，１９７４）。実施例２及び図１０は、ヒアルロナン・オリゴマー添加による内因性ヒアルロナン相互作用の動揺は、乳癌、直腸癌、及び神経膠質腫細胞を含む数種の腫瘍細胞の固定独立性成長を阻害する（図１０参照）。ＨＡオリゴマーの効果的な濃度は１０−１００μｇ／ｍＬであった。ＨＡサブユニット、グルクロン酸、及びＮ−アセチルグルコサミンを含む二種のモノサッカライドの混合物は無効果であった。さらに、溶解性ＣＤ４４は固定独立性成長の効果的な阻害剤であったが、一方、ＨＡに非結合性であることが既に示されている、変異ＣＤ４４の溶解性フォームは成長阻害において無効果であった。

＜実施例７＞ ＨＡオリゴマーによるフォスファターゼ及びテンシン（ＰＴＥＮ）発現の活性化
ここで、細胞のヒアルロナン・オリゴマー処理は、アポトーシスに関連する細胞内事象の既知経路により固定独立性成長を阻害することが示される。この経路における効果は、ＰＴＥＮレベルの上昇（図１１Ａ参照）、フォスフォイノシトール−３−キナーゼ活性の阻害（ＰＩ３；図１１Ｂ）、及びＢＡＤ（Ｂｃｌ−２関連死）とＦＫＨＲのリン酸化もしくはカスパーゼ３活性とＦａｓ発現の活性化を含むこの細胞生存経路の数多くの下流事象の抑制を含む。

これらのデータは、様々な手段（例えば、ＨＧＦ／スキャター因子、β−カテニンの過剰発現、Ｈａｓ２組み換えアデノウィルス）により誘導される内因性のポリマー性ＨＡの発現上昇が細胞生存経路を増強し、アポトーシスに抵抗する（下記実施例を参照）という事実と符合している。したがって、Ｈａｓ２組み換えアデノウィルスに感染したＭＤＣＫ細胞が、非感染の対照細胞に比較して、軟寒天におけるコロニー形成能を増強し（図１３Ａを参照）、Ｐ−Ａｋｔを過剰発現する（図１３Ｂ）。さらに、ＨＡオリゴマーの存在下で、Ｈａｓ２組み換えアデノウィルス感染のこの効果は、ワートマニンまたはＬＹ２９４００２で処理した場合と同様に、反転する（図１３Ａ）。

＜実施例８＞ アポトーシス誘導薬剤に対する腫瘍細胞の耐性
薬剤耐性は、薬剤の取り込み低下、無毒化機構の活性化、及びアポトーシス経路の変化を含む多くの方法により上昇し得る（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ，２：４８−５８，２００２）。“古典的な”多剤耐性（ＭＤＲ）は通常、ｍｄｒ、ｍｒｐ、及び関連ＡＢＣトランスポーター・ファミリー、特に、ＭＤＲ１（Ｐ−グリコプロテイン）、ＭＲＰ２（多剤耐性関連蛋白２）、及びＢＣＲＰ（乳癌耐性蛋白）におけるＡＴＰ依存性流出ポンプの活動を介した薬剤排出の増強に影響される。患者における薬剤耐性は、いくつかの場合においては、アポトーシス・カスケードの下流事象を誘導する新規な治療的干渉によって克服され得る（Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２１：４８５−４９５，２０００；Ｍａｋｉｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１１：Ｓ２２−Ｓ２６，２００１；Ｏ‘Ｇｏｒｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１５：２１−３４，２００１）。

本発明の態様に関連して、多剤耐性の多くの性質がＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ細胞生存経路の活性に依存しているという証拠がある（Ｏ‘Ｇｏｒｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋ Ｒｅｓ，２５：８０１−８１１，２００１；Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，９５：２９−３９，１９９８；Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６３：９５９−９６６，２００２；Ｋｕｏ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１：１９４５−１９５４，２００２）。ＨＡオリゴマーはこの経路を抑制するため、ＨＡオリゴマーがこれらの試薬に対する耐性を逆転させる可能性がある。さらに、ヒアルロニダーゼは様々な化学療法剤の活性を、特に局所に適用される場合に、増強する（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，１３１：８５−９９，１９９８）。ＥＭＴ−６乳癌細胞の多細胞球塊のヒアルロニダーゼによる処理は、ＭＤＲ１に基づく多剤耐性を逆行させる（Ｃｒｏｉｘ，Ｂ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，８８：１２８５−１２９６，１９９６；Ｓｔ Ｃｒｏｉｘ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，１３１：３５−４４，１９９８）。ヒアルロニダーゼの機械的な効果は理解されていないが、一般には、本発明でわかった細胞生存シグナリングへの効果よりむしろ、細胞吸着の減少及び薬物通過の増加の効果の点から説明されてきている。

メトトレキセート処理に対するＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞の耐性へのヒアルロナン・オリゴマーの添加効果を評価した。メトトレキセートに対する腫瘍細胞の耐性機序は多少議論されている。メトトレキセート特異的な、還元された葉酸担体による取り込み低下（Ｗｏｒｍ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１６：１６，２００１；Ｍａ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２７９：８９１−８９７，２０００）、及びＭＲＰファミリーまたは関連トランスポーターのメンバーの介在する放出増加などのようなより“古典的な”効果（Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５９：２５３２−２５３５，１９９９；Ｋｏｏｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９６：６９１４−６９１９，１９９９；Ｖｏｌｋ，Ｅ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６０：３５１４−３５２１，２０００）が、研究ににより証明されている。１００μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマーの添加により、メトトレキセートに対してＭＢ２３１細胞が著しく感受性を高め、ＩＣ₅₀が約１μＭから１０ｎＭに低下し、メトトレキセートの効果の１００倍の改善が得られることが、ここで認められる（図１２、図中、ＭＢ２３１細胞は“ＭＤＡ”と示されている）。さらに、メトトレキセート−感受性化ＭＣＦ−７細胞では、オリゴマー効果は全く認められなかった。これらのデータにより、細胞の多剤耐性を克服するためのＨＡオリゴマーの使用が古典的な化学療法剤をかなり低い濃度で活性にすることができ、これがまた患者における副作用を減少させるために有益である。

＜実施例９＞ 常用される化学療法剤に対するヒト癌細胞系の耐性へのＨＡオリゴマーの効果
ＨＡオリゴマーがメトトレキセートに対するＭＤＡ−ＭＢ２１３細胞の感受性を高めるという説明をさらに拡張するため、多剤耐性研究のためにさらに広く用いられている系、すなわち、ＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞を類似の研究としてここでは用いる。

ヒト乳癌に由来するこれらの細胞をドキソルビシンへの耐性のために選択してＭＤＲ１（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４７：５１４１−５１４８，１９８７）及び薬剤無毒化酵素であるグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（Ｂａｔｉｓｔ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６１：１５５４４−１５５４９，１９８６）のアップ・レギュレーションのために多剤耐性が生じていることが示された。ＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞はネブラスカ州のエプリー癌センターのケネス・コワン博士から取得した。

これらの細胞を用いて、ドキソルビシン、パクリタキセル、及びビンブラスチンに対するＭＣＦ−７及びＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞の、ＨＡオリゴマー存在下及び非存在下における耐性の相対的な程度を評価した。化学療法剤の非存在下において、ＨＡオリゴマー単独では、単層カルチャーの分化にほとんどまたは全く影響がなかった。

ドキソルビシン、パクリタキセル、及びビンブラスチンは、三つのクラスの薬剤、すなわち、“古典的な”多剤耐性に通常影響を受ける、それぞれアントラサイクリン、微小管安定化剤、及びビンカアルカロイドを代表し、ＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞はこれら三つの薬剤に耐性であることが示されている（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，４７：５１４１−５１４８，１９８７；Ｚｉｌｆｏｕ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ，７：４３５−４４３，１９９５；Ｏｇｒｅｔｍｅｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，６７：６０８−６１４，１９９６；Ｈａｌｌ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ，３９：１１３−１２８，１９９９；及びＣｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，９８：４６３−４６９，２００２）。これらの実験は、メトトレキセートを用いて、上記の実施例と同様の方法で実施した（図１２）。細胞は、１０％牛胎児血清及び１０−２５０μｇ／ｍＬのＨＡオリゴマーを含み、一定範囲濃度のパクリタキセル、及びビンブラスチンを含むＤＭＥＭで培養した。２種の供給源の高度精製ＨＡオリゴマー、すなわち、アニカ・セラピューティク社及び生化学株式会社のもの、を用いた（Ｚｅｎｇ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，７７：３９６−４０１，１９９８）。細胞数は、コールター・カウンターで細胞数を計測し、生存細胞にＭＴＴアッセイを行うことにより測定した（Ｖｏｌｋ，Ｅ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６０：３５１４３−３５２１，２０００）。

ＨＡオリゴマーが腫瘍細胞における薬剤蓄積に影響するか否かを決定するために、ＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞におけるジキソルビシン、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞におけるメトトレキセートの取り込みと放出を測定する。ドキソルビシンの取り込みと放出は記述されているように測定される（Ｆｕ，Ｌ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，３８：４１８−４２６，２００２）。簡略に述べれば、ＭＣＦ−７及びＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞を、１０ｍＭのグルコースで補足した倍地中、ＨＡオリゴマーの存在下及び非存在下、１０μＭのドキソルビシンとともに３時間インキュベートする。次に、洗浄細胞を０．３Ｍ塩酸及び６０％エタノール中で処理し、遠心分離し、４７０ｎｍ（励起）及び５９０ｎｍ（放射）でドキソルビシンの分光蛍光測定を行った。放出を測定するために、上記のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、さらにＨＡオリゴマーの存在下または非存在下でドキソルビシンを加えずにインキュベートすることを除き、同様の操作を行った。メトトレキセートの取り込みと放出は、³Ｈ−メトトレキセート（アマシャム社；ウァーム，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１６：１６，２００１）による放射活性測定を用いことを除き、同様の方法で測定する。

これらの実施例は固定依存性（ anchorage-dependent ）条件下において行った。ここで、ＨＡオリゴマーはアポトーシスを誘導し、固定独立性条件下ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ細胞生存経路を抑制したことがデータから証明された（図３及び図１１）。しかしながら、ＨＡオリゴマーも固定依存性条件下、中程度にこの経路を抑制した。この抑制のレベルは、固定依存性条件下にアポトーシスを誘導するには十分ではないものの、この条件下で化学療法剤に対し細胞を感受性にすることは可能である。したがって、ＨＡオリゴマーがＰＴＥＮ発現を活性化し、ＰＩ３−キナーゼ活性を抑制するかどうか、Ａｋｔ及びＢＡＤリン酸化を個々で用いた薬剤処理条件でこれらの細胞において決定した。これらの測定は当業者において標準である方法により実施した（Ｇｈａｔａｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７：３８０１３−２０，２００２）。

ＭＣＦ−７及びＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞においてアポートーシスを誘導するＩＣ₅₀を評価するために、ドキソルビシン、パクリタキセル、及びビンブラスチンの適当な濃度範囲を決定する。１０−２５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマーのこれらの薬剤のＩＣ₅₀に対する効果を試験する。ＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞におけるドキソルビシンの取り込みの放出は、ヒアルロナン・オリゴマーが耐性を最大に逆転させる条件で測定した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞における取り込みと放出は、ヒアルロナン・オリゴマーが耐性を最大に逆転させる条件（パイロット・スタディで決定されている）で測定する。ドキソルビシン、パクリタキセル、及びビンブラスチンの効果を、ヒアルロナン・オリゴマーの存在下及び非存在下において、フォスフォイノシタイド−３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ）、Ａｋｔリン酸化（プロテインキナーゼ３）もしくはＢＡＤ、及びＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞におけるＰＴＥＮ発現などのようなパラメータを用いて測定する。

＜実施例１０＞ 球塊カルチャーにおけるヒト癌細胞の化学耐性（chemoresistance）へのＨＡオリゴマーの効果
多くの研究により、三次元で起こる細胞相互作用、例えば、球塊における多細胞耐性とときどき呼ばれる現象、の条件下において、薬剤耐性がしばしば上昇することが証明されている（ＤｅＳｏｉｚｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ／Ｈｅｍａｔｏｌ ３６：１９３−２０７，２０００；Ｏｌｉｖｅ，Ｐ．Ｌ．以下ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ，１３：１２１−１３８，１９９４；及びＫｅｒｂｅｌ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ，５９：６６１−６７２，１９９４）。そのような耐性はときどきヒアルロニダーゼ処理により逆行させることができる（Ｃｒｏｉｘ，Ｂ＞Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ， ８８： １２８５−１２９６；Ｓｔ Ｃｒｏｉｘ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ，１３１：３５−４４）。

ＨＡオリゴマー非存在下及び様々な濃度のＨＡオリゴマーの存在下において、この方法で培養したＭＣＦ−７及びＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞のドキソルビシン、パクリタキセル、及びビンブラスチンに対する相対的な耐性を測定する。従来の研究により、球塊カルチャーは、適当に感受性化されたＭＣＦ−７細胞において上昇することがわかっている（ｄｉｔ Ｆａｕｔｅ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，１９：１６１−１６８，２００２）。球塊カルチャーは既に記述されているように（Ｂａｌｌａｎｇｒｕｄ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５：３１７１ｓ−３１７６ｓ，１９９９）、すなわち、寒天薄層上に細胞を培養し、次に約１−２００μｍの球塊を選択し、２４ウェル・プレートの寒天層に移すことにより、作製する。薬剤とオリゴマーの組み合わせの効果は、球塊の体積測定により（Ｂａｌｌａｎｇｒｕｄ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５：３１７１ｓ−３１７６ｓ，１９９９）、またはＭＴＴ生存アッセイ（Ｄｅｎｉｚｏｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８９：２７１−２７７，１９８６）により評価する。

ＭＣＦ−７及びＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞の球塊カルチャーを確立する。球塊カルチャーにアポトーシスを誘導するためのＩＣ₅₀を評価するために、ドキソルビシン、パクリタキセル、及びビンブラスチンの適当な濃度範囲を決定する。次に上記薬剤のＩＣ₅₀に対する１０−２５０μｇ／ｍＬヒアルロナン・オリゴマーの効果を試験する。

＜実施例１１＞ ヒト癌細胞のヌードマウス異物移植における化学耐性に対するＨＡオリゴマーの効果
培養系における化学耐性の効果は必ずしもｉｎ ｖｉｖｏにおける関連する効果を反映しない。したがって、ドキソルビシンに対する耐性へのＨＡオリゴマーの効果を実験動物へのＭＣＦ−７／ａｄｒＲ細胞の異物移植を用いてｉｎ ｖｉｖｏで測定する。

異物移植は既に記述されているように作製する（Ｆｕ，Ｌ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．ＥｕｒＪ Ｃａｎｃｅｒ，３８：４１８−４２６，２００２；Ｕｌｌｍａｎ，Ｃ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１：１３７９−１３８２，１９９１）。簡略に記述すれば、０．５×１０⁶個の細胞をヌードマウスに皮下注入する。５×５ｍｍの大きさになった後、マウスを６群に分け、それぞれにドキソルビシン単独（４ｍｇ／ｋｇ）、ＨＡオリゴマー単独（５ｍｇ／ｋｇ）、またはドキソルビシン（４ｍｇ／ｋｇ）とＨＡオリゴマー（５ｍｇ／ｋｇ）を、３−４週間にわたって２日目ごとに、腹腔内投与する。さらに、ドキソルビシンを腹腔内投与し、ＨＡオリゴマー（０．５μｇ／０．５μＬＨＡ／時間）またはＰＢＳを、上記実験の注入部位に隣接して埋め込まれた３週ＡＬＺＥＴポンプから投与する。腫瘍体積を規定の間隔で直径測定により評価する。４週後に屠殺して腫瘍重量を測定する。

ＭＣＦ−７／ａｄｒＲの異物移植ヌードマウスの皮下に作製し、ＩＣ₅₀決定のためのドキソルビシン投与量を評価する。ＡＬＺＥＴポンプからのヒアルロナン・オリゴマー単独の皮下投与と比較した投与腹腔内投与の腫瘍成長に対する効果を評価する。ドキソルビシンのＩＣ₅₀に対するヒアルロナン・オリゴマーの効果をほとんどまたは全く効果のないオリゴマーの投与量、及び有意な効果のみを有する投与量で試験する。

最近の研究により、悪性の活動を抑制する正常細胞−細胞外マトリックス相互作用の重要性、及び悪性の性質の始まりと成長における悪性細胞−マトリックス相互作用の潜在的な働きが証明されてきた（例えば、Ｂｉｓｓｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５９：１７５７−１７６３ｓ；及び１７６３ｓ−１７６４ｓ，１９９９；Ｒｏｓｋｅｌｌｙ，Ｃ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＳＥｍｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ， １２：９７−１０４，２００２を参照）。ＨＡは腫瘍成長に含まれる一つのマトリックス成分である。ここで、上昇したＨＡ発現がＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ細胞生存経路の活性を増強すること、及びＨＡの小さなオリゴマーが、ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ細胞生存経路を抑制し、固定独立性条件下においてアポトーシスを誘導することにより、内因性ＨＡポリマー相互作用と拮抗していることが示される。何か特定の機序に限定されることなく、ＨＡオリゴマーが、細胞生存経路を抑制し、アポトーシス機序を活性化することにより化学耐性癌細胞を感受性化することが提案される。ここで実施例は、ＨＡオリゴマーがｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍成長を遅延させることを示している。これらのオリゴマーが化学耐性を逆行させるという可能性により、少ない副作用でより効果的に癌細胞を殺すことにより現在の化学療法プロトコールを強化する新規な治療が導かれ得る。

＜実施例１２＞ 腫瘍細胞の放射線耐性へのＨＡオリゴマーの効果
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ；分散因子としても知られている）による細胞処理、またはβ−カテニンの発現上昇は、上皮細胞における形質転換特性を誘導する。β−カテニンの場合、これらの形質転換特性は、対照と比較してγ−放射線への耐性上昇及びＳ１相への移行上昇を含んでいる（Ｏｒｆｏｒｄ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４６：８５５−８６８）。

ここで示されるように、ＨＧＦ処理またはβ−カテニン発現上昇が誘導したＭＤＣＫ細胞における固定独立性成長は、ＨＡオリゴマー及び抗ＣＤ４４抗体による処理によっても逆行する（図１４Ａ、１４Ｂ）。さらに、これらの細胞は、マトリゲル（ Matrigel ）が被覆する空間に浸潤する能力をもつことがわかり、ＨＡオリゴマーは、キチン・オリゴマーではできないこの浸潤を逆行させることができた。したがって、放射線に対する細胞の感受性を改善するＨＡオリゴマー処理をさらに検討する。

この目的で、ベクター感染及びβ−カテニン感染したＭＤＣＫ細胞系を構築した。これらの細胞を５Ｇｙ（Ｇｒａｙ単位）のγ放射線に８時間暴露し、それらの細胞周期をＦＡＣＳで分析し、放射線暴露を受けていない細胞と比較して特長づける。さらに、この実験を１０−５００μｇ／ｍＬのＨＡオリゴマーの存在下及び非存在下において行い、オリゴマーがこれらの効果を逆行させ成長停止を引き起こすか否かを確かめる。

＜多剤耐性及び放射線耐性に対する細胞の感受性へのＨＡＢＰの影響＞
多剤耐性及び放射線耐性のそれぞれにおける溶解性ＨＡＢＰの過剰発現の効果を、溶解性ＣＤ４４及びブレビカン（ brevican ）連結モジュール、すなわち脳に由来するヒアルロナン結合プロテオグリカンであるブレビカンのヒアルロナン結合ドメインの合成を促進することができる組み換えアデノウィルス・ベクターを用いて試験する。

何か特定の機序に関わらず、ここで述べる変異ＣＤ４４は、溶解性ＣＤ４４の存在下において薬剤または放射線に対する細胞の上昇した感受性の何か積極的な効果がＨＡＢＰによるＨＡ親和性によるものかを確認するためにさらに用いられる。これらのデータにより、内因性ＨＡへの競合がＨＡオリゴマーの効果を擬態するものか否かを決定される。アポトーシス経路におけるこれらの組成物の効果を確認するため、これらの実験に用いられる、ＨＡオリゴマー処理及び溶解性ＨＡＢＰ処理のいずれかと未処理細胞におけるＰＩ３キナーゼ活性、Ａｋｔリン酸化、及びＰＴＥＮ発現のレベルを決定し得る。

＜実施例１４＞ ドキソルビシン、メトトレキセート、ＢＣＮＵ、タキソール及びビンクリスチンに対するアドリアマイシン耐性細胞の感受性を、ヒアルロナン・オリゴマーは上昇させる。
ここでは、ヒアルロナン−細胞相互作用の動揺が固定独立性条件下において悪性癌細胞におけるアポトーシスを誘導することが示される。これらの条件下において、通常の上皮細胞は、細胞外マトリックスの大分子にインテグリンを介した結合がそれらの生存のために要求されるため、アポトーシスを受ける。しかしながら、多くのタイプの癌細胞は生存のためのこれらの要求を避け、大部分はフォスフォイノシタイド−３（ＰＩ３）キナーゼ／Ａｋｔ及びＭＡＰキナーゼのシグナリング・カスケードのような細胞生存経路の構成的強化によって、懸濁液または軟寒天において培養できる（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３，５５２−６２，２００１；Ｔａｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９１，１８２０−８（１９９９）；Ａｌｍｅｉｄａ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４９，７４１−５４，２０００）。

内因性ヒアルロナン相互作用はヒアルロナン・ジサッカライド（〜１２００−４０００Ｄａ）による処理によって上記のように動揺する。これらのオリゴマーは内因性のポリマー性ヒアルロナンと競合し、このため高親和性、多価、及び協調的相互作用が、低親和性、低価の受容体相互作用に取って代わられる（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５８，８０８６−９１，１９８３；Ｌｅｓｌｅｙ，Ｊ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５，２６９６７−７５，２０００）。ヒアルロナン・オリゴマーはＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ細胞生存経路を抑制し、ＢＡＤ及びＦＫＨＲのリン酸化低下、ＰＴＥＮ発現上昇、カスパーゼ−３活性上昇のようなアポトーシスの前駆事象に導く。ここでは、シグナリング経路におけるこれらの変化が、固定独立性条件下と同様に固定従属性条件下においても起こることがわかる。上記に説明したように、ヒアルロナン・オリゴマーがこの耐性を逆行させると仮定された。

ゆえに、薬剤耐性へのヒアルロナン・オリゴマー共処理の効果は、確立された系、すなわち、ドキソルビシン耐性で選択されたＭＣＦ−７／Ａｄｒヒト乳癌細胞で検討された（Ｆａｉｒｃｈｉｌｄ，Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７，５１４１−８，１９８７）。先ず、相対的な薬剤感受性に対する、ＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞におけるドキソルビシン耐性へのヒアルロナン・オリゴマーの効果は、親ＭＣＦ−７細胞系が比較された。１００μｇ／ｍＬのヒアルロナン・オリゴマーが、ＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞の前記薬剤に対する感受性を〜５５倍に高めたが、すでに感受性であるＭＣＦ−７細胞への効果はほとんどなかった（図１５Ａ、１５Ｂ；表１）。オリゴマーの濃度範囲を試験し、２００μｇ／ｍＬまでの濃度では単独使用の場合に細胞生存にほとんどまたは全く影響を与えなかったにもかかわらず、１０μｇ／ｍＬまたはそれを超える濃度ではドキソルビシン耐性に有意な効果があることがわかった。

他の薬剤に対するこれらの細胞の耐性へのヒアルロナン・オリゴマーの効果を試験、すなわち、それらが多剤耐性に影響するか否かを試験した。ここで前記オリゴマーはタキソールに対して〜１２倍、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソウレア（ＢＣＮＵ）に対して〜７８倍、及びビンクリスチンに対して〜１０倍、耐性を減少させることがわかった（表１）。また、前記オリゴマーは親ＭＣＦ−７細胞にはほとんど効果がなかった（表１）。

ヒアルロナン・オリゴマーは、また異なる細胞系、すなわち葉酸アナログ・メトトレキセートに対するＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞の耐性を試験した（Ｗｏｒｍ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １６，１６，２００１）。ここで、それらがこの系において１３３倍耐性を減少させることがわかった（表１）。

＜実施例１５＞ ヒアルロナン発現は癌細胞に薬物耐性、及びヒアルロナン・オリゴマー処理で逆行する効果を誘導する
もしヒアルロナン・オリゴマーがヒアルロナン相互作用を動揺させることにより多剤耐性細胞を感受性化するのなら、次にヒアルロナン産生増加が薬剤感受性化細胞の耐性上昇を引き起こすことが期待される。したがって、ヒアルロナン産生は、ヒアルロナンを合成する一つの酵素である、Ｈａｓ２の発現を促進する組み換えアデノウィルスで感染することにより、適当に薬剤感受性をもつＭＣＦ−７細胞において活性化された（Ｗｅｉｇｅｌ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２，１３９９７−４０００，１９９７）。

３つの別の実験において、前記Ｈａｓ２アデノウィルス感染細胞は、未処理細胞または組み換えβ−ガラクトシダーゼ・アデノウィルスで感染した対照細胞よりも２．５−４倍多くのヒアルロナンを生産することがわかった（図１６Ａ）。さらに、ヒアルロナン産生の上昇が１０−１２倍のドキソルビシンに対する耐性を誘導し（図１６Ｂ）、この耐性はヒアルロナン・オリゴマーの継続的処理により逆行した（図１６Ｃ）。

予備的なデータにより、グリコプロテインであるエムプリン及び最も悪性の癌細胞の表面に多く存在するＩｇＧスーパーファミリーのメンバー（Ｂｉｓｗａｓ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：４３４−４３９，１９９５）が、腫瘍細胞におけるヒアルロナン産生を調節する。

組み換えエムプリン・アデノウィルスに感染したＭＣＦ−７細胞は、対照よりもドキソルビシン処理に対してより耐性であることがわかった（図１６Ｃ）。さらに、この効果はヒアルロナン・オリゴマー処理により逆行することがわかった（図１６Ｄ）。

＜実施例１６＞ ＰＩ３／ａｋｔ細胞生存経路へのヒアルロナン・オリゴマーの効果
さらに、ヒアルロナン・オリゴマーはＰＩ３／ａｋｔ細胞生存経路を抑制することがわかった。この経路の下流効果の一つはＢＡＤリン酸化であり、これがアポトーシスの前駆効果を逆行させる（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３，２９０５−２７，１９９９）。ヒアルロナン・オリゴマーは、Ａｋｔによる主要なリン酸化部位であるセリン１３６におけるリン酸化を阻害する。しかしながら、この研究はここで用いられるものとは異なる細胞で行われた。

それゆえに、この経路におけるヒアルロナン・オリゴマーの効果はＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞において試験された。ヒアルロナン・オリゴマーはＡｋｔのリン酸化を抑制し、様々な薬剤、すなわちドキソルビシン、タキソール、ビンクリスチン（図１７Ａ）及びＢＣＮＵの存在下、ＰＴＥＮ発現を活性化した。ＰＩ３キナーゼ活性も阻害され、Ａｋｔの総レベルに何の効果も観察されなかった。これらの効果はＢＡＤリン酸化の減少を招くことが期待される。しかしながら、前記で用いた細胞（ＨＣＴ１１６直腸癌及びＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌）とは反対にＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞においては、薬剤及びオリゴマーの存在下または非存在下においてセリン１３６におけるＢＡＤリン酸化はほとんど認められなかった。この理由のため、ＭＡＰキナーゼに関する更なる研究を行う。この経路はＢＡＤリン酸化を誘導し、この場合はセリン１１２におけるものである（Ｂｏｎｎｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６，１３５８−６２，１９９９；Ｍａｂｕｃｈｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７，３３４９０−５００，２００２；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １３１，８５−９９，１９９８）。

ここではデータにより、様々な薬剤で処理したＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞において、強いセリン１１２におけるＢＡＤリン酸化が示される。これらの結果は、これらの細胞においてＭＡＰキナーゼ経路の方がＰＩ３キナーゼ経路よりも多く含まれていることを示唆している。また、データにより、このリン酸化がヒアルロナン・オリゴマーにより阻害されることが示された（図１７Ｂ、１７Ｃ）。さらに、前記オリゴマーは様々な薬剤の存在下において、総レベルではなく、この経路の上流の成分、すなわちＥｒｋ（図１７Ｂ、１７Ｃ）及びＲａｆ−１のリン酸化を阻害する。

これらの実験は固定従属性培養条件下において行われるため、ＭＡＰキナーゼ経路はＦＡＫによって活性化されているだろう（Ｔａｍｕｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ９１，１８２０−８，１９９９；Ａｌｍｅｉｄａ，Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４９，７４１−５４，２０００）。したがって、ＦＡＫリン酸化はヒアルロナン・オリゴマーの存在下及び非存在下において薬剤処理したＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞で、オリゴマーがＦＡＫリン酸化を阻害するか否か決定するために検討した。これらの実験におけるＰ−Ｅｒｋ、ｐ−ＢＡＤ１１２、及びｐ−ＦＡＫレベルは、薬剤およびオリゴマー投与量によって５０−９０％変動することがわかった。これらの実験の多くも、５０−１０００ｎＭのＢＣＮＵ濃度で行い、同様の阻害が観察された。

ヒアルロナン産生の上昇はＭＣＦ−７細胞において薬剤耐性増強を引き起こすため、これらの経路が組み替えＨａｓ２アデノウィルス感染細胞において活性化されるか否かについても確認した。Ａｋｔ、Ｅｒｋ、ＢＡＤ１１２及びＦＡＫのリン酸化は、対照と比較して薬剤処理したＨａｓ２アデノウィルス感染細胞で上昇し、一方、ＰＴＥＮ発現は減少することがわかった。

上記実施例により、内因性ヒアルロナン−腫瘍細胞の相互作用は癌細胞における多剤耐性の決定的な調節成分であること、及びヒアルロナンの振る舞いの最も可能性のある機序は、ＰＩ３キナーゼ及びＭＡＰキナーゼ細胞生存経路を活性化することにより、ＢＡＤリン酸化のような様々な抗アポトーシスの結果に導くということが示されている。活性で、非リン酸化ＢＡＤは生存Ｂｃｌ−２ファミリー・メンバーの前駆体と相互作用し、アポトーシスを誘導する（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３，２９０５−２７，１９９９）。ＢＡＤは、Ａｋｔによりセリン１３６が、Ｅｒｋによりセリン１１２がリン酸化されることにより不活性化され、いずれも腫瘍細胞において薬剤耐性上昇をもたらすことができる抗アポトーシスの結果に導く（Ｂｏｎｎｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６，１３５８−６２，１９９９；Ｍａｂｕｃｈｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７，３３４９０−５００，２００２；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １３１，８５−９９，１９９８）。ここで用いられるＭＣＦ−７／Ａｄｒヒト乳癌細胞において、ＢＡＤリン酸化の調節は主にＥｒｋによって仲介されている。しかしながら、ＨＣＴ１１６ヒト直腸癌細胞及びＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞においては、ＡｋｔによるＢＡＤリン酸化が顕著である。いずれの場合にもヒアルロナン・オリゴマーによる細胞処理はこの過程を阻害し、癌細胞のアポトーシスを促進する。

これらのデータは多剤耐性におけるヒアルロナンの働きを示すだけでなく、ヒアルロナン相互作用の動揺が耐性細胞を感受性化することも示している。したがって、そのような動揺は、ここで示したように化学療法剤に対する癌細胞の感受性化と同様に、腫瘍の成長及び転移に実質的な効果をもつため、二重の治療上の役目を提供する。

これらのデータは、ヒアルロナン・オリゴマーによる多剤耐性細胞の処理により、それらの細胞を薬剤処理へ感受性化することを示している。ドキソルビシンに耐性となった細胞である、アドリアマイシン耐性細胞系ＭＣＦ−７／Ａｄｒは、次のそれぞれの薬剤に対して、以下のような程度で感受性化することがわかった。すなわち、ドキソルビシンに対し５５倍、ＢＣＮＵに対し７８倍、タキソールに対し１２倍、ビンクリスチンに対し１０倍の程度で感受性化する。さらに、ＭＤＡ ＭＢ２３１細胞系の細胞は、ヒアルロナン・オリゴマーによる処理の結果として１３３倍メトトレキセートに感受性となることがわかった。薬剤耐性ＭＣＦ−７細胞のヒアルロナン・オリゴマー処理においては、有意な効果は観察されなかった。

細胞における内因性ヒアルロナン合成の効果も、ヒアルロナン・シンターゼ（組み換えアデノウィルスを使用）のアップ・レギュリレーション供給により検討した。そのようなアップ・レギュリレーションの結果として、薬剤感受性化細胞のＭＣＦ−７は１２倍より耐性になることがわかり、この効果はＨＡオリゴマー処理により逆転することがわかった。

Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、最も悪性の癌細胞の表面に多く存在する蛋白質であるエムプリンのアップ・レギュレーションはヒアルロナン合成を活性化することがわかった。アップ・レギュレーションの結果として、ＭＣＦ−７細胞は１０−１５倍より薬剤耐性になり、この効果はＨＡオリゴマー処理により逆転することがわかった。

抗腫瘍剤は細胞生存シグナリングに含まれる、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ、Ｒａｆ／Ｅｒｋ、及びＦＡＫのような経路を活性化することがわかった。さらに、ＨＡオリゴマー処理は前記薬剤の存在下または非存在下においてこれらの経路を抑制するこちがわかった。ヒアルロナンまたはエムプリン合成のアップ・レギュレーションには反対の効果、すなわちこれらの経路の活性化、がある。

何か特別の機序または細胞内の活動様式に制限されることなく、これらのデータは、ＨＡオリゴマーによる細胞処理は内因性ヒアルロナン合成の効果を阻害し、このためアポトーシス強化剤である抗癌治療剤が他の薬剤耐性細胞において腫瘍細胞死を引き起こすより大きな可能性をもっていることを証明している。

本発明の追加的な態様が特許請求の範囲に記載されているが、これらは限定的に解釈されるべきものではない。

ヒアルロナン・オリゴマーによるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害を示す棒グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーによるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害を示す棒グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーによるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長の阻害を示す棒グラフである。 固定独立条件下におけるヒアルロナン・オリゴマーによるアポトーシスの誘導を示す棒グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーによるＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞におけるカスパーゼ−３活性の活性化を示す棒グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーによるＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞におけるカスパーゼ−３活性の活性化を示す棒グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーによるＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞におけるＰＩ３キナーゼ活性の阻害を示す棒グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーによるＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞におけるＰＩ３キナーゼ活性の阻害を示す棒グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーによるＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞におけるＰＩ３キナーゼ活性の阻害を示す棒グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーによるＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞におけるＰＩ３キナーゼ活性の阻害を示す棒グラフである。 ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞における、ヒアルロナン・オリゴマーによるＡｋｔリン酸化の阻害を示す棒グラフである。 ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞における、ヒアルロナン・オリゴマーによるＡｋｔリン酸化の阻害を示す棒グラフである。 ＴＡ３／Ｓｔ細胞からリン酸化されたＡｋｔのウェスタン・ブロットを示す図である。 アポトーシスに含まれる蛋白質ＢＡＤの、ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞におけるＨＡオリゴマーによるリン酸化の阻害を示すイムノブロットを示す図である。 ＴＡ３／Ｓｔ細胞における核転写因子であるＦＫＨＲのリン酸化の阻害を示すイムノブロットを示す図である。 ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞における、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮの発現のヒアルロナン・オリゴマーによる活性化を示す棒グラフである。 ＨＣＴ１１６ヒト結腸癌細胞における、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮの発現のヒアルロナン・オリゴマーによる活性化を示す棒グラフである。 ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞を用いたイムノブロットを示す図である。 ＴＡ３／Ｓｔマウス乳癌細胞における、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の成長の遅延を示す棒グラフである。 ＨＡオリゴマーまたは過剰発現した溶解性ＣＤ４４による、軟寒天における固定独立性増殖の阻害を示す棒グラフである。 ＨＡオリゴマーによる、ＰＴＥＮ（フォスファターゼとテンシン）の活性化を示す棒グラフである。 ＨＡオリゴマーによる、ＰＩ３キナーゼ活性の阻害を示す棒グラフである。 ＨＡオリゴマーによる、メトトレキセートへの可逆的な耐性を示す折れ線グラフである。 Ｈａｓ２発現を促進するアデノウィルスに感染したＭＤＣＫ細胞による、０．２％軟寒天におけるコロニー形成の阻害を示す棒グラフである。 Ｐ−Ａｋｔ合成が、非組み換え対照細胞に比較して、Ｈａｓ感染細胞において上昇することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。 ＨＧＦ刺激ＭＤＣＫまたはＭＤＣＫ−１０Ａ細胞をＨＡオリゴマーで処理することにより、逆のコロニー形成能が生じることを示す棒グラフである。 β−カテニン過剰発現ＭＤＣＫまたはＭＤＣＫ−３７Ａ細胞をＨＡオリゴマーで処理することにより、逆のコロニー形成能が生じることを示す棒グラフである。 ＨＧＦ刺激ＭＤＣＫまたはＭＤＣＫ−１０Ａ細胞をＨＡオリゴマーで図．１５Ａで示すように処理することにより、マトリゲルで被覆した小胞を通して逆の細胞浸透能が生じることを示す棒グラフである。 β−カテニン過剰発現ＭＤＣＫまたはＭＤＣＫ−３７Ａ細胞をＨＡオリゴマーで処理することにより、逆の細胞浸透能が生じることを示す棒グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーとともにカルチャー培養したＭＣＦ−７／Ａｄｒ薬物耐性ヒト乳癌細胞がドキソルビシン感受性になることを示す折れ線グラフである。 ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞がＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞よりもさらにドキソルビシンに感受性となること、及びＨＡ処理が有意にＭＣＦ−７細胞を感受性を与えないことを示す折れ線グラフである。 癌細胞におけるヒアルロナンの発現増強が誘導したドキソルビシン耐性を示す折れ線グラフである。 ｏ−ＨＡ処理した組み換えＨａｓ−アデノウィルス感染ＭＣＦ−７細胞における、逆ヒアルロナン誘導ドキソルビシン耐性を示す折れ線グラフである。 未処理ＭＣＦ−７細胞、または組み換えエムプリン・アデノウィルスで一晩感染した細胞のドキソルビシン応答を示した折れ線グラフである。 組み換えエムプリン・アデノウィルス感染ＭＣＦ−７細胞におけるエムプリン誘導された逆多剤耐性を示す折れ線グラフである。 ヒアルロナン・オリゴマーが細胞生存の経路を調節することを示すＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞抽出物のウェスタン・ブロットを示す図である。 ｐ−Ｅｒｋ及びｐ−ＢＡＤ１１２のウェスタン・ブロットで処理したＭＣＦ−７／Ａｄｒ細胞の抽出物のウェスタン・ブロットを示す図である。 組み換えＨａｓ２、またはβ−ガラクトシダーゼ・アデノウィルスで感染し、ｐ−Ａｋｔ、ｐ−Ｅｒｋ、ｐ−ＢＡＤ１１２、及びｐ−ＦＡＫのウェスタン・ブロット分析で処理したＭＣＦ−７細胞のウェスタン・ブロットを示す図である。

Claims (26)

1. 多剤耐性癌細胞を治療する医薬品組成物であって、前記癌細胞が複数の治療薬剤に耐性であり、前記組成物が前記薬剤の一つに対する細胞の耐性を減弱させる又は逆行させるため有効投与量で長さが３から１０のジサッカライドであるヒアルロナン・オリゴマーを含むことを特徴とする医薬品組成物。
2. 前記ヒアルロナン・オリゴマーが誘導化され、前記誘導化ヒアルロナン・オリゴマーが、アルキル化、アルコキシ化、及び還元されたヒアルロナン・オリゴマーから構成される群の中から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
3. 前記ヒアルロナン・オリゴマーが誘導化され、前記誘導化ヒアルロナン・オリゴマーが、カルボジイミド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、アミン及びヒドラジドで置換されたヒアルロナン・オリゴマーから構成される群の中から選択されるいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
4. 前記薬剤が抗癌剤であることを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
5. 前記薬剤が、γ−放射線、メトトレキセート、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＢＣＮＵ、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ボルテゾミド、ＺＤ０４７３、及びイマニチブから構成される群の中から選択される少なくともいずれか一つの抗癌剤であることを特徴とする請求項４に記載の医薬品組成物。
6. さらに抗癌剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
7. 前記癌細胞が、黒色腫、直腸癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、神経膠質腫、肺癌、食道癌、乳癌、前立腺癌、頭と首の癌、卵巣癌、腎臓癌、及び肝臓癌から構成される群の中から選択されるいずれかの癌の細胞であることを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
8. 前記有効投与量が少なくとも１ｍｇ／ｋｇ体重であることを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
9. さらに、製薬的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
10. 抗不安剤、抗嘔吐剤、抗疲労剤、サイトカイン、抗感染剤、カリウム・キレーター、及び降圧剤から構成される薬剤群の中から選択されるいずれかの追加的な治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
11. 造血剤または造赤血球剤である追加的な治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
12. 多剤耐性の阻害剤であり、前記阻害剤が、ベラパミル、シクロスポリンＡ、シクロスポリンＤ、レセルピン・アナログ、トリフルオロペラジン、タモキシフェン、ベラパミルＲアイソマー、ＳＤＺＰＳＣ−８３３、ＭＳ−２０９、Ｓ−９７８８、ＧＦ１２０９１８、及びＬＹ３３３５９７９から構成される群の中から選択される少なくとも一つの追加的な治療剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の医薬品組成物。
13. 薬剤耐性癌細胞の抗癌治療に同時に、分離して、または連続して使用するための混合調製物であって、請求項１に記載の組成物及び少なくとも１種の抗癌剤を含有する製品。
14. 請求項１に記載の組成物及び少なくとも１種の抗癌剤の混合物。
15. 多剤耐性癌の治療のための医薬を調製する方法であって、
    長さが３から１０のジサッカライドであるヒアルロナン・オリゴマーと少なくとも１つの抗癌剤とを含む医薬を処方し、前記ヒアルロナン・オリゴマーが、前記医薬に少なくとも１つの抗癌剤に耐性を獲得した細胞を接触させ、前記ヒアルロナン・オリゴマーが前記抗癌剤に対する感受性を前記細胞に与え、もって前記癌を治療できる有効投与量で存在することを特徴とする方法。
16. 放射線耐性癌の治療のための医薬を調製する方法であって、
    長さが３から１０のジサッカライドであるヒアルロナン・オリゴマーを含む医薬を処方し、前記ヒアルロナン・オリゴマーが、前記医薬と少なくとも１つの抗癌放射線源に、少なくとも１つの抗癌放射線源に耐性を獲得した細胞を接触させ、前記ヒアルロナン・オリゴマーが前記抗癌放射線に対する感受性を前記細胞に与え、もって前記癌を治療するのに有効な投与量で存在することを特徴とする方法。
17. 前記細胞が患者の癌細胞であることを特徴とする請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記ヒアルロナン・オリゴマーが、前記抗癌剤に対する前記細胞の感受性を与え、前記細胞の成長または生存を阻害する有効投与量で投与されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 前記投与量が前記細胞におけるプログラム化細胞死を誘導するのに十分な量であることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 多剤耐性癌の治療のための医薬を調製する方法であって、
    抗癌剤及び長さが３から１０のジサッカライドであるヒアルロナン・オリゴマーのそれぞれの治療有効量を含む医薬を処方し、
    多剤耐性癌の患者への該医薬の投与が薬剤耐性を克服する治療有効量であることを特徴とする方法。
21. 前記抗癌剤及びヒアルロナン・オリゴマーがともに投与されることを特徴とする請求項１５または２０に記載の方法。
22. 前記抗癌剤及びヒアルロナン・オリゴマーが連続して投与されることを特徴とする請求項１５または２０に記載の方法。
23. 多剤耐性を治療するためのキットであって、容器及び請求項１の医薬品組成物を含むことを特徴とするキット。
24. さらに少なくとも１つの抗癌剤を含むことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
25. 前記抗癌剤が、γ−放射線、メトトレキセート、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＢＣＮＵ、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ボルテゾミド、ＺＤ０４７３、及びイマニチブから構成される群の中から選択される少なくともいずれか一つの抗癌剤であることを特徴とする請求項２４に記載のキット。
26. 前記細胞をもつ患者を治療するためのヒアルロナン・オリゴマー投与に用いる説明書をさらに含むことを特徴とする請求項２３から２５いずれか１項に記載のキット。

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