JP2017536353A

JP2017536353A - がん治療のための医薬組成物及び薬物スクリーニング用バイオマーカー

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Publication number: JP2017536353A
Application number: JP2017523907A
Authority: JP
Inventors: 査岱龍; 張聖原; 孫光煥; 林仲智; 蔡易達
Original assignee: National Defense Medical Center
Current assignee: National Defense Medical Center
Priority date: 2014-11-19
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2017-12-07
Anticipated expiration: 2034-11-19
Also published as: AU2014411846B2; WO2016078044A1; EP3222276B1; JP6437649B2; AU2014411846A1; CN107427492A; ES2880835T3; EP3222276A4; EP3222276A1; CN107427492B

Abstract

ソラフェニブ及びＧＷ５０４７（３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンジリデン）−５−ヨード−１，３−ジヒドロインドール−２−オン）を含む組成物である、がんの治療のための医薬組成物。この併用療法は、臨床症状を模倣するｉｎ−ｖｉｔｒｏモデル又はｉｎ−ｖｉｖｏ自発転移腎臓がん細胞の動物モデルのいずれかにおいて、ｃ−Ｒａｆ−ＰＰ２Ａ−ＤＡＰＫシグナル伝達経路を介してがん細胞の増殖を阻害する。ＧＷ５０７４がｃ−Ｒａｆへの結合を形成した後、ｃ−Ｒａｆの立体配座が変化し、ソラフェニブとｃ−Ｒａｆとの間の親和性が増加する。この特別に標的化された薬物の併用により、ＰＰ２ＡがＤＡＰＫタンパク質のセリン３０８を脱リン酸化させ、がん細胞を劣化させる。ＤＰＴＫタンパク質のセリン３０８は、薬物スクリーニング用のバイオマーカーとすることができる。

Description

本発明は、ソラフェニブ及びＧＷ５０７４を含む、がんを治療するための医薬組成物に関する。本発明はまた、ｃ−ＲａｆとＤＡＰＫとからなるタンパク質複合体を薬物で解離させる方法を開示し、次いでこれを新しい薬物を設計するための標的として用いることができる。加えて、本発明は、タンパク質ｃ−Ｒａｆ及びＤＡＰＫならびにＤＡＰＫのリン酸化レベルを利用して薬物をスクリーニングする方法をさらに提供する。

がん原遺伝子の活性化又は腫瘍サプレッサー遺伝子の欠損は、しばしばがん細胞の発達を導く。Ｒａｓはがん原遺伝子であり、Ｒａｓタンパク質の活性化は、通常、細胞膜上の受容体チロシンキナーゼ（ＴＫＩ）によって引き起こされる。活性化されたＲａｓタンパク質はＲＡＦと結合し、続いてシグナルを下流に伝達してＭＡＰＫ経路を活性化し、細胞増殖及び細胞分化を調節する。細胞膜上の成長因子受容体への成長因子の結合から生じる活性化されたＧｒｂ−ｓｏｓタンパク質は、下流のＲａｓ−ＧＤＰタンパク質のリン酸化をもたらし、次いで得られたＲａｓ−ＧＴＰはＲａｆタンパク質のＮ末端に結合して、Ｒａｆを活性化し、ＭＥＫのリン酸化を介したＥＲＫの活性化がさらに調節される。次に、活性化したＥＲＫは細胞核に入り、がん細胞の増殖を誘導する。したがって、これらのがん原遺伝子に対して特異的に設計された無数の薬物（これらのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）など）が作り出されてきたが、結局、多くのがん患者が治療中に薬物耐性を発達させただけであった。その結果、チロシンキナーゼのシグナル伝達経路を特異的に標的とする併用療法が一般的な治療法となっている。

血管新生及び細胞増殖は、腫瘍増殖において本質的な役割を果たす。膨大な量の血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）ががん細胞から放出されると、腫瘍において、腫瘍の内皮細胞の表面上での血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）とのＶＥＧＦ−Ａの結合が、Ｒａｆ／マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＥＫ）／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のシグナル伝達経路を活性化し、内皮細胞の血管新生を誘導する。一方、Ｒａｓ−ＥＲＫ経路は、がん細胞増殖も増強する。加えて、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＥＲＫ経路の制御が失われることが、多くの腫瘍細胞株において示されている。したがって、ＶＥＧＦ及びＲａｆは、腫瘍増殖の阻害のための最良の標的となり得る。

ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、ＢａｙｅｒＨｅａｌｔｈＣａｒｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、様々ながんの治療に一般的に用いられる経口マルチキナーゼ阻害剤である。ソラフェニブは、Ｒａｆ、ＶＥＧＦ受容体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体、ＫＩＴ及びＦｍｓ様チロシンキナーゼ−３（ＦＬＴ−３）などのタンパク質を阻害することができる。多くの研究により、ソラフェニブは、種々のがん細胞におけるＲａｆシグナル伝達経路を阻害しつつ、ＶＥＧＦ及びＰＤＧＦシグナル伝達経路の阻害によりがん細胞を取り囲む内皮細胞の増殖を抑制し、続いてがん細胞死を誘導することによって腫瘍増殖を阻害することが示されている。これらの薬物の構造及び試験結果は理想的なものである。しかしながら、何年もの臨床応用の後、治療の初期段階の腫瘍サイズがソラフェニブによって効率的に減少したにもかかわらず、このような薬物は腫瘍を完全に根絶するだけでなく、深刻な副作用を引き起こす可能性があることも発見された。さらに、治療を受けたがん細胞は、長期治療後に薬物耐性を発揮した。さらに、近年、がん細胞におけるＲａｆシグナル伝達経路の阻害が、がん細胞における異なる分子による別の規制に起因してソラフェニブによる阻害を低下させることが、いくつかの研究によって示されている。最も重要なことは、ソラフェニブのがん細胞に対する阻害効果が、Ｒａｆ経路によって制御されない可能性があることを示すいくつかの証拠である。したがって、上記欠点をさらに改善する必要がある。

ソラフェニブは早期に腫瘍サイズを効果的に減少させることができるが、腫瘍を根絶することはできない。さらに、それはしばしば重度の副作用を伴い、治療期間が長くなるとがん細胞はしばしば抵抗性になる。上記を考慮して、ソラフェニブは理想的な治療ではなく、従来技術において改善された治療を提供する必要性が存在する。上記を考慮して、本発明は以下の発明に関する。（１）ソラフェニブとＧＷ５０７４との新規併用療法、（２）ｃ−Ｒａｆ及びＤＡＰＫの解離を伴い、細胞壊死により細胞を効果的に死滅させる新薬設計の標的、（３）薬物スクリーニングのためのバイオマーカーとして、タンパク質ｃ−Ｒａｆ及びＤＡＰＫならびにＤＡＰＫのリン酸化レベルの使用。

一態様では、本発明は、ソラフェニブ及び３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンジリデン）−５−ヨード−１，３−ジヒドロインドール−２−オン（ＧＷ５０７４）を含む、がんを治療するための医薬組成物を提供する。

本発明の実施形態によれば、組成物の化合物は、別々に、同時に、又は逐次的に投与される。

本発明の実施形態によれば、がんは、腎細胞がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、子宮頸がん、口腔がん、神経膠腫、尿路上皮細胞がん、又は黒色腫である。

本発明の実施形態によれば、医薬組成物は、前記化合物の薬学的に許容される塩を含むか、又は前記化合物のための薬学的に許容される塩媒体をさらに含む。上記の媒体としては、賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油若しくは非油剤、界面活性剤、懸濁剤、ゲル化剤、アジュバント、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、着色剤又はそれらの下位概念が挙げられる。

本発明の実施形態によれば、医薬組成物は、経口投与、浸漬、注射、局所適用又はパッチ投与によって投与される。

本発明の実施形態によれば、化合物ＧＷ５０７４は、ｃ−Ｒａｆタンパク質（配列番号１）に結合し、ｃ−Ｒａｆの立体配座変化を誘導し、これによりｃ−Ｒａｆのソラフェニブへの結合親和性を増加させ、ｃ−Ｒａｆ／ＤＡＰＫタンパク質複合体からのｃ−Ｒａｆの解離を引き起こす。

別の態様では、本発明は、がんを治療するための医薬の製造における、上記医薬組成物のいずれか１つの適用を明らかにする。

別の態様では、本発明はまた、化合物を用いてタンパク質複合体を解離するための医薬の製造方法であって、少なくとも１つの化合物をタンパク質複合体の解離に使用することができ、タンパク質複合体はｃ−Ｒａｆ（配列番号１）及びＤＡＰＫ（配列番号２）からなる。

本発明の実施形態によれば、化合物はソラフェニブ及びＧＷ５０７４である。

一態様では、本発明は、バイオマーカーを利用する薬物スクリーニングのための方法を開示する。この方法は、検体を提供する工程と、薬物の投与前に検体のバイオマーカーの発現レベル及び／又はリン酸化レベルを検出する工程と、薬物投与後の細胞増殖阻害率を検出する工程を含み、前記発現レベル及び／又は前記リン酸化レベルが細胞増殖阻害率と正の相関を有する場合、その薬物は適切な薬物候補であり、ｃ−Ｒａｆ（配列番号１）及びＤＡＰＫ（配列番号２）の一方又は両方のバイオマーカーである。

本発明の実施形態によれば、ｃ−Ｒａｆ及びＤＡＰＫのリン酸化部位は、それぞれ、セリン３３８（Ｓｅｒ３３８）及びセリン３０８（Ｓｅｒ３０８）である。

本発明の実施形態によれば、検体は、手術後に収集された分離がん組織、腹水、血液、尿、糞便、喀痰、粘膜細胞又は胃液がんである。

本発明の実施形態によれば、薬物はソラフェニブ及びＧＷ５０７４である。

一態様では、本発明は、薬物スクリーニングのためのバイオマーカーの使用を開示し、前記バイオマーカーが、ｃ−Ｒａｆ（配列番号１）及びＤＡＰＫ（配列番号２）の少なくとも１つである。

本発明の実施形態によれば、ｃ−Ｒａｆタンパク質及びＤＡＰＫタンパク質のリン酸化部位は、それぞれ、セリン３３８（Ｓｅｒ３３８）及びセリン３０８（Ｓｅｒ３０８）である。

本発明の実施形態によれば、前記使用は、薬物投与前の試料のバイオマーカーの発現レベル及び／又はリン酸化レベルを検出する工程と、及び薬物投与後の細胞増殖阻害速度を検出する工程とをさらに含み、発現レベル及び／又はリン酸化レベルが細胞増殖阻害率と正の相関を有する場合、その薬物は適切な薬物候補である。

本開示は、抗血管新生剤であるソラフェニブがｃ−Ｒａｆ阻害剤であるＧＷ５０７４と組み合わせられた併用療法の新規概念を提案した。これらの２つの化合物のいずれも、低用量（５μＭのソラフェニブ又は１０μＭのＧＷ５０７４）で単独で投与した場合、増殖阻害効果を示さない。しかしながら、単独では細胞毒性を示さないこれら２つの薬物の組み合わせは細胞毒性効果を達成し、それによってがん細胞の増殖を効果的に阻害しながら有効用量のソラフェニブによって引き起こされる副作用を減少させる。本発明によって提案された新規な併用療法は、これらの２つの薬物がｃ−Ｒａｆに結合することによってｃ−ＲａｆとＤＡＰＫのタンパク質複合体を破壊し、続いて、細胞アポトーシスを誘導することを示す独特の分子メカニズムを明らかにし、将来の薬物設計のための新たな標的として使用することができる。本発明者によって行われた研究は、併用療法が高度にリン酸化されたｃ−Ｒａｆｓ３３８を有するがん細胞において最も有効であり、より低いＤＡＰＫ発現又はより少ないリン酸化ＤＡＰＫ−ｓ３０８を有するヒトがん細胞に対してあまり効果的でないことを立証する。

ｃ−Ｒａｆ及びＤＡＰＫタンパク質を解離するための薬物、又は本方法によってスクリーニングされた薬物は、ソラフェニブ及びＧＷ５０７４の併用である。

「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本明細書において、ソラフェニブ又はＧＷ５０７４のいずれかと物理的に又は化学的に適合する、当業者に知られている生理学的に不活性又は薬理学的に不活性な材料を指すために使用される。薬学的に許容される賦形剤としては、ポリマー、樹脂、可塑剤、充填剤、潤滑剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤、溶媒、共溶媒、界面活性剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、薬学的グレードの染料又は顔料、及び粘性剤が挙げられる。

この出願において「医薬組成物」は、固体又は液体組成物であり、その形態、濃度及び純度が患者（ヒト又は動物の患者など）への投与に適しており、その投与後に、所望の生理学的変化を誘導し得る固体又は液体組成物である。医薬組成物は、典型的には滅菌及び／又は非発熱性である。

本明細書で使用される場合、「併用」は、２つ以上の化合物及び／又は薬物（本出願では成分とも呼ばれる）を組み合わせている材料を示す。「組み合わされた」及び「組み合わせる」は同じ意味である。

組成物中の２つ以上の化合物／薬物の併用は、物理的又は非物理的であり得る。物理的に結合した化合物／薬物組成物の例には、２種以上の混合された化合物／薬物を（例えば、同じ単一投与量で）含有する組成物（例えば、単一の混合物）、（例えば、架橋、分子凝集又は共通媒体部分への結合によって）２つ以上の化学的／物理的に結合した化合物／薬物を含む組成物、化学的又は物理的に共にパッケージ化された（例えば、液体媒体、粒子（例えば、マイクロ粒子又はナノ粒子）又はエマルジョン液滴上若しくは内部の材料、医薬品キット、医薬品パック又は患者用パック中に配合された）２つ以上の化合物／薬物を含む組成物を含む。ここで、２つ以上の化合物／薬物は、共にパッケージ化されているか共に表示されている（例えば、投与単位のバッチ）。

非物理的併用での化合物／薬物組成物の例には、少なくとも１つ以上の化合物／薬物を含む材料（例えば、非単一混合物）と、上記２つ以上の化合物／薬物の物理的併用が少なくとも１つ以上のものと新しく作られた物理的併用により形成されることを示す指示書；上記２つ以上の化合物／薬物の少なくとも１つを含む材料（例えば、非単一混合物）と、上記２つ以上の化合物／薬物を利用する併用療法を示す指示書；上記２つ以上の化合物／薬物の少なくとも１つを含む材料と、上記２つ以上の化合物／薬物以外の薬物で治療されている（又は服用している）患者集団への投与のための指示書；及び上記２つ以上の化合物／薬物以外の化合物／薬物と一緒に組成物に使用されるように特別に量又は形態が調製された上記２つ以上の化合物／薬物のうちの少なくとも１つを含む材料が含まれる。

本出願において、「併用療法」という用語は、本明細書では、２以上の化合物／薬物（上記で定義した）を含有する組成物を使用する治療を指すために使用される。したがって、本発明において、化合物／薬物の「併用療法」、「組み合わせ」及び「組成物」は、一連の治療の一部として投与される化合物／薬物を指すために使用される。結果として、２つ以上の化合物／薬物のそれぞれの薬量は、異なる可能性があり、それぞれが同一又は異なる時間に投与され得ることを示唆する。前記組成物の化合物／薬物は、順番に（例えば、前又は後に）、又は同時に（例えば、同一時間に）投与することができ、同じ医薬混合物に（一緒に）又は異なる混合物に（別々に）調製することができる。さらに、同じ混合物での同時投与は、単一の混合物として与えられ、異なる混合物での同時投与は、単一の混合物として与えられない。さらに、併用療法における２種以上の化合物／薬物のそれぞれの投与量は、投与様式に応じて変化し得る。

図１は、ｃ−Ｒａｆ阻害剤（ソラフェニブ、ＧＷ５０７４、Ｌ７７９４５０又はＰＬＸ４７２０）の単回投与後２４時間におけるＡＣＨＮ細胞の増殖阻害を示す図である。図２は、ｃ−Ｒａｆ阻害剤（ソラフェニブ、ＧＷ５０７４、Ｌ７７９４５０又はＰＬＸ４７２０）の単回投与後の４８時間におけるＡＣＨＮ細胞の増殖阻害を示す図である。図３は、ｃ−Ｒａｆ阻害剤（ソラフェニブ、ＧＷ５０７４、Ｌ７７９４５０又はＰＬＸ４７２０）の単回投与後７２時間におけるＡＣＨＮ細胞の増殖阻害を示す図である。図４は、種々のｃ−Ｒａｆ阻害剤（Ｓｏｒ：ソラフェニブ、ＧＷ：ＧＷ５０７４、Ｌ７７：Ｌ７７９４５０、ＰＬＸ：ＰＬＸ４７２０）の併用療法の２４、４８及び７２時間後のＡＣＨＮ細胞の増殖阻害を示す図である。図５は、単独又は組み合わせて投与されたソラフェニブ及びＧＷ５０７４処置後の２１日までの３日ごとに測定された異種移植腫瘍量を示す。図６は、種々の薬物の治療後にＬｕｃ−ＡＣＨＮ−ＬＬ細胞と同所移植された免疫不全マウスから収集された光子信号を示す。身体全体に分布した腫瘍の数を計算するために、各マウスの体全体から放出された全光子を測定し、Ｘｅｎｏｇｅｎ（登録商標）リビングイメージソフトウェアによって定量した。矢印は最初の薬物投与の時間を示す。図７は、ＤＭＳＯ（対照群）、５μＭソラフェニブ及び１０μＭＧＷ５０７４又は併用療法の処置後の２４時間におけるＡＣＨＮ細胞のアポトーシス又は壊死のレベルを示す。図８は、ＤＭＳＯ（対照群）、５μＭソラフェニブ、及び１０μＭＧＷ５０７４、又は併用療法による処置後２４時間での、免疫ブロット法によるＡＣＴＨ細胞のｐＤＡＰＫＳ３０８及びＤＡＰＫタンパク質発現のリン酸化レベルを示す。図９は、ＤＭＳＯ（対照群）、５μＭソラフェニブ、及び１０μＭＧＷ５０７４、又は併用療法による処置後２４時間での、特定の抗体を用いて他の関連するタンパク質を染色するための免疫ブロット法によるＡＣＨＮ細胞の内因性ＤＡＰＫの免疫沈降結果を示す。図１０は、ＤＭＳＯ（対照群）、５μＭソラフェニブ及び１０μＭＧＷ５０７４又は併用療法の処置の２４時間後での、特定の抗体を用いて他の関連するタンパク質を染色するためのＡＣＨＮ細胞の内在性ｃ−Ｒａｆの免疫沈降結果を示す。図１１は、ＰＰ２Ａ阻害剤であるカンタリジン酸（Ｃ．Ａ．）又はオカダ酸（Ｏ．Ａ．）の存在下又は非存在下での併用療法後のＡＣＨＮ細胞の増殖阻害を示す。図１２は、併用療法の２４時間後での、野生型又はｃ−Ｒａｆ変異型を安定に発現するＡＣＨＮ細胞の増殖阻害を示す（野生型ｃ−Ｒａｆとの比較において、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。図１３は、ＤＭＳＯ（Ｃｔｒｌ．）処理又は併用療法の２４時間後での、Ｆｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ−ｃ−Ｒａｆ又は示された変異型を発現するＡＣＨＮ細胞のタンパク質発現プロフィールである。Ｆｌａｇ−ｃ−Ｒａｆを細胞溶解物から免疫沈降させ、続いて、示された抗体にて免疫ブロット法を行った。図１４は、併用療法後の、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒ）、ＤＡＰＫｓｉＲＮＡ１（ｓｉＤＡＰＫ−ａ）、又はＤＡＰＫｓｉＲＮＡ２（ｓｉＤＡＰＫ−ｂ）でトランスフェクトされたＡＣＨＮ、７８６−Ｏ及びＲｃｃ−Ｓｕｔ−００２細胞の増殖阻害を示す（上部のパネル）。細胞溶解物のＤＡＰＫ及びα−カテニン発現を免疫ブロット法によって調べた。図１５は、併用療法の２４時間後での、Ｖ５−ｔａｇｇｅｄ−ＤＡＰＫを発現するＨｅＬａ細胞及び示された変異型を発現するＨｅＬａ細胞の増殖阻害を示す。図１６は、併用療法の２４時間後での、Ｖ５−ｔａｇｇｅｄ−ＤＡＰＫを発現するＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞及び示された変異型を発現するＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の増殖阻害を示す。図１７は、５μＭのソラフェニブの処置後２４時間における様々ながん細胞又は正常細胞の増殖阻害を示す。図１８は、１０μＭのＧＷ５０７４の処理後の２４時間における様々ながん細胞又は正常細胞の増殖阻害を示す。図１９は、５μＭのソラフェニブと１０μＭのＧＷ５０７４との併用療法の２４時間後の様々ながん細胞又は正常細胞の増殖阻害を示す。図２０は、対照群と比較した、ＡＣＨＮ群のｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８のリン酸化レベルを示す図である。免疫ブロット法によってｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８及びＤＡＰＫの発現を検出した。図２１は、ｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の発現と細胞の増殖阻害との間の相関を示す回帰プロットである。（Ｒ^２＝０．４５５１、Ｒ＝０．６７４６、ｐ＝０．００００１）図２２は、免疫ブロット法による同じ患者の腫瘍（ｐＴ）又は正常組織（ｐＮ）におけるｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８及びＤＡＰＫの発現レベルを示す図である。図２３は、ＧＡＰＤＨ発現に対する正規化後のｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の相対強度を示す図である。図２４は、ヒトの正常及び腎がん組織のｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８発現の免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析である。拡大図の倍率は、４０倍（上のパネル）、１００倍（下のパネル）であり、スケールバーは１００μＭである。図２５は、マイクロアレイを用いた定量後のヒトの正常及び腎臓がん組織（正常及び種々のグレード（Ｇ））のｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の発現を示し、正常と種々のグレード（Ｇ）を示している。図２６は、マイクロアレイを用いた定量化後のヒト正常及び腎臓がん組織のｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の発現を示し、様々なステージ（Ｔ）とがん細胞の転移（ｍｅｔａ）を示している。図２７は、ソラフェニブ及びＧＷ５０７４との相互作用後のｃ−Ｒａｆキナーゼの立体配座を示すコンピュータシミュレーション写真である。緑色はＧＷ５０７４を表し、赤紫色はソラフェニブを表す。

本発明は、以下の実施形態によりさらに具体的に説明されるが、これらの実施形態は、限定する目的というよりもむしろ実演する目的で提供される。

実施例１−ソラフェニブとＧＷ５０７４の併用療法 − 細胞での試験

ヒト腎がん（ＡＣＨＮ）細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むイーグルＭＥＭ（最小必須培地）中で培養した。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）は、スルホン酸基を有する負電荷タンパク質であり、弱酸性条件下で細胞内タンパク質の塩基性アミノ酸に結合する。弱アルカリ性溶液を用いて細胞からＳＲＢタンパク質を抽出し、吸光度測定を行った。細胞生存の指標である細胞内タンパク質の量は、ＳＲＢの量から計算することができる。ＡＣＨＮ又はＡ４９８細胞を２．５μＭ、５μＭ、１０μＭのソラフェニブ、ＧＷ５０７４、Ｌ７７９４５０又はＰＬＸ４７２０単独で２４時間、４８時間及び７２時間処理し、続いて細胞生存を評価するためのＳＲＢアッセイを行った。あるいは、ＡＣＦ細胞を１０μＭのＧＷ５０７４，１０μＭのＬ７７９４５０又は１０μＭのＰＬＸ４７２０で３０分間前処理した後、さらに２４時間、４８時間及び７２時間５μＭのソラフェニブ処理を行い、続いてＳＲＢアッセイを行って増殖阻害を評価した。

これらの結果に基づいて、２４時間の単一低用量処置（５μＭソラフェニブ又は１０μＭＧＷ５０７４）後に細胞の増殖阻害を示さなかった（図１~３、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝４）ｃ−Ｒａｆ阻害剤ソラフェニブとＧＷ５０７４を組み合わせた。しかしながら、これらの２つの薬物の組み合わせは、いずれかの薬物の単独治療では観察されなかった細胞傷害性を誘発しただけでなく、ソラフェニブの有効用量による副作用を効果的に低減し、がん細胞増殖を抑制し、相乗効果を示唆した（図４、平均±Ｓ．Ｄ．、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝４）。

実施例２−ソラフェニブとＧＷ５０７４の併用療法 − 異種移植

平均体重２０グラムを有する生後６週間の免疫不全雄マウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１^ｎｕ／Ｃｒ１Ｎａｒ１）の右側に、１×１０^７個のヒト腎臓がん細胞（ＡＣＨＮ細胞）株を皮下注射（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｉ．ｐ．）によって異種移植した。マウスを特定の病原体不含（ＳＰＦ）環境で維持した。腫瘍の大きさは、デジタルキャリパーを用いて週に２回測定し、腫瘍量を長さ×幅×高さ×０．５の式で計算した。腫瘍量が１００ｍｍ^３より大きくなったところで、１日１回３週間、５ｍｇ／ｋｇのソラフェニブの経口経管投与及び３ｍｇ／ｋｇのＧＷ５０７４の皮下注射を含む薬物投与を開始し、３日ごとに腫瘍の大きさを測定した。媒体（ＤＭＳＯ）のみを投与した対照群、５ｍｇ／ｋｇソラフェニブ、２５ｍｇ／ｋｇＧＷ５０７４、又は５ｍｇ／ｋｇソラフェニブと２５ｍｇ／ｋｇＧＷ５０７４の併用療法の合計４つの群があり、各群８匹で実験された。

その結果を図５に示す。５μＭのソラフェニブ又は１０μＭのＧＷ５０７４のみの処理は、ほとんど阻害効果を示さなかった。一方、５μＭソラフェニブと１０μＭＧＷ５０７４の併用療法は、ＡＣＨＮ細胞の有意な増殖阻害を示した（ｔ検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝８）。

実施例３−ソラフェニブとＧＷ５０７４の併用療法−同所性モデル

臨床現象をシミュレートするために、我々は、腎がんの転移を研究するための同所自然発生動物モデルを確立した。最初に、ＡＣＨＮ細胞にルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトし、次いで、種々の発現レベルを有する、得られたＬｕｃ−ＡＣＨＮトランスフェクタント（ルシフェラーゼを発現する安定なトランスフェクタント）を、皮下注射によるマウスでのｉｎｖｉｖｏ培養のために選定した。生後６週間の剃毛したマウスに、０．１ｍｌのＰＢＳ中の１×１０^７個のＬｕｃ−ＡＣＨＮ細胞を皮下注射した。注射２ヵ月後、マウスを犠牲にし、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって確認された潜在的に転移性の腫瘍細胞を評価するために、腎臓、肝臓、局所リンパ節及び他の器官を収集した。転移性が高い腫瘍細胞株を１ｍｌのＰＢＳ中で無菌的に小片に解離し、次いで遠心分離後１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地で培養した。数日後、モノクローナル細胞株をまずトリプシンで処理して細胞を解離させ、次いでｉｎｖｉｔｒｏで培養した。肝臓腫瘍組織から得られた細胞をＡＣＨＮ−Ｌと命名した。種々の器官から集められた種々のモノクローナル細胞株の転移能を、これらの腫瘍細胞をマウスの左腎臓に異種移植することによってさらに分析した。異種移植されたマウスを、腫瘍細胞注入の８週間後に犠牲にし、検査した。各器官で観察された腫瘍増殖を、目視検査及び組織学的手順によって調べた。肝臓に見出された転移性細胞を無菌的に小片に解離し、ｉｎｖｉｔｒｏで培養した。肝臓腫瘍組織から得られた細胞をＡＣＨＮ−Ｌ（皮下注射）細胞と命名し、ＡＣＨＮ−Ｌ細胞を左腎臓に注射した後の、肝臓における転移病巣から集めた細胞をＡＣＨＮ−ＬＬ細胞と命名した。ＡＣＨＮ−ＬＬ細胞及び肝臓転移性細胞の同所移植を使用する同じ手順を、転移性が高い腫瘍を選択するために２回繰り返した。転移性が高く死亡率の高いがん細胞株（Ｌｕｃ−ＡＣＨＮ−ＬＬ）を選択した。免疫不全の雄マウスに、５０μＬのＰＢＳ中の３ｘ１０^５Ｌｕｃ−ＡＣＨＮ−ＬＬ細胞を右腎嚢に注射した。ｉｎｖｉｖｏでのルシフェラーゼ活性は、注射直後に腎臓にがん細胞が漏れていないことを確認し、これらのがん細胞の転移をモニターするために、３週間まで毎日検査した。ＩＶＩＳＸｅｎｏｇｅｎシステムを利用する２~５分前に、ＰＢＳ中の７５ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を各マウスの眼窩後洞に注入した。Ｌｕｃ−ＡＣＨＮ−ＬＬ細胞の注入２週間後、ＩＶＩＳＸｅｎｏｇｅｎシステムを用いて生物学的蛍光画像の移動をモニターし、光子信号の強度（光子／秒／ｃｍ^２／ステラジアン）を計算した。この研究には、媒体のみを投与した対照群と、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇのソラフェニブ、２５ｍｇ／ｋｇのＧＷ５０７４、１０ｍｇ／ｋｇのソラフェニブと２５ｍｇ／ｋｇのＧＷ５０７４の併用療法（ＧＷのｉ．ｐ．注射３０分後にソラフェニブを与えた）、又は６０ｍｇ／ｋｇのソラフェニブの投与を受けた４つの試験群の合計５つの群が含まれていた。

この結果から、対照群、１０ｍｇ／ｋｇのソラフェニブ群と２５ｍｇ／ｋｇのＧＷ５０７４群のマウスは、それぞれがん細胞注射後５，８及び５週間以内に死亡した。同様に、６０ｍｇ／ｋｇのソラフェニブを投与した高用量試験群においても体重減少が観察され、その後１０週間以内に死亡した。驚くべきことに、１０ｍｇ／ｋｇのソラフェニブと２５ｍｇ／ｋｇのＧＷ５０７４の低用量併用療法を受けた群のマウスのみが、他の群と比較して、腫瘍サイズ及び転移の両方の腫瘍抑制ならびに生存期間の延長を示した。図６は、ＩＶＩＳ画像及び光子強度の平均±Ｓ．Ｄ．、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝４を示す。さらに、併用療法を受けたマウスの体重及び日常的な動きは、正常マウスで観察されたものと同様であった。併用療法を受けたマウスから採取した腫瘍細胞も、他の群と比較して著しい細胞壊死を示した。

要約すると、低用量ソラフェニブとＧＷ５０７４との併用療法は、ｉｎｖｉｔｒｏでのがん細胞の増殖阻害に有効である。また、最も重要なことに、併用療法の有効性は、がん細胞の臨床的転移をシミュレートする状態においてｉｎｖｉｖｏで調べることができる。

実施例４

ソラフェニブとＧＷ５０７４との併用療法は、細胞死関連プロテインキナーゼ（ＤＡＰＫ）のセリン３０８での脱リン酸化、続いてがん原遺伝子ｃ−Ｒａｆからの解離により細胞壊死を誘導する。細胞を実施例１に記載したように培養し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で１５分間染色した。蛍光アネキシンＶならびにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の存在を、細胞死がアポトーシス又は壊死によって引き起こされるかどうかを決定するために、フローサイトメトリーによって検出した。ｃ−Ｒａｆ及びＤＡＰＫならびにＤＡＰＫのリン酸化レベルの発現を、ウェスタンブロット及び抗体を用いた免疫沈降によって調べた。抗ＤＡＰＫ抗体又は非免疫ウサギＩｇＧ（ＩＰ：免疫グロブリン）を陰性対照として含み、細胞生存率を実施例１に示す通りＳＲＢアッセイによって測定した。この実施例では、ＡＣＨＮ細胞をＤＭＳＯ（対照群）、５μＭソラフェニブ、１０μＭＧＷ５０７４、又は５μＭソラフェニブと１０μＭＧＷ５０７４との併用療法を別々に用いて２４時間処置した。

その結果、ＤＭＳＯ、５μＭソラフェニブの単独療法及び１０μＭＧＷ５０７４の単独療法で処置したＡＣＨＮ細胞の平均細胞壊死率は、それぞれ０．３７、０．７７、１．３５％であることを示した。しかし、併用療法を受けた細胞は、５３．９５％までの壊死の有意な増加を示した（図７、ｔ検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝４）。腫瘍細胞におけるＰＰ２ＡによるｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の脱リン酸化によるＳ３０８のリン酸基の有意な減少は、併用療法で処置した細胞においてのみ観察された（図８）。免疫沈降からの結果は、さらに、ｃ−Ｒａｆ及びＤＡＰＫならびにＰＰ２Ａが複合体を形成することを示唆した。併用療法は、ＰＰ２Ａ、ＤＡＰＫ及びｃ−Ｒａｆ間の相互作用を減少させ、続いてｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８を減少させた（図９及び１０）。併用療法を受けた試験群では、ＰＰＤ阻害剤（カンタリジン酸、ＣＡ及びオカダ酸、ＯＡ）の様々な濃度が、投与の３０分前に提供された場合にのみ、ｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の脱リン酸化の阻害及びＡＣＨＮ細胞の増殖に有効であった（図１１、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝４）。

次に、併用療法がｐｃ−Ｒａｆ^Ｓ３３８に対して治療効果を発揮するか否かを試験した。ＡＣＨＮ細胞にｃ−Ｒａｆ^{Ｓ３３８Ｄ}（Ｓ３３８のリン酸化のシミュレーション）をトランスフェクトした場合、ｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の減少が最も顕著であると認められた。さらに、ｃ−Ｒａｆ^{Ｓ３３８Ａ}（脱リン酸化Ｓ３３８のシミュレーション）は、ＤＡＰＫＳ３０８の脱リン酸化を弱めるだけでなく、併用療法下でのＡＣＨＮ細胞の増殖阻害を減少させた（図１２、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。さらに、免疫沈降の結果は、ｃ−Ｒａｆ^ＷＴ（野生型）及びｃ−Ｒａｆ^{Ｓ３３８Ａ}（Ｓ３３８の非リン酸化シミュレーション）と比較して、ｃ−Ｒａｆ^{Ｓ３３８Ｄ}（リン酸化Ｓ３３８のシミュレーション）が明らかにＰＰ２Ａとの相互作用を失ったことを示唆した（図１３）。したがって、併用療法はｐｃ−Ｒａｆ^Ｓ３３８を増加させるだけでなく、ＰＰ２ＡによるｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の脱リン酸化を促進し、細胞壊死を増強する。

上記の実施例は、ソラフェニブとＧＷ５０７４との併用療法が、細胞死関連プロテインキナーゼ（ＤＡＰＫ）のセリン３０８を脱リン酸化し、続いてがん原遺伝子ｃ−Ｒａｆから解離することを介して細胞壊死を誘導することを明らかにする。ｃ−ＲａｆとＤＡＰＫの解離は、細胞内のＤＡＰＫからのｃ−Ｒａｆの解離が細胞を効果的に死滅させる細胞壊死プロセスの開始につながるため、将来の薬物設計の標的としても使用することができる。

実施例５−ｉｎｖｉｔｒｏバイオマーカーを用いる薬物スクリーニングの方法

上記の研究は、セリン３０８でのＤＡＰＫの脱リン酸化が、がん細胞に対する薬物の抗がん効果の予測バイオマーカーとして使用できることを示した。細胞培養のための方法ならびに増殖阻害を調べるための検出方法は、実施例１に記載した通りである。ＡＣＨＮ、７８６−ＯおよびＲｃｃ−Ｓｕｔ−００２（薬物耐性がん細胞）細胞株を、ａ型およびｂ型ＤＡＰＫのｓｉＲＮＡ（ｓｉＤＡＰＫ−ａ、センス鎖：５´−ＣＡＡＧＡＡＡＣＧＵＵＡＧＣＡＡＡＵＧＵＵ−３´（配列番号３）およびアンチセンス鎖：５´−ＣＡＵＵＵＧＣＵＡＡＣＧＵＵＵＣＵＵＧＵＵ−３´（配列番号４）；ｓｉＤＡＰＫ−ｂ、センス鎖：５´−ＧＧＵＣＡＡＧＧＡＵＣＣＡＡＡＧＡＡＧＵＵ−３（配列番号５）およびアンチセンス鎖５´−ＣＵＵＣＵＵＵＧＧＡＵＣＣＵＵＧＡＣＣＵＵ−３´（配列番号６））で処理した。各細胞株をｓｉＤＡＰＫ−ａ、ｓｉＤＡＰＫ−ｂ及び対照（Ｓｃｒ）によって分析した。５μＭのソラフェニブと１０μＭのＧＷ５０７４との併用療法の後、細胞の増殖阻害を２４時間観察した。一方、ＨｅＬａ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、対照空ベクター（ベクター）、ＷＴ（野生型）、ＤＡＰＫ^{Ｓ３０８Ｄ}、ＤＡＰＫ^{Ｓ３０８Ａ}又はＤＡＰＫ^Ｋ４２Ａ（不活性化プロテインキナーゼ）をトランフェクトし、トランスフェクトした細胞の増殖阻害を５μＭのソラフェニブと１０μＭのＧＷ５０７４との併用療法の２４時間後に試験した。

結果は、ＤＡＰＫタンパク質が、ソラフェニブとＧＷ５０７４との併用療法によって誘導される細胞毒性にとって不可欠であることを示した。ＡＣＨＮ、７８６−Ｏ及びＲＣＣ−ＳＵＴ−００２細胞では、ＤＡＰＫ発現を阻害することができる２つのｓｉＲＮＡに起因して増殖阻害が約６０％低下した（図１４）。さらに、Ｓ３０８におけるＤＡＰＫのリン酸化は、併用療法によって誘導される細胞傷害性と高度に関連している。通常、より高いｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８を発現するＨｅＬａ細胞におけるＤＡＰＫ^ＷＴ及びＤＡＰＫ^{Ｓ３０８Ｄ}の過剰発現は、併用療法を受けた後の細胞毒性を顕著に増加させたが、ＤＡＰＫ^Ｋ４２Ａ（不活性化ＤＡＰキナーゼ）及びＤＡＰＫ^{Ｓ３０８Ａ}（Ｓ３０８の非リン酸化シミュレーション）では併用療法後に細胞死が増えなかった。ＤＡＰＫ^{Ｓ３０８Ｄ}のみが、併用療法を受けた後、通常はより低いｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞における増殖阻害を増加させることが見出された。ＤＡＰＫ^ＷＴ、ＤＡＰＫ^{Ｓ３０８Ａ}、及びＤＡＰＫ^Ｋ４２Ａを含む残りのものは、増殖阻害の増加を示さなかった（図１５及び１６、平均±Ｓ．Ｄ．、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。結果によると、ソラフェニブとＧＷ５０７４の併用療法で処置した場合、細胞毒性を誘導する上で重要な役割を果たすのは、ＤＡＰＫタンパク質そのものではなく、Ｓ３０８がリン酸化されたＤＡＰＫである。これは、Ｓ３０８がリン酸化されていないと、より高いＤＡＰＫ発現であっても、併用療法の下で有効ではないためである。併用療法によって誘発される細胞傷害効果は、活性化されたＤＡＰＫを通過しなければならない。したがって、ソラフェニブとＧＷ５０７４との併用療法は、がん細胞におけるｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の存在下でのみ有効である。

ｃ−Ｒａｆタンパク質のリン酸化は、がん細胞に対する薬物の抗がん効果を予測するためのバイオマーカーとして使用することができる。ｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の減少は、ｃ−Ｒａｆ^{Ｓ３３８Ｄ}（Ｓ３８８のリン酸化をシミュレートする）でトランスフェクトしたＡＣＨＮ細胞において最も明白である。ｃ−Ｒａｆ^{Ｓ３３８Ａ}（Ｓ３８８の非リン酸化をシミュレートする）は、ＤＡＰＫ^Ｓ３０８の脱リン酸化を減少させるだけでなく、併用療法下でのＡＣＨＮ細胞の増殖阻害も低下させる（図１２、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。したがって、ｃ−ＲａｆのＳ３３８リン酸化は、より良好な治療効果のために併用療法に有益であり、ｃ−Ｒａｆ^{Ｓ３３８Ｄ}（Ｓ３８８のリン酸化をシミュレートする）は、ｃ−Ｒａｆ^{Ｓ３３８Ａ}（Ｓ３８８の非リン酸化をシミュレートする）と比較してより良い効果を有する。

さらに、多数のがん細胞及び正常細胞を試験した。併用療法は、正常な線維芽細胞及び上皮細胞におけるＤＡＰＫの低いＳ３０８リン酸化のために、上記の細胞において限られた細胞傷害性しか引き起こさないことが見出された。それにもかかわらず、種々の腫瘍細胞において併用療法によって引き起こされる増殖阻害は、ＤＡＰＫのＳ３０８リン酸化のレベルと正の相関がある（図１７、１８、１９、２０及び２１、平均±Ｓ．Ｄ．、＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。併用療法が、臨床的症例から得られたソラフェニブ耐性がん細胞（ＲＣＣ−Ｓｕｔ−００１、ＲＣＣ−Ｓｕｔ−００２、ＲＣＣ−Ｓｏｒ−００１）及び動物モデルから得られたソラフェニブ耐性がん細胞（７８６−ＯＴ４、ＡＣＨＮ−Ｔ２Ｒ）を用いて薬物耐性がん細胞に対する阻害効果を有するかどうかについてさらに調べた。高度にリン酸化されたＤＡＰＫＳ３０８を有する全ての薬物耐性がん細胞は、併用療法の下で有意に阻害された。さらに、Ｒａｆ阻害剤耐性であるＨＴ２９及びＡ２０５８がん細胞株は、ＤＡＰＫの高いＳ３０８リン酸化も示し、併用療法は、有意な阻害ならびに相乗効果を示した（図１７，１８，１９、及び２０及び以下の表）。さらに、正常細胞におけるＤＡＰＫのＳ３０８リン酸化は比較的低いため、ソラフェニブとＧＷ５０７４の併用療法によって誘導されるがん細胞の増殖阻害は選択的であり、正常細胞に毒性を引き起こさない。

上記表１に示すデータを考慮すると、ｃ−Ｒａｆ及びＤＡＰＫは細胞質及びミトコンドリアに見出され、併用療法は、ＰＰ２ＡによるｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の脱リン酸化と共に、細胞質とミトコンドリアとの間のＤＡＰＫの再配置をもたらす。脱リン酸化されたＤＡＰＫは、細胞質中のｃ−Ｒａｆとのその相互作用を減少させる。さらに、ＤＡＰＫ^{Ｓ３０８Ｄ}のみが、併用療法の下で、ミトコンドリアからＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞質に転位誘導され得る。これは、ＲＯＳの産生及びｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８の低リン酸化をもたらす。しかし、細胞質及びミトコンドリアにおける併用療法によって誘導されたｃ−Ｒａｆ及びそのＳ３３８のリン酸化の低下は、高度にリン酸化されたｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８を有するがん細胞においてのみ見出され、低ｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８を有するがん細胞においては見出されなかった。

実施例６

腎細胞がん患者２０名から採取した腫瘍試料及び正常組織試料をさらに調査した。ウェスタンブロットの結果に基づいて、２０個のサンプルのうち１６個は、正常組織サンプルと比較してがん細胞におけるＳ３０８でのＤＡＰＫのリン酸化の上昇を示した（図２２及び２３（ｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８／ＧＡＰＤＨ、平均±Ｓ．Ｄ．、＊＊：ｐ＜０．００５））。免疫組織化学（ＩＨＣ）分析はまた、ＤＡＰＫのＳ３０８リン酸化が、正常な腎臓組織と比較して１８１のヒト腎がんサンプルにおいてより高いことを実証した（図２４）。一方、ＤＡＰＫのＳ３０８リン酸化は、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）及び半定量分析を使用して、がんの様々なグレード（Ｇ）又はステージ（Ｔ）の間に有意差を示さなかった。この結果は、ｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８が予後を決定する因子であるばかりでなく、腎臓がんを治療するための併用療法の予測バイオマーカーでもあることを示唆した。

この結果に基づいて、ｃ−Ｒａｆと結合した種々のｃ−Ｒａｆ阻害剤の結晶構造を評価するためにコンピュータシミュレーション実験を行った。最大エネルギーは、ＧＷ５０７４とソラフェニブの組み合わせがｃ−Ｒａｆに結合するとき、阻害剤がｃ−Ｒａｆキナーゼの構造領域に結合することによって生成されると予想された（−１８２ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ）。フロントエンドのＧＷ５０７４はｃ−Ｒａｆと結合し、Ｉｌｅ３５５、Ｖａｌ３６３、Ａｌａ３７３、Ｌｅｕ４０６、Ｔｒｐ４２３及びＰｈｅ４７を介した結合のためのより深い疎水性ポケットを生成する。この状況下では、疎水性ポケットのより多くの領域がＧＷ５０７４及びソラフェニブによって占有される（図２７に示される）。

本発明は、ソラフェニブ及びＧＷ５０７４を含む組成物を利用することによってがんを治療するための新規併用療法を開示する。併用療法は、がん細胞に対する選択的阻害のために、正常細胞に対して有毒ではない。したがって、この療法は安全であり、将来の適用のために非常に有望である。併用療法の有効性は、不要な治療を避けるために予測バイオマーカーとしてｐＤＡＰＫ^Ｓ３０８を使用することによって確認された。本発明の研究は、がん治療のための現在の研究が直面する障害を克服し、前臨床治療のための理想的なモデルの要件を満たす。上記の様々な技術的効果は、新規性と発明性の特許性要件を満たす。この出願は関連する法律に従って提出され、特許の付与は熱心に要請される。

Claims

ソラフェニブ及び３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−ヨード−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを含む、がんを治療するための医薬組成物。
前記組成物が、別々に、同時に、又は逐次的に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
前記がんが、腎細胞がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、子宮頸がん、口腔がん、神経膠腫、尿路上皮細胞がん、又は黒色腫である、請求項１に記載の医薬組成物。
薬学的に許容される化合物の塩又は媒体をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
前記媒体が、賦形剤、希釈剤、増粘剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、油又は非油剤、界面活性剤、懸濁剤、ゲル化剤、アジュバント、防腐剤、酸化防止剤、安定剤、及び着色剤からなる群から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、経口投与、浸漬、注射、局所適用、又はパッチ投与によって投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
前記３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−ヨード−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンが、配列番号１の配列を有するｃ−Ｒａｆタンパク質に結合するとｃ−Ｒａｆタンパク質の立体配座を変化させ、ｃ−Ｒａｆタンパク質を前記ｃ−Ｒａｆ／ＤＡＰＫタンパク質複合体から解離させるために、前記ソラフェニブの前記ｃ−Ｒａｆタンパク質への結合親和性を増加させる、請求項１に記載の医薬組成物。
タンパク質複合体を解離する化合物であって、前記タンパク質複合体がｃ−Ｒａｆ／ＤＡＰＫタンパク質複合体であり、前記ｃ−Ｒａｆタンパク質が配列番号１の配列を有し、前記ＤＡＰＫタンパク質が配列番号２の配列を有する、前記タンパク質複合体を解離するための医薬の製造における前記化合物の使用。
前記化合物がソラフェニブ及び３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−ヨード−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンである、請求項８に記載の使用。
検体を提供する工程と、
薬物の投与前に前記検体中のバイオマーカーのリン酸化レベルを検出する工程と、
前記バイオマーカーの前記リン酸化レベルが、前記薬物投与後の細胞増殖阻害率と正の相関を有する場合に、前記薬物が候補薬物であると判定する工程とを含み、
前記バイオマーカーは、配列番号１の配列を有するｃ−Ｒａｆタンパク質及び配列番号２の配列を有するＤＡＰＫタンパク質の少なくとも１つである、ｉｎｖｉｖｏバイオマーカーを用いた薬物スクリーニング方法。
前記ｃ−Ｒａｆタンパク質の前記セリン３３８（Ｓｅｒ３３８）アミノ酸残基がリン酸化され、前記ＤＡＰＫタンパク質の前記セリン３０８（Ｓｅｒ３０８）アミノ酸残基がリン酸化される、請求項１０に記載の方法。
前記検体が、手術後に収集された分離がん組織、腹水、血液、尿、糞便、喀痰、粘膜細胞、胃液又は胆汁がんである、請求項１０に記載の方法。
前記候補薬物が、ソラフェニブ及び３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−ヨード−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンである、請求項１０に記載の方法。
バイオマーカーが、配列番号１の配列を有するｃ−Ｒａｆタンパク質及び配列番号２の配列を有するＤＡＰＫタンパク質である、候補薬物のスクリーニングにおける前記バイオマーカーの使用。
ｃ−Ｒａｆタンパク質の前記セリン３３８（Ｓｅｒ３３８）アミノ酸残基がリン酸化され、ＤＡＰＫタンパク質の前記セリン３０８（Ｓｅｒ３０８）アミノ酸残基がリン酸化される、請求項１４に記載の使用。
前記候補薬物が、ソラフェニブ及び３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ−ベンジリデン）−５−ヨード−１，３−ジヒドロ−インドール−２−オンを含む、請求項１５に記載の使用。
薬物の投与前に前記バイオマーカーのリン酸化レベルを検出する工程と、
前記バイオマーカーの前記リン酸化レベルが、前記薬物投与後の細胞増殖阻害率と正の相関関係を有する場合に、前記薬物が候補薬物であると判定する工程とをさらに含む、請求項１５に記載の使用。