CN107427492B - 用于治疗癌症的医药组合物、其方法及筛选药物的生物标记 - Google Patents

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Abstract

一种用于治疗癌症的医药组合物，该组合物包括索拉非尼及GW5074(3‑(3,5‑二溴‑4‑羟基苯亚甲基)‑5‑碘‑1,3‑二氢吲哚‑2‑酮)，此合并疗法不论在体外或自发性转移肾脏癌细胞动物模式模拟临床症状的体内模式，可通过c‑Raf‑PP2A‑DAPK信息传递路径，进而抑制癌细胞生长。当GW5074与c‑Raf形成键结后导致构型改变，并使索拉非尼与c‑Raf亲和性增加。此一特殊的药物标的结合，促进PP2A将DAPK蛋白上的serine 308位置去磷酸化，使癌细胞走向细胞坏死，DAPK蛋白上的serine 308亦可作为一药物筛选的生物标记。

Description

用于治疗癌症的医药组合物、其方法及筛选药物的生物标记
技术领域
本发明有关于一种用于治疗癌症的医药组合物，该组合物包括索拉非尼(sorafenib)及GW5074。本发明还涉及一种利用药物分离蛋白质复体c-Raf与DAPK的方法，作为新药设计标的。本发明还涉及一种利用c-Raf与DAPK蛋白质及其磷酸化程度作为筛选药物的方法。
背景技术
许多种类的癌细胞中都有原型致癌基因被活化或是抑癌基因缺失导致，其中Ras基因为一原型致癌基因(proto-oncogene)，正常的 RAS蛋白的活化是由细胞膜上的酪氨酸激酶接受器(receptor tyrosine kinase，TKIs)所引发的，活化的Ras蛋白信号会与RAF结合，并将信息传递至下游，进而活化MAPK路径并调节细胞的生长与分化。当细胞表面生长因子接受器与生长因子产生结合时，活化的 Grb-sos蛋白会使下游的Ras-GDP变成Ras-GTP，Ras-GTP与Raf蛋白的N端结合，而开启Raf蛋白的活化作用，通过将MEK磷酸化，进而调控ERK活化，进入细胞核内，促使癌细胞增生。于是针对原型致癌基因(proto-oncogene)这类酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)所开发的药物便大量出现，但却发现许多癌症病患在治疗过程出现抗药性，因此针对癌细胞中不同的酪氨酸激酶 (tyrosinekinase)信息传导途径，便顺理成章的成为药物合并治疗的方式。
血管新生(angiogenesis)与细胞增生在肿瘤生长过程中扮演重要角色，在肿瘤中，当癌细胞大量释放血管增生因子A(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)与肿瘤内的内皮细胞表面上的血管增生因子受体-2(vascular endothelial growth factorreceptor,VEGFR-2)结合启动了内皮细胞内的 Raf/mitogen-activated protein kinase(MEK)/extracellular signal-regulated kinase(ERK)信息传递途径促使内皮细胞增生形成血管，同时Raf-ERK信息途径也可促进癌细胞增生，近年研究中以发现Ras-Raf-ERK在许多肿瘤细胞中都失去调控，因此针对VEGF与 Raf作为抑制目标成为一个最佳的目标。
索拉非尼sorafenib(蕾莎瓦
Figure GDA0002903464330000021
BAY 43-9006；拜耳医疗保健事业群Bayer HealthCare Pharmaceuticals)口服多激酶 抑制剂(Multi-Kinase Inhibitor)广泛应用于多种癌症治疗，可抑制蛋白包括：Raf、VEGF receptor、platelet-derived growthfactor(PDGF) receptor、KIT与Fms-like tyrosine kinase-3(FLT-3)，许多研究皆指出在不同癌细胞中sorafenib可通过抑制癌细胞内的Raf信号途径达到抑制肿瘤生长，同时通过抑制VEGF与PDGF信息途径达到抑制癌细胞周边的内皮细胞增生，进而促使癌细胞死亡。这类药物在设计与实验结果中都非常的理想，但不幸的是，在临床应用几年下来却发现，sorafenib在病患使用初期的确有效抑制肿瘤尺寸，然而却无法根除肿瘤，伴随着严重副作用，同时投药时间增长，导致癌细胞产生抗药性。近年来部分研究发现抑制癌细胞Raf信息途径，癌细胞则可通过不同的分子调控弱化sorafenib的抑制；更重要的是部分研究指出sorafenib抑制癌细胞可能通过非Raf信息途径。上述的诸多缺点，仍亟待加以改良。
发明内容
有鉴于sorafenib在病患使用初期的确有效抑制肿瘤尺寸，然而却无法根除肿瘤，伴随着严重副作用，同时投药时间增长，导致癌细胞产生抗药性，实非有效的方法，而亟待加以改良。本发明提供了以下发明：(1)sorafenib合并GW5074的新颖合并治疗；(2)c-Raf与DAPK的解离，会导致细胞进行细胞坏死程序，以有效杀死细胞，作为未来新药设计标的；(3)c-Raf与DAPK蛋白质及其磷酸化程度可作为筛选药物的生物标记。
本发明的目的即在提供一种用于治疗癌症的医药组合物，该组合物包括索拉非尼(sorafenib)及 3-(3,5-Dibromo-4-hydroxy-benzylidene)-5-iodo-1,3-dihydro-indol-2-one3-(3,5-二溴-4-羟基苯亚甲基)-5-碘-1,3-二氢吲哚-2-酮 (GW5074)。
为达成前述发明目的，其中该组合物经分开、同时或依序地使用。
为达成前述发明目的，其中该癌症包括肾脏癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、子宫颈癌、口腔癌、脑神经胶质瘤、泌尿道上皮细胞癌、或黑色素肿瘤。
为达成前述发明目的，进一步包括该化合物在药学上可接受的盐类或载剂。前述的载剂包括赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、介面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料等。
为达成前述发明目的，其中该医药组合物以口服、浸泡、注射、涂抹或贴片方式投予。
为达成前述发明目的，其中该医药组合物GW5074会结合c-Raf 蛋白质(SEQ IDNO:1)使其构型改变，增加索拉非尼对改变后c-Raf 蛋白质的亲和力，使c-Raf与DAPK蛋白质复体分离。
本发明的目的亦提供一种如上述任一发明目的所定义的医药组合物于制备治疗癌症的药物的用途。
本发明的目的亦提供一种化合物在制备分离蛋白质复体的药物的方法，其中该至少一种化合物可分离蛋白质复体，该蛋白复体为 c-Raf(SEQ ID NO:1)与DAPK(SEQ ID NO:2)。
为达成前述发明目的，其中该化合物为索拉非尼及GW5074。
本发明的目的亦提供一种利用活体外生物标记作为筛选药物的方法，包括：提供一检体；侦测给药前该检体的生物标记表现量及磷酸化程度至少一者，若与给药后的细胞生长抑制率成正相关，则为合适的药物；其中该生物标记为蛋白质c-Raf(SEQ ID NO:1)及蛋白质 DAPK(SEQ ID NO:2)至少一者。
为达成前述发明目的，其中c-Raf蛋白质磷酸化位置为第338 号丝氨酸(Ser338)；DAPK蛋白质磷酸化位置为第308号丝氨酸 (Ser308)。
为达成前述发明目的，其中该检体包括腹水、血液、尿液、粪便、痰、口腔粘膜细胞、胃液、胆汁或手术后的癌症组织离体样本。
为达成前述发明目的，其中该药物为索拉非尼及GW5074。
本发明的目的亦提供一种生物标记用于筛选药物的用途，其中该生物标记为蛋白质c-Raf(SEQ ID NO:1)及蛋白质DAPK(SEQ ID NO:2) 至少一者。
为达成前述发明目的，其中c-Raf蛋白质磷酸化位置为第338号丝氨酸(Ser338)；DAPK蛋白质磷酸化位置为第308号丝氨酸(Ser308)。
为达成前述发明目的，其中该药物为索拉非尼及GW5074。
为达成前述发明目的，进一步包括侦测给药前该检体的生物标记表现量及磷酸化程度至少一者，若与给药后的细胞生长抑制率成正相关，则为合适的药物。
新颖合并治疗概念，将原本抗血管新生药物sorafenib合并 c-Raf抑制剂GW5074，此两样药物在单一低剂量(sorafenib 5uM, GW5074 10uM)下皆对细胞不具任何抑制生长效果，但在合并使用后，可使原本不具细胞毒性的两样药物在合并之后产生具有细胞毒性的效果，并且有效降低Sorafenib在有效剂量下衍生的副作用，有效抑制癌细胞生长。本次提出这一新颖合并治疗发现一特殊分子机转，随着两样药物结合上c-Raf，此时c-Raf与DAPK蛋白复体结构破坏导致细胞凋亡的特殊分子机转，可作为未来药物设计的新标的，研究发现在合并治疗效果上，癌细胞中的c-Raf s338高度磷酸化时合并治疗效果最佳；并发现在人类癌细胞株中，若DAPK蛋白质表现量低或者 DAPK-s308磷酸化较低的细胞株，此时对于合并治疗的效果较差。
分离c-Raf与DAPK蛋白质的药物或筛选的药物为sorafenib、 GW5074组合。
术语〝药学上可接受的赋形剂〞，如本文中所用者，意指谙于此技术者所知可与sorafenib或GW5074的物理和化学特性相容的任何生理学惰性，药理学上不活性的物质。药学上可接受的赋形剂包括，但不限于，聚合物、树脂、增塑剂、填料、润滑剂、稀释剂、粘合剂、崩解剂、溶剂、共一溶剂、界面活性剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、药学级的染料或颜料、及粘度剂。
术语“医药组成物(pharmaceutical composition)”为一种固体或液体组成物，其形式、浓度和纯度程度适合投予给病患(如人类或动物病患)，在投予之后，其可诱发所欲生理变化。医药组成物典型地为无菌及/或非发热性者(non-pyrogenic)。
于用于本文中之时，术语“组合物(combination)”，于应用于量两种或更多种化合物及/或药剂(于本文中也称为成分)之时，意欲定义其中有该两种或更多种化合物/药剂结合的材料。
术语“组合”(“combined”和“combining”)于本文中皆据此诠释。
两种或更多种化合物/药剂在组合物中的结合可为物理性或非物理性者。经物理结合的组合化合物/药剂的例子包括：组成物(如单一调合物)，包括彼此混合(如在相同单一剂内者)的两种或更多种化合物/药剂；组成物，包括其中有两种或更多种化合物/药剂经化学/ 物理联结(例如经由交联、分子粘聚(molecular agglomeration)或结合到共同的媒体基团(vehicle moiety))的材料；组成物，包括其中有两种或更多种化合物/药剂经化学/物理化学共-构装(co-packaged) (例如，经配置在液体媒体、粒子(如微米粒子或纳米粒子)或乳液液滴之上或之内的材料；医药套组(pharmaceutical kits)、医药包(pharmaceutical packs)或病患包(patient packs)，其中有两种或更多种化合物/药剂经共-包装或共-呈现(如作为单位剂批的部份者)。
非经物理结合的组合化合物/药剂的例子包括：材料(如非单一调合物)，包括两种或更多种化合物/药剂中的至少一种加上说明书以指示该至少一种化合物/药剂的即席结合以形成该两种或更多种化合物/药剂的物理结合；材料(如非单一调合物)，包括两种或更多种化合物/药剂中的至少一种加上说明书以指示该两种或更多种化合物/药剂的组合疗法；材料，其包括两种或更多种化合物/药剂中的至少一种加上说明书以指示对一病患族群的投予，其中该病患族群为已服用 (或正在服用)该两种或更多种化合物/药剂中的另一者(其他者)；材料，包括两种或更多种化合物/药剂中的至少一种，其量或其形式经特定地调适以用来与该两种或更多种化合物/药剂中的另一者(其他者)组合。
于用于本文中之时，术语“组合疗法”意欲定义包括使用该两种或更多种化合物/药剂的组合物(如上面所定义者)的治疗法。因此，于本申请案中，对于“组合疗法”、“组合物”与化合物/药剂的“组合”使用等的指称可指称作为整体治疗法的部份投予的化合物/药剂。如此，两种或更多种化合物/药剂中每一者的药量学(posology)可能不同：每一者可于同时间或不同时间投予。所以要理解者为该组合物的化合物/药剂可依序地(如在之前或之后)或同时地投予，可为在相同的医药调合物中(即一起)，或在不同的医药调合物中(即纷开地)。在相同调合物中同时地投予如一种单一调合物形式，而在不同医药调合物中同时投予为非单一者。两种或更多种化合物/药剂中每一者在组合疗法中的药量学也可能针对投予途径而不同。
附图说明
图1为单一剂量的c-Raf抑制剂(sorafenib、GW5074、L779450、 PLX4720)于ACHN处理24小时后，细胞的生长抑制率；
图2单一剂量的c-Raf抑制剂(sorafenib、GW5074、L779450、PLX4720)于ACHN处理48小时后，细胞的生长抑制率；
图3单一剂量的c-Raf抑制剂(sorafenib、GW5074、L779450、 PLX4720)于ACHN处理72小时后，细胞的生长抑制率；
图4为不同c-Raf抑制剂合并治疗于ACHN处理24、48、72小时后，细胞的生长抑制率(Sor：sorafenib、GW：GW5074、L77：L779450、 PLX：PLX4720)；
图5为sorafenib与GW5074单独或合并治疗于异体移植，每3 天测量肿瘤大小至第21天；
图6Luc-ACHN-LL细胞原位植入小鼠，给予不同药物组别处理下的光子信号，为计数分布全身的肿瘤，并利用
Figure GDA0002903464330000081
活体影像软体测量和量化从整个鼠身发射的总光子。箭头所指处为给药起始时间；
图7为ACHN细胞经DMSO(控制组)、5μM sorafenib、10μM GW5074 或合并治疗24小时后细胞凋亡或坏死的程度；
图8为以免疫染色法侦测ACHN细胞经DMSO(控制组)、5μM sorafenib、10μM GW5074或合并治疗24小时后pDAPKS308磷酸化程度与DAPK蛋白质表现量；
图9为ACHN细胞经DMSO(控制组)、5μM sorafenib、10μM GW5074 或合并治疗24小时后，以免疫共同沉淀法侦测其内生性DAPK后，再以免疫染色法以指定抗体染其余相关蛋白；
图10为ACHN细胞经DMSO(控制组)、5μM sorafenib、10μM GW5074或合并治疗24小时后，以免疫共同沉淀法侦测其内生性c-Raf 后，再以免疫染色法以指定抗体染其余相关蛋白；
图11为ACHN细胞经合并治疗给予有无PP2A抑制剂cantharidi (C.A.)或okadaicacid(O.A.)，观察细胞生长抑制率；
图12为ACHN细胞给予稳定表现野生型或突变型c-Raf，再经合并治疗24小时(*p<0.05,**p<0.01为相对于野生型组别)；
图13为ACHN细胞表现野生型或突变型flag-tagged-c-Raf，再经DMSO(控制组)或合并治疗24小时；以免疫共同沉淀法侦测其 Flag-c-Raf后，再以免疫染色法以指定抗体染其余相关蛋白；
图14为ACHN、786-O与Rcc-Sut-002细胞转植Scr.(scrambled siRNA)、DAPKsiRNA1(siDAPK-a)或DAPK siRNA2(siDAPK-b)后，给予合并治疗并观察细胞生长抑制率(上方)；细胞溶解物以免疫染色法染DAPK与-catenin；
图15为HeLa细胞表现V5-tagged-DAPK野生型与突变型，经合并治疗24小时并观察细胞生长抑制率；
图16为MDA-MB231细胞表现V5-tagged-DAPK野生型与突变型，经合并治疗24小时并观察细胞生长抑制率；
图17为不同癌细胞或正常细胞经5μM sorafenib治疗24小时并观察细胞生长抑制率；
图18为不同癌细胞或正常细胞经10μM GW5074治疗24小时并观察细胞生长抑制率；
图19为不同癌细胞或正常细胞经5μM sorafenib與10μM GW5074合并治疗24小时并观察细胞生长抑制率；
图20显示相对于对照组ACHN组pDAPKS308程度；免疫染色法侦测pDAPKS308与DAPK表现量；
图21为回归曲线图为pDAPKS308强度比率与细胞生长抑制率的关联，R2＝0.4551，R＝0.6746，p＝0.00001；
图22为免疫染色法侦测pDAPKS308与DAPK表现量于肿瘤(pT)或同病人之相对正常部位组织(pN)
图23为pDAPKS308经GAPDH一致化后之相对强度；
图24为免疫组织化学色侦测人正常与肾脏癌组织pDAPKS308表现量；原始方大倍率40倍(上方)、100倍(下方)比例尺为100M；
图25为组织微阵列量化人正常与肾脏癌组织pDAPKS308表现量经后之图表；为正常与不同分级G(grade)；；
图26为组织微阵列量化人正常与肾脏癌组织pDAPKS308表现量经后之图表；为不同分期T(T stage)；癌细胞移转(meta.)；
图27为电脑模拟经sorafenib与GW5074作用于c-Raf激酶后的结构；GW5074为绿色，sorafenib为红紫色。
具体实施方式
本发明将就下列实施例作进一步说明，然该等实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为实施本发明的限制。
实施例一sorafenib与GW5074的合并治疗-细胞试验
人类肾脏癌细胞株(ACHN)培养在Eagle’MEM(Minimum Essential Medium)与添加10％胎牛血清(FBS,Fetal Bovine Serum)与1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)培养液中。Sulforhodamine B (SRB)是一个具有磺酸基的阴性蛋白质，在弱酸性环境下可与细胞内蛋白质中的碱性氨基酸结合，使用弱碱溶液萃取细胞内的SRB并测量其吸光值，通过SRB的含量即可得知细胞内的蛋白质含量，并以此代表细胞存活率。单独给予2.5、5、10μM sorafenib、GW5074、L779450 或PLX4720于ACHN或A498细胞株处理24、48与72小时，或是前30 分钟先给予10μM的GW5074、L779450或PLX4720于ACHN细胞株，再给予5μM sorafenib 24、48与72小时后，利用SRB评估细胞生长抑制率。
实验结果可发现，将c-Raf抑制药物sorafenib合并同为抑制c-Raf的化合物GW5074，此两样药物在单一低剂量(5μM sorafenib、 10μM GW5074)24小时皆对细胞不具任何抑制生长效果(图1、2、3，平均值±S.D.，n＝4)。但在合并使用后，可使原本不具细胞毒性的两样药物在合并之后产生具有细胞毒性的效果，并且有效降低 sorafenib在有效剂量下衍生的副作用，有效抑制癌细胞生长，具有相乘效果(synergistic effect)(图4，平均值±S.D.，**P<0.01， n＝4)。
实施例二sorafenib与GW5074的合并治疗-异体移植
我们将1×107人类肾脏癌细胞株(ACHN)后，以异体移植 (xenograft)皮下注射(intraperitoneal injection,i.p.)至右侧于六周大(年龄)、平均体重20公克的免疫缺陷公小鼠 (BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu/CrlNarl)，实施例中的小鼠皆养在无特定病原(specificpathogen-free,SPF)等级的环境中。每周两次利用数位测径器(digital calipers)观察肿瘤大小，肿瘤体积计算方式为长 *宽*高*0.5。当肿瘤大小来到100mm3开始给予药物，每天从口管喂食(oral gavage)5mg/kg sorafenib、皮下注射10mg/kg GW5074合并治疗三周，每三天测量肿瘤大小一次。实验组别分别为控制组只给予溶剂(vehicle，DMSO)、5mg/kgsorafenib、25mg/kg GW5074或是合并治疗5mg/kg sorafenib与25mg/kg GW5074，每组8只动物。
实验结果如图5所示，实验组别中无论是单独给予5μM sorafenib 或是10μMGW5074，都只有极少的抑制效果；相对于合并治疗5μM sorafenib与10μM GW5074皆达到显著的抑制ACHN肿瘤生长的效果 (t-test，平均值±SD，**P<0.01，n＝8)。
实施例三sorafenib与GW5074的合并治疗-原位模式
为模拟临床现象，我们建立原位自发性(orthotopic spontaneous) 肾脏癌细胞移转的动物模式。首先将人类肾脏癌细胞株(ACHN)转殖冷光基因(luciferase)，将各种具有不同的转移能力的Luc-ACHN(稳定转殖萤光素酶)转殖株，以皮下注射至小鼠体内培养，在六周龄的裸小鼠皮下注入1×107Luc-ACHN细胞于0.1毫升的PBS中。注射2个月后，牺牲动物后取其肾、肝、区域淋巴结与其他器官，评估具转移潜力的细胞株，并用苏木紫－伊红染色(H&E)染色确定。具高度转移病灶的细胞株在无菌条件下进行解剖，切成小碎块在1毫升PBS，离心分离后，肉糜在10％小牛血清和1％青霉素/链霉素的MEM培养。几天后，单细胞株用胰酶打散，然后在体外培养。肝脏肿瘤组织的细胞被命名为ACHN-L。我们进一步分析不同器官的细胞的转移能力，将来自不同的器官的肿瘤细胞植入的到左肾。肿瘤细胞注射八周后，牺牲小鼠和检验尸体。通过肉眼和组织学的程序来检验所有内脏器官肿瘤生长的情形。移转至肝脏中的细胞进行无菌解剖，切成小碎块后在体外培养。肝脏肿瘤组织的细胞被命名为ACHN-L(皮下注射)和利用 ACHN-L注射入左肾后，于肝脏所得的转移病灶细胞则命名为ACHN-LL。重复同样的操作，使用ACHN-LL细胞和肝脏转移性细胞株，再经过两轮的原位植入方法进行选择，从中获得移转性高的肿瘤。我们从中筛选出移转能力强且致死率高的癌细胞(Luc-ACHN-LL)，取3×105细胞于50μL PBS原位注射至免疫缺陷公小鼠右侧肾囊(renal capsule)。在动物体内，每天观察萤光素酶活性长达三周，以确认刚注射后没有癌细胞露出到肾脏外侧，并且观察日后是否有无癌细胞移转。使用 IVIS Xenogene系统观察前2-5分钟，从眼窝打入每只小鼠75mg/kg D-Luciferin(Xenogen)溶于PBS。癌细胞(Luc-ACHN-LL)注射后的两周，利用IVIS Xenogene系统观察生物萤光影像移转情形，并计算信号光子强度(photons/s/cm2/steradian)。实验组别分别为控制组只给予溶剂(vehicle)、10mg/kg sorafenib、25mg/kg GW5074、合并治疗10mg/kg sorafenib与25mg/kg GW5074(i.p.GW 30分钟后，再喂食Sor)或是60mg/kg sorafenib。
实验结果显示控制组只给予溶剂(vehicle)、10mg/kg sorafenib、25mg/kgGW5074组小鼠，打入癌细胞后最长分别为不超过五、八、五周内死亡；高剂量的60mg/kgsorafenib组小鼠同样也有体重下降，而后死亡的情形，最长不过十周；令人惊讶的是，相较于其他各组，唯有合并治疗低剂量的10mg/kg sorafenib与25 mg/kg GW5074抑制了肿瘤的大小、抑制了癌细胞的移转(图6所示IVIS 影像与光子强度的量化，平均值±SD，**P<0.01，n＝4)、延长小鼠的存活时间、体重与平日的活动力皆与正常小鼠相仿。从小鼠身上取下肿瘤细胞，也发现了合并治疗组别相较于其他各组的癌细胞有很严重的细胞坏死(necroptosis)。
以上结果证实合并治疗低剂量sorafenib与GW5074不仅具有在体外抑制癌细胞生长的能力，更重要的是，合并治疗的效果可在动物体内且为模拟临床癌细胞移转情形下被观察到。
实施例四
合并治疗索拉非尼与GW5074诱导细胞坏死，是通过死亡相关蛋白激酶(DAPK)第308号丝氨酸去磷酸化后与原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激(c-Raf)离解。细胞同实施例一的培养方法，细胞以磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗后，重新将细胞悬浮在结合缓冲液(bindingbuffer， Enzo Life Sciences)，并以膜联蛋白V(annexin V)-FITC和碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染色15分钟。利用流式细胞仪测定Annexin V的萤光和碘化丙啶的有无，藉此判断细胞是细胞凋亡或是细胞坏死。利用西方点墨法与免疫共沉淀法配合抗体来侦测c-Raf、DAPK及其磷酸化有无，使用抗DAPK的抗体或非免疫的兔抗体(non-immune rabbit IgG，IP：免疫球蛋白)作为阴性对照，以SRB法侦测细胞存活率(如实施例一所示)。以ACHN细胞为实验，分为控制组(DMSO)、5μM sorafenib、10μM GW5074或合并治疗5μM sorafenib与10μMGW5074 处理24小时。
实验结果显示，ACHN细胞于控制组(DMSO)或单独治疗5μM sorafenib、10μMGW5074组中，被侦测到平均细胞坏死的比例分别为0.37、0.77和1.35％。然而当细胞于合并治疗组别中，发现细胞坏死的比例显著上升至53.95％(图7，t-test，平均值±SD， ***P<0.001，n＝4)。只有合并治疗组别中，在肿瘤细胞中pDAPKS308通过PP2A的去磷酸化，其S308磷酸根显著减少(图8)。免疫淀法的检测结果显示了c-Raf和DAPK与PP2A相互作用形成一个复合体。合并治疗降低了PP2A与DAPK和c-RAF的相互作用，并伴随pDAPKS308的减少(图9、10)。在合并治疗的组别中，只有在合并给药前30分钟先预给不同浓度的PP2A抑制剂(Cantharidinacid,C.A.,Okadaic acid, O.A.)，才能有效地抑制pDAPKS308的去磷酸化和减少对ACHN癌细胞的生长抑制效果(图11，*P<0.05，**P<0.01，n＝4)。
接着我们检查合并治疗是否对pc-RafS338有疗效上的影响。当 ACHN细胞转殖c-RafS338D(模拟S338磷酸化)下，pDAPKS308减少的现象是最明显的。c-RafS338A(模拟S338非磷酸化)，不仅弱化了DAPKS308的去磷酸化，同时也减弱了在合并治疗中ACHN细胞的生长抑制率(图 12，*P<0.05，**P<0.01，n＝3)。免疫沉淀法中显示，相较于c-RafWT(野生型)和c-RafS338A(模拟S338非磷酸化)，c-RafS338D(模拟S338磷酸化) 明显地失去与PP2A的相互作用(图13)。合并治疗不只增加了 pc-RafS338，还促进PP2A将pDAPKS308去磷酸化，并增进细胞进行细胞坏死。
本实施例除了公开了合并治疗索拉非尼与GW5074诱导细胞坏死，是通过死亡相关蛋白激酶(DAPK)第308号丝氨酸去磷酸化后与原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激(c-Raf)离解，c-Raf与DAPK的解离亦可作为日后药物设计的标的，也就是当细胞中c-Raf与DAPK的解离，会导致细胞进行细胞坏死程序，以有效杀死细胞。
实施例五利用活体外生物标记作为筛选药物的方法
研究发现，DAPK蛋白质其S308磷酸化表现，可作为预测药物对肿瘤细胞抗癌效果的生物标记。细胞培养方法、生长抑制率的侦测方法同实施例一，利用肾脏癌细胞株ACHN、786-O、Rcc-Sut-002(耐药肿瘤细胞)，给予DAPK-a型与b型的siRNA(siDAPK-a，正义股：5′ -CAAGAAACGUUAGCAAAUGUU-3′[SEQ ID No:3]与反义股：5′ -CAUUUGCUAACGUUUCUUGUU-3′[SEQ ID No:4]；siDAPK-b，正义股：5′ -GGUCAAGGAUCCAAAGAAGUU-3′[SEQ ID No:5]与反义股：5′ -CUUCUUUGGAUCCUUGACCUU-3′[SEQ ID No:6])，分别为控制组(Scr)、 siDAPK-a、siDAPK-b，观察给予合并治疗5μM sorafenib与10μM GW5074处理24小时之细胞生长抑制率；利用子宫颈癌细胞(HeLa)和乳腺癌细胞(MDA-MB-231)细胞，观察控制组空载体(vector)、WT(野生型)、DAPKS308D、DAPKS308A、DAPKK42A(蛋白酶失活)情形下，给予合并治疗5μMsorafenib与10μM GW5074处理24小时的细胞生长抑制率。
实验结果显示，合并治疗sorafenib与GW5074所造成细胞毒作用中，DAPK是不可缺少的蛋白质。ACHN、786-O和RCC-SUT-002细胞中，抑制DAPK的两个siRNA减少了约60％的生长抑制作用(图14)。进一步发现DAPK的S308磷酸化与合并治疗所产生的细胞毒性，是有很大的相关性。在平时pDAPKS308表现量较高的HeLa细胞中，过度表现的DAPKWT和DAPKS308D其合并治疗后显著提高了细胞毒性；而DAPKK42A (DAPK蛋白激酶失活)和DAPKS308A(模拟S308非磷酸化)在合并治疗中，并没有增加细胞细胞致死的能力；相较平时pDAPKS308表现量较低的MDA-MB-231乳腺癌细胞，只有DAPKS308D提升了合并治疗的生长抑制率，其他DAPKWT、DAPKS308A与DAPKK42A并没有提高生长抑制率(图15、16，平均值±SD，**p<0.01,n＝3)。以上结果显示在sorafenib和GW5074 合并治疗中，DAPK的S308磷酸化是扮演着细胞毒性中非常重要的角色，而不是DAPK蛋白本身，因为即便DAPK表现量高，但Serine 308 无磷酸化对于合并治疗仍然无效。合并用药的细胞毒性作用是须经由具活性的DAPK蛋白激酶，因此只有当癌症细胞具有pDAPKS308时， sorafenib和GW5074的合并治疗才较有效果。
c-Raf蛋白质磷酸化表现，可作为预测药物对肿瘤细胞抗癌效果的生物标记。当ACHN细胞转殖c-RafS338D(模拟S338磷酸化)下， pDAPKS308减少的现象是最明显的。c-RafS338A(模拟S338非磷酸化)，不仅弱化了DAPK S308的去磷酸化，同时也减弱了在合并治疗中ACHN细胞的生长抑制率(图12，*P<0.05，**P<0.01，n＝3)。由此证明若 c-Raf S338被磷酸化时合并治疗效果较佳，c-Raf S338D(模拟S338 磷酸化)相较于c-Raf S338A(模拟S338非磷酸化)效果更好。
另外我们也检视了多种癌细胞与正常细胞，由于正常的纤维细胞和上皮细胞本身DAPK的S308磷酸化程度相当低，因此合并治疗对上述细胞的毒性相当低。然而，在不同的肿瘤细胞中，合并治疗造成的生长抑制率与DAPK的S308磷酸化程度呈正相关(图17、18、19、20、 21，平均值±SD，**p<0.01,n＝3)。我们进一步研究合并治疗对耐药性的癌细胞是否有抑制效果，其肿瘤细胞源自于临床例 (RCC-Sut-001，RCC-Sut-002，RCC-Sor-001)和动物模型(786-OT4， ACHN-T2R)，对于sorafenib皆具有耐药性。所有耐药性肿瘤细胞其具有高S308磷酸化程度之DAPK皆被合并治疗显著抑制，另外两个癌细胞株HT29和A2058亦对于Raf抑制剂有抗药性，其细胞内DAPK的 S308磷酸化程度相当高，合并治疗也有显著抑制效果与相乘效果(图 17、18、19、20、表一)。此外，由于正常细胞其细胞内DAPK的S308 磷酸化程度相当低，因此sorafenib和GW5074的合并治疗具有选择性对癌细胞有抑制的作用，而不会对正常细胞具有毒性的优点。
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Figure GDA0002903464330000171
由上表中数据可知，c-Raf和DAPK位于细胞质和线粒体，合并治疗导致DAPK在细胞质与线粒体间的再分配，并伴随着PP2A 将pDAPKS308去磷酸化。无磷酸化的DAPK将减少其在细胞质中与 c-Raf的相互作用。此外，在MDA-MB-231细胞合并治疗下，唯有 DAPKS308D可以被诱导从线粒体转运到细胞质，并伴随ROS的生成与低度pDAPKS308磷酸化。然而，合并治疗在细胞质与线粒体中c-Raf 蛋白及其S338磷酸化皆减少的情形，只有在高度pDAPKS308磷酸化的癌细胞中才会发生，而不会在低度pDAPKS308邻酸化的癌细胞。
实施例六
我们研究了20对病人肾细胞癌的肿瘤样本与其正常组织部位。西方点墨法分析结果显示，20位病人受体中其中16位其癌细胞DAPK的S308相较于正常组织，磷酸化程度有较高的表现(图 22、23(pDAPKS308/GAPDH，平均值±S.D.，**p<0.005)。免疫组织化学分析(IHC)显示，181对人类肾肿瘤细胞样本中DAPK的 S308磷酸化程度显著高于正常肾脏组织(图24)。利用组织微阵列(TMA)与半量化方法分析，对于癌症不同分级(G，grade)或分期(T)，彼此间DAPK的S308磷酸化程度并无显著差异(图25、26)。我们的研究结果表明pDAPKS308不仅仅是预后因子，也可作为预测生物标记物结合治疗肾癌治疗。
鉴于上述结果，我们进行了电脑模拟，以评估不同的Raf抑制剂结合c-Raf后的晶体结构。预测抑制剂达到最大结合c-Raf 激酶结构区域的能量，是当GW5074和sorafenib的组合结合上 c-Raf时(-182千卡/摩尔)。位于前端的GW5074结合c-Raf，通过Ile355、Val363、Ala373、Leu406、Trp423和Phe475造成更深入结合成一个疏水性的口袋处。在这种结合的方式，疏水性口袋处的更多区域将被GW5074和sorafenib占据(图27)。
我们的研究公开了sorafenib和GW5074组合物对于治疗癌症的一种新颖合并疗方法。这种合并治疗由于具有选择性对癌细胞有抑制的作用，而不会对正常细胞具有性毒性的优点，因此是相当具有安全性的，且非常具有应用前途。我们还确定了pDAPKS308作为生物标记来预测合并治疗的疗效，以避免那些不必要的治疗。我们的研究克服目前的癌症治疗研究中所遇到的障碍，并符合标准的理想的临床前治疗模式。
Figure IDA0001392468930000011
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Claims (1)

1.一种索拉非尼及3-(3,5-二溴-4-羟基苯亚甲基)-5-碘-1,3-二氢吲哚-2-酮于制备治疗癌症的药物中的用途，其特征在于，
索拉非尼的剂量为5μM，且3-(3,5-二溴-4-羟基苯亚甲基)-5-碘-1,3-二氢吲哚-2-酮的剂量为10μM；以及
该癌症包括肾脏癌、前列腺癌、肺腺癌、非小细胞肺癌、子宫颈癌、口腔癌、泌尿道上皮细胞癌，或黑色素肿瘤；以及
该癌症表现c-Raf蛋白质及DAPK蛋白质至少一者，其中
该c-Raf蛋白质型号为SEQ ID NO:1，且该c-Raf蛋白质的第338号丝氨酸具有磷酸化；以及
该DAPK蛋白质型号为SEQ ID NO:2，且该DAPK蛋白质的第308号丝氨酸具有磷酸化。
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