CN111208283A

CN111208283A - 增效的肿瘤抑制组合物及其应用

Info

Publication number: CN111208283A
Application number: CN201811388749.2A
Authority: CN
Inventors: 孙丽明; 张晶
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2020-05-29
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN111208283B

Abstract

本发明涉及增效的肿瘤抑制组合物及其应用。本发明首次提出了微管靶向类抗肿瘤药物(microtubule‑targeting agents，MTAs)在引发肿瘤细胞程序性细胞死亡过程中的分子机制，其通过JNK‑cJun通路激发膜定位TNF(membrane‑bound TNF，mTNF)转录，膜定位TNF进一步激活死亡受体TNFR1，起始细胞的凋亡或坏死，该分子机制可以作为研究以膜定位TNF为靶点的抗肿瘤靶向药，以及开发促进MTAs类药物功效的药物。本发明还揭示了一种新型的药物组合方案，即联合MTAs类药物与IAP抑制剂(如Smac mimetics(SM)，即Smac类似物)，能够大大促进MTAs类药物诱导的依赖于膜定位TNF上调而导致的肿瘤细胞凋亡，并降低MTAs类药物的有效剂量及用药时间，从而降低这类化疗药的毒副作用。

Description

增效的肿瘤抑制组合物及其应用

技术领域

本发明属于药物学领域，更具体地，本发明涉及增效的肿瘤抑制组合物及其应用。

背景技术

微管靶向药物(Microtubule-targeting agent，MTA)是一类广泛使用的化疗药物，长期以来在临床上取得了巨大的成功。尽管在肿瘤的临床治疗方面已经得到了很好的验证，关于MTA引起肿瘤细胞死亡的机制仍未得到解答。

微管蛋白(microtubule)是MTA的作用靶点，其在分裂细胞和非分裂细胞中都有着重要作用。MTA通过干扰微管聚合(微管解聚类药物microtubule depolymerizers，如秋水仙碱colchicine和长春花碱vinca alkaloids等)或者稳定微管多聚体(微管稳定类药物microtubule stabilizers，如紫衫烷taxanes和埃博霉素epothiloes等)来发挥作用。

近年来有关MTA通过诱导有丝分裂停滞而杀死癌细胞的理论遭到了越来越多的质疑。大量文献表明患者个体之间癌细胞增殖速率差异很大，即使在同一个肿瘤的不同位置其增殖速度差异也很大。尽管如此，几乎所有的人源肿瘤的倍增时间都远远慢于体外培养的肿瘤细胞。基于大量资料，人源肿瘤倍增时间的中值大约为147天，所以很难在癌症病人样本中看到显著性的有丝分裂停滞癌细胞。这也就无法解释临床上即使用小剂量的MTA是如何以肿瘤中很少的一部分正在分裂的细胞作为靶标，使生长速度很慢的肿瘤，比如乳腺癌，发生大面积的消退。总的来说，MTA促进肿瘤消退的机制仍有待进一步研究。

肿瘤坏死因子(TNF)是细胞因子大家族的一员，主要由巨噬细胞产生。TNF信号在炎症和自身免疫病中发挥的重要作用已经在抗风湿性关节炎和肠炎的治疗中通过抗体疗法中和TNF得到了有效的验证。到目前为止，大多数关于TNF信号介导的细胞死亡的研究都集中在17kDa的分泌型TNF层面。膜定位TNF的表达模式以及其在病理条件下的作用知之甚少。

综上，本领域还需要对药物抑制肿瘤的作用机理机制进行更为明确的研究，并且在此基础上开发出新型的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供增效的肿瘤抑制组合物及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种筛选促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的物质(包括潜在物质)的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)以微管靶向药物和候选物质处理筛选体系，该筛选体系中包括选自下组的信号通路、基因或蛋白：JNK-cJun，膜定位TNF-TNFR1，RIP1-RIP3-MLKL；(2)观测该体系中所述信号通路、基因或蛋白的表达或活性的变化；若所述候选物质促进微管靶向药物对于JNK-cJun，膜定位TNF-TNFR1或RIP1-RIP3-MLKL信号通路的激活作用，进而提高信号通路、基因或蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的物质(包括潜在物质)。

在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制肿瘤的物质(包括潜在物质)的方法，所述方法包括：(1)以候选物质处理筛选体系，该筛选体系中包括膜定位TNF(memTNF)；(2)观测该体系中所述膜定位TNF的表达或活性的变化；若所述候选物质促进膜定位TNF的表达或活性，则表明该候选物质是抑制肿瘤的物质(包括潜在物质)。

在一个优选例中，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、离体组织体系；较佳地，所述的体系为细胞体系。

在另一优选例中，所述的体系还可以为动物体系。

在另一优选例中，所述的组织为离体培养的组织或器官。

在另一优选例中，所述的“提高”为统计学上的提高或显著性提高，如提高20％以上，较佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：来自化合物库或基因库的小分子化合物、基因或蛋白；或针对JNK-cJun，TNF-TNFR1(优选地为膜定位TNF)或RIP1-RIP3-MLKL信号通路、基因或蛋白或它们的上游或下游分子设计的小分子化合物、激动剂、上调剂、促进剂、基因编辑试剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)。

在另一优选例中，所述方法包括设置试验组和对照组，所述试验组以微管靶向药物和候选物质处理筛选体系，所述对照组以微管靶向药物处理筛选体系。

在另一优选例中，所述方法包括设置试验组和对照组，所述试验组是以候选物质处理的筛选体系，所述对照组则不加入候选物质。

在另一优选例中，所述的微管靶向药物包括微管解聚类药物或微管稳定类药物；较佳地，所述的微管靶向药物包括选自下组的药物：噻氨酯达唑(NCZ)，长春新碱(VCR)，紫杉醇(PTX)，多西他赛(DTX)，长春氟宁(Vinflunine)，长春氟宁酒石酸盐(VinflunineTartrate)，普那布林(Plinabulin)，单甲基澳瑞他汀D(MMAD)，单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E)，D-64131，Lexibulin，长春地辛(Vindesine)，Diazonamide，Fosbretabulin disodium，ABT-751，秋水仙碱(Clochicine)，甲苯达唑(Mebendazole)，卡巴他塞(Cabazitaxel)，长春瑞滨(Vinorelbine)，阿苯达唑(Albendazole)，埃博霉素A(Epothilone A)，2-甲氧雌二醇(2-Methoxyestradiol)，灰黄霉素(Griseofulvin)，帕苯达唑(Parbendazole)，埃博霉素B(Epothilone B)。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括：纤维肉瘤，乳腺癌，宫颈癌，肺癌，结肠癌，胰腺癌，前列腺癌，直肠癌，胃癌，肝癌。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的观测该体系中所述信号通路、基因或蛋白的表达或活性的变化包括：观测微管靶向药物通过JNK-cJun通路激发膜定位TNF转录的情况，若是这种促进微管靶向药物通过JNK-cJun通路激发膜定位TNF转录，则则表明该候选物质是促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的物质(包括潜在物质)。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药物组合物，所述药物组合物中包括：微管靶向药物以及Smac类似物。

在另一优选例中，所述的Smac类似物不包括LCL161；或所述的微管靶向药物为紫杉醇或其类似物以外的其它微管靶向药物；或，所述的Samc类似物不包括LCL161且所述的微管靶向药物为紫杉醇或其类似物以外的其它微管靶向药物。

在另一优选例中，所述的Smac类似物包括选自下组的药物：GDC-0917，GDC-0152。

在另一优选例中，所述的微管靶向药物以及Smac类似物是有效量的；较佳地，根据不同细胞系而定最佳使用浓度配比。

在另一优选例中，所述的微管靶向药物与Smac类似物按照质量比为1:(0.0001～10000)；更佳地为1:(0.05～10)；例如为1:0.001，1:0.01，1:0.1，0.5:1，1:1，1:1.25，1:2，1:5，1:10，1:100，1:1000。

在本发明的另一方面，提供前述任一所述的药物组合物的用途，用于制备抑制肿瘤的药盒。

在一个优选例中，所述的药物组合物中，所述的微管靶向药物通过调控JNK-cJun，膜定位TNF-TNFR1或RIP1-RIP3-MLKL信号通路，从而抑制肿瘤。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药盒，所述药盒包括：前面任一所述的药物组合物。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肿瘤的药盒，所述药盒包括：微管靶向药物和Smac类似物；两者分置于独立的容器或包装中。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、微管靶向药物(MTA)在L929纤维肉瘤细胞中通过激活TNFR1引起依赖于RIP1-RIP3-MLKL介导的细胞坏死。

a，用微管解聚类药物(噻氨酯达唑nocodazole，NCZ；长春新碱vincristine，VCR)以及微管稳定类药物(紫杉醇paclitaxel，PTX；多西他赛/多烯紫杉醇docetaxel，DTX)处理L929细胞，同时加入10μM Nec-1。用CellTiter-Glo试剂盒进行基于ATP水平的细胞存活率分析(数据来自2个复孔，结果以平均值±标准平均误差的形式表示)。

b，用如图所示的MTA处理L929细胞40小时，同时加入10μM Nec-1。根据ATP水平计算细胞死亡指数。

c，用500nM NCZ处理后的L929细胞的代表性图像。通过SYTOX Green来指示细胞膜的完整性。比例尺代表400μm。

d，L929细胞经500nM NCZ处理18小时，1mM PTX处理24小时以及1μg/ml TNF处理6小时后进行Triton X-114分相分离实验。通过免疫印迹法对水相(Aq)及脂相(Det)中磷酸化MLKL及总MLKL进行检测。

e，NCZ及PTX在Rip3基因敲除的L929的回补细胞系中引起的细胞死亡。通过免疫印迹法检测RIP3的回补表达。细胞在进行如图所示的处理后通过ATP水平进行存活率分析。

f，NCZ及PTX在Tnfr1基因敲除的L929的回补细胞系中引起的细胞死亡。通过免疫印迹法检测TNFR1的回补表达。细胞在进行如图所示的处理后通过ATP水平进行存活率分析。

g-h，VCR的体内抗肿瘤活性。对荷有L929纤维肉瘤的荷瘤鼠进行VCR给药处理，同时用Nec-1s进行干预，肿瘤生长曲线及图片如图所示。PBS组n＝5；VCR组n＝7；VCR+Nec-1s组n＝5。比例尺代表1cm。结果以平均值±标准平均误差的形式表示。n.s.，差异不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

i-k，用慢病毒对Rip3基因敲除的L929细胞进行回补，通过RT-PCR(i)及免疫印记法(j)检测回补表达，通过ATP水平衡量TNF(k)处理12小时后细胞的存活率。

l-n，用慢病毒对Tnfr1基因敲除的L929细胞进行回补，通过RT-PCR(l)及免疫印记法(m)检测回补表达，通过ATP水平衡量TNF(n)处理12小时后细胞的存活率。

o，p，用500nM NCZ处理L929细胞，同时加入Nec-1，处理时间如图所示。通过ATP水平衡量细胞存活率(a)，通过测量485/520nm的SYTOX Green荧光强度来分析细胞膜的渗透性(b)。

q-t，MTA引起的细胞死亡被RIP1缺失所阻断。用慢病毒对Rip1基因敲除的L929细胞进行回补，通过RT-PCR(c)及免疫印记法(d)检测回补表达，通过ATP水平衡量TNF(e)及MTA(f)处理后细胞的存活率。

u，细胞周期阻滞药物对L929细胞死亡的影响。用如图所示的细胞周期阻滞药物处理L929细胞40小时，同时进行Nec-1干预。根据ATP水平计算细胞死亡指数。

图2、MTA在L929纤维肉瘤细胞中引起的坏死依赖于MLKL。

a，L929细胞经如图所示的处理后用Triton X-100裂解液进行裂解，分别收集Triton X-100可溶性组分(S)和Triton X-100不溶性组分(P)。通过免疫印迹法对S及P中磷酸化MLKL及总MLKL进行检测。

b，c，NCZ处理后的L929细胞中磷酸化MLKL的免疫印迹分析。细胞经500nM NCZ处理相应的时间(b)或用相应的浓度处理24小时(c)后，制备全细胞裂解液，用磷酸化MLKL抗体进行免疫印迹检测。

d，VCR，PTX及DTX处理的L929细胞的免疫印迹分析。细胞如图所示处理24小时后制备全细胞裂解液并进行免疫印迹分析。

e-h，用慢病毒对Mlkl基因敲除的L929细胞进行回补，通过RT-PCR(e)及免疫印记法(f)检测回补表达，通过ATP水平衡量TNF(g)及MTA(h)处理后细胞的存活率。

图3、MTA在L929细胞中引起的坏死是由膜定位TNF介导的。

a，L929细胞及Tnf基因敲除的L929细胞分别进行如图所示处理16小时；通过ATP水平衡量细胞存活率。D代表DMSO；NCZ用量500nM；PTX用量1μM，Nec-1用量10μM。

b，用PBS或15μg/ml TNF抗体对L929细胞进行2个小时预处理，再用500nM NCZ或1μM PTX处理相应的时间。通过ATP水平衡量细胞存活率。

c、L929条件培养基(CM)饲养。L929细胞用500nM NCZ处理相应的时间，Raw264.7细胞用100ng/ml LPS处理3小时，收集条件培养基并以换液的方式加到新鲜的L929细胞中。12小时后，通过ATP水平来衡量细胞存活率。

d、用Raw264.7条件培养基饲养L929细胞。左图，用经100ng/ml LPS激活的Raw264.7条件培养基饲养新鲜的L929细胞，同时用10μM Nec-1或10ug/mlα-TNF进行干预。右图，用经100ng/ml LPS和10μM TACE抑制剂处理的Raw264.7条件培养基饲养新鲜的L929细胞。换液操作9小时后，通过ATP水平来衡量细胞存活率。

e，L929细胞经10μM TACE抑制剂预处理2小时后再用NCZ或PTX处理28小时。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

f，NCZ处理后TNF在细胞膜组分积累。离心分离细胞膜组分的方法如最左图所示。中间三图，L929细胞，TNFR1基因敲除的L929细胞及TNF基因敲除的L929细胞用500nM NCZ处理相应的时间后，分离P100组分，通过免疫印迹的方法检测TNF；用integrin beta-1作为细胞膜组分的内参。最右图，L929细胞用1μMPTX处理24小时后，分离P100组分，通过免疫印迹的方法检测TNF。

g，TNF基因敲除的L929细胞和TNFR1基因敲除的L929细胞共培养的代表性图片。稳定表达EGFP的TNFR1基因敲除的L929细胞和TNF基因敲除的L929细胞以5:1的比例铺于96孔板，经500nM NCZ处理24小时后，用PI染色10分钟。使用Operetta仪器(PerkinElmer公司)进行成像。比例尺代表100μm。

h，用TNF抗体对共培养系统(Tnf基因敲除的L929细胞和Tnfr1基因敲除的L929细胞共培养)进行干预后，用IncuCyte对SYTOX Green阳性的死细胞进行统计分析。细胞如图所示铺于96孔板中，用PBS或15μg/ml TNF抗体预处理2小时后再用NCZ处理24小时。细胞经SYTOX Green染色后用IncuCyte成像，对每孔中SYTOX Green阳性细胞数进行分析及计算。

图4、MTA通过JNK-cJun通路激发memTNF转录。

a，用500nM NCZ或1μM PTX处理L929细胞28个小时，同时加入50μM转录抑制剂Actinomycin D(ActD)。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

b，用500nM NCZ或1μM PTX处理L929细胞，时间如图所示。通过实时定量PCR分析Tnf mRNA水平。

c，NCZ和PTX处理后L929细胞中Tnf和Jun基因表达水平。

d，L929经NCZ及PTX处理后转录因子变化的聚类分析。

e，L929细胞转染4条Rela或Relb的siRNA oligo，48小时后，再用500nMNCZ或1μMPTX处理28小时。通过ATP水平来衡量细胞存活率；通过免疫印迹法检测Rela及Relb的敲减效率。

f，500nM NCZ或1μM PTX处理L929细胞及Jun基因敲除的L929细胞，16小时后用RT-PCR分析Tnf mRNA水平。Jun基因敲除的L929细胞在回补cJun后加药刺激28小时，具体处理如图所示。通过免疫印迹的方法检测cJun的回补表达；通过ATP水平来衡量细胞存活率。

g，用500nM NCZ处理L929细胞及Jun基因敲除的L929细胞16小时，分离P100组分并通过免疫印迹的方法检测TNF。用integrin beta-1作为细胞膜组分的内参。同时收集S100组分，检测cJun的表达。

h，L929细胞用如图所示的抑制剂预处理2小时后，再用500nM NCZ处理24小时。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

i，用500nM NCZ处理L929细胞，时间如图所示，制备全细胞裂解液并用免疫印迹法检测JNK-cJun通路相关蛋白的表达。

j，L929细胞用20μM JNK抑制剂(SP600125)预处理2小时后，再用500nMNCZ处理16小时。分离P100组分并通过免疫印迹的方法检测TNF。用integrinbeta-1作为细胞膜组分的内参。

图5、MTA联合SM(LCL161)可以在人上皮细胞来源的肿瘤细胞系及乳腺癌病人来源的移植瘤中引起大面积依赖于膜定位TNF的凋亡。

a，HeLa细胞用20μg/ml的恩利(E)预处理2小时，再用500nM NCZ或1uMPTX联合100nM SM(LCL161)及20μM z-VAD(Z)处理。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

b，HeLa细胞如图所示处理24小时(NCZ 500nM，VCR 500nM，PTX 1μM，DTX 500nM，SM(LCL161)100nM，TNF/T 20ng/ml)，制备全细胞裂解液，用免疫印迹法检测PARP，caspase-8以及cleaved caspase-3。

c，17种人上皮细胞来源的肿瘤细胞系对于500nM NCZ或1uM PTX联合100nM SM(LCL161)的响应。细胞如图所示处理24小时。根据ATP水平计算细胞死亡指数。

d，HER2-乳腺癌细胞系(SUM149，MDA-MB-468，MCF7以及BT549)对于PTX联合100nMSM(LCL161)的响应，PTX浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

e，三阴性乳腺癌移植瘤(PDX 1)PTX联合SM(LCL161)给药示意图。

f，在裸鼠上建立三阴性乳腺癌移植瘤(PDX 1)，以20mg/kg PTX和25mg/kgSM(LCL161)的剂量单一或联合给药10天。肿瘤生长曲线，荷瘤鼠，肿瘤及肿瘤重量如图所示。比例尺代表2cm。Vehicle，PTX以及SM(LCL161)单一给药组，n＝5；PTX联合SM(LCL61)给药组，n＝6。

g，三阴性乳腺癌移植瘤(PDX 1)石蜡切片苏木精-伊红染色和cleaved caspase-3免疫组化染色。比例尺代表200μm。

h，Annexin V-PE和7-AAD染色的流式分析。收取给药3天后的小鼠，将新鲜分离的肿瘤组织消化成单细胞，用Annexin V-PE和7-AAD进行染色。每组n＝4。

i，j，肿瘤细胞的memTNF。收取给药3天或7天后的小鼠，将新鲜分离的肿瘤组织消化成单细胞，用PE偶联的抗人源TNF的抗体及PE-Cy7偶联的抗鼠源CD45抗体进行染色。对CD45阴性的活的单个肿瘤细胞设门，分析其表面TNF表达情况。直方图和PE的中位荧光强度如图所示。每组n＝5-6。

k，体内TNF中和实验。三阴性乳腺癌移植瘤(PDX 1)的建立和给药操作与f一致。恩利以20mg/kg的剂量通过腹腔注射的方式给药，第一次给药在PTX/SM(LCL161)联合给药前2小时进行，洗后每3天一次。肿瘤生长曲线，荷瘤鼠，肿瘤及肿瘤重量如图所示。比例尺代表2cm。每组n＝8。

l，PTX联合SM(LCL61)用药对于C57BL/6小鼠的毒性。C57BL/6小鼠通过腹腔注射的方式进行PTX联合SM(LCL161)给药，每两天一次，共历时一个月。在实验终点时记录小鼠的体重和体温，并收取血样进行AST和ALT的分析评估。每组n＝6。

图6、MTA联合SM(LCL161)可以在大量细胞系中引起凋亡。

a，HeLa细胞用MTA(NCZ 500nM，VCR 500nM，PTX 1μM，DTX 500nM)联合100nM SM(LCL161)及20μM Z进行处理。通过ATP水平衡量细胞存活率。

b，MTA联合SM(LCL161)在TNFR1基因敲除的HeLa细胞中引起的细胞凋亡。通过RT-PCR及免疫印迹法检测TNFR1的回补表达。用500nM NCZ或1uM PTX联合100nM SM(LCL161)及20μM Z处理20小时后通过ATP衡量细胞存活率。

c，HeLa细胞转染4条TNF siRNA oligo，48小时后，再用500nM NCZ或1μMPTX联合100nM SM(LCL161)处理24小时。通过ATP水平来衡量细胞存活率；通过免疫印迹法检测TNF的敲减效率。

d，HER2-乳腺癌细胞系(SUM149，MDA-MB-468，MCF7以及BT549)对于NCZ联合100nMSM(LCL161)的响应，NCZ浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

e，f，HeLa细胞(宫颈癌细胞系)，CRL5800细胞(非小细胞肺癌细胞系)，HCT116细胞(结肠癌细胞系)，ZR-75-1细胞系(乳腺癌细胞系，Luminal B亚型)对于PTX(e)或NCZ(f)联合100nM SM(LCL161)的响应，PTX及NCZ浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

图7、MTA联合SM(LCL161)引起乳腺癌病人来源的移植瘤消退。

PTX联合SM(LCL161)可以消除乳腺癌病人来源的移植瘤PDX 5(a)，PDX17(b)，PDX8(e)以及PDX 18(g)。肿瘤生长曲线，荷瘤鼠，肿瘤及肿瘤重量如图所示。比例尺代表2cm。对于PDX 5，每组n＝6；对于PDX 17，Vehicle，PTX单一给药及PTX联合SM(LCL161)给药组，n＝7，SM(LCL161)单一给药组n＝6；对于PDX 8，每组n＝8；对于PDX 18，Vehicle组n＝8，PTX和SM(LCL161)单一给药组及PTX联合SM(LCL161)给药组，n＝9。

PDX 5(b)，PDX 17(d)，PDX 8(f)以及PDX 18(h)石蜡切片苏木精-伊红染色和cleaved caspase-3免疫组化染色。比例尺代表200μm。

图8、多种MTA可以通过联合使用SM(LCL161)促进多种肿瘤细胞凋亡。

a，MDA-MB-468细胞，BT549细胞，MCF7细胞(以上三个均为乳腺癌细胞系)，HeLa细胞(宫颈癌细胞系)对于多西他赛(docetaxel，DTX)联合100nM SM(LCL161)的响应，DTX浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

b，MDA-MB-468细胞，BT549细胞(以上两个均为乳腺癌细胞系)，CRL5800细胞(非小细胞肺癌细胞系)，HCT116细胞(结肠癌细胞系)对于长春花碱(vinblastine，VB)联合100nMSM(LCL161)的响应，VB浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

c，MDA-MB-468细胞，BT549细胞，MCF7细胞(以上三个均为乳腺癌细胞系)，HeLa细胞(宫颈癌细胞系)，CRL5800细胞(非小细胞肺癌细胞系)，HCT116细胞(结肠癌细胞系)对于长春瑞滨(vinorelbine，VN)联合100nM SM(LCL161)的响应，VN浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

d，MDA-MB-468细胞，BT549细胞(以上两个均为乳腺癌细胞系)，HCT116细胞(结肠癌细胞系)对于长春氟宁(vinflunine，VF)联合100nM SM(LCL161)的响应，VF浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

e-f，MCF7细胞(乳腺癌细胞系)，HeLa细胞(宫颈癌细胞系)，HCT116(结肠癌细胞系)对于Lexibulin(LEX，e)或埃博霉素B(Epothilone B，EpB，f)联合100nM SM(LCL161)的响应，LEX及EpB浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

g-h，HCT116细胞(结肠癌细胞系)对于长春地辛(vindesine，VD，g)或卡巴他塞(cabazitaxel，CA，h)联合100nM SM(LCL161)的响应，VD及CA浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

图9、联合GDC-0917(SM类药物)可以大幅加剧多种MTA引起的肿瘤细胞凋亡。

a-c，MDA-MB-468细胞，BT549细胞，MCF7细胞(以上三个均为乳腺癌细胞系)，HeLa细胞(宫颈癌细胞系)，CRL5800细胞(非小细胞肺癌细胞系)，HCT116细胞(结肠癌细胞系)对于NCZ(a)，PTX(b)或长春瑞滨(vinorelbine，VN，c)联合100nM GDC-0917的响应，NCZ，PTX以及VN浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

d，MDA-MB-468细胞，BT549细胞(以上两个均为乳腺癌细胞系)，CRL5800细胞(非小细胞肺癌细胞系)，HCT116细胞(结肠癌细胞系)对于长春花碱(vinblastine，VB)联合100nMGDC-0917的响应，VB浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

e，MCF7细胞(乳腺癌细胞系)及HeLa细胞(宫颈癌细胞系)对于多西他赛(docetaxel，DTX)联合100nM GDC-0917的响应，DTX浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

f，HCT116细胞(结肠癌细胞系)对于多种MTAs(Lexibulin，LEX；埃博霉素B，Epothilone B，EpB；长春地辛，vindesine，VD，以及卡巴他塞cabazitaxel，CA)联合100nMSM GDC-0917的响应，LEX，EpB，VD以及CA浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

图10、联合GDC-0152(SM类药物)可以大幅加剧多种MTA引起的肿瘤细胞凋亡。

a-b，MDA-MB-468细胞，BT549细胞，MCF7细胞(以上三个均为乳腺癌细胞系)，HeLa细胞(宫颈癌细胞系)，CRL5800细胞(非小细胞肺癌细胞系)，HCT116细胞(结肠癌细胞系)对于NCZ(a)或PTX(b)联合100nM GDC-0152的响应，NCZ及PTX浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

c-d，MDA-MB-468细胞，BT549细胞(以上两个均为乳腺癌细胞系)，HCT116细胞(结肠癌细胞系)对于多西他赛(docetaxel，DTX，c)或长春氟宁(vinflunine，VF，d)联合100nMSM GDC-0152的响应，DTX以及VF浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

e-f，MCF7细胞(乳腺癌细胞系)及HeLa细胞(宫颈癌细胞系)对于Lexibulin(LEX，e)或者埃博霉素B(Epothilone B，EpB，f)联合100nM SMGDC-0152的响应，LEX以及EpB浓度如图所示。通过ATP水平来衡量细胞存活率。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次提出了微管靶向类抗肿瘤药物(MTA)在引发肿瘤细胞凋亡过程中的分子机制，其通过JNK-cJun通路激发膜定位TNF(memTNF)转录，memTNF进一步激活TNFR1，起始细胞的坏死，且该过程还依赖于RIP1-RIP3-MLKL信号途径。因此，JNK-cJun，memTNFR1，RIP1-RIP3-MLKL信号途径与MTA引发的肿瘤细胞凋亡密切相关，可以作为研究靶点，开发促进MTA药物功效的药物。

如本文所用，所述的微管靶向药物是以微管蛋白为靶标的一类药物的总和，包括微管解聚类药物或微管稳定类药物。更具体地，所述的微管靶向药物包括：噻氨酯达唑，长春新碱，紫杉醇，多西他赛，长春氟宁，长春氟宁酒石酸盐，普那布林，单甲基澳瑞他汀D，单甲基澳瑞他汀E，D-64131，Lexibulin，长春地辛，Diazonamide，Fosbretabulin disodium，ABT-751，秋水仙碱，甲苯达唑，卡巴他塞，长春瑞滨，阿苯达唑，埃博霉素A，2-甲氧雌二醇，灰黄霉素，帕苯达唑，埃博霉素B。

如本文所用，所述的Smac类似物简称为SM，其具有降解IAP(inhibitor ofapoptosis protein，凋亡抑制蛋白)的作用。更具体地，所述的Smac类似物包括：LCL161，GDC-0917，GDC-0152。

如本文所用，所述的“肿瘤”包括实体瘤和非实体瘤，所述的“肿瘤”可以是原位肿瘤或转移肿瘤，其也包括存在耐药性的难治性肿瘤。较佳地，所述的肿瘤是实体瘤。例如，所述的“肿瘤”包括：前列腺癌，乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌等。更具体地，所述的肿瘤包括：纤维肉瘤，乳腺癌，宫颈癌，肺癌，结肠癌，胰腺癌，前列腺癌，直肠癌，胃癌，鼻咽癌、食管癌、肝癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、或小儿肿瘤。

药物筛选

在得知了MTA在引发肿瘤细胞凋亡过程中的分子机制之后，可以基于该特征来筛选通过在该分子机制中起作用，从而促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的物质，从中找到对于抑制肿瘤或协同MTA抑制肿瘤真正有用的药物。

因此，本发明提供一种筛选抑制肿瘤的潜在物质的方法，所述的方法包括：(1)以微管靶向药物和候选物质处理筛选体系，该筛选体系中包括选自下组的信号通路、基因或蛋白：JNK-cJun，memTNF-TNFR1，RIP1-RIP3-MLKL；(2)观测该体系中所述信号通路、基因或蛋白的表达或活性的变化；若所述候选物质促进微管靶向药物对于JNK-cJun，memTNF-TNFR1或RIP1-RIP3-MLKL信号通路的激发作用，进而提高信号通路、基因或蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的物质。所述的物质也包括潜在物质。

在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到所述信号通路、基因或蛋白的表达或活性的变化的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的体系。

对于候选物质没有特别的限制，可以是感兴趣的、广泛的物质。例如，但不限于：来自化合物库或基因库的小分子化合物、基因或蛋白；或针对JNK-cJun，memTNF-TNFR1或RIP1-RIP3-MLKL信号通路、基因或蛋白或它们的上游或下游分子设计的小分子化合物、激动剂、上调剂、促进剂、基因编辑试剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)。在得知了本发明所设计的信号通路信息后，本领域技术人员可以作出多种多样的设计，这些均包含在本发明中。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肿瘤或协同MTA抑制肿瘤真正有用的物质。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的抑制肿瘤的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制肿瘤或协同MTA抑制肿瘤真正有用的药物。

药物组合及其应用

本发明人意外地发现，MTA以及Smac类似物(SM)联合用药能够极其显著地发挥肿瘤抑制效果，两者的联合应用与单独应用相比，所发挥的肿瘤抑制效果呈现十倍、甚至百倍的增加。

基于本发明人的新发现，本发明提供了用于抑制肿瘤的药物组合或组合物，所述药物组合或组合物中包括：MTA以及SM。

所述的MTA以及SM可以被制成药物组合物的方式给药，或者两者可以分离地存在于一个药盒中。其中所述的MTA以及SM均为有效量的。在用作药物时，通常所述的MTA以及SM还与药学上可接受的载体相混合。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。

本发明的具体实施例中，给出了一些针对动物如鼠的给药方案。从动物如鼠的给药剂量换算为适用于人类的给药剂量是本领域技术人员易于作出的，例如可根据Meeh-Rubner公式来进行计算：Meeh-Rubner公式：A＝k×(W2/3)/10,000。

式中A为体表面积，以m2计算；W为体重，以g计算；K为常数，随动物种类而不同，一般而言，小鼠和大鼠9.1，豚鼠9.8，兔10.1，猫9.9，狗11.2，猴11.8，人10.6。应理解，根据药物以及临床情形的不同，根据有经验的药师的评估，给药剂量的换算是可以变化的。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明提供了一种用于抑制肿瘤的药盒，所述的药盒中包括所述的MTA以及SM。更优选地，所述药盒中还包括：使用说明书，以指导临床医师以正确合理的方式用药。

为了方便给药，所述的包含MTA以及SM的组合物或彼此独立存在的MTA以及SM可以被制成单元剂型的形式，置于试剂盒中。“单元剂型”是指为了服用方便，将药物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

肿瘤细胞最明显的特征是它们和相邻细胞的接触抑制消失，导致细胞生长和侵袭不受控制，尤其是在恶性实体瘤中。本发明人的研究表明，MTA可以利用肿瘤细胞这种过度拥挤的特点从而引起临近细胞到细胞之间的杀伤，这样建立起来的“滚雪球效应”最终导致肿瘤退化萎缩。正是由于这种效应，所需药物剂量的阈值会远远低于直接杀伤细胞所需的药物剂量，比如MTA。固有免疫系统在响应病原体入侵后会上调TNF以及其他的细胞因子和趋化因子。值得注意的是，这种免疫反应只有在强度和效应时间都受到严格负调控的时候才是安全的。利用不表达分泌型TNF只表达memTNF的基因工程小鼠进行的研究表明，memTNF在体内引起的促炎反应和自身免疫病效果均次于分泌型TNF。因此，memTNF确保了其作用范围有严格的空间限制，不会引起有害的全身性反应。

SM单一治疗的局限性在于其只能在那些自身肿瘤细胞可以产生大量能够引起细胞死亡的蛋白(如炎症因子等)的病人身上起作用。MTA和SM联用的治疗方案，可以限制重组细胞因子治疗或MTA/SM单一高剂量治疗引起的毒性，通过产生适量memTNF来促进肿瘤细胞发生程序性死亡，因此是较为安全和有效的。癌症具有复杂且异质的特点，常伴随着多种信号通路的失调，单一用药往往很难治愈。然而，基于本发明人所提供的实验证据，MTA和SM联合用药可以在很大程度上提高MTA单一用药的敏感性和响应程度，有望为许多患者带来治愈的可能性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

1、药物及抗体

诺考达唑(nocodazole，NCZ)，紫杉醇(paclitaxel，PTX)，BB-94，BB-2516以及SP600125购自Selleck公司；SMAC模拟物(SM，LCL161)，JNK-IN-8以及CC-930购自MCE公司；Nec-1及放线菌素D(Actinomycin D，ActD)购自Sigma公司；Nec-1s购自BioVision公司；除非有特殊说明，其他化合物均来自国家化合物资源中心。

重组TNF通过常规方法重组表达；恩利购自辉瑞公司。

WB抗体：anti-mMLKL购自Biorbyt公司；anti-phospho-MLKL(phosphor S345)购自Abcam公司；anti-RIP1，anti-COX IV，anti-cJun，anti-phospho-cJun(Ser73)，anti-JNK，anti-phospho-JNK(Thr183/Tyr185)，anti-RelB，anti-PARP，anti-capsase8，anti-cleavecaspase 3(Asp175)以及anti-human TNFR1购自Cell Signaling Technology；anti-RIP3购自Prosci Inc；anti-mouse TNF及anti-mouse TNFR1购自R&D System；anti-RelA购自Santa Cruz；anti-actin及anti-Flag-HRP购自Sigma-Aldrich.

免疫组化抗体：anti-cleaved caspase 3(Asp175)购自Cell SignalingTechnology.

TNF中和实验抗体：anti-mouse TNF购自R&D System。

流式抗体：PE Annexin V凋亡检测试剂盒，PE conjugated anti-human TNF(MAb11)以及PE-Cy7conjugated anti-mouse CD45(30-F11)购自BD Pharmingen.

2、质粒

重组表达载体pHAGE-EGFP，pHAGE-Flag-mRIP1，pHAGE-Flag-mRIP3，pHAGE-mMLKL，pHAGE-Flag-mTNFR1，pHAGE-Flag-TNF以及pHAGE-3xFlag-HA-hTNFR1等均按照标准分子克隆方法得到。pHAGE-Flag-mRIP1(K45A)，pHAGE-Flag-mRIP3(K51A)以及pHAGE-Flag-mRIP3(S232A)等点突变均由PCR的方法得到。

sgRNA合成后退火，再连入pX330-mCherry质粒。

3、细胞培养

L929，HeLa，Hs578T，MDA-MB-468，MCF7，CRL5800，HTB177，BxPC-3，PANC-1，22Rv1，HCT116，AGS以及PLC-PRF-5细胞均培养于DMEM培养基中，添加10％胎牛血清和100units/ml的青霉素/链霉素；BT549，ZR-75-1，NCI-H358以及HCC827细胞培养于RPMI-1640培养基中，添加10％胎牛血清和100units/ml的青霉素/链霉素；SUM149细胞培养于Ham’s F-12培养基中，添加5％胎牛血清，5μg/ml胰岛素，1μg/ml氢化可的松以及4μg/ml庆大霉素。所有细胞均培养于37℃和5％CO₂中。

4、CRISPR/Cas9介导的基因敲除

L929细胞用PolyJet转染试剂(SignaGen Laboratories)进行转染，共转两个表达mouse Rip1/Rip3/Mlkl/Tnfr1/Tnf/Jun sgRNA的pX330-mCherry质粒。HeLa细胞用Lipofectamine 2000转染试剂进行转染，共转两个表达human TNFR1sgRNA的pX330-mCherry质粒。转染24小时之后，将细胞用胰酶消化下来并重悬于DMEM中，通过流式细胞仪(BD FACS Aril)将mCherry阳性的活细胞分选出来，以每盘10cm dish铺200颗细胞的密度进行培养，隔天换液。大约7至10天后，挑取细胞单克隆，扩增后用qPCR及western的方法检测敲除效率，筛选得到对于的基因敲除细胞系。

实验所用sgRNA组合如下：

mouse Rip3：gagggttcggagtcgtgttc(SEQ ID NO:1)，accctccctgaaacgtggac(SEQID NO:2)；

mouse Mlkl：gcacacggtttcctagacgc(SEQ ID NO:3)，cgctaatttgcaactgcatc(SEQID NO:4)；

mouse Tnfr1：tgtcacggtgccgttgaagc(SEQ ID NO:5)，gtgagtgactgtccgagccc(SEQ ID NO:6)；

mouse Tnf：agaaagcatgatccgcgacg(SEQ ID NO:7)，tcggggtgatcggtccccaa(SEQID NO:8)；

mouse Jun：ggtccgagttcttggcgcgg(SEQ ID NO:9)，gctgaccggctgtgccgcgg(SEQID NO:10)；

human TNFR1：atatacccctcaggggttat(SEQ ID NO:11)，gtggttttctgaagcggtga(SEQ ID NO:12)。

5、细胞存活检测方法

细胞存活率用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Kit(Promega)进行检测，用BioTek酶标仪记录luminescence。

6、SYTOX Green染色及细胞膜泄露分析

L929细胞铺于96-孔板中，用NCZ处理相应的时间后，在培养液中加入终浓度为100nM的SYTOX Green(Invitrogen)，37℃染色10min即可进行拍照分析等后续操作。

如果需要进行细胞膜泄露实验分析，染色完成后先使用485/520nm检测一次SYTOXGreen荧光强度，命名为诱导荧光强度；然后，用0.1％Triton X-100裂解细胞后再检测一次SYTOX Green荧光强度，命名为最大荧光强度。细胞膜泄露可按下述公式进行计算：(诱导荧光强度-背景)/(最大荧光强度-背景)×100％。

7、Triton X-114分相实验

处理完成后，收取细胞，用PBS洗两遍并重悬于Triton X-114裂解液中，冰上放置30min后，将样品于4℃以15,000g离心10min；将上清收集起来，于30℃加热3min，再于室温以1,500g离心5min，分别收集上层水相和下层油相，下层油相可以进一步用基础缓冲液洗一遍，然后调整至和上层水相一样的体积。

8、Triton X-100分离实验

处理完成后，收取细胞，用PBS洗两遍并重悬于Triton X-100裂解液中，冰上放置20min后，将样品于4℃以12,700rpm离心10min。分别收集上清液和沉淀，溶于Triton X-100的上清即为S组分，不溶的沉淀则为P组分。

9、TNF酶联免疫吸附测定(ELISA)

WT和Tnf KO L929细胞，以及Raw264.7细胞均培养于12孔板中，弃去旧的培养液，加入100μl新鲜培养液对细胞进行处理。WT和Tnf KO L929细胞用NCZ处理18h或者用PTX处理26h，Raw264.7细胞用LPS处理3h，随后收集培养上清，8，000rpm离心2min以去掉细胞碎片。按照试剂盒的标准步骤取50μl离心后的上清进行测定。

10、条件培养基饲养实验

Raw264.7，L929以及Tnf基因敲除的L929细胞均铺于6孔板中。Raw264.7细胞用LPS或LPS和TACE抑制剂共同处理3小时；L929以及Tnf基因敲除的L929细胞用NCZ处理如图所示的时间，处理完成后，收取培养液，并用0.22μm滤器进行过滤，即为条件培养基。作为靶细胞的新鲜的L929提前一天铺于96孔板中。当用Raw264.7条件培养基进行实验时，弃去旧的细胞培养液，每孔加入100μl Raw264.7条件培养基，与此同时再加入Nec-1或者anti-TNF抗体，共培养9h后通过检测ATP的方法检测细胞存活率；当用L929条件培养基进行实验时，弃去旧的细胞培养液，每孔加入100μl L929条件培养基，共培养12h后通过检测ATP的方法检测细胞存活率。

11、细胞膜组分(P100)分离实验

收集细胞，PBS洗两遍后重悬于含有蔗糖的缓冲液中(10mM Tris-HCl，pH7.4，250mM Sucrose，5mM MgCl₂)，冰上放置30min后，用超声进行破碎。将破好的细胞匀浆液于16,000g离心10min以除掉细胞核和细胞碎片，将上清收集起来，于4℃以100,000g离心1h。离心完成后，沉淀部分即为细胞膜组分(P100)，上清部分即为胞质组分(S100)。

12、TNF抗体中和实验

L929细胞铺于96孔板中，用anti-TNF抗体预处理2h，再用NCZ或者PTX进行处理。Anti-TNF抗体终浓度为15μg/ml。

13、L929-Tnf KO和L929-Tnfr1KO细胞共培养系统

Operetta成像实验：稳定表达EGFP的L929-Tnfr1KO细胞和L929-Tnf KO细胞以5:1的比例铺于96孔板中，NCZ处理24h，PI染色10min。用Operetta(PerkinElmer)拍照分析。对于EGFP通道，激发波长485nm，发射波长520nm；对于PI通道，激发波长520-550nm，发射波长560-630nm。

IncuCyte分析：L929-Tnfr1KO细胞和L929-Tnf KO细胞以如图所示的比例铺于96孔板中，NCZ处理24h，在NCZ处理的2h前用anti-TNF抗体进行干预，TNF抗体终浓度为15μg/ml。NCZ处理完成后，用终浓度100nM SYTOX Green染色。用450-490nm/500-530nm滤光片拍照后用IncuCyte FLR软件进行定量统计。

14、实时定量PCR(qRT-PCR)

总RNA由Trizol(Life technology)进行抽提，用M-MLV转录酶(Progema)进行反转录。用基因特异性引物进行定量PCR实验，目的基因的mRNA水平以该基因的GAPDH水平进行标准化处理。实验中所用引物如下(5’-3’)：

mouse Gapdh(正向，aggtcggtgtgaacggatttg(SEQ ID NO:13)；反向，ggggtcgttgatggcaaca(SEQ ID NO:14))；

mouse Rip1(正向，gaagacagacctagacagcgg(SEQ ID NO:15)；反向，ccagtagcttcaccactcgac(SEQ ID NO:16))；

mouse Rip3(正向，tgtcaagttatggcctactggtgcg(SEQ ID NO:17)；反向，aaccatagccttcacctcccaggat(SEQ ID NO:18))；

mouse Mlkl(正向，aattgtactctgggaaattgcca(SEQ ID NO:19)；反向，tctccaagattccgtccacag(SEQ ID NO:20))；

mouse Tnfr1(正向，ccgggagaagagggatagctt(SEQ ID NO:21)；反向，tcggacagtcactcaccaagt(SEQ ID NO:22))；

mouse Tnf(正向，caggcggtgcctatgtctc(SEQ ID NO:23)；反向，cgatcaccccgaagttcagtag(SEQ ID NO:24))；

mouse Jun(正向，ccttctacgacgatgccctc(SEQ ID NO:25)；反向，ggttcaaggtcatgctctgttt(SEQ ID NO:26))；

human GAPDH(正向，ccagaacatcatccctgcct(SEQ ID NO:27)；反向，cctgcttcaccaccttcttg(SEQ ID NO:28))；

human TNFR1(正向，aacgagtgtgtctcctgtagt(SEQ ID NO:29)；反向，ggagtagagcttggacttccac(SEQ ID NO:30))；

human TNF(正向，gaggccaagccctggtatg(SEQ ID NO:31)；反向，cgggccgattgatctcagc(SEQ ID NO:32))。

15、RNA测序及数据处理

L929细胞用NCZ和PTX处理相应的时间，用Trizol抽提总RNA，用AgilentBioanalyzer 2100进行检测和质控。合格的总RNA进一步用RNeasy micro kit(Cat#74004，QIAGEN，GmBH，Germany)和RNase-Free DNase Set(Cat#79254，QIAGEN，GmBH，Germany)进行纯化。cDNA文库用TruSeq Stranded mRNA kit(Illumina)进行构建。

经过预处理的reads通过Tophat(Version 2.1.1)映射回mm10基因组上，用cufflinks(version 2.1.1)对基因表达水平进行计算。

16、RNA干扰(RNAi)

细胞铺于96孔板或6孔板中，用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂进行siRNA转染。每个基因对应4条特异性的siRNA，序列如下：

mouse Rela(ggaguacccugaagcuaua(SEQ ID NO:33)，gaagaagaguccuuucaau(SEQID NO:34)，uaugagaccuucaagagua(SEQ ID NO:35)，gaauccagaccaacaauaa(SEQ ID NO:36))；

mouse Relb(uggaaaucaucgacgaaua(SEQ ID NO:37)，gcuacgguguggacaagaa(SEQID NO:38)，gaagauccagcugggaauu(SEQ ID NO:39)，gaagauccagcugggaauu(SEQ ID NO:40))；

human TNF(gcccgacuaucucgacuuu(SEQ ID NO:41)，gcguggagcugagagauaa(SEQID NO:42)，ugacaagccuguagcccau(SEQ ID NO:43)，ccagggaccucucucuaau(SEQ ID NO:44))。

17、体内肿瘤模型

6周龄的雌性裸鼠购自中科院上海斯莱克实验动物中心，饲养于上海生物化学与细胞生物学研究所标准的SPF动物房内。实验方案经中国科学院生化与细胞所实验动物管理委员会审批通过，所有操作均严格遵守动管会的各项规章制度。

18、动物模型

(1)L929纤维肉瘤模型

1x10⁶L929细胞通过皮下注射的方式接种到6周雌性裸鼠的背侧。肿瘤形成后每两天测一次大小，其体积计算公式为axb²x0.5(a代表最长边，b代表最短边)。当肿瘤体积达到300mm³左右时，将荷瘤鼠随机分为3组，分别进行Vehicle、5mg/kg长春新碱(VCR)以及5mg/kg VCR+5mg/kg Nec-1给药处理，给药方式为腹腔注射，每两天注射一次，共给药6天。研究终点时，对荷瘤鼠进行安乐死处理并分离取下肿瘤。

(2)病人来源的移植瘤模型(PDX)

已建立可稳定传代的乳腺癌病人来源的异源移植瘤模型。将新鲜分离的移植瘤消化得到单细胞，移植到6周龄雌性裸鼠第四对乳腺脂肪垫下。对于三阴性乳腺癌，当肿瘤大小达到200-300mm³(约为移植后4周)，将荷瘤鼠随机分为4组，分别进行Vehicle，20mg/kgPTX，25mg/kg SM以及PTX/SM联合用药处理，给药方式为腹腔注射，每两天注射一次，共给药10天。过程中每两天测量一次肿瘤大小以绘制生长曲线。研究终点时，对荷瘤鼠进行安乐死处理，拍照，分离肿瘤并记录其重量。将新鲜分离的肿瘤组织消化得到单细胞进行流式分析或者将肿瘤组织固定于4％多聚甲醛中进行后续组织及形态学分析。对于ER+PR+HER2-，ER+PR+HER2+以及ER-PR-HER2+的乳腺癌亚型，当肿瘤大小达到800mm³左右时开始进行分组及给药操作(同三阴性乳腺癌)。

在体内TNF中和实验中，恩利溶于0.9％生理盐水，通过腹腔注射的方式进行给药。第一次给药在PTX/SM给药前2个小时左右进行，此后每三天一次。

19、凋亡细胞及膜定位TNF的流式检测

将新鲜分离的肿瘤组织剪成小块，用胶原酶和透明质酸酶进行消化得到单细胞。对于凋亡检测，使用PE Annexin V凋亡检测试剂盒，按照标准程序进行染色；对于膜定位TNF检测分析，将细胞用PE mouse anti-human TNF antibody和PE-Cy7ratanti-mouseCD45antibody进行细胞表面染色。染色后的细胞，用BD Celesta或者BDLSRII SORP流式细胞仪进行检测，用FlowJo软件进行数据分析。

20、组织学及免疫组织化学染色分析

将新鲜分离的肿瘤组织于4％PFA中固定过夜，以标准程序进行脱水、透明及包埋等操作。将组织切成5mm的切片，脱蜡复水后，直接通过苏木精-伊红染色来进行组织学分析。对于免疫组织化学分析，切片经过脱蜡复水后先用3％H₂O₂进行处理，以消除内源性过氧化物酶的影响，随后用10mM pH6.0的柠檬酸缓冲液进行抗原修复，5％山羊血清封闭半小时后用anti-cleaved-caspase 3(CC3)抗体于4℃孵育过夜。第二天，洗掉一抗，用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h，DAB显色后用苏木精进行复染，脱水透明后封片。用OlympusBX53显微镜进行观察及拍照分析。

21、体内毒性实验

野生型C57BL/6小鼠通过腹腔注射的方式进行20mg/kg PTX和25mg/kg SM联用的给药处理，每两天注射一次，共给药一个月。实验终点时，测量并记录小鼠的体重和体温，同时进行眼眶从静脉取血，用血清进行天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)测定。

22、数据分析

用GraphPad Prism软件(GraphPad Software，Inc.)对数据进行处理和分析。显著性分析采用双侧Student’s t检验。NS代表不显著，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

实施例1、微管靶向药物(MTA)在纤维肉瘤细胞中引起细胞坏死的作用机制

纤维肉瘤细胞(L929)是一种对TNF很敏感的鼠源纤维肉瘤细胞系，在被重组TNF刺激后可以通过程序性细胞坏死(后文简称“细胞坏死”)的方式发生膜裂解性死亡。本发明人利用L929对TNF刺激的敏感性建立了稳定的细胞坏死实验系统，试图通过大规模化合物筛选来寻找坏死的抑制剂。出乎意料的是，本发明人偶然间发现微管靶向药物(MTA)——比如微管解聚类药物(噻氨酯达唑Nocodazole，NCZ；长春新碱Vincristine，VCR)以及微管稳定类药物(紫杉醇Paclitaxel，PTX)；多西他赛/多烯紫杉醇Docetaxel，DTX)，都可以直接诱导L929细胞发生坏死，这种效应呈现出浓度依赖性并且可以被坏死特异性抑制剂Nec-1阻断(图1a)。在Rip1基因敲除的L929细胞中回补激酶活性缺失的RIP1突变体(K45A)也可以完全阻断MTA诱导坏死的发生(图1q-t)。本发明人又试验了20余种MTA，发现它们都可以以相似的模式在L929细胞中引起依赖于RIP1的坏死(图1b)。

由于微管在分裂细胞的纺锤体中发挥着重要作用，通常认为MTA主要是通过引起分裂停滞来抗肿瘤的。因此，需要验证是不是所有引起细胞周期停滞的药物都同MTA一样引起细胞坏死。接下来本发明人试验了不同种类的细胞周期抑制剂，发现这两者之间并没有必然联系(图1u)。虽然从广义上MTA隶属于细胞周期抑制剂，然而实验数据表明各个微管靶向药物MTA均可以在L929细胞中引起细胞坏死。

在细胞水平上，坏死细胞典型的形态变化是细胞膜完整性的改变。本发明人通过SYTOX Green(一种非渗透性的核酸染料)信号的变化对坏死的进程进行监测，观察到在NCZ处理后24小时，绝大部分L929细胞细胞膜的完整性遭到破坏，这个过程可以被Nec-1阻断(图1c，o-p)。MLKL是细胞坏死的执行者，坏死细胞会呈现出MLKL磷酸化以及膜转运的特征。本发明人在MTA处理后的L929上检测到了MLKL的磷酸化以及膜转位，且这种特征呈药物处理时间及药物浓度依赖性(图1d，图2a-d)。Mlkl基因敲除可以完全阻断MTA引起的细胞坏死(图2e-h)。

下一步，本发明人探究磷酸化MLKL的激酶RIP3在这种坏死中的作用。在Rip3基因敲除的L929细胞中表达无激酶活性(K51A)和自磷酸化位点突变(S232A)的RIP3突变体都可以阻断微管靶向药物MTA引起的细胞坏死(图1e，图1i-k)。

TNF是目前发现的唯一一个可以在不使用zVAD阻断caspase活性的情况下引起坏死的细胞因子。从死亡信号起始方面考虑，本发明人推断MTA引起的RIP1介导的细胞坏死依赖于死亡受体的激活。为验证这一假设，本发明人用CRISPR-Cas9的方法构建了Tnfr1基因敲除的L929细胞系，发现Tnfr1敲除可以完全阻断微管靶向药物引起的坏死(图1f，图1l-n)。综上，实验数据表明MTA引起的细胞坏死始于TNFR1激活，且依赖于RIP1-RIP3-MLKL信号途径。

接来下，本发明人想检测在体内MTA是否同样可以引起RIP1介导的坏死。本发明人在裸鼠上建立了L929纤维肉瘤的肿瘤模型，发现与体外情况类似，VCR可以有效地引起肿瘤退化，并且可以被RIP1激酶抑制剂Nec-1s阻断，如图1g-h。

至此，MTA在体内和体外都可以引起L929细胞发生坏死。总的来说，这些结果揭示了MTA杀伤L929肿瘤细胞的作用机制，并且提供了一个很好的系统来研究MTA如何激活细胞毒性TNF信号途径。

实施例2、MTA在L929细胞中引起的坏死是由膜定位TNF介导的

本发明人构建了Tnf基因敲除的L929细胞系，发现MTA引起的细胞坏死被阻断掉(图3a)。这个数据与实施例1里面关于Tnfr1敲除的结果一致。

此外，通过用拮抗TNF的抗体中和，本发明人发现MTA引起的细胞坏死在很大程度上被抑制住了(图3b)。因此，确定MTA在L929上引起的细胞坏死是通过TNF起作用的。

用LPS和NCZ分别刺激Raw264.7细胞和L929细胞，然后分别取其培养上清(CM)去处理新鲜的L929细胞，在12小时之内检测细胞坏死。本发明人发现新鲜的L929细胞对激活后的Raw264.7培养上清非常敏感，可以发生膜裂解性坏死，然而其对NCZ处理后的L929培养上清没有反应，即使是NCZ预处理时间很长的培养上清也不能诱导新鲜的L929坏死(图3c-d)。

TNF被初始合成出来的时候是26kDa的跨膜蛋白(膜定位TNF，memTNF)，当金属蛋白酶TACE大量激活并定位在细胞膜上后可以被切割生成17kDa的可溶性蛋白(分泌型TNF，solTNF)。memTNF和solTNF都可以激活TNFR1，从而引起细胞死亡。本发明人用TACE抑制剂阻断solTNF的切割及从细胞膜上的释放，发现其并不会影响MTA引起的细胞坏死(图3e)；但是在Raw264.7激活过程中加入TACE抑制剂后，其培养上清引起的坏死可以被阻断。这些数据提出了一个难题，MTA引起的细胞坏死依赖于TNF信号，但是培养上清里的TNF并不足以引起坏死。因此，本发明人推断，膜定位TNF(memTNF)参与了MTA引起的坏死。

用生物化学的方法对MTA处理过的L929细胞进行分级离心分离进一步支撑了本发明人的假设。NCZ处理后的L929细胞，memTNF会随着时间的推移在P100部分积累，而P100恰巧是细胞膜的组分。WT和Tnfr1基因敲除的L929呈现出相同模式的memTNF积累，而Tnf基因敲除后的L929细胞则没有这种效应(图3f)。此外，PTX处理的L929细胞也有memTNF积累的现象(图3f最右图)。

为了进一步验证memTNF的作用，本发明人构建了一种共培养系统：把Tnfr1基因敲除的L929细胞作为效应细胞，在其中稳定表达EGFP以便于在视觉上与其他细胞区分开；把Tnf基因敲除的L929细胞作为靶细胞。Tnfr1基因敲除后L929细胞不会再响应TNF的刺激，Tnf基因敲除的细胞不会再有TNF的表达，但在外源TNF的刺激下仍会发生细胞坏死，这两种细胞各自都不会在MTA刺激后发生坏死。当把这两种细胞近距离进行共培养的时候，用NCZ进行处理后，Tnfr1基因敲除的L929细胞仍然活着；然而作为靶细胞，Tnf基因敲除的L929则呈现出效应细胞依赖性的细胞死亡(图3g)。这种近距离信号引起的细胞死亡可以被拮抗TNF的抗体阻断(图3h)。这种共培养系统完全排除了solTNF的参与，进一步支撑了本发明人关于memTNF引起L929细胞坏死的论点。

实施例3、MTA通过JNK-cJun通路激发memTNF转录

为了进一步探究MTA调节memTNF的机制，首先，本发明人检测在MTA处理之后，TNF的表达是否有转录水平的激活。本发明人发现转录抑制剂放线菌素D(ActD)可以完全阻断NCZ以及PTX引起的细胞坏死(图4a)，表明MTA激活的是Tnf基因的转录。实时定量PCR结果表明，NCZ和PTX处理后，Tnf mRNA水平随时间上调(图4b)。

为了寻找MTA刺激后调节TNF表达的转录因子，本发明人用MTA处理后的L929做了RNA测序分析，结果首先再次验证了NCZ/PTX处理激活了内源TnfmRNA表达，处理3小时和16小时后，Tnf mRNA水平随时间增加(图4c)。该结果提示：该转录因子要满足一个条件，即MTA刺激后，其mRNA响应和动态变化要早于Tnf mRNA的变化。换言之，转录因子的变化在前，其调控的Tnf基因的变化在后。因此，基于RNA测序的数据，本发明人对1477个转录因子做了聚类分析，发现第三类基因表达是一类在MTA刺激后快速响应的基因，3小时到达高峰，16小时的时候表达量回落，这类基因的变化要早，且峰值先于Tnf mRNA的动态变化(图4d)。

第三类转录因子中，已有研究报道的与TNF表达相关的转录因子包括NF-kB和cJun，然而大多数研究主要集中在激活的免疫细胞方面，并没有癌细胞响应MTA刺激后转录因子变化的相关线索。本发明人用siRNA oligo敲低NF-κB转录因子p65(Rela)和p50(Relb)两个亚单元的表达，发现MTA引起的坏死并没有受到影响(图4e)。接下来，本发明人探寻cJun在这个过程中的作用。构建Jun基因敲除的L929细胞系并用慢病毒回补了cJun的表达，发现cJun是MTA引起的坏死所不可或缺的。在cJun缺失的情况下，MTA刺激后Tnf mRNA水平的上调以及膜定位TNF的积累都不会发生(图4f-g)。

接下来，本发明人用MAPK和NF-κB信号通路相关抑制剂进行筛选以寻找cJun上游的激酶，发现JNK抑制剂可以完全阻断NCZ引起的坏死(图4h)。NCZ处理过的L929细胞中cJun的表达量增加，JNK的活性增强(图4i)，说明了JNK-cJun信号通路的激活。此外，JNK抑制剂SP600125能够阻断NCZ刺激后膜定位TNF的积累(图4j)。

综合起来看，这些实验结果表明，MTA通过JNK-cJun这个途径调控膜定位TNF的表达。

实施例5、MTA联合SM引起肿瘤细胞凋亡

MTA作为化疗药最大的问题是在有些癌症患者当中不敏感。考虑到IAP的表达是在引起癌细胞发生细胞凋亡的主要障碍，而IAP抑制剂能够通过蛋白酶体快速降解并降低cIAP的表达水平来增强solTNF引起的细胞凋亡。本发明人经过研究筛选，发现引入IAP拮抗剂Smac类似物(SM)进行联合用药可以增加细胞对MTA引起的细胞凋亡的敏感性。试验结果证明，在HeLa细胞中MTA联合SM可以大大提高依赖caspase的凋亡的敏感性，且呈现出时间依赖性(图5a-b，图6a)。

由于MTA在L929中引起的坏死依赖于memTNF-TNFR1信号途径，本发明人继续探究在人源肿瘤细胞中MTA是否也是通过memTNF-TNFR1来发挥作用的。构建TNFR1基因敲除的HeLa细胞，用慢病毒回补TNFR1表达，MTA联合SM引起的凋亡可以被TNFR1基因缺失所阻断(图6b)。用siRNA oligo敲低TNF表达也可以抑制MTA联合SM引起的凋亡(图6c)。

依那西普(Etanercept

恩利)是一种TNF受体融合蛋白，临床上用于拮抗TNF过剩引起的类风湿性关节炎及强直性脊柱炎。当本发明人用恩利来中和HeLa细胞中的TNF后，MTA联合SM引起的凋亡被阻断了(图5a-b)。

本发明人随后又在大量的肿瘤细胞系中对这一联合用药进行检测，对17余种上皮细胞起源的肿瘤细胞系，这些细胞系来源涵盖乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、胃癌、肺癌、宫颈癌；此类细胞系为人源肿瘤细胞系，有IAP表达，通常仅MTA不足以引起细胞凋亡。研究结果显示，MTA和SM单独用药均敏感性不理想，但联合用药可以使所有这些肿瘤细胞急剧发生凋亡(图5c)。更进一步药物动力学研究发现，少量IAP拮抗剂即可大大增加乳腺癌细胞对PTX或NCZ的敏感性，相当于把对PTX或NCZ的敏感性提高了100倍以上(图5d，图6d)。此外，对于HeLa细胞(宫颈癌细胞系)，CRL5800细胞(非小细胞肺癌细胞系)，HCT116细胞(结肠癌细胞系)及ZR-75-1细胞(乳腺癌细胞系，Luminal B亚型)，PTX或NCZ联合SM也得到了同样的促凋亡效果(图6e-f)。这些结果表明，MTA联合SM可以在大量细胞系中引起凋亡。这些结果表明，MTA和SM的联合用药可作为新型肿瘤治疗方案。

与前面揭示的体外情况下膜定位TNF能够引起相邻细胞被杀死的机制一致，乳腺癌病人来源的异种移植瘤模型(这种异种移植瘤仅MTA不足以引起细胞凋亡)IHC染色结果显示PTX和SM联合用药组的肿瘤内部有大量caspase3被激活(图5g)；Annexin V和7-AAD染色结果表明PTX和SM联合用药组于单一用药组相比，具有更多的凋亡细胞(图5h)。此外，通过流式细胞术对肿瘤细胞表面的TNF进行染色分析，发现膜定位的TNF在PTX以及PTX和SM联合给药组均有明显上升(图5i，j)。这些研究结果表明，MTA和SM体内联合用药抗肿瘤的作用机制是通过膜定位的TNF信号来驱动的。

乳腺癌是女性最高发的癌症，严重威胁着公众健康。临床上通常根据雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)以及表皮生长因子受体(HER2)的状态对乳腺癌进行分类。三阴性乳腺癌是一种不依赖于激素和生长因子促进生长，易转移且致死率高的亚型。由于其不表达雌激素受体、孕酮受体及表皮生长因子受体相关基因，激素靶向治疗疗效甚微，也缺少标准化的治疗手段。目前治疗三阴性乳腺癌的唯一希望是化疗，然而由于其易复发和转移，预后欠佳。本发明人使用了三阴性、激素受体阳性、HER2受体阳性以及激素受体和HER2受体均呈阳性的4类共计5例乳腺癌病人的移植瘤模型进行体内研究来评估PTX和SM联合用药的效果。当三阴性移植瘤长到200mm³左右时，开始以20mg/kg PTX和25mg/kg SM的剂量通过腹腔注射的方式隔天给药。其余亚型在移植瘤长到800mm³左右时开始进行给药操作。在本发明人试验的5例乳腺癌病人移植瘤上，联合用药组小鼠身上的肿瘤均得到明显消退甚至完全消失，而PTX和SM单独给药几乎没有任何作用(图5e-f，图7a-h)。

与对照组相比，使用恩利后，PTX和SM联用对于三阴性乳腺癌移植瘤的抗肿瘤效果明显减弱(图5k)。

重要的是，这种联合用药在小鼠身上的药物耐受性很高。在C57BL/6小鼠身上进行的药效动力学及安全性的研究表明本发明所使用的PTX和SM的剂量都是小鼠可以承受的，没有检测到肝脏毒性(AST和ALT水平与对照组相比没有明显差异)，体重和体温也没有降低(图5l)。

进一步地，本发明人扩大研究MTA和SM联合用药药物范围。如图8所示，以MDA-MB-468细胞，BT549细胞，MCF7细胞，HeLa细胞为抑制对象，以多西他赛(docetaxel，DTX)联合100nM SM进行处理，结果说明两者的联合用药效果良好(图8a)。以MDA-MB-468细胞，BT549细胞，CRL5800细胞，HCT116为抑制对象，以长春花碱(vinblastine，VB)联合100nM SM进行处理，结果说明两者的联合用药效果良好(图8b)。以MDA-MB-468细胞，BT549细胞，MCF7细胞，HeLa细胞，CRL5800细胞，HCT116细胞为抑制对象，以长春瑞滨(vinorelbine，VN)联合100nM SM进行处理，结果说明两者的联合用药效果良好(图8c)。以MDA-MB-468细胞，BT549细胞，HCT116细胞为抑制对象，以长春氟宁(vinflunine，VF)联合100nM SM进行处理，结果说明两者的联合用药效果良好(图8d)。以MCF7细胞，HeLa细胞，HCT116细胞为抑制对象，以Lexibulin(LEX)或埃博霉素B(Epothilone B，EpB)联合100nM SM进行处理，结果说明两者的联合用药效果良好(图8e-f)。以HCT116细胞为抑制对象，以长春地辛(vindesine，VD)或卡巴他塞(cabazitaxel，CA)联合100nM SM进行处理，结果同样说明联合用药效果良好(图8g-h)。

如图9所示，以MDA-MB-468细胞，BT549细胞，MCF7细胞，HeLa细胞，CRL5800细胞，HCT116细胞为抑制对象，以NCZ，PTX或长春瑞滨(vinorelbine，VN)联合100nM GDC-0917进行处理，结果显示肿瘤细胞发生显著的凋亡(图9a-c)。以MDA-MB-468细胞，BT549细胞，CRL5800细胞，HCT116细胞为抑制对象，以长春花碱联合100nM GDC-0917进行处理，结果显示肿瘤细胞发生显著的凋亡(图9d)。以MCF7细胞及HeLa细胞为抑制对象，以多西他赛(docetaxel，DTX)联合100nM GDC-0917进行处理，结果显示肿瘤细胞发生显著的凋亡(图9e)。以HCT116细胞为抑制对象，以多种MTA(Lexibulin，LEX；埃博霉素B，Epothilone B，EpB；长春地辛，vindesine，VD，以及卡巴他塞cabazitaxel，CA)联合100nM SM GDC-0917进行处理，结果显示肿瘤细胞发生显著的凋亡(图9f)。

如图10所示，以MDA-MB-468细胞，BT549细胞，MCF7细胞，HeLa细胞，CRL5800细胞，HCT116细胞为抑制对象，以NCZ(a)或PTX(b)联合100nM GDC-0152进行处理，结果显示肿瘤细胞发生显著的凋亡(10a-b)。以MDA-MB-468细胞，BT549细胞，HCT116细胞为抑制对象，以多西他赛(docetaxel，DTX)或长春氟宁(vinflunine，VF)联合100nM SM GDC-0152进行处理，结果显示肿瘤细胞发生显著的凋亡(10c-d)。以MCF7细胞及HeLa细胞为抑制对象，以Lexibulin(LEX)或者埃博霉素B(Epothilone B，EpB，f)联合100nM SMGDC-0152进行处理，结果显示肿瘤细胞发生显著的凋亡(10e-f)。

实施例6、筛药方法

(1)基于memTNF进行筛药

设置：

测试组：L929细胞系(其中内源表达memTNF)，并给予候选物质；

对照组：L929细胞系(其中内源表达memTNF)，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中memTNF的表达情况，并进行比较。如果测试组中memTNF的表达在统计学上高于(如高30％或更低)对照组，就表明该候选物是抑制肿瘤的潜在物质。

(2)基于微管靶向药物和memTNF进行筛药

设置：

测试组：L929细胞系(其中内源表达memTNF)，并给予候选物质以及微管靶向药物处理；

对照组：L929细胞系(其中内源表达memTNF)，给予微管靶向药物NCZ或长春氟宁(也可以是本发明前述所列的其它此类药物)处理，但不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中候选物质是否能够促进微管靶向药物对于memTNA的激活，并进行比较。如果测试组中微管靶向药物对于memTNA的激活作用加强，就表明该候选物是促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的潜在物质。

(3)基于微管靶向药物、JNK-cJun和memTNF进行筛药

设置：

测试组：L929细胞系，其中重组表达(过表达)JNK-cJunt通路以及memTNF，并给予候选物质以及微管靶向药物处理；

对照组：L929细胞系，其中重组表达(过表达)JNK-cJunt通路以及memTNF，给予微管靶向药物NCZ或长春氟宁(也可以是本发明前述所列的其它此类药物)处理，但不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中候选物质是否能够促进微管靶向药物通过JNK-cJun通路激发memTNA转录，并进行比较。如果测试组中微管靶向药物通过JNK-cJun通路激发memTNA转录否作用加强，就表明该候选物是促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的潜在物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 增效的肿瘤抑制组合物及其应用

<130> 188766

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

gagggttcgg agtcgtgttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

accctccctg aaacgtggac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

gcacacggtt tcctagacgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

cgctaatttg caactgcatc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

tgtcacggtg ccgttgaagc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

gtgagtgact gtccgagccc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

agaaagcatg atccgcgacg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

tcggggtgat cggtccccaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

ggtccgagtt cttggcgcgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

gctgaccggc tgtgccgcgg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

atatacccct caggggttat 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 12

gtggttttct gaagcggtga 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 13

aggtcggtgt gaacggattt g 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 14

ggggtcgttg atggcaaca 19

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

gaagacagac ctagacagcg g 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

ccagtagctt caccactcga c 21

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

tgtcaagtta tggcctactg gtgcg 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

aaccatagcc ttcacctccc aggat 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 19

aattgtactc tgggaaattg cca 23

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 20

tctccaagat tccgtccaca g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 21

ccgggagaag agggatagct t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 22

tcggacagtc actcaccaag t 21

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 23

caggcggtgc ctatgtctc 19

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 24

cgatcacccc gaagttcagt ag 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 25

ccttctacga cgatgccctc 20

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 26

ggttcaaggt catgctctgt tt 22

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 27

ccagaacatc atccctgcct 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 28

cctgcttcac caccttcttg 20

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 29

aacgagtgtg tctcctgtag t 21

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 30

ggagtagagc ttggacttcc ac 22

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 31

gaggccaagc cctggtatg 19

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 32

cgggccgatt gatctcagc 19

<210> 33

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 33

ggaguacccu gaagcuaua 19

<210> 34

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 34

gaagaagagu ccuuucaau 19

<210> 35

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 35

uaugagaccu ucaagagua 19

<210> 36

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 36

gaauccagac caacaauaa 19

<210> 37

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 37

uggaaaucau cgacgaaua 19

<210> 38

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 38

gcuacggugu ggacaagaa 19

<210> 39

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 39

gaagauccag cugggaauu 19

<210> 40

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 40

gaagauccag cugggaauu 19

<210> 41

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 41

gcccgacuau cucgacuuu 19

<210> 42

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 42

gcguggagcu gagagauaa 19

<210> 43

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 43

ugacaagccu guagcccau 19

<210> 44

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 干扰RNA(siRNA)

<400> 44

ccagggaccu cucucuaau 19

Claims

1.一种筛选促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的物质的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)以微管靶向药物和候选物质处理筛选体系，该筛选体系中包括选自下组的信号通路、基因或蛋白：JNK-cJun，膜定位TNF-TNFR1，RIP1-RIP3-MLKL；

(2)观测该体系中所述信号通路、基因或蛋白的表达或活性的变化；若所述候选物质促进微管靶向药物对于JNK-cJun，膜定位TNF-TNFR1或RIP1-RIP3-MLKL信号通路的激活作用，进而提高信号通路、基因或蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的物质。

2.一种筛选抑制肿瘤的物质的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)以候选物质处理筛选体系，该筛选体系中包括膜定位TNF；

(2)观测该体系中所述膜定位TNF的表达或活性的变化；若所述候选物质促进膜定位TNF的表达或活性，则表明该候选物质是抑制肿瘤的物质。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、离体组织体系；较佳地，所述的体系为细胞体系。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的候选物质包括：来自化合物库或基因库的小分子化合物、基因或蛋白；或针对JNK-cJun，膜定位TNF-TNFR1或RIP1-RIP3-MLKL信号通路、基因或蛋白或它们的上游或下游分子设计的小分子化合物、激动剂、上调剂、促进剂、基因编辑试剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括设置试验组和对照组，所述试验组以微管靶向药物和候选物质处理筛选体系，所述对照组以微管靶向药物处理筛选体系。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括设置试验组和对照组，所述试验组是以候选物质处理的筛选体系，所述对照组则不加入候选物质。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微管靶向药物包括微管解聚类药物或微管稳定类药物；较佳地，所述的微管靶向药物包括选自下组的药物：噻氨酯达唑，长春新碱，紫杉醇，多西他赛，长春氟宁，长春氟宁酒石酸盐，普那布林，单甲基澳瑞他汀D，单甲基澳瑞他汀E，D-64131，Lexibulin，长春地辛，Diazonamide，Fosbretabulin disodium，ABT-751，秋水仙碱，甲苯达唑，卡巴他塞，长春瑞滨，阿苯达唑，埃博霉素A，2-甲氧雌二醇，灰黄霉素，帕苯达唑，埃博霉素B。

8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤包括：纤维肉瘤，乳腺癌，宫颈癌，肺癌，结肠癌，胰腺癌，前列腺癌，直肠癌，胃癌，肝癌。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的观测该体系中所述信号通路、基因或蛋白的表达或活性的变化包括：观测微管靶向药物通过JNK-cJun通路激发膜定位TNF转录的情况，若是这种促进微管靶向药物通过JNK-cJun通路激发膜定位TNF转录，则则表明该候选物质是促进微管靶向药物的肿瘤抑制效果的物质。

10.一种用于抑制肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括：微管靶向药物以及Smac类似物。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的微管靶向药物包括微管解聚类药物或微管稳定类药物。

12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述的微管靶向药物包括选自下组的药物：噻氨酯达唑，长春新碱，紫杉醇，多西他赛，长春氟宁，长春氟宁酒石酸盐，普那布林，单甲基澳瑞他汀D，单甲基澳瑞他汀E，D-64131，Lexibulin，长春地辛，Diazonamide，Fosbretabulin disodium，ABT-751，秋水仙碱，甲苯达唑，卡巴他塞，长春瑞滨，阿苯达唑，埃博霉素A，2-甲氧雌二醇，灰黄霉素，帕苯达唑，埃博霉素B。

13.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的Smac类似物包括选自下组的药物：LCL161，GDC-0917，GDC-0152。

14.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述的微管靶向药物以及Smac类似物是有效量的。

15.权利要求10～14任一所述的药物组合物的用途，用于制备抑制肿瘤的药盒。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物中，所述的微管靶向药物通过调控JNK-cJun，膜定位TNF-TNFR1或RIP1-RIP3-MLKL信号通路，从而抑制肿瘤。

17.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括：纤维肉瘤，乳腺癌，宫颈癌，肺癌，结肠癌，胰腺癌，前列腺癌，直肠癌，胃癌，肝癌。

18.一种用于抑制肿瘤的药盒，其特征在于，所述药盒包括：权利要求10～14任一所述的药物组合物。

19.一种用于抑制肿瘤的药盒，其特征在于，所述药盒包括：微管靶向药物和Smac类似物；两者分置于独立的容器或包装中。