CN111315382A - Trpv2拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及如下发现，即荜茇酰胺化合物如荜茇酰胺及其类似物、衍生物和前药是瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)的可逆的别构拮抗剂。提供了使用荜茇酰胺化合物治疗特征为TRPV2表达的病况的方法以及用于此类治疗的荜茇酰胺化合物。

Description

TRPV2拮抗剂
领域
本发明涉及使用荜茇酰胺化合物抑制瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)。这可用于例如癌症的治疗。
背景
天然产物(NP)，尤其是其片段样子集，为药物发现和用于研究生物系统的探针提供了极好的起点1-4。考虑到合成途径的挑战性，它们的生物预验证的架构通常包含未被完全合成的化学物质覆盖或仅被完全合成的化学物质少量利用的支架5。此外，NP靶标受体的事实知识仍然有限，并严重阻碍了以天然产物为灵感的分子设计在化学生物学和分子医学中的合理方法的运用6。
以配体为中心的信息学提供了将表型测定读数去卷积到大分子水平的可行平台。特别地，使用“模糊”药效团描述符的工具已被证明可用于NP空间中的脱孤(orphanization)和靶标鉴定7-10。(-)-Englerin A-一种有效的抗癌剂11和TRP调节剂12-14，最近已被报道是一种Cav1.2拮抗剂15。
自从荜茇酰胺作为一种选择性抗癌剂被披露以来，人们已经做出了巨大的努力来发现哪些大分子靶标可以被荜茇酰胺接合16,17。最近，这些研究以显示直接抑制STAT3的报道告终18。然而，已显示片段样NP可以接合多个靶标，从而形成复杂的多重药理学网络2,9。
概述
本申请的发明人已发现片段样抗癌生物碱荜茇酰胺(1，图1A)是瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)的选择性的别构拮抗剂，并且荜茇酰胺的抗癌活性与癌细胞中TRPV2的表达相关。
本发明的一个方面提供了治疗特征为瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)表达的癌症的方法，其包括向有需要的患者施用荜茇酰胺化合物。
优选的荜茇酰胺化合物包括荜茇酰胺及其类似物、衍生物和前药。
荜茇酰胺化合物可以具有以下式1及其盐、溶剂化物和保护的形式：
Figure BDA0002479767150000021
其中Q1是O或S，
-Ar是任选取代的芳基，
-D-选自-C(O)-、-C(S)-、-CH(OH)-和-CH(SH)-，并且
-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成任选取代的杂环，或者-R1和-R2各自独立地选自氢和任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基和芳基。
本发明的另一方面提供了荜茇酰胺化合物，其用于治疗特征为瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)表达的癌症的方法中。
本发明的另一方面提供了荜茇酰胺化合物在制备用于治疗特征为瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)表达的癌症的方法的药物中的用途。
本发明的方面和实施方案在下文中有更详细的描述。
附图简述
图1A显示了荜茇酰胺，1和(-)-englerin A，2的结构，以及相互的靶标接合(engagement)关系。图1B是荜茇酰胺对癌细胞的效果的图示。
图2显示了荜茇酰胺，1调节TRPV2。a)使用基于荧光的测定的1对TRPV2的浓度-反应曲线。IC50＝4.6±0.13log单位，n＝2；对照：曲尼司特，IC50＝2.3±0.25log单位，n＝2。b)HepG2细胞(0.5％DMSO)中1(5μM)抑制大麻二酚(CBD,20μM)引起的钙流入。为了定量，分析了每个孔中(n＝35-45个细胞)五个最强的应答细胞，并归一化为基线。示出了五个最强的应答细胞的平均值。**单因素方差分析和Tukey HSD事后检验：刺激后120s，对照与1之间(p<0.01)以及对照与曲尼司特(p<0.01)之间的显著差异。1和曲尼司特之间没有显著差异。c)HepG2细胞(0.5％DMSO)中1(5μM)抑制CBD(4μM)引起的钙流入。在所有样品之间均未观察到统计学上显著的差异。d)HEK293细胞(0.5％DMSO)中1(5μM)抑制CBD(4μM)引起的钙流入。阴性对照：用CBD(4μM)刺激的未转染的HEK293。为了定量，分析了十个最强应答者/孔，并归一化为基线(转染细胞：n＝70-80，未转染细胞：n＝20)。示出了十个最强应答细胞的平均值。**单因素方差分析和Tukey HSD事后检验：刺激后300s，对照和1之间(p<0.001)、对照和未转染的HEK293细胞之间(p<0.001)以及未转染的HEK293细胞和1之间(p<0.001)的显著差异。e)用人TRPV2-RFP融合蛋白转染的HEK293的钙成像，校正基线水平。f)4μM CBD刺激5分钟后的钙水平(颜色代码-蓝色＝低钙水平；绿色＝中等；黄色＝中高；红色＝高)。未转染的细胞用点标记。显示伪像(例如钙振荡)的细胞用箭头标记。没有未转染的细胞显示出强的钙流入。g)用方形标记的十个最强应答细胞以中等水平表达TRPV2-RFP。h)人工增强的RFP信号：所有十个选定的细胞均表达TRPV2-RFP。i)使用膜片钳测定的1对TRPV2的浓度-反应曲线。IC50＝1μM±0.52log单位，n＝2，刺激物：4μM CBD。j)使用膜片钳测定的1对TRPV2的浓度-反应曲线。IC50>100μM，n＝2，刺激物：10μM CBD。
图3显示了荜茇酰胺，1是一种选择性的人TRPV2别构拮抗剂。a)示例性的膜片钳时程轨迹，显示了1(100μM)对大麻二酚(CBD)活化的(4μM)人TRPV2电流的抑制作用。完成了清洗出1，并可以恢复全部的TRPV2活性；n＝2。b)药物洗出实验的归一化反应。c)在递增浓度的1的情况下，CBD的EC50图。d)1的Michaelis-Menten分析。e)1的Schild图。
图4显示了NCI-60筛选和生物信息学分析。a)通过组织来源分组的NCI-60癌细胞系中荜茇酰胺，1，GI50值(-z分数)的分布。水平虚线表示图平均值。b)通过组织来源分组的NCI-60癌细胞系中1的IC50值(-z分数)的分布。水平虚线表示图平均值。c)NCI-60图中TRPV2mRNA转录水平(log强度)作为1的GI50(-z分数)的函数。表达TRPV2的细胞系对1更为敏感(斯皮尔曼相关系数(Spearman correlation coefficient)(ρ)＝0.28，p<0.05)。d)NCI-60图中TRPV2 mRNA转录水平(log强度)作为1的IC50(-z分数)的函数。表达TRPV2的细胞系对1更为敏感(ρ＝0.29，p<0.05)。e)与1的活性相关的基因的基因集富集分析(GSEA)。对根据斯皮尔曼相关系数排序的基因运行GSEA分析。错误发现率低于5％，41个基因集被认为是显著的。显示了与1的活性正(深灰色)和负(浅灰色)相关的前10个基因集。
图5显示了利用HepG2细胞的伤口愈合测定。a)浓度为5μM的荜茇酰胺，1，以Ca2+依赖性方式抑制癌细胞迁移。C–0.5％DMSO对照；Tr-曲尼司特(10μM)。****p<0.0001；**p<0.01，未配对的双尾t检验。C：n＝5-7；1：n＝13-17；Tr：n＝4-6。DMSO对照之间没有发现显著性差异。b)划痕的示例性图像(40x)。c)显示组成型TRPV2表达的HepG2细胞的荧光辅助细胞分选数据。红色：未染色对照(平均荧光强度，MFI＝5)，蓝色：仅二抗(MFI＝62)，绿色：一抗和二抗(MFI＝1265)。d)涉及细胞迁移的靶标的HepG2 RNA-seq数据分析。从测试的175个基因中，示出了表达水平等于或高于TRPV2的基因，按基因家族着色。垂直虚线表示TRPV2表达水平。
图6显示了基于低级别胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤中的hTRPV2中值表达的患者分层的总体生存Kaplan-Meier图，表明TRPV2是脑肿瘤中的预后标志物。显示了生存差异的对数秩检验的p值。
图7显示了TRPV2在人弥漫性胶质瘤的胶质细胞(白色箭头)和内皮细胞区室(黑色箭头)中表达，特别是在GBM的内皮细胞中具有明显不同的表达水平和表达模式。GBM中内皮细胞细胞质膜的强烈染色与II级和III级胶质瘤内皮中的弱染色或阴性染色以及胶质细胞中的细胞质和点状染色形成对比。TRPV2在正常脑中(在肿瘤边缘)在细胞外，弥漫且弱的，在神经纤维网(星号)中，以及在少数胶质细胞(白色箭头)和神经元中呈点状的表达。
图8显示了(左图)TRPV2在内皮和小胶质细胞/巨噬细胞脑肿瘤细胞中表达。通过细胞类型分组的来源于四个多形性胶质母细胞瘤人类样品的3,589个单细胞中的TRPV2表达(每百万计数-CPM的log2)。数据显示为平均值+/-标准误差。图8(右图)显示了，在24小时后，U251细胞中hTRPV2的瞬时过表达增加了PL毒性。将结果归一化为在不同浓度的PL下，用DMSO媒介物处理的转染细胞，并与仅用转染试剂处理的细胞进行比较。
图9显示了使用装载PL的水凝胶治疗体内多形性胶质母细胞瘤(GBM)的实验流程：颅内注射U251细胞(每组n＝5)，在8天后，利用生物发光成像证实植入。在第9天，植入装载或未装载PL的水凝胶。使用生物发光成像以规定的间隔评估肿瘤生长。
图10显示了用装载PL的水凝胶(50mg/kg)或未装载的水凝胶(对照)处理的U251异种移植小鼠的代表性生物发光图像。数据显示，与肿瘤呈指数生长的对照相比，在21天的时间内PL治疗成功地减少了肿瘤体积。
图11(左图)显示了如通过荧光素酶活性测量的用装载PL或未装载PL的水凝胶处理的小鼠中的肿瘤负荷。数据表示为在每个时间点对照组中的平均肿瘤大小的百分比，并代表组平均值±SEM。数据显示两组之间的显著肿瘤负荷差异(p＝0.0159，n＝5，曼-惠特尼检验)。图11还显示了Kaplan-Meier生存曲线(右图)，其显示与对照组相比，用装载PL的水凝胶处理的小鼠具有增加的生存率(p＝0.0494，对数秩(Manel-Cox检验)。存活截止标准包括与水凝胶植入之前针对每只小鼠测量的原始大小相比，肿瘤大小增加554％。
图12显示了在原发性和复发性GBM中TRPV2相对于PGK1的表达的qRT-PCR分析。
图13显示了在原发性和复发性GBM中排序最高的基因集(Hallmark氧化磷酸化)的表达的热图。
图14显示了PPARGC1A的相互作用的示意图。
图15显示了在原发性和复发性GBM中线粒体生物发生基因的表达的热图。
图16显示了TRPV2表达随脑肿瘤阶段而增加。GTEx正常和TCGA肿瘤(分组为LGG II级、LGG III级和GBM)脑样品中的TRPV2表达(log2TPM)。黑点和线表示中值+/-标准差。**表示p值<0.01，且****p值<0.0001(Wilcoxon秩和检验)。
图17显示了TRPV2主要在肿瘤微环境中表达。显示TCGA GBM和LGG样品中TRPV2表达(log2RSEM)和肿瘤纯度之间的负相关性的散点图(斯皮尔曼相关系数，分别为ρ＝-0.36和-0.447，p＝3.1×10-14和7.5×10-25)。蓝色局部多项式回归(loess)线周围的灰色阴影表示其95％的置信区间。
详述
本发明涉及如下发现，即荜茇酰胺化合物是瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)的可逆的别构拮抗剂，并且可以用于治疗与TRPV2表达相关的病况。
荜茇酰胺化合物可以抑制TRPV2，并且可以优选地是TRPV2的可逆拮抗剂。荜茇酰胺化合物是TRPV2的选择性抑制剂，并且可以比其他TRP通道更大程度地抑制TRPV2。例如，相比TRPV1、TRPV3、TRPV4、TRPV5、TRPA1、TRPC1、TRPC3或TRPC4中的一种或多种，优选全部，荜茇酰胺化合物可以显示对TRPV2的至少5倍或更多、至少10倍或者至少100倍的抑制。
瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)(也称为VRL和VRL1)是热激活的钙通道。TRPV2可以是人TRPV2。人TRPV2(基因ID 51393)具有参考氨基酸序列NP_057197.2，并且可以由参考核苷酸序列NM_016113.4编码。用于测量TRPV2活性和测定抑制活性的技术在本文其他地方描述，并且包括使用Fura2-AM钙探针测量由大麻二酚诱导的钙流入。
荜茇酰胺化合物可以具有下式及其盐、溶剂化物和保护的形式：
Figure BDA0002479767150000061
其中Q1是O或S，
-Ar是任选取代的芳基，
-D-选自：-C(O)-、-C(S)-、-CH(OH)-和-CH(SH)-，并且
-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成任选取代的杂环，或者-R1和-R2各自独立地选自氢和任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基和芳基。
基团Q1优选是O。
基团-Ar是芳基，包括碳芳基或杂芳基，并且芳基可以是单个芳环或者具有两个或更多个芳环的稠合系统。
碳芳基可以是C6-14碳芳基，如苯基或萘基，并且最优选是苯基。
杂芳基可以是C5-14杂芳基，如C5-10杂芳基，如C5-6杂芳基，如C6杂芳基，如吡啶基和嘧啶基，或者C5杂芳基，如呋喃基、噻吩基和吡咯基。
芳基可以是具有6个芳环原子的芳基，如苯基或吡啶基。
优选地，-Ar是碳芳基，且最优选是苯基。
芳基可以是任选取代的，如被一个或多个取代基取代。任选的取代基可以选自：卤素、氰基、-RS1、-OH、-ORS1、-SH、-SRS1、-NH2、-NHRS1、-NRS1RS2、-COOH、-CONH2、-CONHRS1、-CONRS1RS2、-NHCORS1、-N(RS1)CORS1，其中每个-RS1和每个-RS2独立地是烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，其任选地被诸如氟的卤素取代，或者-RS1和-RS2可以一起形成杂环。
芳基可以是任选取代的，如被一个或多个基团，如一个、两个或三个基团取代。
芳基可以任选地被一个或多个基团取代，所述基团选自-OH、-ORS1、-SH和-SRS1，如-SRS1和-ORS1，如-ORS1。
每个-RS1和每个-RS2优选地选自烷基、烯基、炔基，其各自任选地被卤素，如氟取代。
烷基、烯基或炔基可以是直链或支链的。
在-RS1或-RS2是烷基的情况下，这可以是C1-6烷基，如C1-4烷基，如甲基或乙基，如甲基。
在-RS1或-RS2是烯基的情况下，这可以是C2-6烯基，如C2-4烷基，如乙烯基或烯丙基。
在-RS1或-RS2是炔基的情况下，这可以是C2-6炔基，如C2-4炔基，如炔丙基。
在-RS1或-RS2是芳基的情况下，这可以是碳芳基，如C6-10芳基，如苯基或杂芳基，如C5-14杂芳基，如C5-10杂芳基，如C5-6杂芳基，如C6杂芳基，如吡啶基。
在-RS1或-RS2是芳烷基的情况下，这可以是经由C1-6烯基，如C1-2亚烷基，如亚甲基连接的诸如上述的芳基。最优选的芳烷基是苄基。
在-RS1和-RS2一起形成杂环的情况下，这可以是C5-7杂环，并且杂环可以任选地包含选自O、S和N(H)的其他的环杂原子。
在-Ar是六元芳基的情况下，这可以在3位、4位和5位中的一个或多个处是取代的。这里，2位和6位可以是未取代的。在一个实施方案中，3位、4位和5位中的两个或每个是取代的。这里，芳基的连接点被认为是1位。
基团-Ar可以是三烷氧基苯基，如3,4,5-三烷氧基苯基。
基团-Ar可以是三甲氧基苯基，如3,4,5-三甲氧基苯基。
基团-D-优选地选自-C(O)-和-C(S)-，且优选是-C(O)-。这里，基团-D-连同它所连接的氮和-C(Q1)-一起形成酰亚胺或硫酰亚胺。
基团-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成任选取代的杂环。杂环可以是单环，或者可以是稠合环系统，其具有与其他环稠合的至少一个杂环。其他的环可以是另一杂环、环烷基环或芳基环。
优选地，杂环是单环，并且未与另一环稠合。
杂环可以是4-9元环，如4-6元环，如5或6元环，如6元环。
杂环可以包含其他的环杂原子，其可以选自O、S和N(H)。当存在其他杂原子时，该杂原子与-N-D-中的氮原子被至少一个碳环原子隔开。通常，不存在其他杂原子，并且其余的环原子是碳环原子。
杂环可以是饱和的，或者部分或完全不饱和的。杂环可以是芳环，但这不是优选的。
优选地，杂环是部分不饱和的。例如，杂环可以包含一个双键，其是碳-碳双键。为了避免疑义，双键是杂环的内键(即在环内)。当基团-D-是-C(O)-或-C(S)-时，优选的是双键与基团-D-缀合。
当-D-是-C(O)-或-C(S)-时，杂环是内酰胺。这是优选的。
内酰胺可以是部分或完全不饱和的。内酰胺可以是α,β-不饱和的，并且可以是其他γ,δ-不饱和的(在存在第二双键的情况下)。
优选地，-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成α,β不饱和的δ-内酰胺(5,6-二氢吡啶-2-酮-1-基)。
可选地，-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成α,β不饱和的δ-内酰胺。
由R1和-R2连同-N-D-一起形成的杂环可以是任选取代的，如用烷基或卤素，如烷基任选取代的。优选地，杂环未被进一步取代。
可选地，-R1和-R2中的每个独立地选自：氢、烷基、烯基、炔基和任选取代的环烷基、杂烷基、杂环基和芳基。优选地，-R1和-R2中的一个不是氢。例如，-R2可以是氢，而-R1不是氢。
-R1和-R2可以都不是氢。
环烷基、杂烷基、杂环基和芳基可以任选地被烷基，如C1-6烷基，如甲基取代。
基团-R1可以是烷基或烯基，例如当-R2是氢时。
在-R1或-R2是烷基的情况下，这可以是直链或支链烷基，如C1-10烷基，如C1-6，如C1-4烷基，如C1-2烷基。实例包括甲基、乙基和丙基。
在-R1或-R2是烯基的情况下，这可以是具有一个或多个，优选一个碳-碳双键的直链或支链烯基，如C2-10烯基，如C2-6烯基，如C2-4烯基。
实例包括乙烯基和烯丙基。
在-R1或-R2是炔基的情况下，这可以是具有一个或多个，优选一个碳-碳三键的直链或支链炔基，如C2-10炔基，如C2-6炔基，如C2-4炔基。
实例是炔丙基。
提及环烷基，这可以是环烷基如C3-7环烷基，如C5-6环烷基。环烷基可以是饱和的，或者部分或完全饱和的，但其不是芳族的。实例是环己基。
在-R1或-R2是杂烷基的情况下，这可以是烷基，其中一个或两个碳原子被选自O、S和N(H)的杂原子取代。杂烷基可以是直链或支链的，并且可以是C2-10杂烷基，如C2-6杂烷基，如C2-4杂烷基。在存在时，杂烷基可以经由碳原子或氮原子连接。实例是甲氧基甲基。
在-R1或-R2是杂环基的情况下，这可以是环状杂环基团，其具有每个独立地选自O、S和N(H)的一个或两个杂原子。杂环基可以是C3-10杂环基，如C5-7杂环基，如C5-6杂环基。杂环基可以是饱和的，或者部分或完全饱和的，但其不是芳族的。在存在时，杂环基可以经由碳环原子或氮环原子连接。杂环基团可以是吡咯烷基、吗啉基和哌啶基。
在-R1或-R2是芳基的情况下，这可以是芳基，其可以是碳芳基或杂芳基。碳芳基可以是苯基或萘基。杂芳基可以是C5-10杂芳基，如C5-6杂芳基。实例包括吡啶基、咪唑基和噻唑基。
化合物可以作为溶剂化物，如水合物提供。
在适当的情况下，例如在化合物中存在羧基(-COOH)或氨基(如-NH-或-NH2)官能团的情况下，可以以盐形式提供化合物。
在适当的情况下，化合物可以作为保护的形式提供。例如在存在氨基官能团(如-NH-或-NH2)的情况下，这可以用氨基甲酸酯基团如Boc基团保护，以及在存在羟基官能团(-OH)的情况下，这可以用甲硅烷基如TBDMS保护。保护基团的使用在本领域中是熟知的，并且技术人员可以理解，在需要时可以保护其他官能团，并且根据需要可以使用其他保护基团。
式1的化合物的互变异构体也属于本发明的范围内。
式1的化合物的前药形成也属于本发明的范围内。例如，在化合物具有羧基(-COOH)或羟基(-OH)官能团的情况下，这些基团可以以酯形式提供，其中在生理条件下这样的酯是不稳定的。
荜茇酰胺化合物可以是荜茇酰胺或者荜茇酰胺的类似物、衍生物或前药。荜茇酰胺(CAS 20069-09-04)可以获自商业供应商，使用标准技术合成，或根据标准方法从荜茇(Piper longum)植物分离。例如，Seo等人(Bioorg.Med.Chem.Lett.2014,24,5727)描述了荜茇酰胺衍生物的制备。
在式1的化合物中，荜茇酰胺是这样的化合物，其中Q1是O，-Ar是3,4,5-三甲氧基苯基，并且-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成α,β-不饱和的δ-内酰胺(5,6-二氢吡啶-2-酮-1-基)。
适用于本文所述治疗的患者可以患有特征为TRPV2表达的癌症。适用于本文所述治疗的癌症可以是任何类型的实体或非实体癌症或者恶性淋巴瘤，且尤其是白血病、肉瘤、皮肤癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、食道癌、胰腺癌、肾癌、胃癌和脑癌。癌症可以是家族性的或散发性的。在一些优选的实施方案中，癌症可以是皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌，如胶质瘤或胶质母细胞瘤或血癌。
在一些特别优选的实施方案中，癌症可以是脑癌，如胶质瘤，例如II级胶质瘤(弥漫性星形胶质细胞瘤或星形细胞瘤)、III级胶质瘤(渐变性星形胶质细胞瘤(anaplasticastoglioma)或星形细胞瘤)或IV级胶质瘤(胶质母细胞瘤)，例如多形性胶质母细胞瘤(GBM)。gliomer可以是低级别或高级别的gliomer。
胶质母细胞瘤可以是原发性或复发性的胶质母细胞瘤。
癌症可以是转移性癌症。
特征为TRPV2表达的癌症可以包括相对于对照细胞，患者中的一个或多个癌细胞具有增加的TRPV2表达。例如，患者的一个或多个癌细胞中的TRPV2表达可以大于对照细胞中的表达或者大于预定的阈值。
可以通过任何合适的技术来鉴定特征为TRPV2表达的癌症。例如，可以确定来自患者的一个或多个癌细胞中的TRPV2表达。用于确定细胞中靶基因表达的合适技术是本领域熟知的，并且包括基于PCR的方法，如逆转录PCR(RT-PCR)、定量RT-PCR(qPCR)、TaqManTM或TaqManTM低密度阵列(TLDA)、微阵列、多分析物分布测试、放射免疫测定(RIA)、Northern印迹测定、Western印迹测定、免疫荧光测定、酶免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀测定、化学发光测定、免疫组织化学测定、斑点印迹测定或狭缝印迹测定或基于蛋白质组学的方法。在一些实施方案中，可以通过免疫组织化学来鉴定特征为TRPV2表达的癌症。
患者可能先前已被鉴定为患有特征为TRPV2表达的癌症，或者存在患有特征为TRPV2表达的癌症的风险，或者处于患特征为TRPV2表达的癌症的风险。
方法可以包括在施用之前将患者鉴定为患有特征为TRPV2表达的癌症或处于患特征为TRPV2表达的癌症的风险。
适用于如上所述治疗的个体可以是哺乳动物，如啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、灵长类动物、猿猴(例如猴或猿)、猴(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或人。
在一些优选的实施方案中，个体是人。在其他优选的实施方案中，可以使用非人的哺乳动物，尤其是常规用作证明在人中的治疗功效的模型的哺乳动物(例如鼠科动物、灵长类动物、猪、犬科动物或兔类)。
在一些实施方案中，个体在最初的癌症治疗后可以具有微小残留病(MRD)。
患有特征为TRPV2表达的癌症的个体可以显示至少一种可鉴定的体征、症状或实验室发现，其足以根据本领域已知的临床标准对特征为TRPV2表达的癌症进行诊断。这样的临床标准的实例可以在医学教科书中找到，如Harrison’s Principles of InternalMedicine,第15版,Fauci AS等人编辑,McGraw-Hill,New York,2001。在一些情况下，诊断个体中的癌症可以包括鉴定从个体获得的体液或组织的样品中的特定细胞类型(例如癌细胞)。在一些实施方案中，个体可能先前已经被鉴定或诊断为患有特征为TRPV2表达的癌症，或者本发明的方法可以包括例如通过确定个体中的指示特征为TRPV2表达的癌症的可鉴定的体征、症状或实验室发现的存在来鉴定或诊断个体中的特征为TRPV2表达的癌症。
虽然可以向个体单独施用荜茇酰胺化合物，如荜茇酰胺，但优选地，在药物组合物或制剂中提供该化合物。
除荜茇酰胺化合物外，药物组合物还可以包含以下中的一种或多种：药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术人员熟知的其他物质。这样的物质应该是无毒的，并且不应干扰活性化合物的功效。载体或其他物质的确切性质将取决于施用途径，这可以是通过大丸剂(bolus)、输注、注射或任何其他合适的途径，如下文所论述的。合适的物质将是无菌的且无热原的，具有合适的等渗性和稳定性。实例包括无菌盐水(例如0.9％NaCl)、水、葡萄糖、甘油、乙醇等或以上的组合。组合物还可以包含辅助物质，如润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂等。
合适的载体、赋形剂等可以在标准药物教科书中找到，例如，Remington’sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1990。
如本文所用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、物质、组合物和/或剂型，其在合理的医学判断范围内，适用于与对象(例如人)的组织接触而无过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相当。从与制剂中其他成分相容的意义上讲，每种载体、赋形剂等也必须是“可接受的”。
制剂可以方便地以单位剂型提供，并且可以通过药学领域熟知的任何方法来制备。这样的方法包括使活性化合物与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过将活性化合物与液体载体或细分的固体载体或两者均一地且紧密地结合在一起，然后如果必要使产品成型来制备制剂。
制剂可以是液体、溶液、悬浮液、乳剂、酏剂、糖浆剂、片剂、锭剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁囊剂、丸剂、安瓿剂、栓剂、子宫托、软膏剂、凝胶剂、糊剂、乳膏剂、喷雾剂、薄雾、泡沫、洗剂、油、大丸剂、糖饵剂或气雾剂形式。
荜茇酰胺化合物或包含荜茇酰胺化合物的药物组合物可以通过任何方便的施用途径施用至对象，无论是全身/外周还是在所需作用部位，包括但不限于经口(例如通过摄入)；和肠胃外，例如通过注射，包括皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、囊内、囊下、眶内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨内；通过植入储库(depot)，例如经皮下或肌内。尽管不排除其他途径，如腹膜内、皮下、透皮、静脉内、鼻、肌内或其他方便途径，但通常通过经口途径施用。
包含荜茇酰胺化合物的药物组合物可以以适合于预期施用途径的剂量单位制剂配制。
适于经口施用(例如通过摄入)的制剂可以作为以下形式提供：离散单位如胶囊、扁囊剂或片剂，每种包含预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂；作为大丸剂；作为药糖剂；或作为糊剂。
可以通过常规手段，例如压缩或模制，任选地与一种或多种辅助成分一起制备片剂。可以通过下述方式来制备压缩片剂：将自由流动形式的活性化合物(如粉末或颗粒)在合适的机器中压缩，组合物任选地混合有以下中的一种或多种粘合剂(例如聚维酮、明胶、阿拉伯胶、山梨糖醇、黄芪胶、羟丙基甲基纤维素)；填充剂或稀释剂(例如乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅)；崩解剂(例如羟乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)；表面活性剂或分散剂或湿润剂(例如月桂基硫酸钠)；和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、抗坏血酸)。可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备模制片剂。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以使用例如可变比例的用以提供所需的释放特性的羟丙基甲基纤维素来进行配制，以便提供于其中的活性化合物的缓释或控释。片剂可以任选地提供有肠溶衣，以提供在肠道部分而不是在胃中的释放。
适用于肠胃外施用(例如通过注射，包括皮肤、皮下、肌内、静脉内和皮内)的制剂包括水性和非水性等渗的、无热原的无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和使得制剂与预期接收者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮剂，其可以包括悬浮剂和增稠剂，以及设计为将化合物靶向血液成分或一个或多个器官的脂质体或其他微粒系统。用于此类制剂的合适的等渗媒介物的实例包括氯化钠注射液、林格氏液或乳酸林格氏注射液。通常，溶液中活性化合物的浓度为约1ng/ml至约10μg/ml，例如约10ng/ml至约1μg/ml。制剂可以提供于单位剂量或多剂量密封容器中，例如安瓿瓶和小瓶中，并可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需在即将使用之前加入无菌液体载体，例如注射用水。可以从无菌粉末、颗粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。制剂可以为设计为将活性化合物靶向血液成分或一个或多个器官的脂质体或其他微粒系统的形式。
在一些实施方案中，可以将本文所述的荜茇酰胺化合物封装在例如环状低聚糖如环糊精中。封装的荜茇酰胺化合物可以包含在水凝胶中，例如用作术后植入物。
任选地，其他治疗剂或预防剂可以包含在药物组合物或制剂中。
如本文所述的荜茇酰胺化合物可用于治疗癌症，例如特征为TRPV2表达的癌症。
治疗可以是对人或动物(例如，在兽医应用中)的任何治疗或疗法，其中实现了一些所需的治疗效果，例如，抑制或延缓病况的发作或进展，并且包括进展速度的降低、进展速度的停止、转移的抑制、病况的改善、病况的治愈或缓解(无论是部分还是全部)、预防、延迟、减轻或阻止病况的一种或多种症状和/或体征，或者将对象或个体的生存期延长超过未经治疗中所预期的。
癌症生长通常是指多种指标中的任一种，其表明癌症内向更成熟形式的转变。因此，衡量癌症生长抑制的指标包括癌细胞生存率降低、肿瘤体积或形态减小(例如，如使用计算机断层扫描(CT)、超声检查或其他成像方法确定的)、肿瘤生长延迟、肿瘤血管破坏、迟发型超敏反应皮肤试验中性能的改善、溶细胞性T淋巴细胞活性的增加以及肿瘤特异性抗原水平的降低。如本文所述，患癌症个体中TRPV2的抑制可以提高个体抵抗癌症生长，特别是已经存在于对象中的癌症的生长的能力，和/或降低个体中癌症生长的倾向。
如本文所述的治疗可包括预防性治疗(即预防)，即在治疗时，被治疗的个体可能未患有或可能未被诊断为患有特征为TRPV2表达的癌症。例如，可以按本文所述治疗易感或处于患特征为TRPV2表达的癌症的发生或复发的风险的个体。这样的治疗可以预防或延迟个体中特征为TRPV2表达的癌症的发生或复发，或者减轻其在发生或复发后的症状或严重程度。在一些实施方案中，与一般人群相比，个体可能先前被鉴定为具有特征为TRPV2的癌症的增加的易感性或风险，或者方法可包括鉴定具有特征为TRPV2表达的癌症增加的易感性或风险的个体。在一些实施方案中，预防或预防性治疗可能是优选的。
可以如本文中所述以治疗有效量施用荜茇酰胺化合物。
如本文所用的术语“治疗有效量”涉及有效产生一些所需的治疗效果并与合理的效益/风险比相当的活性化合物，或者包含活性化合物的组合、物质、组合物或剂型的量。
荜茇酰胺化合物的适当剂量可随个体而变化。确定最佳剂量通常将包括平衡治疗益处水平与施用的任何风险或有害副作用。选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于：施用途径，施用时间，组合使用的活性化合物、其他药物、化合物和/或物质的分泌速率，以及个体的年龄、性别、体重、状况、一般健康和先前的医学史。活性化合物的量和施用途径最终将取决于医生的判断，尽管通常剂量是在不引起实质性有害或有毒副作用的情况下达到活性化合物的治疗性血浆浓度。
通常，活性化合物的合适剂量范围为每天每千克对象体重约100μg至约400mg，优选每天每千克对象体重约200μg至约200mg。当活性化合物是盐、酯、前药等时，施用的量是基于母体化合物计算的，并且因此要使用的实际重量成比例地增加。例如，可以以胶囊或片剂形式每天两次经口施用50-100mg的荜茇酰胺化合物。
可以以足以将血清浓度维持在产生对TRVP2的>50％的抑制的水平的量口服施用荜茇酰胺化合物。
可以以一个剂量连续地或间歇地(例如，以适当的间隔以分开的剂量)实现体内施用。
确定最有效的施用手段和剂量的方法在本领域中是熟知的，并且将随着用于治疗的制剂、治疗的目的、所治疗的靶细胞和所治疗的对象而变化。可以根据医生选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。
可以施用多剂量的荜茇酰胺化合物，例如可以施用2、3、4、5次或超过5个剂量。荜茇酰胺化合物的施用可以持续一段持续的时间。例如，使用荜茇酰胺化合物的治疗可以持续至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或至少2个月。使用荜茇酰胺化合物的治疗可以持续与减轻癌症症状或达到完全缓解所必需的时间一样长的时间。
可以根据个体情况单独施用荜茇酰胺化合物或者与其他治疗组合同时地或依序地施用荜茇酰胺化合物。例如，可以与一种或多种另外的活性化合物组合施用如本文所述的荜茇酰胺化合物。
可以与第二治疗剂组合施用荜茇酰胺化合物。
第二治疗剂可以是抗癌化合物，例如抗癌化合物选自蒽环霉素、阿糖胞苷、长春新碱、L-天冬酰胺酶、环磷酰胺、菲伯免疫蛋白(fibromun)、达卡巴嗪、甲氨蝶呤和6-巯嘌呤、苯丁酸氮芥、烷化剂、环磷酰胺、皮质类固醇、伊马替尼、克拉屈滨、喷司他丁、利妥昔单抗、苯丁酸氮芥、紫杉烷和阿霉素。
可以与辐照组合施用荜茇酰胺化合物。使用辐照治疗癌症病况是本领域熟知的。
TRPV2的表达还可以用于鉴定可能对用荜茇酰胺化合物进行治疗具有响应性的(“敏感的”)或非响应性的(“抵抗的”)癌症，以及用于选择适合用荜茇酰胺化合物治疗的患者。选择用荜茇酰胺化合物治疗的癌症患者的方法包括：
提供来自癌症患者的癌细胞样品，以及
确定癌细胞中TRPV2表达的存在或量。
可以选择具有表达TRPV2；以超过阈值的水平或以比对照细胞高的水平表达TRPV2的癌细胞的癌症患者，用于利用荜茇酰胺化合物治疗。适于确定细胞中TRPV2表达的存在或量的技术是本领域熟知的。
患者可能患有如上所述的癌症，例如脑癌，如胶质母细胞瘤。
本申请的发明人还已经鉴定了癌症患者，特别是患有脑癌如胶质母细胞瘤的患者中的TRPV2表达和不良预后(例如，3年低于50％的生存率)之间的关系。
本发明的另一方面提供了癌症患者的预后方法，其包括：
提供来自癌症患者的癌细胞样品，以及
确定癌细胞中TRPV2表达的量，TRPV2表达的水平指示患者的预后。
患者可能患有如上所述的癌症，例如脑癌，如胶质母细胞瘤。
可以使用任何合适的技术确定癌细胞中TRPV2表达的量。
本发明的其他方面和实施方案提供了上述的术语“包含(comprising)”替换为术语“由…组成(consisting of)”的方面和实施方案以及上述的术语“包含(comprising)”替换为术语”由…组成(consisting essentially of)”的方面和实施方案。
应当理解，除非上下文另外要求，否则本申请公开了任何以上方面和上述实施方案彼此的所有组合。类似地，除非上下文另外要求，否则本申请单独地或连同任何其他方面一起公开了优选的和/或任选的特征的所有组合。
在阅读本公开内容时，上述实施方案、其他实施方案及其变型的修改对于技术人员将是显而易见的，并且因此，这些均在本发明的范围内。
本说明书中提及的所有文件和序列数据库条目出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
“和/或”在本文中使用时应被视为两个指定的特征或组分中的每一个在有或没有另一个情况下的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A，(ii)B以及(iii)A和B中的每一个的具体公开，就像每个在本文中被单独列出一样。
现在将通过实施例并参考上述附图来说明本发明的某些方面和实施方案。
实验
方法
靶标预测
按先前所报道的，使用SPiDER的靶标预测在可公开访问的网页服务器(www.modlab-cadd.ethz.ch/software/spider)上进行2,11,14,20。简而言之，荜茇酰胺连同来自COBRA数据库的参考化合物一起被投影到自组织映射31。在使用CATS232和MOE2D描述符进行描述之前，使用分子操作环境(MOE，化学计算集团(Chemical Computing Group)，加拿大蒙特利尔)的“冲洗(wash)”功能处理化学结构。通过计算COBRA中分子与参考化合物的欧式距离来进行预测。输出包括置信水平为p<0.05的靶标家族。根据带有结合不同靶标的注释的分子之间的距离的预先计算的背景分布，将距离转换为p值。这些p值的算术平均值用作靶标预测的置信度分数。利用置信度分数的背景分布，每个预测可以与指示预测的统计显著性的另一个p值相关联14。
t-分布随机邻域嵌入(t-SNE)。
从ChEMBL2333收集了注释有人瞬时受体电位(TRP)通道的配体，并按先前所述进行过滤。分别使用MOE2018(化学计算集团，加拿大)和RDKit为所有TRP配体和荜茇酰胺计算了CATS2描述符32和ECFP4样的Morgan指纹(半径2，2048比特)。对CATS2描述符和扩展指纹单独进行主成分分析。保留描述至少80％的数据差异的主成分以用于流形学习。对于t-SNE，在进行概率分析(1000次迭代和600-1000的学习率)之前对主成分进行缩放。使用NumPy1.13.3、Pandas 0.21.0和Scikit-learn 0.18.1文库在Python 2.7.13中进行分析。用Matplotlib 1.5.3计算图。
基于荧光细胞的测定
在SB Discovery(Glasgow,UK)基于收费服务进行测定。将人TRP细胞用胰蛋白酶处理，计数，并以每孔50,000个细胞的密度，以100μL的体积接种在黑色的透明底96孔板中，并孵育过夜。第二天，用钙5染料或膜电位染料加载细胞。使用钙5染料测试了TRPV1-5、TRPA1、TRPM2、TRPM3和TRPM8。使用膜电位染料测试了TRPC1、TRPC3-7和TRPM4-5。两种染料溶液都是在HEPES缓冲的Hank平衡盐溶液(HBSS)中制成的。将染料溶液(90μL)加入到孔中，并在37℃下孵育1小时。然后将测试化合物和标准抑制剂(10μL)加入到孔中，并在室温下孵育10分钟。然后将板置于Flexstation中，并每1.52秒监测荧光。20秒后，加入激动剂，并分别在485nm/525nm和530nm/565nm Ex/Em处监测钙5染料和膜电位染料的荧光，持续2分钟。对照-TRPV1：辣椒平；TRPV2：曲尼司特；TRPV3：钌红；TRPV4：钌红；TRPV5：Gd3+；TRPA1，钌红；TRPC1：Gd3+；TRPC3：Pyr3；TRPC4：ML 204；TRPC5：ML 204；TRPC6：ML 204；TRPC7：SKF 96365；TRPM2：2-APB；TRPM3：Mef酸；TRPM4：克霉唑；TRPM5：TPPO；TRPM8：2-APB。在所有情况下，对照数据均在历史范围内。
膜片钳测定
在SB Discovery(Glasgow,UK)基于收费服务进行测定。使用手动膜片钳方法进行浓度-反应曲线和洗出测定。根据SB Discovery的针对hTRPV2稳定细胞系改编的程序，使HEK-293细胞生长，并制备HEK-293细胞。使细胞血清饥饿约24小时，然后在电生理学测试之前换成含血清的培养基。在室温下使用传统的电生理单元进行手动膜片钳测定。在将含血清的培养基加入细胞后的2-3小时内使用细胞。标准细胞外溶液包含145mM NaCl、4mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM HEPES和10mM葡萄糖。用NaOH将pH调节至7.4，并且渗透压测量为311mOsm/L。标准细胞内溶液包含50mM KCl、10mM NaCl、60mM KF、2mM MgCl2、20mM EGTA和10mM HEPES。用KOH将pH调节至7.2，并且渗透压测量为286mOsm/L。在加入对照(细胞外溶液)和化合物溶液后，使用标准的斜坡方案(ramp protocol)监测电流。电压方案由来自-60mV的保持电位每5秒从-100mV至+100mV的一系列电压斜坡组成。将记录期间在+100mV下的最大向外电流值用于分析。使用来自Axon Instruments(Molecular Devices,USA)的Axon 200B放大器和Digidata1440A采集系统进行手动膜片钳实验。使用来自AxonInstruments的软件程序pClamp(第10版)来刺激和记录电活性。电容瞬变从记录中以电子方式进行补偿，然而穿过串联电阻的电压降和液接电位没有得到补偿。串联电阻通常小于10MΩ，平均电池容量为约25pF。GraphPad Prism(第5版)软件用于分析和绘制所有图形。将激动剂(大麻二酚；Abcam#ab120448)制成于100％DMSO中的100mM储备液，并在测试前于生理溶液中稀释至4μM或10μM。将荜茇酰胺制成于100％DMSO中的100mM储备液，并在生理溶液中稀释至指定浓度(100μM、50μM、10μM、1μM和0.1μM)，其中还包含4μM或10μM大麻二酚。每天将钌红(Sigma,#R2751)制成10mM储备液离子蒸馏水，并在生理溶液中稀释至100μM。
细胞内钙成像
细胞(ATCC)在补充有10％FBS(Gibco)、GlutaMax(Gibco)、MEM和NEAA(Gibco)、4.5g/L葡萄糖和0.11g/L丙酮酸钠的DMEM(Gibco)中生长至50％汇合度。将细胞接种在μ-ibidi 8孔板中，并用TRPV2-RFP34(由日本群马大学的Itaru Kojima教授赠予)转染。孵育48小时后，对细胞进行钙成像。用Fura-2 AM(Life Technologies)进行细胞内钙测量，并根据先前所述的研究12进行修改。简而言之，在测量前1小时，用5μM Fura-2-AM加载细胞45分钟。用Tyrod溶液(119mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、6g/L葡萄糖、25mM HEPES pH7.4)替换细胞培养基。同时，将各自的处理物加入细胞中(终浓度为1％DMSO(对照)，5μM荜茇酰胺和10μM曲尼司特)，并允许细胞重新调整15分钟。在通过加入4μM或20μM大麻二酚(CBD)激活TRPV2之前，记录340nm和380nm激发引起的Fura-2 AM发射，持续1分钟。使用MetaFluor Analyst软件进行图像分析。用astatsa.com进行统计分析。钙成像采集后，立即用4％多聚甲醛固定细胞15min。用PBS洗涤细胞三次，并包埋在Fluoromount G中。使用LSMZeiss 880显微镜对样品成像。
免疫印迹
将HEK293细胞用TRPV2-RFP转染，用阴性对照siRNA(5nM)或TRPV2 siRNA(5nM)共转染，并孵育48h。将细胞用PBS洗涤并在裂解缓冲液(20mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl、1％Triton-X100、1mM EDTA、0.5％脱氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂混合物(Roche))中裂解，通过具有25g针头的注射器10次，在冰上孵育30min，并在18.000g和4℃下离心20min。在-20℃下用3倍体积的丙酮沉淀上清液过夜。将沉淀的蛋白质沉淀重新悬浮在适当体积的裂解缓冲液中，与5x还原SDS样品缓冲液合并，并煮沸10min。使用Tris-甘氨酸缓冲的SDS PAGE分离蛋白质，并在恒定的350mA下转移至PVDF膜，保持90min。将膜用在具有0.1％吐温20的Tris缓冲盐水中的10％奶粉封闭1h，并用针对TRPV2(Atlas抗体)和微管蛋白(Thermofisher)的抗体进行免疫检测。
动态光散射
将动态光散射(Zetasizer Nano S,Malvern,UK)用于测定化合物胶体聚集。在25℃下测量粒径。按其他地方所述测量水溶性，并在60分钟内进行连续测量35。在去离子水中稀释以获得100μM(0.1％DMSO)的分析物溶液后，在DMSO中制备100mM的荜茇酰胺储备溶液。通过连续稀释来测量胶体聚集。
荜茇酰胺活性的NCI-60筛选
对荜茇酰胺进行NCI-60人肿瘤细胞系筛选，并在59种NCI-60细胞系中，在四个剂量反应参数(GI50、IC50、LC50和TGI)下，以五个浓度水平(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM)测量了其活性。从CellMiner数据库下载了NCI-60细胞系中TRPV2归一化的基因表达(从五个微阵列平台合并的平均探针强度)36,37。将斯皮尔曼相关性用于检验针对57种癌细胞系的TRPV2表达水平与荜茇酰胺IC50值之间的相互依赖性。
荜茇酰胺活性的CTRP筛选
检索了来自癌症治疗反应门户网站(Cancer Therapeutics Response Portal,CTRP)v2的775种人类癌细胞系的TRPV2稳健多阵列平均值(RMA)归一化的表达和荜茇敏感性数据23。将剂量-反应曲线下面积(AUC)用作在16点浓度范围内测量的细胞系对荜茇酰胺敏感性的度量。较低的AUC值意味着较高的药物活性。将斯皮尔曼相关性用于检验TRPV2表达水平和荜茇酰胺的AUC之间的相互依赖性。
人类癌症群组中的TRPV2预测值的分析
从Firebrowse下载归一化的TRPV2基因表达(通过期望最大化的RNA-seq-RSEM(RNA-seq by Expectation Maximization-RSEM)进行定量)38，以及属于来自癌症基因组图集(TCGA)的30个群组的9,785个肿瘤样品的临床数据。使用TRPV2中值表达将患者分为两个亚组，通过R包生存率(R package survival)，使用每种癌症类型的Kaplan-Meier图和对数秩检验来评估预后意义39。
GTEx-TCGA比较
使用通过Toil40计算的TPM(每百万的转录物)值进行来自TCGA(507种低级别胶质瘤(LGG)和153种多形性胶质母细胞瘤(GBM)样品)的脑肿瘤与来自基因型组织表达(GTEx)项目的正常脑组织(1,141个样品)之间的TRPV2基因表达的比较。
TCGA肿瘤纯度分析
使用TIMER(肿瘤免疫评估资源(Tumor IMmune Estimation Resource))41进行LGG和GBM样品中TRPV2基因表达(log2RSEM)与肿瘤纯度之间的相关性分析。
脑单细胞中的TRPV2表达
从公共数据库26中检索了来源于4个人类GBM样品的3,589个单细胞中的归一化的TRPV2基因表达(每百万的log2计数)。从(基因表达大棚车数据组(Gene ExpressionOmnibus dataset)登陆号GSE73721)42中检索了来自成人脑健康组织的不同纯化细胞类型中的归一化的TRPV2表达(每千碱基百万片段-FPKM)。
毒性测定
将5,000个细胞/孔接种在含2％FBS的DMEM的96孔板中。第二天，以不同的浓度加入荜茇酰胺。每个孔中的总DMSO浓度不超过1％。在24小时、48小时和72小时，将培养基移出并用CellTiter-Blue(Promega，在培养基中为1:20)替换。在测量荧光强度之前，将板孵育90分钟。
免疫组织化学染色
将石蜡包埋的样品切片并进行抗原回收(Dako PT link，pH 6，95℃，20分钟)。用MeOH中的3％H2O2封闭30分钟后，将切片与抗TRPV2(Atlas抗体HPA044993，1:300)一起在室温下孵育1小时，然后与HRP缀合的二抗(Dako envision抗兔的，即用的)一起在室温下孵育30分钟。用DAB色原(3,3'-二氨基联苯胺，Dako)显影切片，并用Harris苏木精进行复染。使用NanoZoomer SQ(Hamamatsu)将载玻片数字化。
HEK293和U251中的过表达
将75,000个HEK293细胞接种在24孔板的每个孔中。第二天，用hTRPV2-RFP质粒(由日本群马大学Itaru Kojima教授赠予)转染细胞。孵育24小时后，更换培养基，并以5μM和10μM加入PL。24小时后，使用CellTitre-Blue(Promega)或膜联蛋白V，7-AAD染色评估细胞活力。使用流式细胞术评估转染效率。
将50,000个U251细胞接种在24孔板的每个孔中。第二天，用hTRPV2-RFP质粒转染细胞。孵育48小时后，更换培养基，并以5μM和10μM加入PL。24小时后，使用CellTitre-Blue(Promega)评估细胞活力。使用流式细胞术评估转染效率。
流式细胞术
收获细胞并在-20℃下用甲醇固定10分钟，然后用PBS(0.05％吐温20)洗涤。将样品与抗TRPV2(Atlas抗体，1:100于PBS中)一起孵育20分钟，然后与山羊抗兔Alexa 488(Abcam，ab150077，1:500于PBS中)二抗一起孵育。使用带有FACS Diva软件的BDLSRFortessa X-20进行分析。
膜联蛋白V，7-AAD活力测定
通过用培养基(HEK293)或TrypLE express(Gibco)洗涤来从板上收获细胞。离心后除去培养基，并将细胞用结合缓冲液洗涤两次，然后在室温下与膜联蛋白V-APC(eBiosciences,1:100)和7-AAD(Pharmigen,1:50)一起孵育30分钟。将样品用结合缓冲液稀释，并通过流式细胞术使用带有FACS Diva软件的BD LSRFortessa X-20进行分析。将具有单一染色的样品用作对照。
将荜茇酰胺封装至β-环糊精内
将乙醇中的荜茇酰胺(abcr GmbH)与2-羟丙基-β-环糊精(Carbosynth Ltd)一起在水中以1:2的比例孵育，并在室温下搅拌1小时。然后将溶液蒸发至干。
荜茇酰胺水凝胶支架合成和体内颅内植入
按先前所述形成水凝胶支架27-30。简而言之，将等份的固体含量为12.5％的树状物胺和固体含量为5％的葡聚糖醛混合以形成预固化盘。对于掺杂的支架，在形成水凝胶之前，将50mg/kg的预先用β-环糊精封装的荜茇酰胺加入到葡聚糖溶液中。形成预固化盘，并将其颅内植入携带GBM肿瘤的小鼠的右脑半球中，或用于体外测定。
从水凝胶支架体外释放荜茇酰胺
在37℃下，将单独的或掺杂有预先用β-环糊精封装的荜茇酰胺的水凝胶支架的预固化盘在PBS中孵育。在不同的时间点，从PBS中收集样品，并使用液相色谱-质谱法，通过积分对应于荜茇酰胺的峰下面积，对释放的荜茇酰胺进行定量。将数据绘制为每个时间点封装在水凝胶中的总荜茇酰胺的百分比。
利用掺杂有荜茇酰胺的水凝胶的细胞活力测试
用每孔50,000个U251细胞接种24孔板。24小时后，将含有单独的或掺杂有预先用β-环糊精封装的荜茇酰胺的水凝胶支架的预固化盘的Transwell渗透性支撑插入物(6.5mm插入物，8.0μm PET膜，Costar)加入到孔中。24小时、48小时和72小时后，使用CellTiter-Blue试剂((Promega，1:20于培养基中)测量细胞活力。
U251-GFP-荧光素酶细胞系的制备
将每孔50,000个细胞接种在6孔板中。第二天，将3mL慢病毒-GFP-荧光素酶(由Carlos Custodia在2016年11月生产)和4μL凝聚胺加入到孔中。48小时后除去含病毒的培养基，并用含10％FBS的新鲜DMEM代替。扩增细胞并使用FACS分选。将融合细胞的小瓶冷冻，直到需要进行体内实验。
掺杂有荜茇酰胺的水凝胶作为异种移植小鼠模型中的GBM的治疗
所有的小鼠研究均已获得伦理委员会的批准，并根据其规定和政策进行实验。在8周大的雄性无胸腺裸鼠(Charles River Laboratories)中建立了胶质母细胞瘤异种移植物。一旦用异氟烷麻醉小鼠并将其固定在立体定向框架上，在前囟侧面2.5mm和后面1.5mm，在右大脑上方进行直径为2.7mm的钻孔。使用钝头针和汉密尔顿(Hamilton)注射器将在体积为3μL PBS的250,000个胶质母细胞瘤细胞(U251-GFP-luc)以2.5mm的深度注入脑中(针降低3mm，然后缩回0.5mm，以产生针对细胞的口袋)。将针保持在原位5分钟，以使细胞回流最小化。一旦移除针头，就缝合切口并允许动物恢复。诱导肿瘤后8天，使用IVIS Lumina系统对小鼠成像。根据小鼠的生物发光信号对小鼠进行排序，并将其分成两个相等的组。诱导肿瘤后9天，经由腹膜内注射美托咪定和氯胺酮使小鼠麻醉，并重新打开缝线。在应用水凝胶(仅水凝胶支架的预固化盘(对于对照组)，或掺杂有预先用β-环糊精封装的荜茇酰胺(50mg/kg)的水凝胶支架的预固化盘)之前，定位颅骨中的洞，并破坏表面上的组织，以确保水凝胶与脑组织接触。再次缝合皮肤，并用阿替美唑(antipamezole)逆转麻醉。在实验过程中，在所有动物组上进行经由小鼠体重评价的体内毒性评估。水凝胶植入后三周，处死小鼠以确保肿瘤大小不超过人道终点。收获包括脑和脊髓在内的器官用于组织学评价。用苏木精和曙红对肿瘤的组织切片(n＝5)进行染色，并且为了进行免疫组织化学分析，将肿瘤(n＝5)用抗体抗TRPV2(Atlas抗体，HPA044993，稀释度1:200)和抗Ki67(Abcam ab15580，稀释度1:200)染色。基于肿瘤诱导后8天通过IVIS lumina测量的原始肿瘤大小增加554％的截止值绘制存活曲线。设定该值是因为在先前的实验中，肿瘤能够生长到这样的体积，使颅骨变形。这仅在头部的组织切片被分析后是可见的，并且决定设置一个值以确保终点是人道的并且与临床相关的。
肿瘤生长的分析
在无创纵向监测肿瘤进展后用IVIS Lumina生物发光和荧光成像系统(XenogenIVIS Lumina,Perkin Elmer)扫描小鼠。成像前15分钟，给小鼠皮下注射于PBS(Lonza)中的150μL D-荧光素(30mg/mL，Perkin Elmer)。在指定的时间点(颅内植入水凝胶盘后的第-1天、第3天、第6天、第10天、第13天、第18天和第21天)进行全动物成像。
实时定量RT-PCR(QPCR)
根据制造商的方案(Sigma,Darmstadt,Germany)，使用TRIzolTM试剂分离总RNA。使用Superscript III(Promega,Mannheim,Germany)将500ng RNA转换为cDNA，并使用25ngcDNA作为模板，使用GoTaq qPCR预混合物(Promega,Mannheim,Germany)进行定量PCR。使用StepOneplus检测系统(Applied Biosystems,Foster City,USA)对TRPV2进行定量PCR。热循环仪条件是95℃，保持20min，接着40个循环的95℃，3min，然后60℃，保持30sec。使用2-ΔCT方法计算mRNA表达并将其归一化为内部对照PGK1。
样品制备
按其他地方所述(Poschmann等人[1])，从冷冻的组织切片中提取蛋白质。简而言之，用TissueLyser(Qiagen,Hilden,Germany)在尿素缓冲液中将细胞均质化，然后进行超声处理。在14,000x g和4℃下离心15min后，收集上清液，并将所含蛋白质在-20℃下用丙酮以1:4(v/v)的比例沉淀过夜。经由Pierce 660nm蛋白质测定(Fischer Scientific,Schwerte,Germany)测定蛋白质浓度，并通过在50V下，在4％-12％Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Novex NuPAGE,Thermo Scientific,Darmstadt,Germany)上电泳迁移10min来对每个样品10μg的蛋白质进行脱盐。银染后，切下蛋白质条带，还原，烷基化，并用胰蛋白酶消化，然后经由超声处理进行肽提取。将肽溶解在16μL 0.1％TFA(v/v)中，并在应用邻苯二醛测定下测量肽浓度。
LC-MS分析
对于质谱分析，在纳米高效液相色谱电喷雾电离质谱仪上分析每个样品的15μL肽溶液。分析系统由经由纳米电喷雾离子源(Thermo Fischer Scientific,Bremen,Germany)与QExactive plus质谱仪偶联的RSLCnano U3000 HPLC组成。浓缩注入的肽，并在捕集柱(Acclaim PepMao C18，2cm x 100μm x 3μm粒径，
Figure BDA0002479767150000271
孔径，Thermo FischerScientific,Bremen,Germany)上，用0.1％TFA(v/v)以6μL/min的流速脱盐10分钟。随后，在60℃下，在分析柱(Acclaim PepMap RSLC C18,25cm x 75μm x 2μm粒径，
Figure BDA0002479767150000272
孔径，Thermo Fischer Scientific,Bremen,Germany)上，以300nL/min的恒定流速在120min梯度内分离肽。通过4％-40％的溶剂B(溶剂A：0.1％(v/v)甲酸于水中，溶剂B：0.1％(v/v)甲酸，84％(v/v)乙腈于水中)的梯度实现分离。之后，将肽在1400V的电压下电离，并引入以正模式运行的质谱仪中。以剖面模式在350-2000m/z的范围内，在70,000的分辨率下记录MS扫描，而在17,500的分辨率下记录串联质谱。用数据依赖的Top10方法和30％的归一化碰撞能量记录串联质谱。用重复计数1，持续100ms来激活动态排除。
计算质谱数据分析
将Proteome Discoverer(版本2.1.0.81,Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)应用于肽/蛋白质鉴定，其中采用UniProt数据库(人类；包括同种型；日期2018-05-01)，用Mascot(版本2.4.1,Matrix Science,London,UK)作为搜索引擎。将肽水平上的1％的错误发现率(p≤0.01)设置为鉴定阈值。用针对蛋白质组学(Proteomics)的Progenesis QI(版本2.0,Nonlinear Dynamics,Waters Corporation,Newcastle uponTyne,UK)对蛋白质进行定量。
途径分析
基因集包括来自包括GO、Reactome、KEGG在内的几个数据库的精选通路(2016年3月24日，并使用Cytoscape(www.cytoscape.org；p≤0.001,q≤0.05,相似性截止值0.5)进行可视化)。以原发性和复发性配对分析质谱数据，并将T值用于进行排序分析。创新途径分析(Ingenuity Pathway Analysis,IPA)使用的大量基因形成配对T检验(p≤0.05且倍数变化±2)。基于p≤0.05确定IPA的显著性。通过将平均值表达归一化为0(标准差为1)，并使用皮尔森相异度算法(Pearson’s dissimilarity algorithm)和Partek Genomic Suite(Partek Incorporated,Missouri,USA)中的平均连锁(average linkage)来进行热图和层次聚类。
我们假设1和2之间的药效团关系(图1A)涵盖了TRP调节的蓝图，TRP调节是针对1的迄今未知的药物靶标家族，这可以部分解释其有效的抗癌和/或抗转移性活性。通过机器学习进行的确信结合预测，我们进一步激发了1针对TRP通道的测试。我们使用的基于配体的算法的独特架构已经显示可有效识别被竞争性工具所忽略的NP的配体-靶标关系2。在现有的结合假设下，我们使用与荧光钙检测探针偶联的基于细胞的表达系统，针对一组人类的配体设门的TRP通道，包括香草素(TRPV)、经典的(canonical)(TRPC)、melastatin(TRPM)和锚蛋白(TRPA)对应物进行了筛选工作。值得注意的是，1没有激活任何测定的通道，而仅经由TRPV2剂量依赖性地有效抑制了由大麻二酚引起的钙流入(IC50＝4.6μM±0.13log单位，配体效率＝0.32；表1和图2a)。我们使用Fura2-AM钙探针在HepG2细胞中进行了钙成像实验，我们证实了所述细胞表达TRPV2(图2b,c)。用5μM的1进行细胞处理后，可以以与10μM浓度的对照化合物曲尼司特类似的的方式显著抑制由20μM大麻二酚引起的钙流入(p<0.01，单因素方差分析和Tukey事后检验)(图2b)。有趣的是，用4μM大麻二酚刺激并不会引起细胞内钙的增加(图2c)，这表明HepG2中TRPV2通道的拷贝数低，并且限制了其作为模型系统的应用。
然后，我们用所需的质粒DNA转染HEK293细胞，以允许TRPV2-RFP融合蛋白的瞬时过表达(图2d-h)。随后用4μM大麻二酚刺激转染的细胞，并用1处理以证实先前观察到的功能作用(图2d)。除了激活TRPV2外，大麻二酚还调节CB1 G蛋白偶联受体，并在微摩尔浓度下表现出复杂的多重药理19。为了排除由于TRPV2以外的靶标调节而引起的钙流入，我们还用大麻二酚刺激了未转染的HEK293。事实上，尽管调节其他靶标，但转染的HEK293细胞中的大多数钙流入是由TRPV2通道的接合引起的。
我们的数据进一步显示，转染的HEK293细胞中1对钙流入的抑制显著不同于未转染的对照细胞中的钙流入(p<0.001，单因素方差分析和Tukey HSD事后检验)。因此，通过1显示的效果归因于TRPV2调节。
使用膜片钳作为正交技术，我们证实了经由中断由4μM大麻二酚引起的钙电流与TRPV2通道的结合以及功能拮抗作用(IC50＝1μM±0.52log单位，图2i)。重要的是，用10μM大麻二酚刺激TRPV2时1的抑制作用被取消(IC50(1)>100μM,n＝2；EC50(大麻二酚)＝3.8μM,nHill＝0.6,n＝3；图2j)。因此，我们的数据表明了1的特异性和定向的分子识别，并且不存在对TRPV2的人工(artefactual)抑制。动态光散射数据进一步支持了胶体聚集体诱导的抑制作用(假阳性读出中的一种常见现象)的不存在。
通过1揭示的显著选择性部分是出乎意料的。根据CATS自相关拓扑药效团描述符(MOE 2016.10,化学计算组实现(Chemical Computing Group implementation))，虽然1与已知的TRPV配体具有较低的子结构相似性(平均Tanimoto指数＝0.10，Morgan指纹，半径2，2048比特)，但它仍然填充了图上记录的(charted)TRPV生物活性空间。所获得的活性特征也很有趣，并对早期发现程序中的化学物质优先化的标记系统提出了挑战。荜茇酰胺易于被常见的基于子结构的过滤标记，如泛测定干扰化合物(PAINS)20，以及Swill的迅速消除(rapid elimination of swill，REOS)21中的那些过滤，其尤其将Michael受体鉴定为结构警报。如通过质谱分析评估的，在生物正交条件下将1与N-和C-保护的半胱氨酸一起孵育可产生稳定的半胱氨酸加合物。Adams等人已经进行了类似的观察17。因此，考虑1与人蛋白质组中的游离半胱氨酸残基的混杂的靶标接合行为和总体反应性是合理的。为了解决1与TRPV2的不可逆结合的可能性，我们进行了一系列孵育和洗出实验(图3a，b)。令人欣慰的是，洗出后TRPV2的活性可以完全恢复，这提供了有力的证据，即结合是非共价的，或者在共价修饰TRPV2后，1呈现出快速的解离速率。
在获得的数据的激励下，我们接下来努力了解1与TRPV2的结合模式，为此我们进行了与大麻二酚的共孵育实验。随着1的浓度的增加，对大麻二酚EC50曲线的最大影响减小，这是非竞争性(别构)拮抗作用的典型特征(图3c)22。此外，1的浓度高于5μM时，大麻二酚的表观vmax值减小，这也与别构抑制相一致——激动剂浓度的增加不能超过1的功能作用(图3d)。鉴于曲线和Hill斜率都与我们先前的数据完全一致，Schild图进一步支持了抑制模式(图3e)。
接下来，我们使用等温滴定量热法来筛选100μM的1针对兔、抹香鲸和藏羚TRPV2直系同源物的不同构建体。化合物1不与任何构建体结合。尽管是初步的，但数据提示了分子识别的关键特征。我们对研究物种的TRPV2蛋白序列进行比对以鉴定差异，从而确定1的潜在结合结构域。令人惊讶的是，所谓TRPV2孔炮塔区域(pore turret region)在直系同源物之间差异很大。天然存在的肽与炮塔(turret)的结合已显示与TRPV1的接合有关23。然而，尚未建立TRPV2配体的这种关系，这进一步促使我们通过用兔对应物取代天然的人TRPV2炮塔来构建TRPV2嵌合体。重要的是，在钙成像实验中，用嵌合体TRPV2通道转染的HEK293细胞对4μM的大麻二酚同样敏感，这提供了指示，即其结合位点拓扑结构并未受到干扰。
然后，我们研究了1对TRPV2的调节是否与其抑制细胞活性有关。为此，针对5种不同浓度的代表9种不同的癌症类型(图S3)的人癌细胞系的NCI-60组24，测试了1的推定的抗增殖活性。我们将抗增殖活性参数GI50和IC50转换为它们的-z分数，由此高值对应于细胞系对1的高度敏感性。总体而言，发现血液、结肠和皮肤癌细胞系对1最为敏感(图4a，b)。
为了探讨TRPV2对1的抗增殖效果的作用，我们寻求1引起的细胞抑制作用与TRPV2mRNA表达之间的相关性。与我们的体外分析一致，基于GI50(斯皮尔曼相关系数(ρ)＝0.28，p<0.05；图4c)和IC50(ρ＝0.29，p<0.05；图4d)值，表达TRPV2的细胞系对1非常敏感。据我们所知，以前尚未将TRPV2拮抗作用与抑制癌细胞生长联系起来。然而，不表达TRPV2的细胞系对1的敏感性表明对另外的靶标的调节。有趣的是，对于其他已知的1的靶标，即STAT318,25和NF-kB26，未观察到显著相关性。尽管如此，我们对mRNA表达水平的分析并未捕获这些蛋白质的活性对其他调节，例如STAT3磷酸化作用或NF-kB抑制降解的水平的高度依赖性。随后，我们将分析扩展到NCI-60组可公开获得的所有mRNA表达数据。将根据基因表达与1的GI50之间的斯皮尔曼相关系数进行排序的基因用于运行基因集富集分析(GSEA)27,28，允许我们鉴定表明潜在靶标(归一化富集分数(NES)为正的基因集，图4e)和耐药性(负NES，图4e)机制的途径(错误发现率<5％)。RNA加工——例如剪接体、核糖体、RNA降解、RNA聚合酶——属于正相关的途径(图4e)，这可能是由于它们在1活性较高的快速分裂细胞中具有更高的活化。正富集的抗原加工和呈递途径中的基因不与NF-kB的靶标(人免疫应答的主要介导物29)重叠，表明1可能影响不同的免疫机制。
好奇于NCI-60组的血液和皮肤癌中TRPV2 mRNA的高表达，我们探索了TRPV2作为预后标志物和潜在药物靶标的用途。通过分析来自基因型-组织表达项目的RNA-seq数据30,31，我们证实了血液但非正常皮肤组织中TRPV2的较高表达。我们进一步研究了癌症基因组图集(TCGA,https://cancergenome.nih.gov/)肿瘤样品中的TRPV2表达。事实上，TRPV2在人血液和皮肤癌中高度表达，但是两个相应的TCGA群组中正常组织的表达数据的缺乏使得无法测试那些癌症类型中的TRPV2过表达。有趣的是，肺在正常组织中表现出最高的TRPV2表达，这与在TCGA肺肿瘤样本中的非常低的表达水平相反，后一现象也在NCI-60癌细胞系中观察到。因此，生存分析揭示了TRPV2仅在四个不同的群组中的肺癌类型中的预后价值(p<0.05)32-35。较低的表达与较差的患者生存相关。
总而言之，这些结果突出了TRPV2作为肺癌的潜在预后标志物。考虑到基因表达分析的注意事项，例如mRNA水平可能无法完全翻译成蛋白质含量，我们的数据仍具有指示意义，并且应以健康的怀疑态度进行解释。考虑到TRPV2已显示在除了NCI-60组中取样的那些以外的癌细胞系和阶段中的蛋白质水平上过表达36，在其他实例中1经由TRPV2调节来诱导表型变化是可行的。
TRPV2已明确地涉及转移性乳腺癌和前列腺癌中作为细胞迁移的介导物36-39。为了探究化合物1-TRPV2相互作用对细胞迁移的重要性，我们首先测试了前列腺癌PC3和LNCaP细胞系对1的敏感性。我们用5μM和10μM的1处理细胞，这与先前确定的针对TRPV2的IC50值一致。在两种情况下，细胞活力都在24小时内受损。相反，我们使用表达TRPV2的HepG2细胞系建立了24小时长的伤口愈合划痕测定，其中在实验时程中以5μM的1处理不会诱导显著的细胞死亡。化合物1以与TRPV2抑制剂对照曲尼司特相似的方式显著减少HepG2细胞随时间的迁移(图5a-c)。该结果在另一种肝癌细胞系——Huh-7中可重现。此外，1显示出的抗迁移作用取决于中等的钙浓度，表明破坏钙转运是一种作用机制40,41。为了进一步评估TRPV2调节在HepG2迁移环境中的重要性，我们手动收集了与癌细胞迁移相关的一组175种大分子42-46。例如，这些包括激酶、GPCR、离子通道和在钙信号传导中起关键作用的转录因子(图5d)。从ENCODE47收集HepG2 RNA-seq数据，并计算每个靶标的平均基因表达。我们的数据显示，与89％的分析靶标相比，TRPV2过表达。虽然多重药理学解释了1对癌细胞迁移的净效应，但TRPV2的抑制在最相关的机制中起重要作用。
hTRPV2是GBM的不良预后的标志物
为了探究hTRPV2对荜茇酰胺(PL)抗增殖效应的作用，我们寻求PL引起的细胞抑制作用与hTRPV2 mRNA表达之间的相关性。为此，我们针对癌细胞系的NCI-60组筛选了PL，并分析了可公开获得的CTRP数据23。令人欣慰的是，表达hTRPV2的细胞系在两种药物筛选中均对PL非常敏感，这表明hTRPV2作为癌症中的药物靶标的重要性(斯皮尔曼相关系数，对于NCI-60和CTRP组分别为ρ＝0.29和0.24，p＝0.03和1.5×10-11；图4d)。
为了进一步研究hTRPV2在癌症中的作用，我们在来自癌症基因组图集(TCGA)的30个群组中测试了其预后价值。事实上，发现高的hTRPV2表达与脑肿瘤中的不良患者生存强烈相关(p＝4.37×10-13，对数秩检验)，包括单独地低级别胶质瘤(LGG)24和GBM25群组中(分别为p＝0.028和0.0087，对数秩检验；图6)。另外，我们发现hTRPV2表达伴随肿瘤分期显着增加(图16)。在LGG和GBM样品中，hTRPV2表达与肿瘤纯度呈负相关(斯皮尔曼相关系数，分别为p＝-0.45和-0.36，p＝7.5×10-25和3.1×10-14；图17)，因此表明其主要在肿瘤微环境中表达。接下来，我们分析了来自一组呈现GBM II-IV级患者的脑肿瘤组织样品中的hTRPV2的表达。免疫组织化学分析揭示，hTRPV2在肿瘤细胞中的表达(点状染色)确实比在肿瘤边缘的表达更多(图7)。最重要的是，我们观察到肿瘤中上皮细胞的表面和细胞质中的高级别GBM过表达hTRPV2。总之，这与高的hTRPV2表达在血管生成和肿瘤进展中起作用并与不良预后有关的事实有关。事实上，我们的结果与从完全独立的数据集26的生物信息学分析中获得的发现类似(图8左图)。
hTRPV2过表达引起增加的PL毒性
已经在计算机上鉴定了hTRPV2表达与GBM等级之间的相关性之后，我们使TRPV2+胶质瘤U251细胞经受hTRPV2的瞬时过表达，目的是加剧涉及hTRPV2的信号传导途径。如通过CellTiter Blue、膜联蛋白V和7-AAD染色评估的，与未转染的对照相比，用5μM PL处理的转染细胞显示出降低的活力(p＝0.0002，n＝9，曼-惠特尼检验)(图8，右图)。该数据充分证实了我们的分析，并且证实了hTRPV2不仅是PL的细胞靶标，而且配体-靶标接合也会导致细胞死亡。重要的是，U251细胞以剂量和时间依赖性方式对PL敏感，这可把hTRPV2的调节计算在内。用瞬时TRPV2转染的HEK细胞可以获得相同的结果。
掺杂荜茇酰胺的水凝胶作为GBM的新型局部治疗
接下来，我们探索了PL在GBM的异种移植小鼠模型中的治疗潜力。我们将PL以1:2的比例封装在环糊精中，这大大改善了其水溶性。此外，为了提高治疗功效，我们创建了适合手术后施用的疗法。为此，我们设计了可植入水凝胶，其掺杂有封装在β-环糊精中的PL。使用这种新型材料将PL局部和持续地递送到脑中，我们在肿瘤部位获得了高浓度的PL，并且至健康组织和器官的最小泄漏。为了使PL能够释放到肿瘤组织中并避免物质迁移和释放到邻近部位，水凝胶上装饰有如先前报道的与组织胺相互作用而形成粘合键(adhesivebonds)的醛基团27-30。我们的水凝胶物质在生理条件(PBS，pH 7.4，37℃下)下的PL释放速率的特性显示，在前4小时内有显著的排放释放，然后稳定释放少量的PL(全部的3％)，持续至少192小时。该数据提供了体外毒性实验的基本原理，其中掺杂有PL的水凝胶在与U251细胞一起孵育仅24小时后就能够诱导近乎完全的细胞死亡。空的水凝胶对细胞活力没有任何影响。
我们继续研究掺杂PL的水凝胶在GBM小鼠模型中的体内治疗功效。在用2.5×105个U251-GFP-luc细胞诱导肿瘤后8天，将装载有PL的水凝胶支架植入无胸腺裸鼠(Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)的脑的幕上区(图9)。对于对照组，我们使用空的水凝胶，即缺乏PL组分的水凝胶作为植入物。然后通过表达荧光素酶的GBM细胞系的生物发光，经由实时成像系统，以固定的间隔，在水凝胶植入后21天和肿瘤诱导后30天，测量了肿瘤进展的抑制。在水凝胶植入后21天，如通过生物发光成像所证明的，掺杂PL的水凝胶导致几乎完全缓解(p＝0.0159，n＝5，曼-惠特尼检验，图10)。事实上，两组之间的生存率差异显著(p＝0.0494，对数秩(Manel-Cox检验；图11)，这可能代表了GBM治疗的一项重大成就。此外，为了验证构建体的安全性，在水凝胶植入后21天从小鼠收获器官，并染色用于病理学分析。我们的数据清楚地显示，当与空的水凝胶对照组相比时，体内应用掺杂的水凝胶不会对肺、肝、肾、脾、心脏和肠造成任何损害。然而，根据治疗后肿瘤的大小减小，肿瘤组织显示血管化的大大降低。如通过稳定体重的维持和施用位点处缺乏坏死所指示的，在水凝胶暴露后21天，在所有动物组中均未观察到体内毒性或其他生理并发症。因此，我们的数据表明装载PL的水凝胶是生物相容的。基于这些结果，我们可以得出结论，即经由葡聚糖-树状物水凝胶颅内施用PL为GBM治疗提供了新的选择。
TRPV2在成对的复发GBM中更高地表达
TRPV2与更具攻击性的表型相关，因此，我们决定对TRPV2的GBM的原发性和再生性对进行测试。在纳米高效液相色谱电喷雾电离质谱仪上分析了11种原发性和复发性成对样品。TRPV2在原发性和复发性样品之间没有差异调节。事实上，在质谱法中没有检测到肽。当查看存档的数据时，我们可以看到，在3299份保藏的人类研究中，只有88份检测到TRPV2，而GAPDH可以被观察到336次。由于TRPV2具有6个高度疏水的跨膜结构域，因此只有使用疏水特异性裂解缓冲液的研究才能检测到TRPV2。因此，我们进行了qRT-PCR来测试mRNA水平，事实上，TRPV2在复发的人群中更高地表达(图12)。信号归一化后，去除具有缺失值的蛋白质，并进行配对T检验。使用预先排序的基因集富集分析(GSEA)来分析排序的T值，而使用创新途径分析(IPA)处理重要的蛋白质(p≤0.05和倍数变化±1.5)。在原发性样品中，我们观察到与基因和mRNA调控以及粘附和蛋白质定位有关的术语。氧化磷酸化和神经递质信号传导均涉及钙的运输，其在复发性样品中上调，表明TRPV2在复发性样品中更具活性。显示了排序最高的基因集Hallmark氧化磷酸化的热图，显示了表达确实增加，然而是在单独样品水平上的增加。接下来，我们查看了IPA的结果，并观察到类似的经典途径受到调控(图13)。如在表2中可以观察到的，线粒体功能障碍和氧化磷酸化是最高的命中。然后，我们进行了上游分析，并选择了涉及线粒体功能障碍的前4种候选物。我们观察到RICTOR在原发性样品中具有活性，这会导致抑制与氧化磷酸化有关的基因。然而，约三分之一的蛋白质没有被下调，表明RICTOR可能不是线粒体功能障碍的上游调节物。相反，我们的结果表明，参与线粒体生物发生的PPARGC1A(显示在图14中以及图15的热图中)是潜在的上游调节剂，其负责线粒体功能障碍并增加了复发肿瘤中的氧化磷酸化作用。
NP及其生物学上经过预先验证的架构为开发化学生物学和分子医学的探针和药物前导提供了经常未开发的(often-untapped)机会。但是，仅对一部分的NP进行了生物活性测试，尤其是通过表型测定。因此，迫切需要鉴定以生物学相关浓度接合的靶标，以使得能够进行有根据的药物设计。对药理网络即中靶与脱靶的相互连接的深入了解，提供了设计优选的多药理学特性的配体的解决方案，并减轻了可能导致不良药物反应和消耗的特征。尽管具有结构不利因素(structural liabilities)，但化合物1显示出有前景的抗癌特性。使用药效团相似性原理和可公开获得的机器学习方法，我们将1与TRPV2的功能的、配体有效的和别构的拮抗作用相关联。重要的是，化合物1在TRP通道家族中显示出极好的选择性，并且可以为合理的分子设计提供主要的灵感来源。此外，考虑到NP化学空间中先前不存在TRPV2拮抗剂，结果是前所未有的。本文中表征的机制为观察到的抗癌和抗转移作用16和潜在的靶标易处理性提供了迄今为至先前未知的解释。TRP通道是癌症环境中的一类新兴的潜在药物靶标48，但TRPV2仍在很大程度上未被开发36。尽管化合物1需要选择性TRPV2调节的特征，但其不应直接用作TRPV2化学探针。事实上，STAT3以相同的浓度的接合18可能会导致引起混淆的测定读出。
从计算的视角来看，我们的方法依赖于机器学习工具、叠加算法和能量最小化力场。因此，假阳性预测也应该是可以预期的。尽管如此，我们的结果显示，可以迅速地采用2D和3D药效团描述符来表明和揭示生物活性化学物质的新生物学。
本文公开的数据为将来在癌症药物发现背景下探索TRPV2，以及1作为药物前导的潜在价值提供了平台。最终，我们预见了将复杂的表型读出去卷积为大分子水平的相关计算技术的广泛范围和主要应用。通过利用分子医学中药理学网络的建立，该概念和相关概念可以发现作为系统生物学中的一般方法的适用性。
Figure BDA0002479767150000371
对照-TRPV2：曲尼司特(IC50＝2.3μM±0.25log单位)；TRPA1：钌红(IC50＝2.3μM±0.19log单位)；TRPC7：SKF 96365(IC50＝103μM±0.27log单位)。所有实验均以一式双份进行。
表1
Figure BDA0002479767150000372
表2
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Claims (37)

1.治疗特征为瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)表达的癌症的方法，其包括：
向有需要的患者施用荜茇酰胺化合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述荜茇酰胺化合物是TRPV2的可逆拮抗剂。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述荜茇酰胺化合物是荜茇酰胺或其类似物、衍生物或前药。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述荜茇酰胺化合物具有以下式1及其盐、溶剂化物和保护的形式：
Figure FDA0002479767140000011
其中Q1是O或S，
Ar是任选取代的芳基，
-D-选自-C(O)-、-C(S)-、-CH(OH)-和-CH(SH)-，并且
-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成任选取代的杂环，或者-R1和-R2各自独立地选自氢和任选取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基和芳基。
5.如权利要求4所述的方法，其中Q1是O。
6.如权利要求3或权利要求5所述的方法，其中-D-是-C(O)-或-C(S)-，如-C(O)-。
7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成任选取代的杂环，如杂环。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述杂环是部分不饱和的。
9.如权利要求8所述的方法，其中-D-是-C(O)-或-C(S)-，并且所述不饱和部分与-C(O)-或-C(S)-缀合。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述杂环是单环，如4-9元环，如4-6元环，如5元环或6元环，如6元环。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成α,β-不饱和的δ-内酰胺，如其中-R1和-R2连同它们所连接的-N-D-一起形成5,6-二氢吡啶-2-酮-1-基。
12.如权利要求4-11中任一项所述的方法，其中Ar-是任选取代的碳芳基，如苯基，或者任选取代的杂芳基，如吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基和吡咯基。
13.如权利要求12所述的方法，其中Ar-是任选取代的苯基。
14.如权利要求4-13中任一项所述的方法，其中Ar-是任选地被一个或多个基团，如一个、两个或三个基团取代的芳基，所述基团选自：卤素、氰基、-RS1、-OH、-ORS1、-SH、-SRS1、-NH2、-NHRS1、-NRS1RS2、-COOH、-CONH2、-CONHRS1、-CONRS1RS2、-NHCORS1、-N(RS1)CORS1，其中每个-RS1和每个-RS2独立地是任选地被卤素取代的烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基，或者-RS1和-RS2可以一起形成杂环。
15.如权利要求14所述的方法，其中Ar-是任选地被一个或多个基团，如一个、两个或三个基团取代的芳基，所述基团选自：-OH、-ORS1、-SH和-SRS1，如-SRS1和-ORS1，如-ORS1。
16.如权利要求4-15中任一项所述的方法，其中Ar-是三烷氧基苯基，如三甲氧基苯基。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述荜茇酰胺化合物是荜茇酰胺。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述患者先前被鉴定为患有特征为TRPV2表达的癌症或者处于患特征为TRPV2表达的癌症的风险。
19.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其还包括在所述施用之前将所述患者鉴定为患有特征为TRPV2表达的癌症或处于患特征为TRPV2表达的癌症的风险。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中相对于对照细胞，所述患者中的一个或多个癌细胞具有增加的TRPV2表达。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述患者中的一个或多个癌细胞中的TRPV2表达大于预定的阈值。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中癌症是皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、脑癌或血癌。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述胶质母细胞瘤是原发性的或复发性的。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述荜茇酰胺化合物与第二治疗剂组合施用。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述第二治疗剂是抗癌化合物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述抗癌化合物选自：蒽环霉素、阿糖胞苷、长春新碱、L-天冬酰胺酶、环磷酰胺、菲伯免疫蛋白、达卡巴嗪、甲氨蝶呤和6-巯嘌呤、苯丁酸氮芥、烷化剂、环磷酰胺、皮质类固醇、伊马替尼、克拉屈滨、喷司他丁、利妥昔单抗、苯丁酸氮芥、紫杉烷和阿霉素。
29.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述荜茇酰胺化合物与辐照组合施用。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述荜茇酰胺化合物被封装在水凝胶中。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述水凝胶是环糊精。
32.荜茇酰胺化合物，其用于权利要求1-31中任一项所述的治疗特征为瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)表达的癌症的方法中的用途。
33.荜茇酰胺化合物在制备用于权利要求1-31中任一项所述的治疗特征为瞬时受体电位香草素2通道(TRPV2)表达的癌症的方法的药物中的用途。
34.如权利要求32所述的用于所述用途的荜茇酰胺化合物或如权利要求33所述的用途，其中所述荜茇酰胺化合物被封装在环糊精中。
35.如权利要求34所述的用于所述用途的荜茇酰胺化合物或用途，其中所述封装的荜茇酰胺化合物包含在水凝胶中。
36.选择用荜茇酰胺化合物治疗的癌症患者的方法，其包括：
提供来自癌症患者的癌细胞的样品，
确定所述癌细胞中TRPV2表达的存在，以及
选择具有表达TRPV2的癌细胞的癌症患者用于用所述荜茇酰胺化合物进行治疗。
37.对癌症患者进行预后的方法，其包括：
提供来自癌症患者的癌细胞的样品，以及
确定所述癌细胞中的TRPV2表达水平，所述TRPV2表达水平指示所述患者的预后。
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