CN102146054A - 荜茇酰胺衍生物及其药物组合物和在制备抑制肿瘤生长的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了荜茇酰胺衍生物在制备治疗癌症的药物中的用途以及以荜茇酰胺衍生物为活性成分的可用于治疗癌症的药物组合物，本发明提供数种从天然植物中提取的以及人工合成的荜茇酰胺衍生物，实验证明这些化合物可以选择性的杀死癌细胞，而对正常细胞的生理功能没有影响，动物体内实验证明这些化合物可以明显抑制肿瘤的生长，同时对动物的正常生理功能没有影响，从而表明可以利用这些化合物制备可选择性杀死癌细胞的新型抗癌药物。

Description

荜茇酰胺衍生物及其药物组合物和在制备抑制肿瘤生长的药物中的用途

技术领域

本发明涉及用于治疗癌症的药用性化合物领域。具体地说，本发明涉及荜茇酰胺衍生物在制备治疗癌症的药物中的用途以及以荜茇酰胺衍生物为活性成分的可用于治疗癌症的药物组合物。

背景技术

据世界卫生组织介绍：20世纪80年代，全世界癌症发病每年约700万人，癌症死亡每年约500万人。到90年代，全世界癌症发病每年约1000万人，每年死亡约700万人。癌症在全球的危害日趋严重。在我国70年代中期，卫生部全国肿瘤防治研究办公室组织全国癌症死亡回顾调查，当时，癌症发病每年约90万人，癌症死亡每年约70万人。到90年代初期(1990年～1992年)据全国肿瘤防治研究办公室抽样调查结果，癌症发病全国每年约160万人，死亡每年约130万人。我国恶性肿瘤的发生率和死亡率在过去的20年中明显上升，在我国的一些主要大城市中，恶性肿瘤已居死亡病因中之首。

目前癌症临床治疗主要是通过外科手术、放射线治疗、化学治疗等方法。外科手术(Surgery)利用手术将固性肿瘤摘除(Lumpectomy)，而肿瘤的摘除须于癌症的早期，癌细胞尚未转移时进行，但大多数的癌症未于早期发现，如胰腺癌、肝癌、肺癌、食道癌等，而且某些部位的癌症手术非常困难，如头颈癌及脑癌等；手术切除通常无法完全清除癌细胞，术后的复发可能性及导致癌细胞转移可能性也极高。放射线治疗(Radiotherapy)利用放射线同位素如Co⁶⁰，以体外照射的方式，对癌症细胞的基因造成破坏，使细胞死亡，但是放射线同时也会对正常的细胞造成伤害，目前已研发利用单株抗体结合放射线同位素或癌症化学药物，有如导弹的功能，直接攻击癌细胞，避免正常细胞遭受伤害，同时减少药物副作用。化学疗法如同放射线疗法，大多数的化学药物是针对癌细胞快速生长的特点所施予的，但是对某些正常细胞如毛囊细胞或骨髓细胞等，生长快速的细胞仍会大幅度造成伤害，而导致免疫系统受损、掉发及呕吐等可能严重危及生命的副作用。一般使用的化学治疗药物有抑制核苷酸生成的抗代谢药物(如5-Fluorouracil、Methotrexate等)、干扰基因复制的烷基化剂(如Cyclophosphamide、Chlorambucil、Mechlorethamine等)、干扰酵素作用的抗生素类药物(如Dactinomycin、Doxorubicin等)、抑制有丝分裂的药物(如Paclitaxel、Vincristine等)、类固醇或荷尔蒙拮抗剂(用以治疗对荷尔蒙敏感的肿瘤，如Predmospne、Tamoxifan等)。

如何降低治疗技术对身体机能的不可逆损伤，提高癌症治愈率，改善患者生存质量是癌症治疗过程中亟待解决的问题。因此，研究开发新的抗癌药物成了医学界经久不衰的研究热点。而在新抗癌药物的研发中，那些可以选择性地杀死癌细胞而对正常细胞无害的药物又是热点中的热点，这是因为传统的治疗癌症的药物不能将正常细胞与癌细胞区别对待，如果使用常规的给药手段，则会造成给药区域的大量正常细胞死亡，造成严重的副作用。而如果开发出了可以选择性地杀死癌细胞的抗癌药物，则上述缺点将不复存在，患者也会从痛苦的化疗过程中解脱出来。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种荜茇酰胺衍生物在制备治疗癌症的药物中的用途以及以荜茇酰胺衍生物为活性成分的可用于治疗癌症的药物组合物。

荜茇为胡椒科植物荜菝的果穗。荜茇多年生草质藤本，生于海拔约600米的疏林中。分布于云南东南至西南部。福建、广东和广西有栽培。9月由果穗由绿变黑时采收，除去杂质，晒干。已商品化的有云南荜菝和进口荜菝两种。

荜茇为中、蒙药常用药材，诸多古医药学著作中对此都有记载，如《本草纲目》：“荜茇，为头痛、鼻渊、牙痛要药，取其辛热能入阳明经散浮热也。”《本草便读》：“荜茇，大辛大热，味类胡椒，入胃与大肠，阳明药也。温中散寒，破滞气，开郁结，下气除痰，又能散上焦之浮热，凡一切牙痛、头风、吞酸等症，属于阳明湿火者，皆可用此以治之。”。

发明人最近发现，从荜茇提取物中分离出来的一些化合物能够杀死肿瘤细胞，体外和动物体内实验都证明这些化合物能够强烈抑制肿瘤细胞的生长，而同时却对正常细胞的生理机能没有影响，而这个发现对癌症的有效治疗具有重大的意义，使用这些化合物作为有效成分制备出来的抗癌药物将能有效地选择性杀死癌细胞，而且只需要通过常规的给药途径对治疗对象给药即可。

发明人从荜茇提取物中分离出来了一系列的化合物，这些化合物的结构与下图结构式类似，其中有某些化合物具有抗癌活性，而有些化合物则没有。发明人发现具有抗癌活性的化合物都具有上面结构式

中圆圈中的结构，在进一步的化学修饰中，发明人发现圆圈中的结构一旦改变，化合物的抗癌性能就消失或者减弱很多，例如将上图中箭头所示位置的单键换为双键或者双键换为单键，化合物的抗癌性能就大大降低甚至消失；相反，在圆圈之外的部分进行化学修饰，则不会减弱化合物抗癌性能，某些情况下甚至能增强化合物的抗癌性能，例如本发明提供的化合物2、3和4，都在天然分离出的化合物基础上增强了抗癌性能。在上述发现的基础上，我们总结出上面所示的通式，其中R₁、R₂基团可以任意地选自各种取代基，这些化合物都具有良好的抗癌性质。

根据本发明的一方面，本发明提供了荜茇酰胺衍生物，所述荜茇酰胺衍生物为具有式(1)结构的化合物或其可药用的盐、酯或前药：

其中，R₁和R₂各自独立地选自氢原子、C_1～10的烷基、C_2～10的烯基、C_2～10的炔基、C_1～10的烷氧基、被杂原子取代的C_1～10的烷氧基、卤素原子、CF₃、CCl₃、CI₃、CN、NO₂、NH₂、OH、C_2～10的酰基、C_6～10的芳基、5或6元杂环基。优选地，所述R₁选自氢原子、C_1～10的烷氧基、C_1～10氨基烷氧基；R₂选自C_6～10芳基烷氧基、C_5～10的哌啶基烷氧基、C_1～10的烷氧基。

优选地，式(1)的化合物为式(2)的化合物：

优选地，式(1)的化合物为式(3)的化合物：

优选地，式(1)的化合物为式(4)的化合物：

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的所述荜茇酰胺衍生物、以及任选的药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、辅料或媒介物。

根据本发明的再一方面，本发明提供所述荜茇酰胺衍生物或药物组合物在制备抑制肿瘤生长的药物中的用途。

优选地，所述肿瘤是恶性肿瘤、恶性黑色素瘤或恶性毒瘤。其中，所述肿瘤为皮肤癌、肝癌、食道癌、胃癌、血癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌或肾癌。

附图说明

图1Caspase 3活性检测化合物的抗肿瘤活性。A)HT-29细胞在10μM化合物2处理24小时后，与FITC-VAD-FMK(5μM)孵育半小时，加入Black blue试剂，十分钟后利用荧光显微镜检测，右侧为对照；B)采用相同的方法，用化合物3对HT-29细胞进行相同的处理。

图2不同浓度化合物4处理HT-29细胞。浓度分别为0.25μM，0.5μM，1μM，2μM，4μM，8μM，10μM，15μM。

图3体内抗肿瘤活性。在裸鼠身上嫁接HT-29细胞(1×10⁶)，当肿瘤达到5毫米后，通过静脉注射不同浓度的化合物2，0mg/Kg，0mg/Kg，10mg/Kg，10mg/Kg，25mg/Kg，三周后测量肿瘤大小。实验中一共使用了25只鼠，其中使用了25mg/Kg化合物2的鼠有两只未检测出明显的肿瘤。

图4在正常条件下，老鼠骨骼肌肌母细胞C2C12，能被诱导分化成为肌管。在10μM化合物2的刺激下，仍然能正常生长(左图)和分化(右图)。与对照相比，细胞生长周期、形态没有任何区别。

图5利用从1-3天幼鼠分离得到的心肌细胞，考察药物对细胞生长和收缩频率的影响。在10μM化合物3的刺激下，与对照没有刺激相比，心肌细胞的生长和收缩频率没有明显变化。左图：培养第一天；右图：培养第七天。在开始培养细胞时，加入化合物3，在每次换液时，重新加入新配好的化合物3。

具体实施方式

以下将通过具体的实施例说明本发明，但是这些具体的实施例不应当理解为对本发明的限制，对某些细节进行修改将仍然落入本发明的保护范围之内。化合物2、3和4为发明人合成、筛选出来的抗癌性能最好的几个实例，以下的实验数据只是最优的实验结果，而与化合物2、3和4具有类似结构的通式化合物(1)也都具有良好的抗癌性能。

实施例1

本发明的化合物1(结构式见附图1)中，当R₁＝-OCH₃，R₂＝CH₃的化合物a是从天然植物中提取获得的。

实施例2

化合物式2按如下步骤合成：

第一步：在一个100mL的圆底烧瓶中，加入1g(1当量)的反应物(1)和4.10g(1当量)的反应物(2)。在氩气保护下，加入50mL无水DMF溶剂。待反应物全部溶解后，在0℃下加入272mg(1.1当量)的氢化钠。反应在0℃下搅拌2小时后，逐步升温到室温；然后继续搅拌过夜。反应完成后在高真空下出去大部分DMF后，用二氯甲烷对反应浓缩液进行萃取。合并有机相，用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗后，用旋转蒸发仪浓缩。最后反应产物(3)通过硅胶分离柱进行提纯。最后产物：2.65g；产率：90％。质谱(HRMS，ESI)：288.1161(M+1)。元素分析：C，66.71；H，5.99；N，4.90；O，22.40。

第二步：在一个100mL的干燥圆底烧瓶中，加入2.35g(1当量)的反应物(3)和3.27g(3当量)的无水三氯化铝。在氮保护下，加入60mL无水二氯甲烷溶剂。待反应物全部溶解后，反应在室温下搅拌2小时后，有橙色沉淀生成；加入20mL无水二氯甲烷后反应继续搅拌过夜。反应完成后在真空下除去大部分溶剂。最后反应产物(4)通过硅胶分离柱进行提纯。最后产物：1.98g；产率：89％。质谱(HRMS，ESI)：204.1011(M+1)。元素分析：C，65.82；H，5.61；N，5.22；O，23.35。

第三步：在一个100mL的干燥圆底烧瓶中，加入1.67g(1当量)的反应物(4)和0.63g(1.1当量)的苯酚，3.21g的三苯基膦后，在0℃下加入3.09g DIAD(2.5当量)。在氮气保护下，加入60mL无水四氢呋喃溶剂。反应在0℃下搅拌2小时后，除去冰浴，反应升至室温后反应继续搅拌过夜。反应完成后在真空下除去溶剂。最后反应产物式2(A)通过硅胶分离柱进行提纯。最后产物：1.78g；产率：83％。质谱(HRMS，ESI)：350.1307(M+1)。元素分析：C，72.22；H，5.44；N，3.99；O，18.35。

实施例3

化合物式3按如下步骤合成：

第一步：在一个100mL的圆底烧瓶中，加入1g(1当量)的反应物(1)和4.72g(1当量)的反应物(5)。在氩气保护下，加入50mL无水DMF溶剂。待反应物全部溶解后，在0℃下加入272mg(1.1当量)的氢化钠。反应在0℃下搅拌2小时后，逐步升温到室温；然后继续搅拌过夜。反应完成后在高真空下出去大部分DMF后，用二氯甲烷对反应浓缩液进行萃取。合并有机相，用饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗后，用旋转蒸发仪浓缩。最后反应产物(6)通过硅胶分离柱进行提纯。最后产物：2.77g；产率：85％。质谱(HRMS，ESI)：318.1259(M+1)。元素分析：C，64.35；H，6.01；N，4.39；O，25.25。

第二步：在一个100mL的圆底烧瓶中，加入2.55g(1当量)的反应物(6)和3.21g(3当量)的无水三氯化铝。在氮保护下，加入50mL无水二氯甲烷溶剂。待反应物全部溶解后，反应在室温下搅拌2小时后，有黄色沉淀生成；加入30mL无水二氯甲烷后反应继续搅拌过夜。反应完成后在真空下除去大部分溶剂。最后反应产物(7)通过硅胶分离柱进行提纯。最后产物：2.01g；产率：82％。质谱(HRMS，ESI)：304.1105(M+1)。元素分析：C，63.39；H，5.71；N，4.63；O，26.27。

第三步：在一个100mL的干燥圆底烧瓶中，加入2.00g(1当量)的反应物(7)和1.46g(1.1当量)的反应物(8)，3.46g(2当量)的三苯基膦后，在0℃下加入3.33g DIAD(2.5当量)。在氮气保护下，加入50mL无水四氢呋喃溶剂。反应在0℃下搅拌2小时后，除去冰浴，反应升至室温后反应继续搅拌过夜。反应完成后在真空下除去溶剂。最后反应产物(9)通过硅胶分离柱进行提纯。最后产物：2.88g；产率：90％。质谱(HRMS，ESI)：487.2359(M+1)。元素分析：C，64.22；H，7.05；N，5.70；O，23.03。

第四步：在一个100mL的圆底烧瓶中，在0℃下加入2.88g(1当量)的反应物(9)，12.0mL三氟乙酸，和60.0mL二氯甲烷。在反应在0℃下搅拌1小时后，除去冰浴，反应升至室温后反应继续搅拌过夜。反应完成后在真空下除去溶剂。最后反应产物式3(B)通过硅胶分离柱进行提纯。最后产物：2.11g；产率：92％。质谱(HRMS，ESI)：387.4409(M+1)。元素分析：C，65.31；H，6.76；N，7.22；O，20.71。

实施例4

化合物式4按如下步骤合成：

第一步：化合物(10)由化合物(6)和三氯化铝反应生成化合物(7)的副反应得来。通常副反应生成的化合物(10)和(7)从同一次硅胶柱分离出来，最后产率约为，10％。质谱(HRMS，ESI)：304.1115(M+1)。元素分析：C，63.44；H，5.70；N，4.60；O，26.30。

第二步：在一个10mL的干燥圆底烧瓶中，加入200mg(1当量)的反应物(10)和64.7mg(1.1当量)的反应物(11)，346mg(2当量)的三苯基膦后，在0℃下加入333mg DIAD(2.5当量)。在氮气保护下，加入4mL无水四氢呋喃溶剂。反应在0℃下搅拌2小时后，除去冰浴，反应升至室温后反应继续搅拌过夜。反应完成后在真空下除去溶剂。最后反应产物式4(C)通过硅胶分离柱进行提纯。最后产物：190mg；产率：77％。质谱(HRMS，ESI)：345.1831(M+1)。元素分析：C，64.22；H，7.03；N，7.40；O，21.35。

实施例5

体外抗肿瘤实验

1×10⁵的HT-29细胞在六孔培养板培养一天后，加入10μM化合物2或3处理24或48小时后，移去含药培养基，用无药的培养基清洗两次后，每个孔中加入40微升5M caspACE(FITC-VAD-FMK)，在37℃孵育半个小时，期间用锡箔纸覆盖。然后，每孔加入50微升比萘酚蓝黑B(Naphthol Blue Black B)(5mM in PBS溶液)，孵育十分钟。利用荧光显微镜拍照，统计计算。实验结果如图2所示。其中图2A是HT-29细胞在10μM化合物2处理24小时后，与FITC-VAD-FMK(5uM)孵育半小时，加入Black blue试剂，十分钟后利用荧光显微镜检测，右侧为对照。由图2A可以看出，加入了化合物2之后(左图)，HT-29细胞明显进入凋亡的比例比未加入化合物2的情况(右图)多，这说明化合物2能有效杀死HT-29细胞。图2B针对HT-29，进行相同的处理。HT-29细胞在10μM化合物3处理24小时后，与FITC-VAD-FMK(5uM)孵育半小时，加入Black blue试剂，十分钟后利用荧光显微镜检测，右侧为对照。由图3A可以看出，加入了化合物3之后(左图)，HT-29细胞明显进入凋亡的比例比未加入化合物3的情况(右图)多，这说明化合物3也能有效杀死HT-29细胞。

实施例6

化合物浓度实验

1×10⁵的HT-29细胞在六孔培养板培养一天后，加入不同浓度梯度的化合物4处理24或48小时。浓度梯度分别为0.25μM，0.5μM，1μM，2μM，4μM，8μM，10μM，15μM。利用Caspase 3活性检测检测细胞凋亡，统计计算。实验结果如图3所示。图3纵坐标表示存活细胞的比例，横坐标表示化合物4的浓度(单位μM)，由图4可知，当化合物的浓度达到10μM的时候，就可以使70％以上的癌细胞死亡，表明该化合物具有很强的杀死癌细胞的能力。

实施例7

体内抗肿瘤活性

在裸鼠身上嫁接HT-29细胞(1×10⁶)，当肿瘤达到5毫米后，通过静脉注射不同浓度的化合物2，0mg/Kg，0mg/Kg，10mg/Kg，10mg/Kg，25mg/Kg。三周后测量肿瘤大小。结果如图4所示。由图4可以看出，注射10mg/Kg的化合物2即可明显抑制肿瘤的生长。

实施例8

化合物2对正常C2C12细胞生长和分化的影响

将老鼠骨骼肌肌母细胞C2C12在含高血清(10％胎牛血清)的高糖DMEM培养液中，培养直至铺满整个培养皿，然后换成低血清(2％马血清)的DMEM培养基。两到三天后细胞分化成为肌管。为了研究化合物2对细胞生长和分化的影响，分别在细胞开始生长、开始分化时加入一定浓度的化合物2，观察研究细胞的生长、分化后的形态。实验结果如图5所示，在正常条件下，老鼠骨骼肌肌母细胞C2C12，能被诱导分化成为肌管。在10μM化合物2的刺激下，仍然能正常生长(左图)和分化(右图)。与未加入化合物2的对照实验结果相比，细胞生长周期、形态没有任何区别。

实施例9

化合物3对正常幼鼠心脏细胞收缩的影响

利用从1-3天幼鼠分离得到的心肌细胞，考察药物对细胞生长和收缩频率的影响。在10μM化合物3的刺激下，与对照没有刺激相比，心肌细胞的生长和收缩频率没有明显变化。实验结果如图6所示，左图：培养第一天；右图：培养第七天。在开始培养细胞时，加入化合物3，在每次换液时，重新加入新配好的化合物3。

实施例10

化合物4在动物一般药理学研究和毒性试验

(1)、对精神神经系统的影响

小鼠口服化合物4150mg/kg、100mg/kg、50/mg和25mg/kg剂量，四个剂量对小鼠的一般行为则无明显影响，与对照组.相似(P＞0.02)。

(2)、对心血管、呼吸系统及体温的影响

大鼠血管及呼吸系统试验表明：经口给予化合物4剂量分别为100、50和25mg/kg，对大鼠心血管系统和呼吸系统，包括呼吸频率、呼吸幅度、血压和心电、体温等各指标均与给药前相似，无明显影响(n＝10，P＞0.02)。

需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。

Claims (9)

1.荜茇酰胺衍生物，其特征在于，所述荜茇酰胺衍生物为具有式(1)结构的化合物或其可药用的盐、酯或前药：

其中，R₁和R₂各自独立地选自氢原子、C_1～10的烷基、C_2～10的烯基、C_2～10的炔基、C_1～10的烷氧基、被杂原子取代的C_1～10的烷氧基、由卤素原子、CF₃、CCl₃、CI₃、CN、NO₂、NH₂或OH取代的C_1～10的烷氧基、卤素原子、CF₃、CCl₃、CI₃、CN、NO₂、NH₂、OH、C_{2～ 10}的酰基、C_6～10的芳基、5或6元杂环基。

2.根据权利要求1所述的荜茇酰胺衍生物，其特征在于，所述R₁选自氢原子、C_1～10的烷氧基、C_1～10氨基烷氧基；R₂选自C_6～10芳基烷氧基、C_5～10的哌啶基烷氧基、C_1～10的烷氧基。

3.根据权利要求2所述的荜茇酰胺衍生物，其特征在于，式(1)的化合物为式(2)的化合物：

4.根据权利要求2所述的荜茇酰胺衍生物，其特征在于，式(1)的化合物为式(3)的化合物：

5.根据权利要求2所述的荜茇酰胺衍生物，其特征在于，式(1)的化合物为式(4)的化合物：

6.一种药物组合物，其包含权利要求1～5任一项所述的治疗有效量的荜茇酰胺衍生物、以及任选的药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、辅料或媒介物。

7.一种如权利要求1～6任一项所述的荜茇酰胺衍生物或药物组合物在制备抑制肿瘤生长的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的荜茇酰胺衍生物，其特征在于，所述肿瘤是恶性肿瘤、恶性黑色素瘤或恶性毒瘤。

9.根据权利要求8所述的荜茇酰胺衍生物，其特征在于，所述肿瘤为皮肤癌、肝癌、食道癌、胃癌、血癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌或肾癌。

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