CN109172549A - 一种抗肿瘤活性组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属抗癌药物技术领域，具体涉及一种一种抗肿瘤活性组合物，其特征在于，由人参皂苷‑Rh2、白藜芦醇、灵芝多糖及冬虫夏草组成。本发明还提供了所述的抗肿瘤活性组合物的应用以及提供了一种抗肿瘤的药物。本发明所述的四种植物化学物单药具有良好的协同增效作用。

Description

一种抗肿瘤活性组合物及其应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种药物组合物对肿瘤的预防和抗癌作用及其应用。

背景技术

癌症是人类死亡的主要原因之一，其发病率仍在逐年增加，仅美国2017年就有160万新发病例和60万癌症相关死亡病例，而中国2018年最新癌症报告显示每年新发癌症病例达429万，其中死亡病例280多万。尽管目前对癌症的诊治取得了重大的进步，但癌症仍然是全球范围内严重危害人类健康的疾病，其常规传统疗法如放疗和化疗仍存在许多缺陷和毒副作用，5年生存率非常低。因此，需要不断研发新的、有效且无毒副作用的抗癌新药，以提高癌症患者的生活质量和总生存率。

目前，植物化学物(phytochemicals)对肿瘤的预防和抗癌作用是近年研究的热点之一。很多的植物化学物单药虽然也具有一定的抗癌作用，但单药抗癌活性仍较低，需要较大的使用剂量下方可达到一定的效果，如此就必然给患者带来加大且广泛的副作用(如肝毒性和肾毒性)以及较大的经济负担；不仅如此，多种植物化学物单体购买渠道少，需分开购买服用，患者顺应性差，更令患者难以接受的是价格昂贵，疗效低。因此，医药工作者需要进行持续研发工作，找寻一种具有高效抗癌作用的同时，可有效降低药物的使用量，且疗效好，成本更低。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的旨在提供一种活性高，使用量小，具有良好的抗肿瘤作用及对癌细胞杀伤作用效果，对癌症高危人群的预防及治疗抗肿瘤活性组合物(本发明也简称为组合物)。

本发明的另一目的旨在提供上述抗肿瘤活性组合物的应用。

本发明第三目的在于，提供了一种添加有所述的抗肿瘤活性组合物的药物。

为解决现有技术存在的问题，发明人需要在众多植物化学物及中药成分中找寻相互之间可以进行良好匹配的，可以很好起到协同增效作用的药物活性组合物。基于本发明的以上目的，经过长期的，持续不断的研究，终于研发出了以下一种抗肿瘤活性组合物。

本发明的抗肿瘤活性组合物，由人参皂苷-Rh2、白藜芦醇、灵芝多糖及冬虫夏草四种成分组成。

本发明从成千上万的抗肿瘤单体成分中，创新地发现，本发明所述的四种植物化学物单药具有良好的协同增效作用，通过组分的协同，即使在较低的成分用量下，仍可显著地提升抗肿瘤活性。通过研究发现，将不高于各组分的半抑制浓度IC50的成分联合使用，即可获得高达98％抗肿瘤效果，显示出本发明所述的四种组分联合使用，在较低的用量下仍可以显著抑制肿瘤细胞的增殖以及诱导肿瘤细胞凋亡，具有明显的协同抗癌效应，大大减轻的患者的负担。

研究进一步发现，进一步调控组合物中的各成分的重量比例，可进一步提升组分中间的协同效果，有助于进一步提升抗肿瘤活性。

作为优选，所述的抗肿瘤活性组合物，各组分的重量份为：

研究发现，基于所述的组分之间的协同，进一步将组分之间的重量比控制在所述的范围下，可进一步协同提升组分之间的协同效果，明显提升抗肿瘤活性。

进一步优选，所述的抗肿瘤活性组合物，各组分的重量份为：

最优选，所述的抗肿瘤活性组合物，各组分的重量份为：

所述的人参皂苷-Rh2可以采用现有方法制备或者购买自现有商用产品。本发明的人参皂苷-Rh2可来源于人参、西洋参等，将切碎的新鲜或干燥的人参用低于其体积100倍的极性溶剂室温下浸泡数天，或回流数小时，过滤，滤液真空浓缩，浓缩物再溶于极性溶剂中，加入铁盐溶液调成中性，室温搅拌，滤去酚性沉淀物，用色谱柱精制即得人参皂苷-Rh2。

所述的白藜芦醇可以采用现有方法制备或者购买自现有商用产品。本发明的白藜芦醇可来源于虎杖、桑椹等植物，取虎杖粗粉20g，用5倍量70％乙醇在90℃加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，减压回收溶剂后以适量甲醇超声溶解，用0.45um滤膜过滤，滤液用色谱柱精制即得白藜芦醇。

所述的灵芝多糖可以采用现有方法制备或者购买自现有商用产品。本发明的灵芝多糖可来源于多孔菌科灵芝属真菌菌丝体的次生代谢产物，存在于灵芝属真菌的菌丝体和子实体中。灵芝子实体粉碎加入少量培养基发酵，发酵后原料离心，上清液低温真空浓缩，透析，乙醇沉淀，丙酮洗涤，除蛋白，喷雾干燥，最后加入10％水提干粉混合而成。

所述的冬虫夏草可以采用现有方法制备或者购买自现有商用产品。本发明的冬虫夏草可来源于冬虫夏草菌丝体的热水提取物，然后80％乙醇沉淀和经过EP透析制备而成。

本发明还提供了所述的所述的抗肿瘤活性组合物的应用，用于制备抗肿瘤的药物。

优选地，所述的应用，将所述的抗肿瘤活性组合物用于制备治疗乳腺癌、肺癌或结肠癌中的至少一种疾病的抗肿瘤药物。

进一步优选，所述的应用，将所述的抗肿瘤活性组合物和其他抗肿瘤的活性成分复合，用于制得抗肿瘤的药物。

优选地，所述的其他抗肿瘤的活性成分优选为小白菊内酯、小檗碱、硒类复合物、花青素、大蒜素、番茄红素中的至少一种。

由本发明组合物制备的药物可以是以本发明所述的组合物为有效成分制成，也可以是以本发明所述的组合物为有效成分与其它抗肿瘤有效成分(如小白菊内酯、小檗碱、硒类复合物、花青素、大蒜素、番茄红素等)组配制成。

优选地，所述的应用，将所述的抗肿瘤活性组合物和药学上可接受的辅料复合，制得所述的抗肿瘤的药物。

所述的应用中，将本发明所述的抗肿瘤活性组合物和药效学上可接受的其它辅料，制成相应的剂型。如：胶囊、片剂、注射剂、粉剂等。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物，包含所述的抗肿瘤活性组合物，还选择性包含药学上可接受的辅料。

所述的抗肿瘤的药物，可以为胶囊、片剂、注射剂、粉剂等剂型。

例如，依据组合物配制成组合胶囊，从而方便患者服用、降低成本、提高疗效、达到更好的优化组合抗癌效果。

通过本发明所制备的抗肿瘤药物组合物应用可用于癌症病人的治疗或者癌症高危人群的预防及治疗等，抗肿瘤药物组合物在各种癌症的预防和绿色综合治疗等方面将具有广泛的应用前景。

有益效果

本发明以A549，MCF-7和SW480三株癌细胞为研究对象，研究分析人参皂苷-Rh2、白藜芦醇、灵芝多糖及冬虫夏草单药及四种抗肿瘤药物组合物对体外培养癌细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。根据植物化学物单药对癌细胞的半抑制浓度IC50的实验结果，采用IC50或低一个剂量配制成抗肿瘤药物组合物，当人参皂苷-Rh2、白藜芦醇、灵芝多糖及冬虫夏草配制成组合联合用药时，杀伤效应较单药显著增强，具有明显的协同抗癌效应。本研究为绿色抗癌产品研发和临床应用打下了理论基础。

附图说明

图1：植物化学物单药及本发明组合物对癌细胞生长抑制的影响。

图2：本发明组合物诱导三株癌细胞凋亡呈剂量依赖性

图3：植物化学物复方诱导肺癌和乳腺癌癌细胞凋亡及统计

具体实施方式

1.1主要材料A549、MCF-7、SW480三株癌细胞购买于中南大学湘雅细胞库。二甲基亚砜(美国Sigma公司)；RPMI1640培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶/EDTA混合液均购自美国Gibco公司；人参皂苷-Rh2、白藜芦醇、灵芝多糖、冬虫夏草四种植物化合物(北京酷尔化学科技有限公司)；CCK8试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司)；细胞周期检测试剂盒、AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；流式细胞仪(FACSCalibur，美国BD公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；倒置显微镜(日本Olympus)；透射电镜(日立H-800)。

1.2CCK8法检测癌细胞的生长抑制率A549、MCF-7、SW480三株癌细胞培养于RPMI1640培养基。培养基加入10％胎牛血清，置于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养，2～3天传代一次。实验时取对数生长期的细胞，消化后进行细胞计数，A549、MCF-7以每孔5000个细胞接种于96孔板，SW480以每孔8000个细胞接种于96孔板，每孔100μl细胞悬液，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养。细胞贴壁24h后加药处理，植物化学物单药实验组以各种单药IC50半抑制浓度上2个剂量为最大剂量，其中人参皂苷-Rh2组(25，50，100，200，400mg/L(mg/L为每L所述的细胞悬液添加的该组分的重量))、白藜芦醇组(6.25，12.5，25，50，100mg/L(mg/L为每L所述的细胞悬液添加的该组分的重量))，灵芝多糖组(0.20，0.40，0.8，1.60，3.20g/L(g/L为每L所述的细胞悬液添加的该组分的重量))、冬虫夏草组(0.50，1.00，2.00，4.00，8.00g/L(g/L为每L所述的细胞悬液添加的该组分的重量))，每个剂量设5个重复孔，阴性对照组加等量培养基，阳性对照组加入5-FU 100ug/ml。植物化学物复方实验组以各种单药IC50半抑制浓度(人参皂苷-Rh2100mg/L，白藜芦醇25mg/L，灵芝多糖0.80g/L，冬虫夏草2.00g/L(g/L(mg/L)为每L所述的细胞悬液添加的该组分的重量))按比例组合成复方，复方组设低、中、高3个浓度，每个浓度设5个复孔。另设阴性对照组加等量培养基，阳性对照组加入5-FU100ug/ml。分别于加药后24h、36h及48h后，倒掉培养基，加入新鲜配好的10％的cck8溶液100μl，培养箱孵育1小时后取出摇匀，于多功能酶标仪490nm波长处检测吸光度(OD值)。细胞生长抑制率(％)＝[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100％。每组实验重复3次。

1.3流式细胞仪检测细胞周期取对数生长期的细胞，消化收集细胞后以每孔5×105个细胞接种六孔板中，4h后加药，加药后48h用胰蛋白酶将待检测的细胞消化成单细胞，1000rpm离心5min收集细胞，加入4℃预冷PBS缓冲液将细胞打匀，1000rpm离心5min收集细胞，重复洗一次。加入0.5ml PBS，吹打混匀，迅速打入5mL-20℃预冷的70％乙醇中，4℃固定过夜。1000rpm离心5min收集固定细胞，PBS洗2-3次，1000rpm离心5min收集细胞。加入200μLPBS重悬细胞，轻轻吹打细胞，转至1.5ml离心管中。加入2μL RnaseA(10mg/mL)，37℃水浴30min。加入10.5μL PI(1mg/mL)至终浓度为50ug/mL，4℃避光染色30min。BD流式细胞仪检测细胞周期。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期的细胞，消化细胞后以每孔5×105个细胞接种六孔板中，4h后加药，加药后48h用胰蛋白酶将待检测的细胞消化成单细胞，1000rpm离心5min收集细胞，加入4℃预冷PBS缓冲液对细胞进行冲洗，将细胞沉淀吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5min收集细胞。加入4℃预冷PBS缓冲液再次对细胞进行冲洗，将细胞沉淀吹散成单细胞悬液，并进行细胞计数，1000rpm离心5min收集细胞。按收集细胞数目加入适量的1×Binding Buffer，将细胞数调至5×10⁶cells/ml。取上述细胞悬液100ul(5×10⁵个)，分别加入7μl FITCAnnexin V和7μl P1。轻轻颠倒混匀，避光RT(25℃)孵育15min。最后加入400ul 1xBinding Buffer，1h之内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。需要设置未染细胞，FITC Annexin V单染细胞及PI单染细胞进行参数调整。

2结果

2.1植物化学物对癌细胞生长抑制的影响

植物化学物单药及复方对癌细胞生长抑制的影响见图1：

A549、MCF-7和SW480三株癌细胞经不同浓度的植物化合物单药人参皂苷-Rh2、白藜芦醇、灵芝多糖、冬虫夏草处理24h、48h和72h后，通过CCK8法检测四种植物化合物对三株癌细胞生长的抑制作用均呈剂量依赖性和时间依赖性。如图1的A所示：冬虫夏草杀伤A549、MCF-7和SW480细胞的IC50值分别为4.52、3.83和6.25g/L；如图1的B所示：灵芝多糖杀伤A549、MCF-7和SW480细胞的IC50值分别为4.42、4.01和5.94g/L；如图1的C所示：人参皂苷-Rh2杀伤A549、MCF-7和SW480细胞的IC50值分别为151.2、179.5和174.7mg/L；如图1的D所示：白藜芦醇杀伤A549、MCF-7和SW480细胞的IC50值分别为14.61、36.27和36.90mg/L。由植物化学物人参皂苷-Rh2、白藜芦醇、灵芝多糖、冬虫夏草复IC50剂量(人参皂苷-Rh2100mg/L，白藜芦醇25mg/L，灵芝多糖0.8g/L，冬虫夏草2.0g/L)组成的复方处理A549、MCF-7和SW480癌细胞48h后，其对三株癌细胞的生长抑制率分别为97.73％、97.99％、95.10％，均较单个植物化学物抑制率显著增强(P＜0.01)。如图1E所示，四种植物化学物联合使用可以显著增强抑制A549、MCF-7和SW480癌细胞的增殖，具有明显的协同抗癌效应。

2.2植物化学物复方对癌细胞周期的影响

植物化学物复方处理A549、MCF-7和SW480细胞48小时后，用流式细胞仪分析细胞周期的分布。在A549、MCF-7和SW480细胞中，与培基阴性对照组比较，如表1所示，植物化学物复方主要阻滞A549、MCF-7和SW480癌细胞的周期于G0/G1期，从而抑制癌细胞进入分裂增殖周期。

表1本发明组合物作用48h对癌细胞周期的影响(n＝3)％

2.3植物化学物复方诱导癌细胞凋亡A549、MCF-7和SW480三株癌细胞经植物化合物复方处理48h后，通过Annexin-V-FITC/PI染色后进行流式细胞术检测，发现三株癌细胞不同程度发生凋亡。如图2所示，植物化学物复方可以诱导A549、MCF-7和SW480细胞凋亡，并呈剂量依赖性。最高剂量植物化学物复方处理组，MCF-7、A549和SW480细胞的凋亡率分别为56.00％、39.10％和42.90％。表2为植物化学物复方三次诱导A549、MCF-7和SW480癌细胞发生凋亡的均值，结果显示植物化学物复方具有显著诱导三株癌细胞凋亡的作用。

表2植物化合物复方处理48h诱导三株癌细胞凋亡率的比较(n＝3)％

注：实验组与阴性对照组比较P＜0.01

植物化学物单药及复方诱导三株癌细胞凋亡呈剂量依赖性见图2

植物化学物复方诱导两株癌细胞凋亡见图3(A：植物化学物复方诱导肺癌细胞凋亡并呈剂量依赖性；B：植物化学物复方诱导乳腺癌细胞凋亡并呈剂量依赖性；C：植物化学物复方诱导两株癌细胞凋亡统计图；D：植物化学物复方诱导癌细胞凋亡镜下图，随时间诱导凋亡加强)

研究发现，通过上述四种植物化学物单药对体外培养的A549、MCF-7和SW480癌细胞抑制作用的实验研究，并以半抑制浓度IC50或低一个剂量配制成抗肿瘤药物组合物，其能表现出高达98％的抗肿瘤活性。体外抗癌研究表现，人参皂苷-Rh2、白藜芦醇、灵芝多糖及冬虫夏草四种单药进行组合，具有显著地抗癌效率。

Claims (10)

1.一种抗肿瘤活性组合物，其特征在于，由人参皂苷-Rh2、白藜芦醇、灵芝多糖及冬虫夏草组成。

2.如权利要求1所述的抗肿瘤活性组合物，其特征在于，各组分的重量份为：

3.如权利要求2所述的抗肿瘤活性组合物，其特征在于，各组分的重量份为：

4.如权利要求2所述的抗肿瘤活性组合物，其特征在于，各组分的重量份为：

5.一种权利要求1～4任一项所述的抗肿瘤活性组合物的应用，其特征在于，用于制备抗肿瘤的药物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，用于制备治疗乳腺癌、肺癌或结肠癌中的至少一种疾病的抗肿瘤药物。

7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，将所述的抗肿瘤活性组合物和其他抗肿瘤的活性成分复合，用于制得抗肿瘤的药物；

所述的其他抗肿瘤的活性成分优选为小白菊内酯、小檗碱、硒类复合物、花青素、大蒜素、番茄红素中的至少一种。

8.如权利要求5～7任一项所述的应用，其特征在于，将所述的抗肿瘤活性组合物和药学上可接受的辅料复合，制得所述的抗肿瘤的药物。

9.一种抗肿瘤的药物，其特征在于，包含权利要求1～4任一项所述的抗肿瘤活性组合物。

10.如权利要求9所述的抗肿瘤的药物，其特征在于，还包含药学上可接受的辅料。