CN109689078A - 葡萄提取物及与其有关的方法 - Google Patents

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杰瑞·韦恩·史密斯
P·E·加拉格尔
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Abstract

提供了具有提高的酚类物质含量的液体和粉末的葡萄提取物。所述提取物可以由葡萄籽、葡萄皮或其组合制成。在某些情况下，提取物可以是葡萄籽提取物和葡萄皮提取物的混合物。还提供了制造这些提取物的方法。这些方法包括控制温度条件以增加提取物中酚类化合物的产率。还提供了使用所述提取物治疗受试者的方法，包括对癌症以及与高血压有关的终末器官损伤的治疗。

Description

葡萄提取物及与其有关的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年4月1日提交的美国临时申请No.62/316,918的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
已经开发了各种方法来从包括葡萄在内的水果中提取果汁和营养成分。然而，这些已知方法可能无法有效率地从水果中提取或保存有价值的化合物。
包含酚类、类黄酮和白藜芦醇的抗氧化化合物可有益于人类健康。例如，可以在诸如动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病和一些癌症等发生氧化过程的疾病中看到有益效果。类黄酮代表由苯丙烷途径产生的广泛且常见的天然多酚类。它们是葡萄中可溶性酚类物质的重要组合，并且被认为是葡萄衍生产品的益处的主要贡献者。
需要从植物，特别是葡萄中提取多酚和其他植物衍生的植物化学物质的改进方法，以及这些产品用于治疗疾病的用途。
发明内容
本文描述了由葡萄及其制剂制成的提取物。本公开内容的提取物包括液体提取物和由其制备的粉末提取物。还提供了用于产生不同提取物的各种方法和与癌症有关的治疗方法。
在一个方面，提供了一种从葡萄籽、葡萄皮或其组合制造液体提取物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供葡萄籽、葡萄皮或其组合；(b)将葡萄籽、葡萄皮或其组合与蒸馏水接触以形成提取混合物；(c)在120℉至200℉的温度范围内加热提取混合物，在此加热期间加入另外的蒸馏水；(d)冷却提取混合物；(e)过滤提取混合物以除去固体，从而形成滤液；(f)在滤液中加入食品防腐剂；(g)冷却滤液，以形成冷却的滤液；(h)过滤冷却的滤液，从而产生液体提取物。
另一方面，提供了一种产生葡萄籽提取物的方法，该方法包括以下步骤：(a)使葡萄籽与蒸馏水接触；(b)在120℉至200℉的温度范围内加热步骤(a)中的水和葡萄籽，在此加热期间加入另外的蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄籽和水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄籽和水以产生葡萄籽滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液以产生冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液，从而产生葡萄籽提取物。
另一方面，提供了一种产生葡萄皮提取物的方法，该方法包括以下步骤：(a)使葡萄皮与蒸馏水接触；(b)在120℉至200℉的温度范围内加热步骤(a)中的水和葡萄皮，在此加热期间加入另外的蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄皮和水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄皮和水以产生葡萄皮滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液以产生冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液，从而产生葡萄皮提取物。
在另一个方面，提供了一种产生葡萄籽和葡萄皮提取物的方法，该方法包括以下步骤：(a)使葡萄籽和葡萄皮与蒸馏水接触；(b)在120℉至200℉的温度范围内加热步骤(a)中的水和葡萄籽以及葡萄皮，在此加热期间加入另外的蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄籽和葡萄皮以及水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄籽和葡萄皮以及水，以产生葡萄籽和葡萄皮滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液以产生冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液，从而产生葡萄籽和葡萄皮提取物。
另一方面，提供一种制备葡萄衍生的液体提取物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供通过上述方法制备的葡萄籽液体提取物；(b)提供通过上述方法制备的葡萄皮液体提取物；(c)将葡萄籽液体提取物和葡萄皮液体提取物以约50:50至约85:15(体积/体积(v/v))的比例混合，从而形成葡萄衍生的液体提取物。
在另一方面，提供了一种制备葡萄衍生的粉末提取物的方法，该方法包括以下步骤：如上所述从葡萄籽、葡萄皮或其组合获得或制造葡萄衍生的液体提取物，然后对液体提取物进行喷雾干燥以形成粉末提取物。
在另一方面，提供了产生粉末提取物的方法，所述方法包括对通过上述和本公开的其他部分描述的方法产生的液体提取物进行喷雾干燥。
在另一方面，提供了一种产生葡萄籽和葡萄皮提取物的方法，该方法包括将葡萄皮提取物和葡萄籽提取物组合。
其他方面包括使用本公开中描述的方法产生的提取物和由其制备的制剂。在一个方面，提供了一种粉末提取物或制剂，其含有约25％至50％(重量/重量(w/w))总酚类化合物。另一方面，提供了一种粉末提取物或制剂，其含有至少约30％(重量/重量(w/w))总酚类化合物。另一方面，提供了一种提取物，每克粉末提取物含有约250-500mg总酚类化合物。另一方面，提供了一种粉末提取物，含有浓度为每克粉末提取物至少约6mg的没食子酸或鞣花酸中的至少一种。还提供了任何上述提取物的共混物的提取物和制剂。
在一些实施方案中，本公开中提供的制剂的总酚含量在至少6个月的时期内保持稳定，其特征在于在6个月时总酚含量降低不超过10％。
本文进一步描述了治疗或预防受试者中的各种疾病和病症的方法。治疗或预防此类疾病和病症的方法包括向受试者施用有效量的如本公开中所述的提取物。
另一方面，提供了治疗患有疾病、疾病风险增加或有复发风险的受试者的方法，该方法包括给受试者施用如本公开的前面部分所述的药学有效量的葡萄衍生的提取物的步骤。在某些情况下，该方法包括施用液体提取物或制剂。在一些情况下，该方法包括施用粉末提取物或制剂。该疾病可包括癌症、高血压诱导的纤维化、放射诱导的纤维化或放射诱导的骨丢失中的任何一种。
在下面的描述和附图中阐述了一个或多个方面和实施方式的细节。根据说明书和附图以及权利要求，其他特征、目的和优点将是显而易见的。
附图说明
图1A-1B显示了与市售的含有磨碎的麝香葡萄籽(GS磨碎)的补充剂相比,根据实施例1的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的酚类化合物含量的评估。图1A显示使用比色测定法的总酚类化合物分析，以及图1B显示通过UPLC-质谱法对选择的单个酚类化合物的分析(儿茶素、没食子酸、表儿茶素、鞣花酸、原花青素(procyanadin)和儿茶素-没食子酸酯(cat-gall))。**表示p<0.01。
图2A和图2B显示了说明针对用与本文所述的不同的方法制备的葡萄皮提取物或葡萄籽提取物处理的细胞系的细胞生长分析的图。将LnCaP(图2A)或PC3(图2B)人前列腺癌细胞与递增浓度的麝香葡萄籽或葡萄皮提取物一起温育，并通过计数每孔的细胞数量来计量细胞增殖。数据表示为内参(Con，其未用任一提取物处理)的百分比。n＝12，**表示p<0.01。通过增加从麝香葡萄籽或葡萄皮中分离的提取物的浓度来抑制人前列腺癌细胞的生长。与麝香葡萄籽相比，使用麝香葡萄皮提取物对前列腺癌细胞的增殖没有差异。
图2C-2E显示了说明针对用与本文所述的不同的方法制备的葡萄籽提取物或葡萄皮提取物处理的细胞系的细胞生长分析的图。ZR-75-1细胞是人雌激素受体阳性乳腺癌细胞，MDA-MD-231是人三阴性乳腺癌细胞，SKBR3细胞是过表达乳腺癌细胞的人表皮生长因子2(HER2)。将ZR-75-1、MDA-MD-231和SKBR3细胞与递增浓度的麝香葡萄籽或葡萄皮提取物一起温育，并通过计数每孔的细胞数量来计量细胞增殖。数据表示为内参(Con，其未用任一提取物处理)的百分比。对于ZR-75-1细胞，n＝9，对于MDA-MB-231细胞，n＝6，对于SKBR3细胞，n＝18；与内参相比，*表示p<0.05，**表示p<0.01。通过增加任一提取物的浓度来抑制人乳腺癌细胞的生长。
图2F-2G显示了说明针对用与本文所述的不同的方法制备的葡萄籽提取物或葡萄皮提取物处理的细胞系的细胞生长分析的图。将A549和SK-LU-1人肺癌细胞与递增浓度的麝香葡萄籽或葡萄皮提取物一起温育，并通过计数每孔的细胞数量来计量细胞增殖。数据表示为内参(Con，其未用任一提取物处理)的百分比。对于A549细胞，n＝12，对于SK-LU-1细胞，n＝9；**表示p<0.01。通过增加从麝香葡萄籽或葡萄皮中分离的提取物的浓度来抑制人肺癌细胞的生长。用麝香葡萄籽或葡萄皮提取物处理的肺癌细胞的增殖没有差异。
图2H-2I显示了说明针对用与本文所述的不同的方法制备的葡萄籽提取物或葡萄皮提取物处理的细胞系的细胞生长分析的图。将U87和U373人胶质母细胞瘤与递增浓度的麝香葡萄籽或葡萄皮提取物一起温育，并通过计数每孔的细胞数量来计量细胞增殖。数据表示为内参(Con，其未用任一提取物处理)的百分比。对于U87细胞，n＝12，对于U373细胞，n＝9；**表示p<0.01。通过增加从麝香葡萄籽或葡萄皮中分离的提取物的浓度来抑制人胶质母细胞瘤的生长。用麝香葡萄籽或葡萄皮提取物处理的胶质母细胞瘤的增殖没有差异。
图2J-2K显示了说明针对用与本文所述的不同的方法制备的葡萄籽提取物或葡萄皮提取物处理的细胞系的细胞生长分析的图。将HCT116和HT29人结肠癌细胞与递增浓度的麝香葡萄籽或葡萄皮提取物一起温育，并通过计数每孔的细胞数量来计量细胞增殖。数据表示为内参(Con，其未用任一提取物处理)的百分比。对于HCT116细胞，n＝15-18，对于HT29细胞，n＝12；*表示p<0.05，**表示p<0.01。通过增加从麝香葡萄籽或葡萄皮中分离的提取物的浓度来抑制人结肠癌细胞的生长。用麝香葡萄籽或葡萄皮提取物处理的结肠癌细胞的增殖没有差异。
图2L-2M显示了说明针对用与本文所述的不同的方法制备的葡萄籽提取物或葡萄皮提取物处理的细胞系的细胞生长分析的图。将SKMEL28和RPMI7951人结肠癌细胞与递增浓度的麝香葡萄籽或葡萄皮提取物一起温育，并通过计数每孔的细胞数量来计量细胞增殖。数据表示为内参(Con，其未用任一提取物处理)的百分比。对于SKMEL28细胞，n＝6，对于RPMI 7951细胞，n＝9；*表示p<0.05，**表示p<0.01。通过增加从麝香葡萄籽或葡萄皮中分离的提取物的浓度来抑制人皮肤癌细胞的生长。用麝香葡萄籽或葡萄皮提取物处理的皮肤细胞的增殖没有差异。
图2N-2P显示了说明针对用与本文所述的不同的方法制备的葡萄籽提取物或葡萄皮提取物处理的细胞系的细胞生长分析的图。将THP-1-急性人单核细胞白血病细胞、HL60-急性人早幼粒细胞白血病细胞和K562-慢性人髓性白血病细胞与递增浓度的麝香葡萄籽或葡萄皮提取物一起温育，并通过计数每孔的细胞数量来计量细胞增殖。数据表示为内参(Con，其未用任一提取物处理)的百分比。对于THP-1细胞，n＝12，对于HL60，n＝12，对于K562细胞，n＝12；*表示p<0.05，**表示p<0.01。通过增加从麝香葡萄籽或葡萄皮中分离的提取物的浓度来抑制人白血病细胞的生长。用麝香葡萄籽或葡萄皮提取物处理的白血病细胞的增殖没有差异。
图3A-3B显示了说明针对用与本文所述的不同的方法制备的葡萄皮提取物或葡萄籽提取物处理的细胞系的MAP激酶活性的图。将ZR-75-1人雌激素受体阳性乳腺癌和MBA-MD-231人三阴性乳腺癌细胞与50μg/mL麝香葡萄籽提取物(GSeE)或麝香葡萄皮提取物(GSkE)一起温育4小时，并使用来自Cell Signaling的抗体来测量磷酸化-ERK(ERK1和ERK2)。使用β-肌动蛋白作为上样内参，通过光密度测定法计量磷酸化-ERK的量。代表性的凝胶包括在内。n＝3-7，***表示p<0.001。来自麝香葡萄籽和麝香葡萄皮的提取物均降低了乳腺癌细胞中的磷酸化ERK1/ERK2活性，表明该提取物抑制乳腺癌细胞增殖。麝香葡萄籽提取物或麝香葡萄皮提取物对乳腺癌细胞增殖的减少没有差异。
图4A-4C显示了如实施例1中所述的对于用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的乳腺癌小鼠模型(c-neu小鼠)的体重分析图。从3周龄开始，通过饮用水给予小鼠l-MGE。内参小鼠饮用常规水。在25周后(图4A)或31周后(图4B和图4C)对小鼠实施安乐死，取出它们的乳腺肿瘤并称重；对有肿瘤(图4A和图4B)或没有肿瘤(图4C)的小鼠称重。对于来自25周龄小鼠的肿瘤，n＝7-12，对于来自31周龄小鼠的肿瘤，n＝7-10；*表示p<0.05。饮用常规水或l-MGE 25周的c-neu小鼠的体重没有差异。虽然用麝香葡萄籽或葡萄皮提取物处理的胶质母细胞瘤的比例存在差异。尽管在31周龄时饮用l-MGE的c-neu小鼠的体重存在差异，但差异是由于这些动物的较大的肿瘤；在没有肿瘤的情况下则体重没有差异。
图5A-5B显示了如实施例1中所述的对于用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的乳腺癌小鼠模型(c-neu小鼠)的心脏重量分析的图。从3周龄开始通过饮用水给予小鼠l-MGE。内参小鼠饮用常规水。在25周后(图5A)或31周后(图5B)对小鼠实施安乐死，取出它们的心脏并称重。对于来自25周龄小鼠的肿瘤，n＝7-12，对于来自31周龄小鼠的肿瘤，n＝7-10。饮用常规水或l-MGE 25或31周后，c-neu小鼠的心脏重量没有差异，表明提取物对心脏重量没有影响。
图6A-6B显示了如实施例1中所述的对于用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的乳腺癌小鼠模型(c-neu小鼠)的肾重量分析的图。从3周龄开始通过饮用水给予小鼠l-MGE。内参小鼠饮用常规水。在25周后(图6A)或31周后(图6B)对小鼠实施安乐死，取出它们的肾并称重。对于来自25周龄小鼠的肿瘤，n＝7-12，对于来自31周龄小鼠的肿瘤，n＝7-10。饮用常规水或l-MGE 25或31周后，c-neu小鼠肾脏的重量没有差异，表明提取物对肾脏重量没有影响。
图7显示了如实施例1中所述的对于用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的乳腺癌小鼠模型(c-neu小鼠)的肿瘤多发率的图。从3周龄开始通过饮用水给予小鼠l-MGE。内参小鼠饮用常规水。25周后对小鼠实施安乐死，计数乳腺肿瘤的数量，以确定肿瘤的多发率。取出个体乳腺肿瘤并称重，以确定肿瘤负荷(如图8A-8B所示)。n＝7-11；*表示p<0.05。与饮用水的小鼠相比，用l-MGE处理的c-neu小鼠显著减少了乳腺肿瘤的数量，表明来自麝香葡萄的提取物降低了肿瘤的多发率。
图8A-8B显示了如实施例1中所述的对于用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的乳腺癌小鼠模型(c-neu小鼠)的肿瘤重量的分析的图。从3周龄开始通过饮用水给予小鼠l-MGE。内参小鼠饮用常规水。在25周后(左侧)或31周后(右侧)对小鼠实施安乐死，取出它们的乳腺肿瘤并称重。对于来自25周龄小鼠的肿瘤，n＝6-12，对于来自31周龄小鼠的肿瘤，n＝7-10；*表示p<0.05，**表示p<0.01。与饮用水的小鼠相比，用l-MGE处理的c-neu小鼠肿瘤大小显著减小，表明来自麝香葡萄的提取物减少肿瘤生长。
图9显示了如实施例1中所述的对于来自用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的乳腺癌小鼠模型(c-neu小鼠)的肿瘤中的增殖的分析。将来自饮用水(内参)或l-MGE的25周龄小鼠的肿瘤切片与针对增殖标志物“Ki67”的抗体一起温育。在代表性显微图像旁边呈现了显示Ki67染色阳性细胞百分比的图。n＝8-10，*表示p<0.05。与饮用常规水的c-neu小鼠相比，用l-MGE处理25周龄c-neu小鼠显著降低Ki67的量，表明麝香葡萄提取物通过减少肿瘤细胞增殖来减少肿瘤生长。
图10显示了如实施例1中所述的对于用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的乳腺癌小鼠模型(c-neu小鼠)的肿瘤中活性ERK1/2MAP激酶活性的分析。将来自饮用水(内参)或l-MGE的25周龄c-neu小鼠的肿瘤切片与针对磷酸化-ERK1/2的抗体一起温育。在代表性显微图像旁边呈现了显示磷酸化-ERK阳性细胞百分比的图。n＝8-10，*表示p<0.05。与饮用常规水的c-neu小鼠相比，用l-MGE处理的25周龄c-neu小鼠显著减少磷酸化ERK1/2MAP激酶的量，表明l-MGE通过降低增殖蛋白激酶活性来减少肿瘤生长。
图11显示了如实施例1中所述用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的乳腺癌小鼠模型(c-neu小鼠)中肿瘤中血管生成的分析。将来自内参的或l-MGE处理的小鼠c-neu的肿瘤切片与针对CD34的抗体一起温育，并通过阳性免疫反应性和形态学鉴定血管。在代表性显微图像旁边呈现了显示血管密度的图表。n＝6-8，*表示p<0.05。与内参小鼠相比，用l-MGE处理的c-neu小鼠肿瘤中的血管数量显著减少，表明葡萄提取物减少血管生成以减小肿瘤大小。
图12显示了如实施例1中所述的对于用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的乳腺癌小鼠模型(c-neu小鼠)的肿瘤的纤维化的分析。将来自内参的或l-MGE处理的31周龄的c-neu小鼠的肿瘤切片用苦味酸-天狼星红染色，以测量组织纤维化。在代表性显微图像旁边呈现了显示每个视野内纤维化的百分比的图表。n＝6-8，***表示p<0.001。与内参小鼠相比，用l-MGE处理显著降低c-neu乳腺肿瘤中的苦味酸-天狼星红染色量，表明l-MGE减少肿瘤内的纤维化。
图13A-13B显示如实施例1中所述的对于用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的肺癌小鼠模型中肿瘤数的分析。从3周开始，使来自用3-甲基胆蒽处理的母体的雌性幼崽接受在饮用水中的MGE，1年后实施安乐死。对肺表面上的肿瘤总数(图13A)或非聚结肿瘤(图13B)的数量进行计数。n＝26-32。***表示p<0.001。与饮用水的小鼠相比，用l-MGE对由于在子宫内暴露于3-甲基胆蒽而易于发育肺肿瘤的小鼠进行处理，肺肿瘤的数量显著减少，表明来自麝香葡萄的提取物降低了肿瘤的多发率。
图14A-14B显示如实施例1中所述用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的肺癌小鼠模型中肿瘤体积的分析。从3周开始，使来自用3-甲基胆蒽处理的母体的雌性幼崽接受在饮用水中的MGE，1年后实施安乐死。对肺表面上的总肿瘤面积(左图)或非聚集肿瘤区域(右图)进行计算。n＝26-32。***表示p<0.001。与饮用水的小鼠相比，用l-MGE对由于在子宫内暴露于3-甲基胆蒽而易于发育肺肿瘤的小鼠进行处理，肺肿瘤的面积显著减小，表明来自麝香葡萄的提取物减少了肿瘤体积。
图15显示了如实施例1中所述的对于用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的肺癌小鼠模型中的增殖的分析。将来自用3-甲基胆蒽处理的母体的雌性后代的肿瘤切片与针对增殖标记物“增殖细胞核抗原(PCNA)”的抗体一起温育，并且计数每个视野的阳性染色细胞总数。在代表性显微图像旁边呈现了显示PCNA/细胞百分比的图表。n＝26-32，**表示p<0.01。用l-MGE对在由于子宫内暴露于3-甲基胆蒽而易于发育肺肿瘤的小鼠进行处理，标志物PCNA的量显著降低，表明l-MGE降低了雌性小鼠的发育中的肺肿瘤中的肿瘤增殖。
图16显示了如实施例1中所述用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)处理的肺癌小鼠模型中血管生成的分析。将来自用3-甲基胆蒽处理的母体的雌性后代的肿瘤切片与针对CD34的抗体一起温育，并通过阳性免疫反应性和形态学来鉴定血管，并计数每个视野的阳性染色血管总数。在代表性显微图像旁边呈现了显示血管密度(CD34免疫反应性)的图表。n＝26-32，**表示p<0.01。用l-MGE对由于在子宫内暴露于3-甲基胆蒽而易于发育肺肿瘤的小鼠进行处理，血管的量显著减少，表明l-MGE减少了雌性小鼠的发育中的肺肿瘤中的血管生成。
图17显示了毒性研究中小鼠的体重分析，评估了根据本公开的各方面的如实施例1中所述的不同剂量的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的影响。在处理期结束时称重每个治疗组中的小鼠，以确定p-MGE对小鼠体重的影响。与内参相比，使用最高剂量的p-MGE的小鼠体重有小但显著的降低。n＝5，p<0.05。与内参组相比，在4周处理期结束时小鼠的体重与p-MGE的三个最低浓度相似。用最高浓度的p-MGE处理的小鼠总体重有小但显著的降低(从28.6±1.2克到25.0±1.3克，小于其总体重的15％)。
图18A-18C显示了毒性研究中小鼠食物摄入、粪便排泄和尿量的分析，评估了根据本公开的各方面的如实施例1中所述的不同剂量的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的影响。在处理的最后一周期间，将每个治疗组中的小鼠置于代谢笼中24小时，以测量食物摄入(图18A)、粪便排泄(图18B)和尿量(图18C)。n＝5。用p-MGE处理的小鼠的食物摄入、粪便产生或尿量没有差异。
图19显示了毒性研究中小鼠的病理组织分析，评估了根据本公开的各方面的如实施例1所述的不同剂量的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的影响。将每个治疗组中小鼠的心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏和脑取出。将心脏、肺、肝、肾和脾的一部分固定，包埋在石蜡中，切片，用H&E染色，并由兽医病理学家检查。
图20显示了毒性研究中小鼠心脏重量的分析，评估了根据本公开的各方面的如实施例1所述的不同剂量的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的影响。取出每个治疗组中的小鼠心脏并在处理期结束时称重，以确定p-MGE对心脏重量的影响。n＝5。用p-MGE处理的小鼠的心脏重量没有差异。
图21显示了毒性研究中的小鼠血压分析，评估了在根据本公开的各方面的如实施例1所述的不同剂量的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的影响。在未麻醉的小鼠(为进行血压测量训练1周)中通过尾套体积描记法测量血压。n＝5。与未处理的小鼠(内参)相比，用递增浓度的p-MGE处理4周的小鼠的血压没有差异。
图22A-22E显示了总结毒性研究中的小鼠的心脏超声心动图的图，评估了根据本公开的各方面的如实施例1所述的不同剂量的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的影响。在第4周期间，使用M模式和B模式的VEVO，用异氟烷麻醉小鼠，并计算各种心脏参数，包括射血分数(图22A)、缩短分数(图22B)、心输出量(图22C)、每搏输出量(图22D)和心率(图22E)。n＝5。对于用递增浓度的p-MGE处理的小鼠，心脏收缩期间从心脏喷射的血液分数没有差异。与未处理的小鼠相比，用p-MGE处理的小鼠的心脏中的心肌收缩力(以缩短分数测量)没有差异。在未处理的小鼠(内参)和用p-MGE处理的小鼠中，作为心脏泵血量的量度，心输出量没有差异。为处理的小鼠(内参)和用p-MGE处理的小鼠中，每搏输出量或心率没有差异。
图23A-23E显示了毒性研究中总结小鼠的器官重量评估的图，评估了根据本公开的各方面的如实施例1所述的不同剂量的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的影响。将每个治疗组中的小鼠的选定器官取出，并在处理期结束时称重，以确定p-MGE对器官重量的影响(n＝5)。用p-MGE处理的小鼠的肺、肾、脾或脑重量没有差异(图23A、23C-23E)。如图23B所示，与内参相比，使用第二至最高剂量的p-MGE，肝脏重量有小但显著的增加(p<0.05)。与内参组相比，在4周处理期结束时小鼠肝脏的重量与两个最低浓度相似。与内参组相比，用第二浓度至最高浓度的p-MGE处理的小鼠具有小但显著的肝重量增加。然而，用最高浓度的p-MGE处理的小鼠的肝脏重量与内参没有差异。
图24A-24B显示了毒性研究中总结小鼠肾功能评估的图，评估了根据本公开的各方面的如实施例1所述的不同剂量的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的影响。通过放射免疫测定法测量未处理和已处理的小鼠的尿液(在处理的第4周期间收集)中白蛋白的量，并表示为尿肌酐的量度(n＝5)。如图24A所示，与未处理的小鼠相比，用递增的浓度处理4周的小鼠的尿白蛋白的量作为肾功能的量度没有差异，并且符合同样动物的肾小球或肾小管的任何病理学缺乏。与未处理小鼠(内参)相比，通过放射免疫测定法测量尿血管紧张素原(Aogen)，作为用递增浓度的p-MGE处理4周的小鼠的尿中肾损伤/功能的指标。还测量了尿中的尿肌酐，Aogen的量表示为ng Aogen/mg肌酐。n＝5。如图24B所示，未处理小鼠和处理小鼠之间的尿Aogen量没有差异，表明p-MGE不损伤肾，通过病理学评估符合肾小球和肾小管的病理学缺乏(lack of pathology)。
图25显示了根据本公开的各方面的对于如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对血压的影响的分析。对用常规饮用水(内参)、0.2mg/mL p-MGE(p-MGE)、Ang II(24μg/kg/h Ang II，通过植入渗透微型泵施用)或者Ang II和p-MGE处理4周的雄性Sprague-Dawley大鼠测量收缩压。通过尾套体积描记法每周测量血压。n＝8，*表示p<0.05，**表示p<0.005，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。在该研究中，施用Ang II在4周时间段内增加大鼠的血压。p-MGE对饮用常规水的内参大鼠或用Ang II处理的大鼠的血压没有影响，表明p-MGE不会加剧高血压。
图26显示了根据本公开的方面的对于图25描述的大鼠的体重评估。在4周处理期结束时，称重大鼠，以确定用p-MGE处理是否对正常血压或高血压大鼠的体重有影响。n＝8，****表示p<0.0001。在存在或不存在用p-MGE处理的情况下，Ang II降低了大鼠的体重。在正常血压、未处理的大鼠或Ang II处理的高血压大鼠中，用p-MGE处理对体重没有影响，表明p-MGE不影响体重。
图27A-27B显示了根据本公开的各方面的对于如实施例1中所述的用Ang II和/或麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)处理的Sprague-Dawley大鼠的心脏收缩功能的评估。图27A显示了大鼠中的射血分数，而图27B显示了大鼠中缩短分数，所述大鼠用AngII、p-MGE或两者都处理4周，并使用VisualSonics Vevo 2100高分辨率成像系统(在中乳头水平的M模式胸骨旁短轴视图)测量。n＝8。与内参相比，Ang II和p-MGE单独或组合均未改变射血分数和缩短分数，表明Ang II和p-MGE施用对心脏收缩功能没有影响。
图28A-28C(应该是28)显示了根据本公开的方面的对于图27A-27B描述的大鼠的心脏特征的分析。图28A显示左后壁厚度的测量值，图28B显示了大鼠中的舒张末期直径的测量值，而图28C显示了相对壁厚的测量值，所述大鼠用Ang II、p-MGE或两者都处理4周，并使用VisualSonics Vevo 2100高分辨率成像系统在中乳头水平以M模式胸骨旁短轴视图评估。n＝8；与内参相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。Ang II增加左心室(LV)后壁厚度、降低LV舒张末期内径和增加相对壁厚，表明Ang II处理诱导了左心室同心重塑。p-MGE不会加剧或减少Ang II介导的变化。
图29A-29B显示了根据本公开的各方面的对于图28A-28B描述的用Ang II、p-MGE或两者处理4周的大鼠的舒张功能的评估，图2A显示评估e'作为LV松弛的量度，图29B显示评估E/e'作为左心室充盈压的指示。n＝8；与内参相比，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001；单独与Ang II相比，#p<0.05。Ang II诱导的舒张功能障碍，反映在心室舒张受损和左心室充盈压增高。共同施用p-MGE降低了Ang-II介导的E/e'增加并倾向于增加e'，表明p-MGE改善Ang II诱导的舒张功能障碍。
图30A-30B显示了根据本公开的各方面的对于图28A-28B描述的用Ang II、p-MGE或两者处理4周的大鼠中高血压诱导的心脏损伤的评估。用苦味酸-天狼星红染色心脏的左心室部分以鉴定总胶原，其在来自每只大鼠的左心室的4个图像中计量。n＝8；与内参相比，****p<0.0001；与Ang II相比，#p<0.05。共同施用p-MGE改善了Ang II介导的左心室间质纤维化的增加，表明该提取物可以减轻高血压引起的心脏损伤。
图31A-31B显示了根据本公开的各方面的对于图28A-28B描述的用Ang II、p-MGE或两者处理4周的大鼠中高血压诱导的心脏损伤的评估。用小麦胚芽凝集素染色心脏左心室的切片以勾勒出心肌细胞。平均横截面积(MCSA)取自每只动物的至少四个单独图像的平均值。与内参相比，*p<0.05；单独与Ang II相比，#p<0.05。通过共同施用p-MGE减弱了AngII增加的心肌细胞MCSA，表明通过施用p-MGE可以改善心肌细胞肥大。
图32A-32F显示了根据本公开的各方面，总结如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对人MDA-MB-231三阴性乳腺肿瘤的生长的影响的图。将无胸腺小鼠(n＝8)注射MDA-MB-231细胞，并用p-MGE处理，在其饮用水中施用4周。在清醒小鼠中每周测量肿瘤大小两次，并使用半椭圆体的公式计算肿瘤大小。图32A显示了图解说明用递增浓度的p-MGE进行的4周处理减少了无胸腺小鼠中人三阴性乳腺肿瘤的体积的图。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。取出这些小鼠(n＝8)的肿瘤并称重。图32B显示图解说明与未处理的小鼠相比、用递增浓度的p-MGE处理降低了小鼠肿瘤的重量的图，表明施用p-MGE将减少乳腺肿瘤生长。*表示p<0.05，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。图32C-32E分别显示在如参照图32A和图32B所述的饮用水用0.1mg酚类/mL p-MGE处理的小鼠或内参小鼠中的MDA-MB-231肿瘤中，双特异性磷酸酶1(也称为MAP激酶磷酸酶1(DUSP1/MKP1))、血小板衍生生长因子(PDGF)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(p21)的mRNA水平的分析。使用TRIzol从肿瘤中分离RNA，并使用靶标特异性引物/探针组(Applied Biosystems)来计量mRNA，使用18S rRNA作为内部参考。将结果计量为Ct值，其中Ct定义为PCR的阈值循环，在该阈值循环中首先检测扩增产物并定义为相对基因表达(靶标/内参的比率)。n＝8，****表示p<0.0001。图32C显示图解说明用p-MGE处理降低了DUSP1/MAKP1的相对表达。已知DUSP1/MAKP1使ERK1和ERK2蛋白激酶去磷酸化并因此使其失活，已知ERK1和ERK2蛋白激酶参与癌细胞的增殖。DUSP1/MAKP1的增加可以解释在用p-MGE处理的MDA-MB-231细胞和用提取物处理的脑特异性乳腺癌细胞中观察到的磷酸化-ERK1和磷酸化-ERK2的减少。图32D显示图解说明用p-MGE的处理降低了PDGF的相对表达的图，PDGF是参与细胞生长调节的主要生长因子之一。通过用p-MGE处理减少PDGF可参与p-MGE诱导的肿瘤生长减少。图32E显示图解说明用p-MGE的处理增加了p21的相对表达的图，p21是抑制细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合物的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CKI)。通过用p-MGE的处理减少p21表明p-MGE可以抑制细胞周期以减少肿瘤生长，这符合在用p-MGE处理的脑特异性乳腺癌细胞中观察到的细胞周期蛋白D的减少。图32F显示了参与细胞增殖调节的细胞循环路径，其中圆圈表明p21在该过程中的作用。p-MGE诱导的p21增加可通过减少通过细胞循环的演进而参与调节细胞生长。
图33A-33B显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对脑特异性转移性乳腺癌细胞系的生长的影响。将细胞系4T1.luc.2Br5或Eo771.luc.Br5以集落形成密度来植板并暴露于指定浓度的p-MGE(在这些图中标记为MGE)。将得到的集落染色并计量，并针对无(0)p-MGE内参归一化。数据代表3次实验的平均值+/-SEM，每次至少一式三份进行。***表示p<0.001，****表示p<0.0001。p-MGE减少了两种不同的脑特异性乳腺癌细胞系的生长，这些细胞来自三阴性乳腺癌亲本细胞系(4T1)和ER+亲本细胞系(Eo771)，表明该提取物会抑制转移性乳腺癌生长。
图34A显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对脑特异性乳腺癌细胞系生长的影响。如图所示，将脑特异性乳腺癌细胞(4T1-Br5、Eo771-Br5、MDA-MB231Br和MCF7.HER2.Br3)与10μg/mL p-MGE(M)或不含p-MGE(C表示内参)一起温育，通过蛋白质印迹(Western blot)分析磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)与总ERK1/2的比较。显示的印迹代表3个独立实验；下面的计量表示来自3个独立实验的平均值。用p-MGE处理24小时后，4T1-Br5显示ERK1/2磷酸化显著降低(降低68％，p<0.05)，表明MAP激酶的磷酸化和活化的减少可能参与p-MGE诱导的细胞生长减少。相反，磷酸化ERK1/2在Eo771、MDA-MB-231或MCF-HER1脑特异性乳腺癌细胞中没有变化，表明不同途径可能参与不同类型乳腺癌细胞中细胞生长的抑制。
图34B显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对脑特异性乳腺癌细胞系的生长的影响。将脑特异性乳腺癌细胞(4T1-Br5、Eo771-Br5、MDA-MB231Br和MCF7.HER2.Br3)与10μg/mL p-MGE(M)或不含p-MGE(C表示内参)一起温育4小时或24小时，然后通过蛋白质印迹分析用针对细胞周期蛋白D1的抗体进行探测；微管蛋白用作上样内参。*表示p<0.05，**表示P<0.01。p-MGE在4T1三阴性、E0771ER+、MDA-MB-231三阴性和MCF7.HER2ER+/HER2过表达细胞系中处理24小时后引起细胞周期蛋白D1减少，表明该提取物减少了通过细胞循环的演进(progression)。
图35显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对脑特异性乳腺癌细胞系的生长的影响。如图所示，将脑特异性乳腺癌细胞(4T1-Br5、Eo771-Br5、MDA-MB231Br和MCF7.HER2.Br3)与10μg/mL p-MGE(M)或不含p-MGE(C表示内参)一起温育4或24小时，进行针对PARP或裂解的半胱天冬酶3的蛋白质印迹分析；β-肌动蛋白用作上样内参。*PARP裂解产物。所示数据代表针对每个细胞系的3个独立实验。p-MGE刺激脑特异性4T1细胞系中的细胞凋亡，通过裂解的PARP和裂解的半胱天冬酶3的增加作为细胞凋亡的标志物来检测。相反，在其他3种脑特异性细胞系中，p-MGE不会增加细胞凋亡，这表明不同的机制导致不同类型的转移性乳腺癌中细胞生长的减少。
图36A-36B显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响。根据制造商的说明，用来自Essen Bioscience的IncuCyteTM NucLightTM Red Lentivirus Reagent(EF1α，Puro)转染MDA-MB-231人TNBC细胞，以标记细胞核。根据制造商的说明进行转染，并使用嘌呤霉素选择和维持转染的细胞。将标记的细胞接种到96孔板中，并用递增浓度的p-MGE处理，以μg酚类/mL培养基计算。如图A所示在48小时测量细胞增殖，并在图B中计量。n＝3，一式四份，****表示p<0.0001。p-MGE显著降低人MDA-MB-231细胞的增殖，与肿瘤生长的减少相符。
图37A-37C显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞增殖的影响。响应于p-MGE浓度的增加，在BT-549(图37A)、BT-20(图37B)和4T1(图37C)TNBC细胞系中测量细胞增殖。n＝3一式四份；*表示p<0.05，**表示p<0.005，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。通过增加p-MGE的浓度来降低BT-549和BT-20人三阴性乳腺癌细胞和4T1小鼠TNBC细胞的生长，表明TNBC是用p-MGE处理的靶标。
图38A-38D显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)处理的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞中MAP激酶信号传导的分析。用p-MGE(10μg/mL或20μg/mL)处理4T1细胞12小时，制备细胞裂解物并用于使用针对磷酸化的MAP激酶p-ERK1和p-ERK2和活化的MAP激酶p-ERK1和p-ERK2的抗体的蛋白质印迹分析。分别如图38A和图38B所示，将磷酸化-ERK1和ERK2的量针对未磷酸化的ERK1和未磷酸化的ERK2的量归一化，而在图38C和图38B中示出代表性印迹图像。n＝6，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。p-MGE显著降低参与细胞生长调节的磷酸化活化的ERK1和ERK2、MAP激酶，表明ERK1/2活性的降低参与了细胞增殖和乳腺肿瘤生长的减少。
图39显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)处理的三阴性乳腺癌细胞中的差异基因分析的结果。将4T1小鼠三阴性乳腺癌细胞与20μg酚类/mL p-MGE温育0、1、6或12小时，并使用TRIzol分离总RNA。在WakeForest University综合癌症中心癌症基因组学共享资源中使用RNAseq分析差异基因表达。使用EPIG(其是用于提取微阵列基因表达模式和鉴定共表达的基因的方法)分析数据全局基因模式分析，显示9种不同模式的2009个基因的上调、下调或无显著改变。由p-MGE上调的基因家族包括涉及炎症或脂多糖(LPS)反应的29个基因，涉及病毒防御或IFNβ反应的272个基因，以及涉及自体吞噬或内质网(ER)应激反应的741个基因。与此相对，被下调的有96个涉及核小体组装或先天免疫应答的基因，748个涉及细胞周期或细胞分裂的基因。四种额外的基因模式显示没有显著富集。
图40A-40B显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对三阴性乳腺癌细胞迁徙的影响。使MDA-MB-231TNBC细胞在96孔板中生长至汇合，并使用IncuCyteTM WoundMakerTM将800μm区域剥蚀。然后用递增浓度的p-MGE处理细胞(如图中所示)。图40A显示代表性图像，其描绘了在24小时处理期间迁徙到剥蚀区域内的迁移距离，在此期间，用浓度为25μg酚类/mL的p-MGE处理细胞。图40B显示了在每种浓度的p-MGE下细胞在24小时内迁徙的计量距离。n＝3一式四份；**表示p<0.05，****表示p<0.01。p-MGE抑制MDA-MB-231TNBC细胞的迁徙，表明p-MGE会减少侵袭，这是导致转移性TNBC的迁徙过程的一部分。
图40C-40D显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对三阴性乳腺癌细胞迁徙的影响。使4T1TNBC细胞在96孔板中生长至汇合，并使用IncuCyteTM WoundMakerTM将800μm区域剥蚀。如图40C的图表所示，用递增浓度的p-MGE处理细胞，并在48小时的处理期间计算将伤口闭合的迁移距离。如图40D的图表所示，细胞在24小时迁徙的距离被计量。n＝3一式四份；**表示p<0.005，****表示p<0.0001。p-MGE抑制4T1TNBC细胞的迁徙，表明p-MGE会减少TNBC的迁徙，其是侵袭和转移生长过程的一部分。
图41A显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对HER2阳性乳腺癌细胞增殖的影响。用递增浓度的p-MGE处理SKBr3人HER2乳腺癌细胞，计算为μg酚类/mL培养基。在48小时测量细胞增殖并计量为内参的百分比。n＝3一式四份，*表示p<0.05，**表示p<0 01，***表示p<0.001，****表示p<.0001。p-MGE显著降低人SKBr3人HER2过表达细胞的增殖，表明该提取物可以减少HER2过表达乳腺肿瘤的生长。
图41B-41D显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对AKT/mTOR信号传导途径中蛋白质的磷酸化状态的影响。用20μg/mL pMGE以递增的时间处理SKBr3人HER2细胞，并制备细胞裂解物，以供用蛋白质印迹分析。使用GelDoc分析凝胶，并通过分析每泳道上样蛋白质的总量将免疫反应条带归一化用于上样。代表性图像显示在图表下方。n＝5，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。图41B显示丝氨酸473处的AKT磷酸化，图41C显示苏氨酸308处的AKT磷酸化，图41D显示m-TOR处的磷酸化(p-mTOR)。p-MGE显著降低AKT和m-TOR的磷酸化和活化，表明AKT途径和mTOR的激活参与HER2过表达乳腺癌细胞和肿瘤中的增殖和存活的调节。
图42A-42D显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的辐射和/或麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对脑特异性转移性乳腺癌细胞的集落生长的影响。将4T1.luc2.Br5或Eo771.luc.Br5细胞在集落形成密度下植板过夜，暴露于p-MGE(在图中表示为MGE)24小时，并如所示辐照(IR)。将集落染色并计量，如图42A(4T1.luc2.Br5)和42B(Eo771.luc.Br5)所示。存活分数＝#集落数/植板细胞数*假辐照细胞的植板效率。数据代表3-4次独立实验的平均值±SEM，每次实验一式三份。图42C是来自图42A的数据，显示4T1.luc2.Br5细胞的相对集落计数；p-MGE和IR的组合导致比两者中任一单独的条件更大的损失。**表示与内参(假)相比p<0.01；****表示与内参(假)相比p<0.001；b，与2Gy内参相比p<0.05，与p-MGE(假)相比p<0.001。n＝3次实验，一式三份进行。图42D是来自图42B的数据，显示了Eo771.luc.Br5细胞的相对集落计数；p-MGE和IR的组合导致比两者中任一单独的条件更大的损失。*表示与内参(假)相比p<0.05；**表示与内参(假)相比p<0.01；a，与2Gy内参相比p<0.01，与p-MGE(假)相比p<0.001。n＝4次实验一式三份进行。p-MGE与通常用于治疗转移性脑癌患者的辐射的组合导致生长的减少，大于单独使用p-MGE或辐射，这表明p-MGE与辐射共同施用可能更有效地减少肿瘤生长。
图43显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的他莫昔芬和/或麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对ER+乳腺癌肿瘤生长的影响。向无胸腺小鼠的乳房脂肪垫注射ZR-75-1ER+细胞(1×106个细胞)，并且使用卡尺每三天测量肿瘤生长。当肿瘤达到30mm3的大小时，用水/常规食物(内参)、0.1mg酚类/mL p-MGE(在图中标记为MGE)/常规食物处理小鼠7周，大约剂量为32mg/kg/天他莫昔芬(TAM，在含有来自Harlan-Teklad的400ppm TAM柠檬酸盐的食物中施用)/常规水、或p-MGE和他莫昔芬(图中为TAM+MGE)。使用半椭圆体的公式计算肿瘤大小。*表示p<0.05；n＝7-8。与饮用常规水的小鼠相比，用p-MGE处理7周显著减小了肿瘤体积。单用他莫昔芬处理也可减小肿瘤大小。然而，p-MGE和他莫昔芬的组合在减少肿瘤体积方面引起了累加效应，单独与p-MGE或他莫昔芬相比，是显著的。这些结果表明p-MGE可与他莫昔芬联合使用以减少ER+肿瘤生长。
图44显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的他莫昔芬和/或麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对ER+乳腺癌肿瘤重量的影响。如图43所述的用或不用p-MGE和/或他莫昔芬处理的ZR-75-1肿瘤在处理7周后取出并称重。n＝7-8。与饮用常规水的小鼠相比，用7周处理的p-MGE处理显著降低了肿瘤重量。单独用他莫昔芬(TAM)治疗也降低了肿瘤重量。然而，p-MGE和他莫昔芬(TAM+MGE)的组合在减少肿瘤重量方面引起了累加效应，这与单独的p-MGE或他莫昔芬相比是显著的。这些结果表明p-MGE可与他莫昔芬联合使用以减少ER+肿瘤生长。
图45A-45B显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的他莫昔芬和/或麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对ER+乳腺癌肿瘤细胞增殖的影响。如图43中所述的用或不用他莫昔芬和/或p-MGE(在图中标记为TAM和MGE)处理的ZR-75-1肿瘤，在处理7周后取出，在福尔马林中固定，包埋在石蜡中并切片。将切片与针对增殖标志物Ki67的抗体一起温育。如图45A所示，每个视野内计数Ki67细胞的数量并取平均值。来自每个治疗组的代表性图片显示在图45B中。*表示p<0.05；n＝7-8。单独用p-MGE处理显著降低Ki67免疫反应性，表明该提取物抑制ER+乳腺肿瘤的增殖。雌激素受体拮抗剂他莫昔芬(TAM)也显著减少增殖。用p-MGE和他莫昔芬(MGE+TAM)处理比单独用p-MGE或他莫昔芬处理更显著地减少增殖。这些结果表明p-MGE可与他莫昔芬联合使用以减少ER+肿瘤生长。
图46显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的他莫昔芬和/或麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对ER+乳腺癌肿瘤体积的影响。向无胸腺小鼠的乳房脂肪垫注射MCF7人ER+细胞(1×106个细胞)，并使用卡尺每三天测量肿瘤生长。当肿瘤达到30mm3的大小时，用水/常规食物(内参)、0.1mg酚类/mL p-MGE(在图中标记为MGE)/常规食物处理小鼠5周，大约剂量为32mg/kg/d他莫昔芬(TAM，在含有来自Harlan-Teklad的400ppm TAM柠檬酸盐的食物中施用)(TAM，在其食物中施用)/常规水或p-MGE和他莫昔芬(MGE+TAM)。使用半椭圆体的公式计算肿瘤大小。*表示p<0.05，n＝7-8。与饮用常规水的小鼠相比，用p-MGE处理的5周内减小了MCF7肿瘤体积。单独用他莫昔芬处理也可减小肿瘤大小。然而，p-MGE和他莫昔芬的组合在减少肿瘤体积方面引起了累加效应，这与单独的p-MGE或他莫昔芬相比，是显著的。这些结果表明p-MGE可与他莫昔芬联合使用以减少ER+肿瘤生长。
图47显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的他莫昔芬和/或麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对ER+乳腺癌肿瘤重量的影响。如图46所述处理MCF7人ER+乳腺肿瘤，处理5周后取出并称重。*表示p<0.05，n＝7-8。与饮用常规水的小鼠相比，用p-MGE处理5周显著减轻了肿瘤重量。单独用他莫昔芬治疗也减轻了肿瘤重量。然而，p-MGE和他莫昔芬的组合在减轻肿瘤重量方面引起了累加效应，这与单独的p-MGE或他莫昔芬相比，是显著的。这些结果表明p-MGE可与他莫昔芬联合使用以减少ER+肿瘤生长。
图48显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对前列腺肿瘤大小的影响。向无胸腺小鼠注射LNCaP人前列腺癌细胞，并在其饮用水中施用递增浓度的p-MGE处理5周。在5周处理期结束时测量清醒小鼠中的肿瘤体积，并使用半椭圆体的公式计算肿瘤大小。n＝5-6；*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。用递增浓度的p-MGE处理导致无胸腺小鼠中人前列腺肿瘤的呈剂量依赖性地减小。
图49显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对前列腺肿瘤生长的影响。处理5周后取出未处理(内参)或用递增浓度的p-MGE处理的无胸腺小鼠的LNCaP前列腺肿瘤，并称重。n＝5-6，**表示p<0.01，***表示p<0.001。与未处理的小鼠相比，用递增浓度的p-MGE处理导致无胸腺小鼠中人前列腺肿瘤重量的呈剂量依赖性地减小，表明施用p-MGE将减少前列腺肿瘤生长。
图50显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对前列腺肿瘤细胞增殖的影响。来自未处理(内参)或用0.1mg酚类/mLp-MGE(p-MGE)处理的无胸腺小鼠的LNCaP前列腺肿瘤在多聚甲醛中固定，包埋在石蜡中，切成切片并用针对Ki67的抗体染色。计数每个视野内Ki67阳性细胞的数量，如图左侧所示。代表性切片显示在右侧。n＝6，*表示p<0.05。用p-MGE处理降低了用增殖标志物Ki67染色的细胞百分比，表明该提取物减少了前列腺肿瘤细胞的增殖。
图51显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对血管生成的影响，如前列腺肿瘤中的血管数所反映的。来自未处理(内参)或用0.1mg酚类/mL p-MGE(p-MGE)处理的无胸腺小鼠的LNCaP前列腺肿瘤在多聚甲醛中固定，包埋在石蜡中，切成0.5mm切片并用针对CD34的抗体(它会使内皮细胞染色)来染色。通过阳性免疫反应性和形态学鉴定每个视野内血管的数量。n＝6，*表示p<0.05。用p-MGE处理减少了每个视野内的血管数量，表明该提取物抑制了前列腺肿瘤中的血管生成。
图52显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对前列腺肿瘤中VEGF和PLGF(调节血管生成的生长因子)的表达的影响。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂从未处理的(内参)或用0.1mg酚/毫升p-MGE(p-MGE)处理的无胸腺小鼠的LNCaP前列腺肿瘤中分离RNA。使用VEGF-或PLGF-特异性引物/探针组(Applied Biosystems)计量血管内皮生长因子(VEGF)和胎盘生长因子(PLGF)，并将18S rRNA用作内部参考。将结果计量为Ct值，其中Ct定义为PCR的阈值循环，在该阈值循环中首先检测扩增产物并定义为相对基因表达(靶标/内参的比率)。n＝6，*表示p<0.05。用p-MGE处理降低了VEGF和PLGF的相对表达，这与血管数量的减少一致，如图51所示，提供进一步的证据表明该提取物可抑制前列腺肿瘤的血管生成。
图53显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对响应于辐射处理的肌原纤维形成和免疫细胞浸润的影响。健康小鼠或是未接受任何处理，或是进行辐射(IR)、p-MGE、或辐射和p-MGE一起(IR+p-MGE)处理6周。分离胫骨前肌并用H&E来染色以显现肌肉组织的形态。接受辐射处理的肌肉显示出大量的再生肌纤维(白色箭头)和免疫细胞的浸润(黑色箭头)。用辐射处理小鼠的后肢导致肌原纤维再生和免疫细胞移动进入肌肉，这通过共同施用p-MGE而减少。
图54显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)对辐射诱导的纤维化的影响。健康小鼠或是未接受任何处理，或是接受放射(IR)、p-MGE、或放射和p-MGE(IR+p-MGE)处理6周。分离胫骨前肌并用Masson'sTrichrome染色法来染色以鉴定组织纤维化区域。使用ImageJ软件计量组织中纤维化的百分比。用放射治疗显著增加纤维化面积，其通过施用p-MGE而降低，但是单独用提取物处理没有效果，表明p-MGE处理显著减少了放射诱导的纤维化。
图55A-55C显示了根据本公开的各方面，如实施例1所述的用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)处理的小鼠中响应于辐照的肌肉组织的量中TGBβ、CTGF和SMAD2蛋白水平的评估。健康小鼠用总分数为7.3Gy/分数的四个分数辐照，每周两次，持续两周(对人类放射性癌症治疗建模)，并施用水(内参，无放射治疗)、饮用水中的p-MGE(仅p-MGE)、单独辐射(辐照)、或辐射和p-MGE(辐照+p-MGE)。通过ELISA测量肌肉组织中TGFβ、CTGF或SMAD2的浓度，并与内参或单独地与p-MGE比较。辐照增加了TGFβ、CTGF和SMAD2的肌肉密度。单独施用p-MGE对三种因子中的任何一种都没有显著影响。然而，在辐照之前、期间和之后施用p-MGE使得TGFβ和CTGF的组织水平恢复到与内参和SMAD2没有差异的水平，达到与单独的p-MGE没有差异的水平。这些结果表明，放射治疗激活TGBβ/CTGF/SMAD途径以增加组织纤维化，并且p-MGE通过减弱该途径来减少纤维化。
图56显示了根据本公开的各方面，如实施例1中所述的用麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)处理对响应于辐照的破骨细胞诱导的影响。在2Gy辐照之前，用0.0001、0.0002和0.0004μg/mL的p-MGE处理RAW264.7破骨细胞前体24小时，并在第7天计数破骨细胞的数量。NR，无辐射；IR，用2Gy辐射；NR MGE 0.0001、0 0002或0.0004，没有辐射并用递增浓度的p-MGE处理；以及IR MGE 0.0001、0.0002或0.0004，用2Gy辐射并用递增浓度的p-MGE处理。n＝2，重复；*表示单独地与内参相比p<0.05。单独用2Gy处理增加了破骨细胞前体向破骨细胞的转化。通过用0.0001、0.0002和0.0004μg/mL的p-MGE预处理24小时来防止辐射诱导的破骨细胞数量的增加，表明该提取物保护骨免于活性破骨细胞的增加。
图57显示了与根据本公开的各方面如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)相比，各种市售麝香葡萄产品中的酚含量的分析。对由麝香葡萄制成的9种不同市售产品的胶囊的酚含量以如下方式来进行评估：重新悬浮于水中并使用TissueLyzerTM(Qiagen)进行匀浆、然后再使用比色Folin-Ciocalteau方法的改型来测量总酚(以没食子酸作为标准)。酚类物质的量按每胶囊来计量。表3中提供了关于每种产品的信息和用于该图的缩写。与测试的9种市售麝香葡萄产品相比，含有p-MGE的胶囊的酚含量最高。
图58显示了与根据本公开的各方面如实施例1中所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)相比，各种麝香葡萄产品中的酚类化合物的分析。对图57中评估的p-MGE和三种麝香葡萄产品针对个别的多酚进行进一步分析。将样品在70％甲醇/1％甲酸中萃取并在Qiagen TissueLyserTM中匀浆；通过以100,000×g离心60分钟除去不溶物质。将提取物掺入同位素标记的儿茶素作为内标，并使用梯度条件直接应用于UHPLC-MS分析，所述梯度条件解析17种酚标准，检出限为200pg/μL。通过与标准比较来确定和计量主要成分——表皮素、没食子酸、原花青素、儿茶素和儿茶素-没食子酸酯。与来自自然珍珠(Nature's Pearl)、生物动力(Biopower)或Muscadinex的产品相比，p-MGE含有最高含量的儿茶素-没食子酸酯、原花青素，鞣花酸、表儿茶素、没食子酸和儿茶素。
图59显示了与根据本公开的各方面如实施例1所述的麝香葡萄籽和麝香葡萄皮液体提取物(l-MGE)和麝香葡萄籽和麝香葡萄皮粉末提取物(p-MGE)的色谱、质谱分析的结果。使用梯度条件通过UHPLC-MS分析评估提取物，所述梯度条件解析17种酚标准物，检出限为200pg/μL。分子量在约500和2000之间的产物分析的解析度得到了提高。用虚线框表示说明提取物的不同酚类成分的某些区别峰。
具体实施方式
本文描述了由葡萄制备的提取物及其制剂。本公开的提取物包括液体提取物和由其制备的粉末提取物。还提供了用于产生不同提取物的各种方法和与癌症有关的治疗方法。与现有的葡萄提取物相比，本公开的提取物具有增加的酚含量。特别地，本文所述的制造方法包括保持提取物(粉末和液体)的酚类化合物含量和使不溶物含量最小化的步骤。
以下将参考附图和实施例来描述本公开的各方面和特征，在附图和示例中示出了本发明的实施方案。该描述并非旨在作为涵盖可以实现本发明的所有不同方式的详细目录，亦非旨在涵盖可以添加到本发明的所有特征。例如，关于一个实施方式示出的特征可以结合到其他实施方案中，并且可以从该实施方式中删除关于特定实施方案示出的特征。因此，本发明预期在本发明的一些实施方案中，可排除或省略本文所述的任何特征或特征组合。另外，根据本公开，本领域技术人员将清楚对本文提出的各种实施方案的许多变化和添加，其不脱离本发明。因此，以下描述旨在说明本发明的一些特定实施方案，而不是穷举地指定其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本公开中使用的术语仅用于描述特定实施方案和特征的目的，而不是限制性的。
除非上下文另有说明，否则特别意指本文描述的各种特征和方面可以以任何组合使用。此外，本发明还预期在一些实施方案中，可排除或省略本文所阐述的任何特征或特征的组合。为了说明，在说明组合物包含组分A、B和C的情况下，特别意指A、B或C中的任何一种或其组合可以省略并单独或以以任何组合形式放弃。
如在本公开和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。同样如本文所用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能组合，以及当在替代方案(“或”)中解释时任何和所有可能的组合缺失。
如本文所用，术语“约”，当用于指可测量的值(例如质量、剂量、时间、温度等)时，是指具体量的0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或甚至20％的变化。例如，如果一个量被描述为包含“约50％X”，则应理解，在一些实施方案中，该组合物包含50％X，而在其他实施方案中，其可包含例如40％至60％X的任何值(即50±10％)。
如本文所使用的，术语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当在替代方案(“或”)中解释时任何和所有可能的组合缺失。
如本文所用，诸如“在X和Y之间”和“在约X和Y之间”的短语应该被解释为包括X和Y。如本文所使用的，诸如“在约X和Y之间”的短语意味着“在约X和约Y之间”，以及诸如“从约X到Y”的短语意思是“从约X到约Y”。
如本文所使用的术语“包含”、“包括”和“具有”指定所述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整体、步骤、操作、元素、组分和/或其组。
术语“药学有效量”在本公开中可与“治疗有效量”互换使用，并且是指对于治疗、消除或减轻受试者中治疗的疾病或病症的至少一种症状有效的药理学剂的量。在一些情况下，“治疗有效量”或“有效量”可以指用于在受试者中表现出可检测的治疗或抑制作用的功能剂或药物组合物的量。可以通过本领域已知的任何测定方法检测该效果。在某些情况下，当所治疗的疾病是癌症时，有效量可以是有效引发抗癌反应的量，抗癌反应包括对任何细胞增殖、细胞迁徙、血管生成、纤维化和炎症的减少。
如本文所用，过渡短语“基本上由......组成”是指权利要求的范围应被解释为包含权利要求中所述的特定材料或步骤、以及不会实质上影响要求保护的发明的基本的和新颖的特性。因此，当在本发明的权利要求中使用时，术语“基本上由......组成”不应被解释为等同于“包含”。
如本文所使用的，术语“增加(increase、increasing、increased)”、“增强(enhance、enhanced、enhancing和enchancement)”(及其语法变体)描述的是，与内参相比，提升了至少约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％或更多。
如本文所用，术语“减小”和“减少”(及其语法变体)是指与内参相比，在特定参数上减少了至少约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。
如本文所用的术语，“果渣”是指果汁从果实中压榨后剩余的果肉材料。果渣包括果实的果肉、籽和皮。
I.制备提取物和制剂的方法
本文描述的提取物可以用多种方式制备。本文所述的提取物可由容易获得的原料制备。
提供了由葡萄籽、葡萄皮或其组合产生提取物的方法。在对葡萄籽和葡萄皮进行提取之前，将葡萄压榨成果汁和果渣，并将果渣与果汁分开。通常，在室温下(例如，约70℉)，压榨葡萄并将果渣与果汁分离。将果渣冷却到至少约-20℉至最高-50℉的温度，这将果渣中的氧含量降低至零或接近零，从而增加果渣稳定性(减少微生物污染等)和维持高酚水平。在提取之前，将果渣解冻然后干燥。干燥的果渣中的皮和籽彼此分开。可选地，可以洗涤皮和籽以去除不需要的碎屑。在某些情况下，籽和皮可以重新组合然后提取。在其他情况下，可以如进一步描述的那样单独提取籽和皮。可选地，可以组合由籽和皮制成的提取物。
在一个方面，提供了一种产生葡萄籽和葡萄皮提取物的方法，包括使葡萄籽和葡萄皮与蒸馏水接触，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(b)加热步骤(a)的水、葡萄籽和葡萄皮，温度范围为约120℉至最高200℉(例如，约120℉、125℉、130℉、135℉、140℉、145℉、150℉、155℉、160℉、165℉、170℉、175℉、180℉、185℉、190℉、195℉、200℉、或其中的任何范围或值，但不超过200℉)，在此加热期间加入另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄籽、葡萄皮和水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄籽、葡萄皮和水，以产生葡萄籽和皮滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液，得到冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液，从而产生葡萄籽和葡萄皮提取物。在一些实施方案中，加热步骤(b)可以进一步包括在蒸馏水中搅拌葡萄籽和葡萄皮。在更进一步的实施方案中，加热可以在大气压下进行。在一些实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约85％籽比约15％皮，约80％籽比约20％皮，约75％籽比约25％皮，约70％籽比约30％皮，或约65％籽比约35％皮。在一些实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约70％籽比约30％皮。在进一步的实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约85％籽比约15％皮。
另一方面，提供了一种产生葡萄籽提取物的方法，包括：(a)使葡萄籽与蒸馏水接触，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(b)加热步骤(a)的水和葡萄籽，温度范围为约120℉至最高200℉(例如，约120℉、125℉、130℉、135℉、140℉、145℉、150℉、155℉、160℉、165℉、170℉、175℉、180℉、185℉、190℉、195℉、200℉、或其中的任何范围或值，但不超过200℉)，在此加热期间加入另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄籽和水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄籽和水以产生葡萄籽滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液，得到冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液，从而产生葡萄籽提取物。在一些实施方案中，加热步骤(b)可以进一步包括在蒸馏水中搅拌葡萄籽。在更进一步的实施方案中，加热可以在大气压下进行。
在另一方面，提供了一种产生葡萄皮提取物的方法，包括：(a)使葡萄皮(无籽或果肉)与蒸馏水接触，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(b)加热步骤(a)中的水和葡萄皮，温度范围为约120℉至最高200℉，在此加热期间加入另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄皮和水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄皮和水以产生葡萄皮滤液；(e)在步骤(d)的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)的滤液，得到冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)的冷却的滤液，从而产生葡萄籽提取物。在一些实施方案中，加热步骤(b)可以进一步包括在蒸馏水中搅拌葡萄皮。在更进一步的实施方案中，加热可以在大气压下进行。通过该方法产生的提取物中的酚类浓度可以为至少约3g/L至约8g/L。
令人惊讶的是，使用本文所述的方法将葡萄籽和葡萄皮彼此分开地提取提供了具有降低的不溶性物质和更高的多酚含量的提取物。葡萄籽和葡萄皮可以从一种或多种合适的葡萄品种中获得。因此，在一些方面，葡萄籽和葡萄皮可以从一种或多种葡萄品种获得，包括但不限于圆叶葡萄(Vitis rotundifolia)(下文称为“麝香葡萄(muscadinegrapes)”)、釀酒葡萄(Vitis vinifera)(下文称“葡萄藤”)、美洲葡萄(Vitis labrusca)、河岸葡萄(Vitis riparia)、夏葡萄(Vitis aestivalis)、沙地葡萄(Vitis rupestris)、紫葛葡萄(Vitis coignetiae)、霜葡萄(Vitis vulpina)和/或山葡萄(Vitis amurensis)。在一些实施方案中，葡萄籽和/或葡萄皮可以从一种或多种圆叶葡萄品种获得。例如，在一些实施方案中，葡萄籽和/或葡萄皮可以从非洲女王(African Queen)、阿拉楚阿(Alachua)、阿尔伯马尔(Albermarle)、黑美人(Black Beauty)、黑仔(Black Fry)、卡洛斯(Carlos)、柯沃特(Cowart)、达琳(Darlene)、南方爵士(Dixieland)、南方红(Dixie Red)、多琳(Doreen)、花儿(Flowers)、煎蛋(Fry)、无籽煎蛋(Fry Seedless)、GA-1、金色小岛、奶奶Val(Granny Val)、希金斯(Higgins)、狩猎(Hunt)、伊森(Ison)、詹姆斯(James)、珍宝(Jumbo)、木兰(Magnolia)、记忆(Memory)、米什(Mish)、内斯比特(Nesbitt)、NC-1、贵族(Noble)、波丽安娜(Polyanna)、罗莎(Rosa)、红门(Redgate)、王室(Regale)、斯嘉丽(Scarlett)、斯卡珀农(Scuppernong)、英镑银(Sterling)、糖门(Sugargate)、巅峰(Summit)、至上(Supreme)、甜蜜珍妮(Sweet Jenny)、塔拉(Tara)、北卡罗来纳人(Tarheel)、托马斯(Thomas)、凯旋(Triumph)和/或威德(Welder)麝香葡萄，或其中两种或更多种麝香葡萄品种的任意组合。
可以使用蒸馏水制备提取物。制备所用蒸馏水可使用常规技术，包括蒸馏、反渗透、活性炭过滤、离子交换、或其组合。在某些情况下，可以使用“分级蒸汽压缩蒸馏水”。如本文所用，术语“分级蒸汽压缩蒸馏水”是指高纯度蒸汽蒸馏水。分级蒸馏系统具有脱气装置，该脱气装置排出有机化合物，从而除去会污染未蒸馏水的化学品部分。纯水由11％的氢和89％的氧组成。未蒸馏水(例如自来水或泉水)可含有杂质(例如，溶解的固体和有机化合物)，而分级蒸汽压缩的蒸馏水内这些杂质的含量显著降低的。在一些情况下，分级蒸汽压缩蒸馏水可具有约1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm或至多约10-20ppm。在一些情况下，分级蒸汽压缩蒸馏水可以是约99.9％、99.8％、99.7％、99.6％、99.5％、99.4％、99.3％、99.2％、99.1％或99％纯水。例如，与未蒸馏水相比，分级蒸汽压缩蒸馏水没有或基本上降低了氯的含量。氯是一种强氧化剂，可以破坏多酚类化合物，因此可以干扰酚类物质的提取。分级蒸汽压缩蒸馏水还含有通常在未蒸馏水(例如自来水或泉水)中发现的降低水平的溶解固体，例如钠、钙、镁、铁和许多其它无机元素。诸如这些的无机元素的存在可以影响提取过程的效率，因此，本公开中描述的提取方法使用具有最少污染物的水。
在一些方面，使葡萄籽与蒸馏水接触包括使葡萄籽与蒸馏水接触的比例为约4.5磅葡萄籽比约0.5加仑水到约4.5磅葡萄籽比约2.5加仑水(例如，从约1磅葡萄籽比约0.11加仑水到约1磅葡萄籽比约0.56加仑水)及其中的任何范围或量。在代表性的实施方案中，该比例可以是约1磅葡萄籽比约0.22加仑水。在其他方面，使葡萄皮与蒸馏水接触包括使葡萄皮与水接触，其比例为约2磅葡萄皮比约0.5加仑水到约2磅葡萄皮比约2.5加仑水(例如，从大约1磅的葡萄皮比大约0.25加仑水到大约1磅的葡萄皮比大约1.25加仑的水)。在代表性实施方案中，该比例可为约2磅葡萄皮比约1加仑水(例如，约1磅葡萄皮比约0.5加仑水)。在一些实施方案中，可以使450磅葡萄籽或约200磅葡萄皮与总共约140加仑的蒸馏水接触。值得注意的是，当葡萄籽和葡萄皮彼此分开地被提取时，更有效率地从葡萄皮和葡萄籽中提取多酚。然而，在一些实施方案中，可以对籽和皮一起进行提取。因此，在代表性实施方案中，该方法包括在总共约140加仑的分级蒸气压缩蒸馏水中提取约314磅葡萄籽和约59磅葡萄皮。在一个实例中，葡萄皮和葡萄籽的组合与蒸馏水接触的比例包括：约3.7磅的葡萄籽和葡萄皮的组合比约0.5加仑水至约3.7葡萄籽和葡萄皮的组合比约2.5加仑水。在另一个实例中，使葡萄皮和葡萄籽的组合与蒸馏水接触的比例包括约3.7磅的葡萄皮和葡萄籽的组合比约1.0加仑的水。
有各种合适的容器可用于加热步骤。容器需要保持所需量的水和葡萄籽和/或葡萄皮。因此，例如，合适的容器可包括但不限于蒸汽釜。在一些方面，该方法可以在大气压下进行。发明人发现，除了沸腾之外，高压条件也会破坏多酚化合物，从而降低葡萄皮/籽的提取效率。因此，在一些实施方案中，压力容器不是适用于对葡萄皮和/或籽进行提取的容器。在某些情况下，容器不是封闭的容器。在某些情况下，容器可包括或装配有搅拌装置，以在加热步骤中搅拌容器的内容物。
存在于葡萄籽和皮中的抗氧化剂化合物，包括酚类、类黄酮和白藜芦醇，会被高温破坏。本文公开的最高加热温度200℉使提取过程中抗氧化剂化合物的破坏最小化。在一些实施方案中，加热可持续约1小时至约6小时(例如，约1小时至约5小时，约1小时至约4小时，约1小时至约3小时，或约1小时至约2小时，约1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时，或其中的任何范围或值)在约120℉到最高200℉的温度下(例如，120、125、130、135、140、145、150,155、160、165、170、175、180、185、190、195、200°F，以及其中的任何范围或值)。在某些情况下，加热可在120℉至200℉的温度下进行1至2小时。在特定情况下，加热可在约175℉至不超过200℉的温度下进行1至2小时。
在步骤(b)中添加另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水(用于任何葡萄皮提取、葡萄籽提取、或葡萄籽与葡萄皮提取方法)。这种另外的水可以一次加入或在整个加热期间逐渐/周期性地加入。当逐渐添加时，在加热的同时添加另外的水的周期可以是大约每5分钟至大约每60分钟(例如，大约每5、10、15、20、25、30、15、40、45、50、55、60分钟，或其中的任何范围和值)，或其某些组合，达到的总量为：约1磅葡萄籽或葡萄皮比约0.92加仑水到约1磅葡萄籽或葡萄皮比约4.6加仑水。因此，在一些实施方案中，在加热步骤(a)的水和葡萄皮或葡萄籽的过程中，可以在大约每5分钟至大约每60分钟或其某些组合中，添加另外的分级蒸气压缩蒸馏水。在代表性的实施方案中，在加热步骤(a)中的水和葡萄皮或葡萄籽的过程中，可以每15分钟至约每30分钟、或其某些组合加入另外的分级蒸气压缩蒸馏水。
在用蒸馏水加热葡萄籽或葡萄皮之后并在过滤之前，可以冷却蒸馏水中的葡萄籽或葡萄皮。在一些实施方案中，冷却可以是约40℉至约180℉的温度范围(例如，约40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180℉，或其中的任何范围或值)。在代表性实施方案中，冷却可以达到约170℉至约180℉的温度范围(例如，170℉、171℉、172℉、173℉、174℉、175℉、176℉、177℉、178℉、179℉、180℉，或其中的任何范围或值)。
在一些实施方案中，葡萄籽和水、葡萄皮和水、或葡萄皮、葡萄籽和水的过滤包括通过筛分尺寸过滤约20微米至约50微米(例如，约20微米、25、30、35、40、45、50微米；例如，约600目(mesh)至约300目(例如，约600、500、400、300目))，以及其中的任何范围或值。
在一些实施方案中，使用的过滤器由不锈钢而不是塑料组成，从而避免可能存在于塑料中的浸出化学品进入提取物中。因此，过滤器不是塑料的。同样，该过程中使用的其他容器和仪器也不是塑料的。例如，用于收集滤液或提取物的容器可包括但不限于不锈钢桶。
在一些实施方案中，食品防腐剂可以以约0.1％至约20％(重量/体积(w/v))(例如，约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20％w/v)的量添加至葡萄皮滤液或葡萄籽滤液中。在一些实施方案中，食品防腐剂可以以约0.1％至约15％、约0.1％至约10％、约0.1％至约5％、约0.1％至约1％、以及其中的任何值或范围的量添加至葡萄皮滤液或葡萄籽滤液中。在代表性的实施方案中，食品防腐剂可以以约0.1％至约1.0％w/v的量添加到葡萄籽滤液或葡萄皮滤液中。在一些实施方案中，食品防腐剂可包括但不限于山梨酸钾、柠檬酸、乙酸或维生素E(例如，生育酚、生育三烯酚)中的至少一种。在某些情况下，食品防腐剂可以是山梨酸钾。在特定情况下，食品防腐剂可以是添加到葡萄籽滤液、葡萄皮滤液或葡萄籽和葡萄皮滤液中的山梨酸钾，其量为约0.1％至约1.0％w/v。
在葡萄籽滤液、葡萄皮滤液、或葡萄籽和葡萄皮滤液中加入食品防腐剂后，可将滤液冷藏或冷却。在某些情况下，滤液可以冷却至约35℉至约45℉(例如，约35℉、36℉、37℉、38℉、39℉、40℉、41℉、42℉、43℉、44℉、45℉，以及其中的任何范围或值)的温度范围。在一些情况下，滤液可以冷藏(冷却)约24小时至约120小时(即，约1天至约5天)(例如，约24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120小时，或其中的任何范围或值)。在一些实施方案中，冷却可持续约24小时至约72小时。在代表性实施方案中，葡萄籽滤液、葡萄皮滤液或葡萄籽和葡萄皮滤液的冷却可持续约24小时。
冷藏后，可以再次过滤冷却的葡萄籽滤液，冷却的葡萄皮滤液，或冷却的葡萄籽和葡萄皮滤液。在一些实施方案中，冷却的滤液的过滤包括通过过滤器过滤，过滤器具有的筛眼孔径为约1微米至约10微米(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10微米)、或其中的任何范围或值(例如，12,000目至约1250目)。
过滤冷却的葡萄籽滤液、冷却的葡萄皮滤液、或冷却的葡萄籽和葡萄皮滤液(步骤(g))后，食品级乙醇可作为防腐剂加入滤液中。在一些情况下，乙醇可以以提取物的约2％至约5％(v/v)的量添加(例如，约2％、3％、4％、5％或其中的任何范围或值)。在特定情况下，可以加入提取物的2％(v/v)的乙醇。添加的食品级乙醇可以是约190标准(即95％乙醇)。在一些实施方案中，食品级乙醇可以由任何植物来源制成，包括但不限于玉米、小麦、甘蔗和/或葡萄。在代表性实施方案中，食品级乙醇可以是有机乙醇。如本文所用，术语“有机醇”是指由例如有机玉米、小麦、甘蔗、葡萄和/或其他有机乙醇来源制成的醇。将食品标记为有机食品的要求由美国农业部规定(www.ams.usda.gov/rules-regulations/organic/labeling)。
因此，在一些方面，提供了一种产生葡萄籽和葡萄皮提取物的方法，包括：使葡萄籽和葡萄皮与蒸馏水接触，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(b)加热步骤(a)中的水、葡萄籽和葡萄皮，温度范围为约120℉至最高200℉，在此加热期间加入另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄籽和葡萄皮及水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄籽、葡萄皮和水，以产生葡萄籽和葡萄皮滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液，得到冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液；(h)将食品级乙醇加入到步骤(g)中的滤液中，从而产生液体提取物。在一些实施方案中，加热步骤(b)可以进一步包括在分级蒸气压缩蒸馏水中搅拌葡萄籽和葡萄皮。在更进一步的实施方案中，加热可以在大气压下进行。在一些实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约85％籽比约15％皮，约80％籽比约20％皮，约75％籽比约25％皮，约70％籽比约30％皮，或约65％籽比约35％皮。在一些实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约70％籽比约30％皮。在进一步的实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约85％籽比约15％皮。
另一方面，提供了一种产生葡萄籽提取物的方法，包括：(a)使葡萄籽与蒸馏水接触，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(b)加热步骤(a)中的水和葡萄籽，温度范围为约120℉至最高200℉(例如，约120℉、125℉、130℉、135°F、140℉、145℉、150℉、155℉、160℉、165℉、170℉、175℉、180℉、185℉、190℉、195℉、200℉，或其中的任何范围或值，但不超过200℉)，在此加热期间加入另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄籽和水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄籽和水以产生葡萄籽滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液，得到冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液；(h)将食品级乙醇加入到步骤(g)中的滤液中，从而产生液体提取物。在一些实施方案中，加热步骤(b)可以进一步包括在蒸馏水中搅拌葡萄籽。在更进一步的实施方案中，加热可以在大气压下进行。
在另一方面，提供了一种产生葡萄皮提取物的方法，包括：(a)使葡萄皮(无籽或果肉)与蒸馏水接触，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(b)加热步骤(a)中的水和葡萄皮，温度范围为约120℉至最高200℉，在此加热期间加入另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄皮和水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄皮和水以产生葡萄皮滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液，得到冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液；(h)将食品级乙醇加入到步骤(g)中的滤液中，从而产生液体提取物。在一些实施方案中，加热步骤(b)可以进一步包括在蒸馏水中搅拌葡萄皮。在更进一步的实施方案中，加热可以在大气压下进行。
在另一方面，提供了一种产生葡萄皮和葡萄籽提取物的方法，包括：提供通过本文所述方法制备的葡萄籽液体提取物；提供通过本文所述方法制备的葡萄皮液体提取物；将葡萄籽液体提取物和葡萄皮液体提取物以约50:50至约85:15(体积/体积(v/v))的比例混合，从而形成葡萄衍生的液体提取物。葡萄籽提取物与葡萄皮提取物的比例可为约85％籽提取物比约15％皮，约80％籽提取物比约20％皮提取物，约75％籽提取物比约25％皮提取物，约70％籽提取物比约30％皮提取物，或约65％籽提取物比约35％皮提取物。在一些实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约70％籽提取物比约30％皮提取物。在进一步的实施方案中，葡萄籽与葡萄皮提取物的比例可为约85％籽提取物比约15％皮提取物。
在一个实例中，提供了一种产生粉末状葡萄籽和葡萄皮提取物的方法，包括：使葡萄籽和葡萄皮与蒸馏水接触，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(b)将步骤(a)中的水、葡萄籽和葡萄皮加热至约120℉至最高200℉的温度，在此加热期间加入另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄籽和葡萄皮及水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄籽、葡萄皮和水，以产生葡萄籽和葡萄皮滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液，以得到冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液；(h)将食品级乙醇加入到步骤(g)中的滤液中，从而产生液体提取物，以及(h)喷雾干燥液体提取物以产生粉末状葡萄籽和葡萄皮提取物。在一些实施方案中，加热步骤(b)可以进一步包括在蒸馏水中搅拌葡萄籽和葡萄皮。在更进一步的实施方案中，加热可以在大气压下进行。在一些实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约85％籽比约15％皮，约80％籽比约20％皮，约75％籽比约25％皮，约70％籽比约30％皮，或约65％籽比约35％皮。在一些实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约70％籽比约30％皮。在进一步的实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约85％籽比约15％皮。
在另一个例子中，提供了一种产生粉末状葡萄籽提取物的方法，包括：(a)使葡萄籽与蒸馏水接触，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(b)加热步骤(a)中的水和葡萄籽至约120℉至最高200℉(例如，约120℉、125℉、130℉、135°F、140℉、145℉、150℉、155℉、160℉、165℉、170℉、175℉、180℉、185℉、190℉、195℉、200℉，或其中的任何范围或值，但不超过200℉)，在此加热期间加入另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄籽和水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄籽和水以产生葡萄籽滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液，得到冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液；(h)将食品级乙醇加入到步骤(g)中的滤液中，从而产生液体提取物，以及(h)喷雾干燥液体提取物以产生粉末状葡萄籽提取物。在一些实施方案中，加热步骤(b)可以进一步包括在蒸馏水中搅拌葡萄籽。在更进一步的实施方案中，加热可以在大气压下进行。
在另一个实例中，提供了一种产生粉末状葡萄皮提取物的方法，包括：(a)使葡萄皮(无籽或果肉)与蒸馏水接触，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(b)加热步骤(a)中的水和葡萄皮，温度范围为约120℉至最高200℉，在此加热期间加入另外的蒸馏水，可选地为分级蒸汽压缩蒸馏水；(c)冷却步骤(b)中的葡萄皮和水；(d)过滤步骤(c)中的葡萄皮和水以产生葡萄皮滤液；(e)在步骤(d)中的滤液中加入食品防腐剂；(f)冷却步骤(e)中的滤液，得到冷却的滤液；(g)过滤步骤(f)中的冷却的滤液；(h)将食品级乙醇加入到步骤(g)中的滤液中，从而产生液体提取物，和(h)喷雾干燥液体提取物以产生粉末状葡萄皮提取物。在一些实施方案中，加热步骤(b)可以进一步包括在蒸馏水中搅拌葡萄皮。在更进一步的实施方案中，加热可以在大气压下进行。
除了制备液体提取物的方法之外，还提供了制备粉末提取物的方法。本公开的粉状提取物可以通过干燥如本文所述制备的液体提取物来制备。在某些情况下，液体提取物可以被喷雾干燥。术语“喷雾干燥”广义上是指将液体混合物打碎成小液滴(雾化)并从混合物中快速除去溶剂的方法。在典型的喷雾干燥设备中，强驱动力使溶剂从液滴中蒸发，这可以通过提供干燥气体来提供。仅作为非限制性实例，典型的喷雾干燥设备包括干燥室、用于将含溶剂的进料雾化到干燥室中的雾化装置、流入干燥室以从含进料的雾化溶剂中除去溶剂的干燥气体的源、干燥产物的出口、和位于干燥室下游的产物收集装置。通常，产物收集装置包括连接到干燥设备的旋风分离器。在旋风分离器中，将喷雾干燥过程中产生的颗粒与干燥气体和蒸发溶剂分离，从而收集颗粒。过滤器也可用于分离和收集通过喷雾干燥产生的颗粒。
可以在本文所述的方法中以常规方式进行喷雾干燥。干燥气体可以是任何合适的气体，但惰性气体如氮气、富氮空气、和氩，是优选的。在一些实施方案中，使用氮气。通过喷雾干燥产生的无定形共沉淀物可以通过本领域常用的技术来回收，例如使用旋风分离器或过滤器。
也可以通过例如在惰性气氛下基本上完全蒸发溶剂、浓缩溶液或蒸馏溶剂来实现溶剂的除去，从而获得粉末提取物。
在一个实施方案中，干燥在大气压或减压下，例如，低于约200mm Hg，或低于约50mm Hg，在约25℃至约90℃的温度下进行。可以进行任何达到所需结果的所需时间段，例如约1至20小时。根据产品规格，干燥也可以进行更短或更长的时间。将根据所用溶剂的挥发性来选择温度和压力，并且上述条件应仅被视为一般指南。干燥可以适当地在盘式干燥器、真空烘箱、空气烘箱中，或使用流化床干燥器、旋转闪蒸干燥器、闪蒸干燥器等进行。干燥设备的选择完全在本领域的普通技术范围内。在某些情况下，所得粉末提取物可具有约3.0-3.4％的残余水分含量。
在一个实例中，液体提取物可以雾化，其喷雾引入44英寸×32英寸干燥器中，与加热的天然气在约200-400℉的温度下混合(例如，入口温度约为400℉，出口温度约为200℉)，流速为18,000-22,000cfm。
在一个实例中，例如本公开的实施例1，提供了一种产生葡萄籽和葡萄皮粉末提取物的方法，包括雾化含有葡萄籽和葡萄皮的液体提取物以产生喷雾并干燥所述喷雾。在一些实施方案中，使用天然气以18,000-22,000cfm的流速在干燥器中进行干燥。在一些实施方案中，干燥在约200-400℉范围内的温度下进行。在一些情况下，所产生的粉末提取物具有约3.0-3.4％的残余水分含量。通过该方法形成的粉末提取物可以被包封或可以被重构以形成液体。在某些情况下，粉末提取物可以配制在羟丙甲纤维素胶囊中。提取物，特别是粉末提取物，可以在至少3、4、5、6、8、10、18或24个月的时期内保持稳定，其特征在于在这段时期结束时的酚水平为该时期开始时酚水平的至少90％，例如至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％。
在一些情况下，与含有磨碎的葡萄籽或皮(或两者)的已知市售提取物相比，根据上述方法产生的提取物，总体或单独比较，通常比含有磨碎的葡萄籽的市售胶囊具有更多的酚类。所述提取物中增强的(富集的)酚类包括，例如，儿茶素、没食子酸、表儿茶素、鞣花酸、原花青素和儿茶素-没食子酸酯(cat-gall)。
在一个实例中，例如本公开的实施例2，提供了一种产生麝香葡萄籽提取物的方法，包括将葡萄籽放入敞口蒸汽釜中并加入所需量的分级蒸汽压缩蒸馏水，例如，450磅的葡萄籽用100加仑分级蒸汽压缩蒸馏水。分级蒸汽压缩蒸馏水中的葡萄籽可以在约175-200℉加热约1-2小时。可选地在加热期间，可以加入另外的分级蒸气压缩蒸馏水，例如每15-30分钟以5加仑的增量加入，直至达到所需的总水量，例如140加仑。加热后，可以降低温度并冷却至约170-180℉。然后可以通过网状不锈钢筛过滤水中的葡萄籽，并可以收集滤液。可选地，可以将山梨酸钾加入葡萄籽滤液中。提取物，特别是粉末提取物，可以在至少3、4、5、6、8、10、18或24个月的时期内保持稳定，其特征在于在这段时期结束时的酚水平为该时期开始时酚水平的至少90％，例如至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％。
在一个实例中，例如本公开的实施例3，提供了一种产生麝香葡萄皮提取物的方法，包括将葡萄皮放入敞口蒸汽釜中并加入所需量的分级蒸汽压缩蒸馏水，例如450磅葡萄皮用100加仑分级蒸汽压缩蒸馏水。分级蒸汽压缩蒸馏水中的葡萄皮可在约175-200℉加热约1-2小时。可选地在加热期间，可以加入另外的分级蒸气压缩蒸馏水，例如每15-30分钟以5加仑的增量加入，直至达到所需的总水量，例如140加仑。加热后，可以降低温度并冷却至约170-180℉。然后可以通过网状不锈钢筛过滤水中的葡萄皮，并可以收集滤液。可选地，可以将山梨酸钾添加到葡萄皮滤液中。提取物，特别是粉末提取物，可以在至少3、4、5、6、8、10、18或24个月的时期内保持稳定，其特征在于在这段时期结束时的酚水平为该时期开始时酚水平的至少90％，例如至少92％、至少95％、至少98％、或至少99％。
可以根据本领域已知的任何合适方法，在本文所述方法的任何阶段监测提取物组合物。例如，成分可以通过光谱手段监测，例如核磁共振光谱(例如1H或13C)、红外光谱、分光光度法(例如UV-可见光)、质谱法，或通过色谱法如高效液相色谱法(HPLC)或薄层色谱，或其组合。
在一个方面，提供了一种从葡萄籽、葡萄皮或其组合制造液体提取物的方法，该方法包括：(a)提供葡萄籽、葡萄皮或其组合；(b)将葡萄籽、葡萄皮或其组合与蒸馏水接触以形成提取混合物；(c)在120℉至200℉的温度范围内加热提取混合物，在此加热期间加入另外的蒸馏水；(d)冷却提取混合物；(e)过滤提取混合物以除去固体，从而形成滤液；(f)在滤液中加入食品防腐剂；(g)冷却滤液，以形成冷却的滤液；(h)过滤冷却的滤液，从而产生液体提取物。
在一些实施方案中，葡萄籽、葡萄皮或其组合得自选自下组的葡萄：包括但不限于圆叶葡萄、釀酒葡萄、美洲葡萄、河岸葡萄、夏葡萄、沙地葡萄、紫葛葡萄、霜葡萄和山葡萄。在某些实施方案中，葡萄籽、葡萄皮或其组合得自圆叶葡萄。
在一些实施方案中，提供葡萄籽用于该方法。在一个实施方案中，蒸馏水是分级蒸汽压缩蒸馏水。在一个实施方案中，使葡萄籽与蒸馏水接触包括：约4.5磅葡萄籽与约0.5加仑水至约4.5磅葡萄籽上至约2.5加仑水的比例。在一个实施方案中，使葡萄籽与蒸馏水接触包括约4.5磅葡萄籽与约1加仑水的比例。在一个实施方案中，加入另外的蒸馏水以达到约1磅葡萄籽与约0.92加仑水至约1磅葡萄籽与约4.6加仑水的比例。
在其他实施方案中，提供葡萄皮用于该方法。在一个实施方案中，使葡萄皮与蒸馏水接触包括约2磅葡萄皮与约0.5加仑水上至约2磅葡萄皮与约1.25加仑水的比例。在一个实施方案中，使葡萄皮与蒸馏水接触包括约2磅葡萄皮与约1加仑水的比例。在一个实施方案中，加入另外的蒸馏水以达到约1磅葡萄皮与约0.92加仑水上至约1磅葡萄皮与约4.6加仑水的比例。
在其他实施方案中，提供葡萄籽和葡萄皮的组合用于该方法。
在一个实施方案中，葡萄籽和葡萄皮的组合具有约50％葡萄籽与50％葡萄皮(重量/重量(w/w))至约85％葡萄籽与15％葡萄皮的比例。在一个实施方案中，使葡萄皮和葡萄籽的组合与蒸馏水接触，包括约3.7磅葡萄籽和葡萄皮的组合与约0.5加仑水、上至约3.7磅葡萄籽和葡萄皮的组合与约2.5加仑水的比例。在一个实施方案中，使葡萄皮和葡萄籽的组合与蒸馏水接触，包括约3.7磅葡萄皮和葡萄籽的组合与约1.0加仑水的比例。
在一些情况下，所提供的制造葡萄籽、葡萄皮或其组合的提取物的方法包括将提取混合物加热约1至约6小时。在某些情况下，加热进行约1至约2小时。在一个实施方案中，在加热过程中将另外的蒸馏水以多个部分加入到萃取混合物中。在一个实施方案中，在加热过程中约每5分钟至约每60分钟将一部分另外的蒸馏水加入到萃取混合物中。在一个实施方案中，在加热期间，每15分钟至约每30分钟将一部分另外的蒸馏水加入到萃取混合物中。
在一些实施方案中，将提取混合物冷却至约40℉至约170℉的温度。在一些实施方案中，将提取混合物通过筛孔尺寸为约20微米至约50微米的过滤器过滤。
在一些实施方案中，将食品防腐剂以约0.1％至约20％(重量/体积(w/v))的量加入滤液中。在一个实施方案中，将食品防腐剂以约0.1％至约1％(w/v)的量加入滤液中。在一个实施方案中，防腐剂包含山梨酸钾、柠檬酸、乙酸或维生素E中的至少一种。
在一些实施方案中，将滤液在约35℉至约45℉的温度下冷却。在一个实施方案中，将滤液冷却约24小时至约120小时。在一个实施方案中，将滤液冷却约24小时。在一个实施方案中，过滤冷却的滤液包括将冷却的滤液通过筛孔尺寸为约1微米至约10微米的过滤器过滤。
在一些实施方案中，将食品级乙醇加入到步骤(g)的过滤的冷却滤液中，从而产生液体提取物。在一个实施方案中，食品级乙醇为约190标准(95％乙醇)。在一个实施方案中，食品级乙醇由玉米、小麦、甘蔗或葡萄制成。在一个实施方案中，食品级乙醇是有机食品级乙醇。在一个实施方案中，添加到步骤(g)的过滤的冷却滤液中的食品级乙醇的体积为液体提取物体积的约2％至约5％。
另一方面，提供一种制备葡萄衍生的液体提取物的方法，包括：(a)提供通过上述方法制备的葡萄籽液体提取物；(b)提供通过上述方法制备的葡萄皮液体提取物；(c)将葡萄籽液体提取物和葡萄皮液体提取物以约50:50至约85:15(体积/体积(v/v))的比例混合，从而形成葡萄衍生的液体提取物。
另一方面，提供了一种制备葡萄衍生的粉末提取物的方法，包括：如上所述从葡萄籽、葡萄皮或其组合获得或制造葡萄衍生的液体提取物，然后喷雾干燥液体提取物形成粉末提取物。
II.提取物
本公开还提供了由葡萄籽、葡萄皮或其组合制成的提取物。液体提取物和粉末提取物均有提供。
本公开的提取物是通过部分I中描述的方法制备的提取物。在一些实施方案中，提取物由葡萄籽制成。在一些实施方案中，提取物是葡萄籽液体或粉末提取物。在一些实施方案中，提取物由葡萄皮制成。在一些实施方案中，提取物是葡萄皮液体或粉末提取物。在一些实施方案中，提取物由葡萄籽和葡萄皮制成。当提取物是葡萄籽和皮粉末提取物时，它可以包括由葡萄籽和皮液体提取物制成的喷雾干燥的粉末提取物。或者，葡萄籽和皮粉末提取物可包含由葡萄籽液体提取物和葡萄皮液体提取物的混合物制成的喷雾干燥的粉末提取物。或者，葡萄籽和皮粉末提取物可包含由葡萄籽液体提取物制成的喷雾干燥粉末提取物和由葡萄皮液体提取物制成的喷雾干燥粉末提取物的混合物。如果提取物是葡萄籽和皮液体提取物，它可以包含葡萄籽液体提取物和葡萄皮液体提取物的混合物，葡萄籽粉末提取物与葡萄籽液体提取物的混合物，葡萄皮粉末提取物和葡萄皮提取物的混合物，葡萄籽粉末提取物与葡萄皮液体提取物的混合物，葡萄皮粉末提取物与葡萄籽液体提取物的混合物，或包含至少一种其中溶解有葡萄籽粉末提取物或葡萄皮粉末提取物的溶液。在一些情况下，本公开的葡萄籽和皮液体提取物不包括通过包括以下步骤的方法制备的液体提取物：(a)提供葡萄籽和葡萄皮的组合；(b)将葡萄籽和葡萄皮的组合物与蒸馏水接触以形成提取混合物；(c)在120℉至200℉的温度范围内加热提取混合物，在此加热期间加入另外的蒸馏水；(d)冷却提取混合物；(e)过滤提取混合物以除去固体，从而形成滤液；(f)在滤液中加入食品防腐剂；(g)冷却滤液，以形成冷却的滤液；(h)过滤冷却的滤液，从而产生液体提取物。
本发明进一步提供了通过本发明的方法制备的提取物。产生的提取物中多酚的最终浓度可以通过调节在该过程中使用的水与葡萄籽或皮的比例来调节。因此，在一些方面，当使用约140加仑的水和约450磅的葡萄籽时，通过本发明的方法产生的提取物可包含15-25g/L的总多酚含量(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25g/L、及其中的任何范围或值)。在一些情况下，由葡萄皮产生的提取物中多酚的最终浓度可以是3g/L至8g/L。
如本文所述的提取物可包含100％葡萄籽提取物、100％葡萄皮提取物、100％葡萄籽和葡萄皮提取物、或其任何组合。因此，在一些方面，可以组合由葡萄皮产生的提取物和由葡萄籽产生的提取物，以产生组合的葡萄籽和葡萄皮提取物。葡萄籽提取物与葡萄皮提取物的比例可以是95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50等。在特定方面，葡萄籽提取物与葡萄皮提取物的比例可以是70:30。在其他方面，葡萄籽提取物与葡萄皮提取物的比例可以是85:15。
在一个实例中，提供了通过本公开中描述的提取方法制备的液体提取物。在一些情况下，液体提取物的总酚类化合物含量可以是约10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL、以及其中的任何值或范围。在一些情况下，液体提取物可具有约20mg/mL至200mg/mL的总酚类化合物含量。
在某些情况下，液体提取物是葡萄籽液体提取物和葡萄皮液体提取物的混合物。例如，葡萄籽液体提取物和葡萄皮液体提取物可以比例为约50:50至约85:15(体积/体积(v/v))。葡萄籽提取物与葡萄皮提取物的比例可为约85％籽提取物比约15％皮、约80％籽提取物比约20％皮提取物、约75％籽提取物比约25％皮提取物、约70％籽提取物比约30％皮提取物、或约65％籽提取物比约35％皮提取物。在一些实施方案中，葡萄籽与葡萄皮的比例可为约70％籽提取物比约30％皮提取物。在进一步的实施方案中，葡萄籽与葡萄皮提取物的比例可为约85％籽提取物比约15％皮提取物。
在另一个实例中，提供了通过本公开中描述的提取方法制备的粉末提取物。在一些情况下，粉末提取物包含约25％至50％(重量/重量(w/w))的总酚类化合物。在另一个例子中，提供了包含至少约30％(重量/重量(w/w))总酚类化合物的粉末提取物。在另一个例子中，提供了每克粉末提取物具有约250-500mg总酚类化合物的粉末提取物。在一些情况下，粉末提取物可包括浓度为至少约6mg/g粉末提取物的没食子酸或鞣花酸中的至少一种。在一些情况下，粉末提取物具有约150mg/g至约600mg/g的总酚浓度(例如，约150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、475、500、525、550、575、600mg/g，以及其中的任何值或范围)。在代表性实施方案中，粉末提取物可具有约250mg/g至约400mg/g、或约270mg/g至约350mg/g的酚类浓度。
在一些情况下，提取物包括食品防腐剂，例如山梨酸钾、柠檬酸、乙酸或维生素E(例如，生育酚、生育三烯酚)。例如，液体提取物可包含0.1％w/v山梨酸钾。在某些情况下，提取物可包括食品级乙醇。例如，液体提取物可包括乙醇，其为液体提取物体积的约2％至约5％v/v。在某些情况下，乙醇是95％乙醇(190标准)。
在一些实施方案中，葡萄衍生的粉末提取物包含约25％至50％(重量/重量(w/w))的总酚类化合物。
在一些实施方案中，葡萄衍生的粉末提取物包含至少约30％(重量/重量(w/w))的总酚类化合物。
在一些实施方案中，葡萄衍生的粉末提取物包含每克粉末提取物约250-500mg总酚类化合物。
在一些实施方案中，葡萄衍生的粉末提取物包含浓度为每克粉末提取物至少约6mg的没食子酸或鞣花酸中的至少一种。
在一些实施方案中，当进行高效液相色谱、质谱分析时，葡萄衍生的粉末提取物包含分子量为706和1033的独特组分。
在一些实施方案中，葡萄衍生的粉末提取物包含的分子量为730或1288的组分的量使得当进行高效液相色谱、质谱分析时，分子量为730或1288的组分不出现在在分析中生成的色谱图中的最大的30％的峰中。
在一些实施方案中，本公开中提供的提取物的总酚含量在至少6个月的时期内保持稳定，其特征在于在6个月时总酚含量降低不超过10％。
III.提取物特征
本公开提供的麝香葡萄提取物，例如使用实施例1-3中描述的方法产生的那些，可以使用本领域熟知的方法分析酚类含量。在某些情况下，没食子酸可用作酚含量分析测定的标准。在一个实施方案中，酚类含量可通过福林酚(Folin-Ciocalteau)方法来评估，例如，如实施例1中所述。当评估粉末提取物时，可将粉末提取物重新悬浮于水或其它合适的溶剂中并进行匀浆，然后测量其中含有的酚类。与非根据本公开所述的方法而生产的麝香葡萄的补充剂或提取物的酚类含量相比，根据本公开中描述的方法制备的提取物可具有至少5倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少16倍、至少20倍高的酚含量。在一个实例中，提取物是麝香葡萄籽和皮的粉末提取物，其根据实施例1中描述的方法(p-MGE)制备，具有162.3mg酚类/胶囊。此类补充剂和提取物的非限制性实例包括市售的“优质麝香葡萄籽膳食补充剂(Premium Muscadine Grape Seed Dietary Supplement，“NP”)”、“麝香葡萄升级版膳食补充剂(Muscadine Plus Dietary Supplement，“MN”)”、“优质麝香葡萄(PremiumMuscadine，“NF”)”、“麝香葡萄浆果(Muscadine Berries，“EN”)”、来自BiopowerNutrition(“BP”)的“麝香葡萄籽(Muscadine Grape Seed)”、“麝香葡萄籽草本补充剂(Muscadine Grape Seed Herbal Supplement，“VIT”)”、“Muscadinex膳食补充剂(Muscadinex Dietary Supplement，“NCMH”)”、“纯麝香葡萄籽(Pure Muscadine GrapeSeed，“BN”)”和“麝香葡萄籽(Muscadine Grape Seed，“FHN”)”。在一个实施例中，如图57所示，p-MGE的酚含量是BP产品的酚含量的16倍。在另一个实施方案中，基于mg酚类/克粉末，p-MGE制剂每个胶囊的总酚含量比EN产品高12.4倍，总酚含量比EN产品高14.9倍。
根据实施例1-3中描述的方法产生的麝香葡萄提取物可以富含一种或多种个别的酚类化合物。例如，此类酚类可包括但不限于表皮素、没食子酸、原花青素B、鞣花酸儿茶素和儿茶素没食子酸酯。在某些情况下，与由麝香葡萄制造的市售补充剂(包括前一段中描述的那些)相比，所提供的提取物可具有显著更高水平的这样的个别的酚类物质。在一些实施例中，例如，如图58所示，麝香葡萄籽和皮粉末提取物(p-MGE)可以包含至少5倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少16倍、至少20倍高的水平的至少一种类型的酚类化合物，如市售补充剂(例如在第III部分的前面段落中描述的那些)中所见。富含的酚类化合物可以是表皮素、没食子酸、原花青素B，鞣花酸儿茶素或儿茶素没食子酸酯中的一种或多种。用于该比较的市售补充剂可以是此类补充剂和提取物的非限制性实例，包括市售的“优质麝香葡萄籽膳食补充剂(Premium Muscadine Grape Seed Dietary Supplement，“NP”)”、“麝香葡萄升级版膳食补充剂(Muscadine Plus Dietary Supplement，“MN”)”、“优质麝香葡萄(Premium Muscadine，“NF”)”、“麝香葡萄浆果(Muscadine Berries，“EN”)”、来自BiopowerNutrition(“BP”)的“麝香葡萄籽”、“麝香葡萄籽草本补充剂(Muscadine Grape SeedHerbal Supplement，“VIT”)”、“Muscadinex膳食补充剂(Muscadinex DietarySupplement，“NCMH”)”、“纯麝香葡萄籽(Pure Muscadine Grape Seed，“BN”)”和“麝香葡萄籽(Muscadine Grape Seed，“FHN”)”中的任何一种。在某些情况下，市售补充剂是NP、BP或NCMH。在一个具体实施方案中，本文提供的p-MGE可含有22.0±0.7mg/g的表皮素、13.5±0.6mg/g的没食子酸、7.1±0.3mg/g的原花青素B、4.7±0.4mg/g的鞣花酸、2.7±0.1mg/g儿茶素和1.8±0.1mg/g儿茶素没食子酸酯。
质谱(“MS”)也可用于分析提取物。在一个实施方案中，质谱是与质谱检测(UHPLC-MS)相结合的岛津超高效液相色谱(UHPLC)。在某些情况下，可以通过喷涂膜方法处理根据实施例5制造的l-MGE以产生粉末形式的提取物(p-MGE)，如实施例1中所述，然后将其包封。在一些情况下，根据质谱分析，如本文提供的p-MGE富含具有分子量为706和1033的化合物，其在l-MGE中不具有(或大为减少)，如图59所示。在某些情况下，本文提供的p-MGE不含(或含有大为减少的量的)分子量为730和1288的化合物，其存在于l-MGE中，如图59所示。
提取物中的酚类物质可随时间减少。根据实施例1-3制备的葡萄提取物可显示出出色的商业用途稳定性(保质期)。例如，提取物可在65℉至77℉的环境温度下保持稳定至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少2年或更长时间。许多标准可用于评估本公开提供的葡萄提取物是否稳定。在某些情况下，葡萄提取物在保存一段时间后，提取物中总酚含量没有减少、减少少于2％、减少少于5％、减少少于10％、减少少于15％、减少少于20％、或少于25％时，被认为是稳定的。在一些情况下，例如，如表4中所示，p-MGE的总酚含量保持基本相同，例如，在一年后没有降低或显示小于5％、或小于3％的降低。
根据本公开制备的提取物通常也是生物学稳定的，在至少12个月、至少16个月、或至少18个月的时期内具有低的或没有微生物生长。例如，如表5中所示，根据实施例1中描述的方法制备的p-MGE提取物可以在16个月的时间内保持不含包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的微生物。在另一个实施方案中，本发明的提取物，特别是提供的粉末提取物，更特别是根据实施例1中描述的方法制备的p-MGE，16个月后可具有小于10pg/g的酵母和霉菌计数和/或小于10pcu/g的需氧菌计数。
IV.制剂
本文所述的提取物可以以药物组合物(制剂)而提供。取决于预期的给药方式，药物组合物可以是固体、半固体、液体剂型或其组合的形式，例如片剂、栓剂、丸剂、胶囊、粉末、液体或悬浮液，优选为适合单次施用精确剂量的单位剂型。该组合物包括药学有效量的本文所述的提取物，特别是其中的酚类化合物，以及药学上可接受的载体，此外，还可包括其他药物、药剂、载体或稀释剂。术语“药学上可接受的”是指不是在生物学上或在其他方面不合需要的物质，其可以与所选择的化合物一起施用于个体而不会引起不可接受的生物学效应，也不会以有害的方式与其所被包含在的药物成分中的其他组分相互作用。
在一些情况下，液体药物制剂中酚类化合物的浓度可以在10mg/mL、15mg/mL，20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL，或其中的任何数值或范围的范围内。在一些情况下，制剂可具有约20mg/mL至200mg/mL的总酚类化合物含量。在一些情况下，固体药物制剂中酚类化合物的量可以为约150mg/g至约600mg/g(例如，约150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、475、500、525、550、575、600mg/g，或其中的任何值或范围)。例如，该制剂可具有每克粉末提取物约250-500mg总酚类化合物。在一个实例中，制剂可具有约250mg/g至约400mg/g的酚浓度。在一些情况下，半固体药物制剂中酚类化合物的量可以为约150mg/g至约600mg/g(例如，约150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、475、500、525、550、575、600mg/g，或其中的任何值或范围)。例如，该制剂可具有每克粉末提取物约250-500mg总酚类化合物。在一个实例中，制剂可具有约250mg/g至约400mg/g的酚浓度。
如本文所用，术语载体包括任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂，、增溶剂、脂质、稳定剂，或本领域熟知的用于药物制剂的其他材料。用于组合物的载体的选择取决于组合物的预期施用途径。含有这些物质的药学上可接受的载体和制剂的制备描述于，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22d Edition,Lloyd etal.eds.,Pharmaceutical Press and Philadelphia College of Pharmacy atUniversity of the Sciences(2012年)。生理学上可接受的载体的实例包括：缓冲剂，例如磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和与其他有机酸的缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，例如(ICI，Inc.；Bridgewater，新泽西)、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM(BASF；Florham Park，NJ)。
所述成分还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以促进对微生物作用的防止。也可包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。
用于口服施用本文所述化合物或其衍生物的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，本文所述的粉末提取物可以与至少一种惰性常规赋形剂(或载体)混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙，或(a)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)保湿剂，例如甘油，(d)崩解剂，如同例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液缓凝剂，例如石蜡，(f)吸收促进剂，例如季铵化合物，(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，(h)吸附剂，例如高岭土和膨润土，和(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、或其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物也可以用作软和硬填充明胶胶囊中的填充剂，使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。
固体剂型如片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂可以用包衣和外壳制备，例如肠溶包衣和本领域已知的其它包衣。它们可以含有遮光剂，也可以是这样的组合物，即它们以延迟的方式在肠道的某一部分释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。如果合适，活性化合物也可以是一种或多种上述赋形剂的微胶囊形式。在一些情况下，包衣或壳可以是植物来源的，例如由羟丙基甲基纤维素(HPMC或羟丙甲纤维素)制成的胶囊或壳。
用于口服施用本文所述提取物的液体剂型包括药学上可接受的乳液，溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除提取物外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄基醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脂肪酸酯脱水山梨糖醇，或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，该组合物还可以包括其他试剂，例如润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂或芳香剂。
除提取物外，悬浮液可含有其它试剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂和黄蓍胶，或这些物质的混合物等等。
用于局部施用本文所述提取物的剂型包括软膏、粉末、喷雾剂和吸入剂。本文所述的提取物可以在无菌条件下与生理学上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼科制剂、软膏、粉末和溶液也包括在组合物的范围内。
在一些实施方案中，粉末制剂包含约25％至50％(重量/重量(w/w))的总酚类化合物。
在一些实施方案中，粉末制剂包含至少约30％(重量/重量(w/w))的总酚类化合物。
在一些实施方案中，粉末制剂包含每克粉末提取物约250-500mg总酚类化合物。
在一些实施方案中，粉末制剂包含浓度为至少约6mg/g粉末提取物的没食子酸或鞣花酸中的至少一种。
在一些实施方案中，当进行高效液相色谱、质谱分析时，粉末制剂包含分子量为706和1033的独特组分。
在一些实施方案中，粉末制剂包含的分子量为730或1288的组分的量使得当进行高效液相色谱、质谱分析时，分子量为730或1288的组分不出现在在分析中生成的色谱图中的最大的30％的峰中。
在一些实施方案中，本公开中提供的制剂的总酚含量在至少6个月的时期内保持稳定，其特征在于在6个月时总酚含量降低不超过10％。
V.治疗方法
所提供的提取物可用于食品、饮料、化妆品、膳食补充剂、营养品等中，从而提供具有增加的抗氧化剂含量的产品。
由麝香葡萄产生的几种植物化学物质，例如鞣花酸和白藜芦醇，针对它们的健康益处在生物医学文献中被广泛引用。黄酮类化合物通常是良好的抗氧化剂，且其制造厂家将其用于抗氧化保护。这些化合物可直接淬灭氧化自由基。黄酮类化合物可以螯合金属离子，金属离子通常是产生自由基的催化剂。这些化合物可能有助于以有益的方式调节基因表达。慢性疾病状态通常涉及基因表达的不利模式。黄酮类化合物是健康基因表达模式的强力的调节剂。
在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的提取物的食品，其中所述食品可以是液体(例如，用于肠内喂养或静脉内施用的饮料或液体)、固体(例如，条)，片剂和/或粉末。在一些实施方案中，食品可以是包封的粉末。在一些实施方案中，食品可以是医疗食品，其可以是例如以液体、固体、粉末或丸剂形式提供。
如本文所用，“医用食品”如“孤儿药物法”(USC 360ee(b)(3))第5(b)(3)节中所定义，并且是指在医生的监督下口服或肠内施用的“配制的食品”，根据公认的科学原则，用于通过医学评估确定有独特营养需求的疾病或病症的特定饮食管理。
在一些情况下，所提供的提取物可用于制备抗氧化剂组合物，其中将抗氧化剂组合物施用于受试者以治疗与氧化应激和/或炎症相关的疾病和病症。因此，在一些实施方案中，提供了治疗与氧化应激和/或炎症相关的疾病和病症的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本发明的提取物的组合物。
本文所述的提取物和制剂可用于肿瘤学领域。本文提供了使用所述提取物和制剂治疗患有癌症的受试者的方法。还提供了治疗患有癌症风险增加的受试者的方法。还提供了治疗具有癌症复发风险的受试者的方法。通常，该方法包括向患有疾病或病症的受试者施用有效量的本文所述的提取物或制剂。当用于描述以所提供的方法来施用的提取物或制剂的量时，有效量是指实现所需药理学效果或其他生物学效果的提取物、或提取物的酚类化合物含量、或制剂。
在一些情况下，给予受试者的提取物中总酚类化合物的总日剂量为300mg至6000mg。例如，受试者可以通过提取物被施用的总酚类化合物的总日剂量为300mg、325mg、350mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg、800mg、825mg、850mg、875mg、900mg、925mg、950mg、975mg、1000mg、1025mg、1050mg、1075mg、1100mg、1125mg、1150mg、1175mg、1200mg、1225mg、1250mg、1275mg、1300mg、1325mg、1350mg、1375mg、1400mg、1425mg、1450mg、1475mg、1500mg、1525mg、1550mg、1575mg、1600mg、1625mg、1650mg、1675mg、1700mg、1725mg、1750mg、1775mg、或1800mg(或任何这些剂量的5％以内的量)。在一些实例中，受试者可通过提取物被施用的总酚类化合物的总日剂量为1800mg、1900mg、2000mg、2100mg、2200mg、2300mg、2400mg、2500mg、2600mg、2700mg、2800mg、2900mg、3000mg、3100mg、3200mg、3300mg、3400mg、3500mg、3600mg、3700mg、3800mg、3900mg、3900mg、4000mg、4100mg、4200mg、4300mg、4400mg、4500mg、4600mg、4700mg、4800mg、4900mg、5000mg、5100mg、5200mg、5300mg、5400mg、5500mg、5600mg、5700mg、5800mg、5900mg、或6000毫克(或任何这些剂量的5％以内的量)。在某些实例中，受试者可以通过提取物被施用的提取物中总酚类化合物的总日剂量为324mg、648mg、700mg、972mg、1400、1620mg、2800或5600mg。本公开中描述的小鼠研究可用于确定人的剂量。例如，平均小鼠重0.025千克。通过提取物施用0.25、0.5、1和2mg总酚，例如根据实施例1中描述的方法制备的粉末麝香葡萄籽和皮提取物，每只小鼠每天对应的剂量范围为10、20、40和80mg酚类/千克/天。如果假定平均人类成年人体重为70kg，则相应的人类剂量为每天700、1400、2800和5600mg总酚。
在一些情况下，每天至少两次向受试者施用一定剂量的提取物或制剂。例如，在一些情况下，每天给受试者施用一定剂量的提取物或制剂2次、3次、4次、5次或6次。
在一些情况下，将粉末提取物或含有粉末提取物的制剂施用给受试者。在一些情况下，每剂量的粉末提取物或制剂的总酚类化合物含量可为约30-50％(mg/mg)。在一些情况下，一定剂量的粉末提取物或制剂包含约150-500mg总酚类化合物。
在一些情况下，可以给受试者施用总日剂量的液体提取物或粉末提取物，其包含每kg体重至少约10mg的总酚类化合物。例如，可以给受试者施用总日剂量的液体提取物或粉末提取物，其包含每kg体重约10mg、20mg、40mg或80mg的总酚类化合物。
在一些情况下，每剂量的液体提取物或制剂的总酚类化合物含量为至少约20mg/mL。在一些情况下，每剂量的液体提取物或制剂的总酚类化合物含量可以是10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL、250mg/mL、275mg/mL、300mg/mL，或其中的任何数值或范围。在一些情况下，总酚类化合物含量可以在约20mg/mL至200mg/mL的范围内。在一个实例中，一定剂量的液体提取物可包括约2.5g至约3.5g总酚类化合物。
如本文所用，受试者是指哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物包括例如人、非人灵长类动物(例如猿和猴)、牛、马、绵羊、大鼠、狗、猫、小鼠、猪和山羊。非哺乳动物包括例如鱼类、两栖动物、爬行动物和鸟类。本文所述的提取物和制剂可用于治疗人类的疾病和病症，包括但不限于儿科和老年人群，以及动物，例如兽医应用。
如本文所用，术语预防(prevent、preventing或prevention)疾病或病症是指这样一种作用，例如在受试者开始显示疾病或病症的一种或多种症状的之前或几乎同时，施用组合物或治疗剂，这抑制或延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或严重程度。
如本文所用，术语“治疗”、“处理”或“进行处理/治疗”(treatment、treat或treating)是指减少疾病或病症的一种或多种症状的方法。因此，在所公开的方法中，治疗可以指在疾病或病症的一种或多种症状的严重性上降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，与内参相比，如果受试者中疾病的一种或多种症状或体征(例如，肿瘤的大小或肿瘤生长速率)减少10％，则认为处理疾病的方法是一种治疗。如本文所用，内参是指未处理的病症(例如，未用本文所述的化合物和组合物处理的肿瘤细胞)。因此，与原生或内参相比，水平相比，减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或在10％和100％之间任何百分比的减少。应理解，治疗不一定是指治愈或完全消除疾病、病症、或者疾病或病症的症状。如本文所用，与内参水平相比，提及“降低”、“减少”或“抑制”包括10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的变化。这些术语可以包括但非必须地包括“完全消除”。
本文所述的提取物和制剂可用于预防和治疗方法。对于预防用途，在发病前(即在疾病的明显迹象之前)、在早期发作期间(例如在疾病的初始体征和症状时)、或疾病发展后，将药学有效量的如本文所述的提取物或制剂施用于受试者。预防性施用可在疾病症状出现之前进行数天至数年。治疗性处理包括在诊断出疾病或病症后，向受试者施用药学有效量的本文所述的化合物及其组合物或药学上可接受的盐。
示例性给药途径包括但不限于口服、肠内、皮肤、注射(例如皮下、肌肉内、皮内、腹膜内、静脉内和肿瘤内)、舌下、透皮、鼻内、局部和吸入途径。关于这些途径的讨论在上述第III部分中与制剂有关的描述中有提供。
本文所述组合物的施用可以是使用药学有效量进行在对治疗疾病或病症有效的一段时间内进行。本文所述的提取物和组合物的有效量可以由本领域普通技术人员确定，并且包括哺乳动物每天每公斤体重总酚类化合物约为600mg至6000mg的示例性剂量，可以以单剂量或以单独的分剂量的形式施用，例如至少一天两次。取决于受试者的疾病或病症，提取物或组合物的药学有效量可导致不同的治疗效果。
本领域技术人员将理解，任何特定受试者的具体剂量水平和剂量频率可以变化，并且取决于多种因素，包括所用特定提取物或制剂的活性；该化合物的代谢稳定性和作用时间长度；受试者的人种、年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用的方式和时间；排泄率；药物组合；受试者经历的疾病或病症的性质、以及特定疾病或病症的严重程度。在制剂中使用的精确剂量还取决于施用路径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个受试者的情况来决定。可以根据源自体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线来推断有效剂量。此外，根据施用途径，本领域技术人员将知道如何确定剂量以导致受试者的细胞、组织和/或器官中的期望水平的响应的血浆浓度。
在一个方面，本文提供了治疗或减轻受试者中的癌症的方法，包括施用本公开中提供的提取物。还提供了预防或降低受试者中发生癌症的可能性的方法，包括施用本公开中提供的提取物。还提供了预防或降低患有癌症的受试者中发生转移的可能性的方法，包括施用本公开中提供的提取物。还提供了抑制受试者中癌细胞生长或增殖的方法、抑制组织中血管生成的方法、以及抑制组织中纤维化的方法，包括施用本公开中提供的提取物。在一些情况下，治疗受试者中的癌症的方法包括向受试者施用有效量的本公开中提供的提取物或制剂。在一些情况下，施用提取物或制剂抑制受试者中的癌细胞生长或增殖。在一些情况下，施用提取物或制剂防止或减少肿瘤生长、转移或肿瘤生长和转移两者的可能性。在一些情况下，施用提取物或制剂抑制癌细胞生长或增殖、血管生成、炎症或纤维化中的至少一种。在一些情况下，施用提取物或制剂抑制内皮细胞的细胞生长或增殖(体内、体外)。
在一个方面，提供了治疗患有癌症、癌症风险增加或有复发风险的受试者的方法，该方法包括向受试者施用如本公开中所述的药学有效量的液体提取物、粉末提取物，或包含两者任一的制剂。在一些情况下，施用提取物抑制癌症相关细胞生长或增殖、血管生成、炎症或纤维化中的至少一种。
本公开提供的提取物具有广泛用于治疗癌症的用途。此类癌症包括但不限于癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和混合型癌症。在一个实施方案中，癌症是骨癌，例如尤文氏肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤和其他软组织肉瘤。在另一个实施方案中，癌症是脑癌，例如少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、淋巴瘤、神经鞘瘤或成神经管细胞瘤。在某些情况下，癌症是神经胶质瘤。在另一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在一些情况下，乳腺癌是HER2过表达乳腺癌、雌激素受体(ER)阳性乳腺癌或三阴性乳腺癌的。在某些情况下，癌症是脑特异性转移性乳腺癌。在另一个实施方案中，癌症是内分泌系统癌症，例如肾上腺癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、垂体癌和甲状腺癌。在另一个实施方案中，癌症是胃肠癌，例如肛门癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、胆囊癌、胃癌、肝癌和小肠癌。例如，癌症可以是胆道癌或胆管癌。在一个实例中，癌症是肝癌。在另一个实例中，癌症是肝细胞癌。在另一个实施方案中，癌症是妇科癌症，例如宫颈癌、子宫内膜癌、子宫癌、输卵管癌、妊娠滋养细胞疾病、绒毛膜癌、卵巢癌、阴道癌或外阴癌。在另一个实施方案中，癌症是头颈癌，例如喉癌、咽癌、食道癌、口咽癌、甲状旁腺癌或甲状腺癌。在另一个实施方案中，癌症是黑素瘤、鳞状细胞癌或基底细胞癌。在另一个实施方案中，癌症是白血病癌症，例如急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病或骨髓增生性疾病。在另一个实施方案中，癌症是肺癌，例如间皮瘤或非小细胞肺癌。在另一个实施方案中，癌症是淋巴瘤，例如皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病或非霍奇金病。在另一个实施方案中，癌症是骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤。在另一个实施方案中，癌症是阴茎癌。在另一个实施方案中，癌症是前列腺癌。在另一个实施方案中，癌症是睾丸癌。在另一个实施方案中，癌症是甲状腺癌，例如乳头状、滤泡状、髓质、间变性或未分化的甲状腺癌。在另一个实施方案中，癌症是泌尿道癌、膀胱癌或肾癌，例如肾癌和肝细胞癌。在某些情况下，癌症是泌尿生殖系统癌症。在某些情况下，癌症是腹膜癌。在另一个例子中，癌症是肉瘤。例如，癌症可以是滑膜癌。在具体的实施方案中，癌症可以是乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肺癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌症是HER2过表达，例如乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、结肠癌、前列腺癌或胰腺癌。在其他情况下，癌症是转移性癌症。在某些情况下，癌症是原发性癌症。
在受试者中治疗或预防癌症的方法可以进一步包括向受试者施用治疗剂、放射疗法或其组合。因此，所提供的组合物和方法可包括一种或多种另外的试剂。一种或多种另外的试剂和本文所述的提取物或制剂可以以任何顺序施用，包括伴随、同时或顺序施用。顺序施用可以间隔最多数天的时间间隔给药。该方法还可以包括不止一次施用一种或多种另外的试剂和/或本文所述的提取物或制剂。一种或多种另外的药剂和提取物或制剂的给药可以通过相同或不同的途径并同时或依次进行。
另外的治疗剂包括但不限于化学治疗剂。化学治疗剂是有效抑制或阻止异常生长细胞生长的化合物或组合物。因此，这种药剂可以治疗性地用于治疗癌症以及由异常细胞生长标记的其他疾病。化学治疗化合物的说明性实例包括但不限于贝沙罗汀、吉非替尼、厄洛替尼、吉西他滨、紫杉醇、多西紫杉醇、拓扑替康、伊立替康、替莫唑胺、卡莫司汀、长春瑞滨、卡培他滨、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、硼替佐米、奥利默森、六甲基三聚氰胺、异环磷酰胺、CPT-11、来氟米特(deflunomide)、环己酰亚胺、二嗪、天冬酰胺酶、米托坦(mitotant)、长春碱、卡铂、秋水仙碱、依托泊苷、美法仑、6-巯基嘌呤、替尼泊苷、长春碱、抗生素衍生物(包括蒽环类，如多柔比星、脂质体多柔比星，和己烯雌酚多柔比星，博来霉素，柔红霉素和放线菌素)；抗雄激素(如恩杂鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺和ARN-509)；抗雌激素药(如他莫昔芬)；抗代谢物(如氟尿嘧啶(FU)、5-FU、甲氨蝶呤、氟尿苷、干扰素α-2B、谷氨酸、哌霉素、巯嘌呤和6-硫鸟嘌呤)；细胞毒性剂(如卡莫司汀、BCNU、洛莫司汀、CCNU、阿糖胞苷、环磷酰胺、雌莫司汀、羟基脲、丙卡巴肼、丝裂霉素、白消安、顺铂、长春新碱和硫酸长春新碱)；激素(如甲羟孕酮、雌莫司汀磷酸钠、乙炔雌二醇、雌二醇、醋酸甲地孕酮、甲基睾酮、二乙基己烯雌酚二磷酸酯、氯三苯乙烯和睾酮内酯)；氮芥子衍生物(如威克瘤锭(mephalen)、苯丁酸氮芥、氮芥(氮芥(nitrogen mustard)和噻替哌)；类固醇(如倍他米松磷酸钠(bethamethasone sodium phosphate))；Akt抑制剂；糖皮质激素受体抑制剂(如倍氯米松、倍他米松、布地奈德、环索奈德、氟尼缩松、氟替卡松、米非司酮、莫米松和曲安西龙)；和生存因子抑制剂(如神经营养因子抑制剂、细胞因子、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝素结合表皮生长因子因子(HB-EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、神经鞘瘤来源生长因子(SDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(如BMP1-BMP15)、生长分化因子-9(GDF-9)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、促红细胞生成素(EPO)和血小板生成素(TPO)。
可选地，一种或多种另外的试剂可包括抗体。抗体可以包括完整的免疫球蛋白或其片段，该免疫球蛋白包括各种类别和同种型，例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，IgM等。其片段可以包括Fab、Fv以及F(ab')2和Fab'等。抗体还可以是单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体或本领域技术人员已知的任何其他抗体衍生物，其保留对特定结合位点特异的结合活性。另外，可以在适当的情况下使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要保持对特定结合位点的结合亲和力即可。示例性抗体包括曲妥珠单抗、阿仑单抗、泽娃灵(ibritumomab)、百利妥(blinatumomab)贝伐单抗和西妥昔单抗。
可选地，一种或多种另外的试剂可以包括癌症疫苗，例如，sipuleucel-T(由Dendreon制造)，其在2010年被美国联邦和药物管理局批准用于某些患有转移性前列腺癌的男性。
任何上述另外的试剂可以与本文所述的提取物或制剂任意组合使用。组合可以伴随地(例如作为混合物)、分别地但同时地施用(例如通过分开的静脉输液管路进入同一受试者)，或者依次地施用(例如首先给予一种化合物或试剂，然后给予第二种)。因此，术语组合用于指两种或更多种试剂的伴随地、同时地或顺序地施用。
在一些情况下，以药学有效量施用实施例1-3中产生的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，可以减少三阴性乳腺肿瘤的生长。在一些情况下，肿瘤尺寸的减小可以是至少30％、至少40％、至少50％、或至少66％，例如约66％。治疗有效量可取决于受试者的体重。例如，对于25mg小鼠，剂量可以是每天0.5mg至5mg酚类，例如每天0.5至2mg。在一些情况下，治疗有效量的提取物可以在20-80mg总酚/kg/天的范围内，即每天每kg患者体重20-80mg总酚。在一个实例中，如图32A所示，对携带人三阴性乳腺肿瘤的小鼠施用p-MGE(平均25mg体重)，其剂量为0.05、0.1、0.2或0.4mg酚/毫升，相当于每天0.25、0.5、1或2mg的酚类，可使肿瘤体积减少50％至65％。在一个实例中，如图32B所示，每天施用p-MGE，其剂量为0.05、0.1、0.2或0.4mg酚/毫升，相当于每天0.25、0.5、1或2mg的酚类物质，与未处理的小鼠相比，在为期30天处理期结束时可使肿瘤重量减少405至70％。在一个实例中，如图32C所示，对于25克小鼠，每天施用0.5mg酚类的p-MGE，其使DUSP1(MKP1)的表达增加约50％，导致磷酸化的活化MAP激酶的量减少。在一个实例中，如图32D所示，对于25克小鼠施用0.1mg/mL的p-MGE，相当于每天0.5mg酚类，将PDGF表达降低约50％。在另一个例子中，如图32E所示，对于25克小鼠施用0.1mg/mL的p-MGE，即每天0.5mg酚类，将p21的表达增加至未处理受试者的约2倍。因此，在一些情况下，施用本公开提供的提取物可以将乳腺癌肿瘤体积或重量减少40-70％，特别是当以10-80的剂量施用时，例如每天每千克受试者的质量(重量)施用20-80mg的总酚类物质。例如，在一些情况下，施用本公开提供的提取物可以将乳腺癌肿瘤体积或重量(或两者)减少至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％或70％(或在这些值的5％以内的程度)。
在一些情况下，以药学有效量施用实施例1-3中产生的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE),可以减少前列腺肿瘤的生长。例如，p-MGE可以以10-80mg的范围，例如每天每千克患者体重施用20mg的总酚类物质。在一些情况下，与未处理的内参相比，前列腺肿瘤的体积减少可以是至少25％、至少30％、至少40％、或至少50％，例如，约46％或约52％。这里参考图48描述了其一个示例。在一些情况下，p-MGE处理使前列腺肿瘤细胞的增殖减少至少20％、25％、30％、35％或40％(或在这些值的5％以内的程度)。例如，就如本文中关于图50所描述的，给携带前列腺肿瘤的小鼠施用p-MGE的0.1mg酚类/mL导致每个视野中Ki67阳性细胞数量减少36％，表明p-MGE减少前列腺肿瘤细胞的增殖。在另一个例子中，就如本文中关于图48所描述的，与未处理的小鼠相比，用p-MGE以每天0.5mg酚类或每天2mg酚类处理携带前列腺肿瘤的小鼠，可分别使肿瘤体积减少约52％或75％。在一些情况下，前列腺肿瘤的重量减轻可以是至少30％、至少40％、或至少50％，例如约59％。这里参考图49描述了其一个示例。因此，在某些情况下，本公开提供的提取物的施用可以将前列腺癌肿瘤体积或重量减少40％至75％，特别是当以每天每千克20-80mg总酚类物质的剂量施用时。受试者的体重(重量)。例如，在一些情况下，施用本公开提供的提取物可以将前列腺癌肿瘤体积或重量(或两者)减少至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％或75％(或在这些值的5％以内的程度)。
在一些情况下，将实施例1-3中产生的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，施用于受试者可以抑制前列腺肿瘤中的血管生成。在一些情况下，与未处理的内参相比，p-MGE可以使前列腺肿瘤中的血管数量减少至少15％、至少20％、至少25％或至少30％。在一个实例中，就如本文中关于图51所描述的，与未处理的小鼠相比，用p-MGE 0.1mg酚类/mL(相当于每天0.5mg酚类物质)处理携带前列腺肿瘤的小鼠可以使血管数量减少约42％。因此，在一些情况下，施用本公开提供的提取物可以将血管形成减少至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(或在这些值的5％以内的程度)。在一些情况下，与未处理的内参相比，p-MGE可以将肿瘤细胞中VEGF和PLGF(调节血管生成的生长因子)的相对表达降低至少15％、至少20％、至少25％或至少30％。在某些情况下，就如本文中关于图52A-52B所描述的，用p-MGE以0.1mg酚类/mL(其相当于每天0.5mg酚类)处理携带前列腺肿瘤的小鼠，可以使VEGF和PLGF的表达降低约30％至40％。因此，在一些情况下，施用本公开提供的提取物可以将VEGF表达、PLGF表达或两者降低至少20％、25％、30％、35％、40％或45％(或在这些值的5％以内的程度)。
在一些情况下，以药学上有效量的方式施用实施例1-3中产生的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，可以抑制脑特异性转移性乳腺癌细胞的生长。这些细胞可能是特异性转移到大脑的三阴性乳腺癌细胞(“TNBC”)。在某些情况下，就如本文中关于图33A-33B所描述的，施用p-MGE可以减少源自三阴性乳腺癌细胞、ER+乳腺癌细胞或两者的脑特异性转移性乳腺癌细胞的生长。例如，p-MGE可以抑制源自癌症的脑特异性乳腺癌细胞的生长，所述癌症表现类似于三阴性乳腺癌细胞系4T1，或源自ER+细胞系Eo7714T1的细胞系。在另一个实例中，p-MGE可以抑制脑特异性乳腺癌细胞的生长，其表现类似于脑特异性乳腺癌细胞系luc.2Br5、Eo771.luc.Br5或两者。在一些情况下，粉末提取物可以抑制脑特异性转移性乳腺癌细胞的细胞周期演进和/或诱导凋亡。在某些情况下，就如本文中关于图34A所描述的，向脑特异性乳腺癌细胞施用p-MGE可显著降低ERK1/2磷酸化。例如，就如本文中关于图34B所描述的，p-MGE的施用可以通过抑制细胞周期进程来抑制肿瘤细胞生长，例如通过降低细胞中的细胞周期蛋白D1水平。另外，在某些情况下，就如本文中关于图35所描述的，10μg/mL的p-MGE处理24小时可诱导细胞凋亡，如裂解的PARP和活性裂解形式的半胱天冬酶3的存在所示。
在一些情况下，以药学上有效量的方式施用实施例1-3中产生的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，可以减少三阴性乳腺癌细胞(TNBCs)的增殖。在一些情况下，施用由本公开提供的治疗量的提取物可以减少TNBC的初级生长。例如，就如本文中关于图36A-36B和图37A-37C所描述的，p-MGE可以在5μg/ml和25μg/ml(酚类物质/剂量)的浓度下降低TNBC的增殖。在某些情况下，就如本文中关于图38A-38D所描述的，施用p-MGE可以显著降低磷酸化和活化的ERK1和ERK2，它们是参与细胞生长调节的MAP激酶。因此，在一些情况下，当施用剂量为每千克受试者的质量(重量)每天20-80mg的总酚类物质时，本公开提供的提取物的施用可以将癌细胞增殖降低多达80％，特别是对于乳腺癌细胞，更特别是对于三阴性乳腺癌细胞。例如，施用本公开提供的提取物将癌细胞的增殖，特别是对于乳腺癌细胞，更特别是三阴性乳腺癌细胞，减少至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(或在这些值的5％以内的程度)。
在一些情况下，可以以药学上有效量的方式将用实施例1-3中产生的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，施用至具有三阴性乳腺癌的受试者，以上调或下调基因途径或家族。就如本文中关于图39所描述的，例如，用20μg/mL p-MGE(每剂量酚类物质)处理三阴性乳腺癌细胞可上调参与炎症或脂多糖(LPS)反应的基因，参与病毒防御或干扰素β的基因(IFNβ)响应，以及参与自噬或内质网(ER)应激反应的基因。在另一个实例中，用20μg/mL p-MGE(每剂量酚类物质)处理三阴性乳腺癌细胞可以下调参与核小体组装的基因，参与先天免疫应答的基因，和参与细胞周期或细胞分裂的基因，其可反映MAP激酶信号传导的变化和参与调节p-MGE处理后观察到的细胞周期的蛋白质。
在一些情况下，以药学有效量的方式施用实施例1-3中产生的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，可以减少HER2过度表达(阳性)乳腺癌细胞的增殖。在一些情况下，施用由本公开提供的治疗量的提取物可以减少这些细胞的初级生长。例如，就如本文中关于图41A所描述的，p-MGE可以在10μg/ml和40μg/ml(酚类物质/剂量)的浓度下降低HER2过表达(阳性)乳腺癌细胞的增殖。在某些情况下，就如本文中关于图41B-41D所描述的，p-MGE的施用可以显著降低磷酸化的活化AKT和m-TOR，其是细胞生长和存活的生理以及病理(如癌症)条件下的重要细胞内信号传导途径的关键组分。因此，在一些情况下，当施用剂量为每天每千克受试者质量(重量)20-80mg总酚类物质时，本公开提供的提取物的施用可以使癌细胞增殖减少约60％，特别是对于乳腺癌细胞，并且更具体地，对于HER2过表达(阳性)乳腺癌细胞。例如，本公开提供的提取物的施用使癌细胞增殖，特别是乳腺癌细胞，更特别是HER2过表达(阳性)乳腺癌细胞，减少至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(或在这些值的5％以内的程度)。
在一些情况下，以药学有效量的方式施用实施例1-3中制备的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，可以减少三阴性乳腺癌细胞(TNBCs)的迁徙量。在一些情况下，施用由本公开提供的治疗量的提取物可以减少TNBC的侵入性生长。例如，这可以降低这种肿瘤细胞的侵袭性。在某些情况下，就如本文中关于图40A-40D所描述的，以10μg/ml和25μg/ml(每剂量酚类物质)的剂量施用时(总剂量为10μg/mL和25μg/毫升)，p-MGE减少TNBC远离原发性肿瘤的迁徙。因此，在一些情况下，当在施用剂量为每天每千克受试者质量(重量)20-80mg总酚类物质时，本公开提供的提取物的施用可以将癌细胞迁徙减少25％至50％，特别是对于乳腺癌细胞，并且更特别地对于三阴性乳腺癌细胞。例如，本公开提供的提取物的施用使癌细胞迁徙，特别是乳腺癌细胞，更特别是三阴性乳腺癌细胞，减少至少20％、25％、30％、35％、40％、55％、或60％(或在这些值的5％以内的程度)。
在一些情况下，以药学有效量施用实施例1-3中制备的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，可以减少雌激素受体阳性(ER+)人乳腺肿瘤的生长。例如，治疗期可以是至少6周、至少7周或至少8周。在一些情况下，相对于未处理的内参受试者中的肿瘤生长，施用p-MGE可抑制肿瘤生长至少30％、至少40％、至少50％。在一些情况下，可以将p-MGE与雌激素受体拮抗剂组合施用于受试者以治疗ER+人乳腺肿瘤。在某些情况下，雌激素受体拮抗剂可以是他莫昔芬。在一些情况下，与单独的任一种治疗相比，用p-MGE和雌激素受体拮抗剂的组合治疗可以减少肿瘤生长。在一个实例中，就如关于图43、44、46和47所描述的，对携带由ZR-75-1细胞或MCF7细胞形成的ER+肿瘤的ER+小鼠施用p-MGE，对于25克小鼠，每只小鼠每天0.5mg酚类物质的剂量，显著减少肿瘤的生长，并且肿瘤生长的减少与增殖标志物Ki67阳性的细胞数量的减少相关，就如关于图45所描述的。因此，在一些情况下，当施用剂量为每千克受试者的质量(重量)每天约20-80mg总酚物质时，单独或与化学治疗剂组合施用本公开提供的提取物可以使肿瘤生长、肿瘤大小或两者均减少50％至95％。在一些情况下，单独或与化学治疗剂组合施用本公开提供的提取物可以使肿瘤生长、肿瘤大小或两者均减少至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％(或在这些值的5％以内的程度)。
在一些情况下，药学有效量的实施例1-3中制备的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，可以与放射组合施用以在患病期间治疗患者，例如癌症。在一些情况下，提取物可以与2Gy放射组合施用。在一些情况下，组合治疗比单独的放射治疗或p-MGE治疗更大程度地抑制患病细胞生长和/或杀死患病细胞。在一个示例中，如关于图42A-42B所描述的，辐射不会显著增加辐射灵敏度。在另一个示例中，就如关于图42C-42D所描述的，p-MGE的施用可导致小鼠脑特异性转移性乳腺癌细胞(例如，4T1.luc2.BR5细胞或Eo771.luc.Br 5细胞)比单独的任一种处理更大程度地减少。因此，在一些情况下，当施用剂量为每千克受试者的质量(重量)每天20-80mg总酚类物质时，本公开提供的提取物的施用可以使脑转移性癌细胞，特别是脑转移性乳腺癌细胞减少15％至50％。例如，单独或与化学治疗剂组合施用本公开提供的提取物可以使肿瘤生长、肿瘤大小或两者减少均至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(或在这些值的5％以内的程度)。在一些情况下，当施用剂量为每千克受试者的质量(重量)每天20-80mg总酚类物质时，本公开提供的提取物与放射疗法的施用可以使脑转移性癌细胞，特别是脑转移性乳腺癌细胞减少50％至80％。例如，本公开提供的提取物与放射疗法组合施用可使脑转移癌细胞，特别是脑转移性乳腺癌细胞至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％，75％或80％(或在这些值的5％以内的程度)。
在一些情况下，药学有效量的实施例1-3中制备的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，与化学治疗剂组合施用，与单独施用葡萄提取物或化学治疗剂相比，可以引起ER+肿瘤更大程度的生长减少。在一个实施方案中，化学治疗剂是他莫昔芬。这里参考图43描述了其一个示例。在某些情况下，就如本文中关于图44所描述的，用p-MGE与他莫昔芬组合处理有ER+肿瘤的受试者具有抑制肿瘤生长的累加效应，即，组合以比单独的p-MGE或他莫昔芬处理更大的程度显著降低肿瘤重量。与单独的任一种处理相比，组合处理还可以降低Ki67阳性肿瘤细胞的百分比，就如关于图45A-45B所描述的，其表明葡萄提取物和他莫昔芬的组合可以比单独的任一种处理更大程度地减少肿瘤细胞增殖。因此，在一些情况下，当施用剂量为每千克受试者的质量(重量)每天20-80mg总酚类物质时，本公开提供的提取物和化学治疗剂的施用可以使肿瘤大小(面积)，特别是乳腺癌肿瘤，更特别是ER+乳腺癌肿瘤，比单独的提取物多减少30％至40％，与单独使用化学治疗剂或两者相比多减少30％至50％。例如，本公开提供的提取物与化学治疗剂一起可以使肿瘤大小(面积)，特别是乳腺癌肿瘤，更特别是ER+乳腺癌肿瘤，比单独的提取物、单独的化学治疗剂、或两者，多减少至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(或在这些值的5％以内的程度)。在一些情况下，当施用剂量为每千克受试者的质量(重量)每天20-80mg总酚类物质时，施用本公开提供的提取物和化学治疗剂可以使肿瘤重量，特别是乳腺癌肿瘤，更特别是ER+乳腺癌肿瘤，比单独的提取物多减少25％至50％，与单独的化学治疗剂或两者相比多减少10％至20％。例如，本公开提供的提取物与化学治疗剂一起，与单独的提取物、单独的化学治疗剂或两者相比，可以将肿瘤重量，特别是乳腺癌肿瘤，更特别是ER+乳腺癌肿瘤，多减少至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％(或在这些值的5％以内的程度)。在一些情况下，当施用剂量为以每千克受试者体重(重量)每天20-80mg总酚类物质时，本公开提供的提取物和化学治疗剂的组合施用与单独的提取物、或单独的化学治疗剂、或两者相比，可以使肿瘤细胞的增殖(例如测定的Ki67阳性表达)，多减少20％至30％。
另一方面，本文提供了减少或缓解受试者中辐射诱导的纤维化和骨丢失的方法，包括施用本公开提供的提取物。以药学有效量施用实施例1-3中制备的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，可以减少辐射诱导的纤维化。提取物可以防止在辐照后的骨骼肌纤维化、减少辐射诱导的骨损伤、或两者兼具。纤维化的减少可以通过辐射组织中的炎症减少来证明/反映。在一个实施方案中，通过组织染色，即Masson's Trichrome染色，来检测纤维化的减少。在一个实施方案中，就如图53和图54所示，用p-MGE处理可以减少放射治疗诱导的纤维化至非辐照水平。提取物可以通过抑制辐射诱导的TGFβ、CTGF或SMAD2的产生来减少纤维化，就如关于图55A-55C所描述的。因此，在一些情况下，当以每千克受试者质量(重量)每天20-80mg总酚类物质的剂量来施用时，本公开提供的提取物的施用可以使暴露于辐射的受试者的骨骼肌中的纤维化减少80％至90％。例如，与未接受提取物的受试者相比，本公开提供的提取物可以使暴露于辐射的受试者的骨骼肌中的纤维化减少至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％(或在这些值的5％以内的程度)。在一个示例中，就如本文中关于图56和图57所描述的，与单独的放射相比，与放射同时或在放射之前用p-MGE处理破骨细胞前体，可以减少由破骨细胞前体形成的破骨细胞的数量。与暴露于辐射但未施用本公开的提取物的受试者相比，用葡萄提取物处理可减少辐射诱导的活性破骨细胞的增加，从而活性破骨细胞的减少就减少了骨吸收和防止骨丢失。因此，在一些情况下，当施用剂量为每千克受试者的质量(重量)每天20-80mg总酚物质时，本公开提供的提取物的施用可以使骨损失(骨密度损失，矿物质含量)减少95％至100％，包括通过减少破骨细胞前体的数量、或减少破骨细胞前体至破骨细胞的成熟。例如，与未接受提取物的受试者相比，本公开提供的提取物可以使骨损失(骨密度损失，矿物质含量)减少(包括通过减少破骨细胞前体的数量、或减少破骨细胞前体至破骨细胞的成熟)，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(或在这些值的5％以内的程度)。
另一方面，本文公开的葡萄提取物可用于治疗患有高血压的患者。在某些情况下，治疗患者是为了减少高血压对器官的影响，例如终末器官损伤。高血压是血液对动脉壁的长期作用力异常高的状态，最终可能导致健康问题。心脏病通常与高血压有关。高血压通常通过测量以毫米汞柱(mm Hg)给出的血压来诊断，包括收缩压和舒张压。正常血压低于120/80mm Hg，高血压前期的收缩压为120至139mm Hg、或舒张压为80至89mm Hg。第1阶段高血压是收缩压范围为140至159mm Hg、或舒张压范围为90至99mm Hg的病症。更严重的高血压，2期高血压，是收缩压为160mmHg或更高、或舒张压为100mmHg或更高的病症。可以受益于本文公开的葡萄提取物治疗的患者包括但不限于1期和2期高血压患者。特别地，本公开提供的提取物可用于减少与高血压相关的终末器官损伤，例如纤维化，其通常在心肌中发育，导致肌肉僵硬和心脏功能降低。
在一些实施方案中，实施例1-3中产生的麝香葡萄提取物，例如，根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，可以以药学有效的剂量施用至患有高血压的患者而不会加剧Ang II诱导的高血压。例如，p-MGE可以以每千克患者质量每天10-80mg总酚类物质(10-80mg/kg/天)的剂量施用。在一些情况下，就如关于图25所描述的，施用p-MGE不会加剧高血压，如在接受处理的具有Ang-II诱导的高血压的受试者和未接受p-MGE处理的受试者中的收缩压没有实质性变化所指示的那样。在另一个实例中，就如关于图26所描述的，p-MGE处理不会加剧Ang II诱导的体重减轻。这通过以下事实表明：接受处理的具有Ang-II诱导的高血压的受试者的体重与未接受p-MGE处理的受试者的体重基本相同。在另一个实例中，p-MGE处理可能对高血压患者的心肌收缩力(cardiaccontractility)或左心室重塑没有影响，就如关于图27A-27B所描述的。在某些情况下，就如关于图28A-28C所描述的，与未用p-MGE处理的受试者相比，向具有Ang II诱导的血压升高的受试者施用p-MGE，对壁厚度或左心室内径没有影响。因此，本公开的提取物通常不会加剧高血压。不管怎样，在一些实施方案中，就如关于图29A-29B所描述的，与未用p-MGE处理的受试者相比，施用p-MGE可以防止Ang II诱导的E/e'值的增加。因此，在一些实施方案中，p-MGE可以改善Ang II诱导的舒张功能障碍。在某些情况下，就如关于图31A-31B所描述的，在患有高血压的受试者中施用p-MGE可以降低心脏肥大，例如，通过降低左心室中心肌细胞的平均横截面积(大小)。在某些情况下，就如关于图30A-30B所描述的，施用p-MGE可减弱Ang II介导的胶原增加，从而降低左心室的硬度。在一些情况下，p-MGE处理可显著减弱心肌细胞肥大、舒张功能障碍、减少心脏间质纤维化和/或减少心肌细胞大小。因此，在某些情况下，当施用剂量为每千克受试者的质量(重量)每天20-80mg总酚类物质时，本公开提供的提取物的施用可以减少高血压相关纤维化，特别是减少90％至100％的心脏肥大。例如，与未接受提取物的受试者相比，本公开提供的提取物减少高血压相关的纤维化，特别是使心脏肥大减少至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(或在这些值的5％以内的程度)。在一些情况下，当施用剂量为每千克受试者的质量(重量)每天20-80mg总酚类物质时，本公开提供的提取物的施用可以使高血压相关的纤维化(特别是使胶原蛋白的产生)减少60％至70％。例如，与未接受提取物的受试者相比，本公开提供的提取物使高血压相关的纤维化，特别是使胶原蛋白的产生，减少至少50％、55％、60％、65％、70％或75％(或在这些值的5％以内的程度)。
在一些实施方案中，根据实施例1-3产生的葡萄提取物可以与一种或多种有效治疗高血压的其他药剂组合使用。本文所述的一种或多种另外的试剂和提取物或制剂可以以任何顺序施用，包括伴随、同时或顺序施用。顺序施用可以间隔最多数天的时间间隔给药。该方法还可以包括多次施用一种或多种另外的试剂和/或本文所述的提取物或制剂。一种或多种另外的试剂和提取物或制剂的施用可以通过相同或不同的途径并同时或依次进行。这种试剂的非限制性实例包括利尿剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、α受体阻滞剂、α-2受体激动剂、组合的α和β受体阻滞剂、中枢激动剂、外周肾上腺素能抑制剂、血管扩张剂(血管扩张剂)和β受体阻滞剂。如何施用这些药剂的方法和剂量方案是本领域技术人员公知的。
通常，对育龄妇女或孕妇施用p-MGE不会对母体或其后代的一般健康产生不利影响，如实施例7中所讨论的，对于母体的心血管功能(包括心血管测量心肌收缩力和收缩压)、血压、体重或器官重量，或者新生儿的数量或长度。
在一个方面，提供了治疗患有疾病、疾病风险增加或有复发风险的受试者的方法，该方法包括向受试者以药学有效量施用如本公开的前面部分的葡萄衍生的提取物。在一些情况下，该方法包括施用液体提取物或制剂。在一些情况下，该方法包括施用粉末提取物或制剂。在一些实施方案中，每天至少两次向受试者施用一定剂量的粉末提取物或制剂。
在一些实施方案中，每剂量的粉末提取物或制剂的总酚类化合物含量为约30-50％(mg/mg)。在一些实施方案中，一定剂量的粉末提取物或制剂包含约150-500mg总酚类化合物。
在一些实施方案中，向受试者施用总日剂量的液体提取物或粉末提取物，其包含每千克体重至少约10mg的总酚类化合物。在一些实施方案中，向受试者施用总日剂量的液体提取物或粉末提取物，其包含每千克体重约10mg、20mg、40mg或80mg的总酚类化合物。在一些实施方案中，每剂量的液体提取物或制剂的总酚类化合物含量为约20mg/mL。在一些实施方案中，一定剂量的液体提取物包含约2.5g至约3.5g总酚类化合物。
在一些实施方案中，该疾病是癌症。在一些实施方案中，施用提取物抑制癌症相关细胞生长或增殖、血管生成、炎症或纤维化中的至少一种。在一些实施方案中，癌症包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肺癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤中的至少一种。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌或HER2过表达乳腺癌中的至少一种。在一些实施方案中，癌症包括脑转移性乳腺癌。在一些实施方案中，提取物与化学治疗剂或放射疗法中的至少一种组合施用。
在一些实施方案中，该疾病是高血压诱导的纤维化。
在一些实施方案中，该疾病是辐射诱导的纤维化。
在一些实施方案中，该疾病是辐射诱导的骨丢失。这可以反映在骨强度损失和/或骨脆性增加、钙含量降低和骨量减少。
尽管现在将结合以下实施例中的某些优选实施方案并参考附图描述本发明的各方面，以便可以更全面地理解和理解本发明的方面，但并不意图将本发明限制于这些特定实施例。相反，本申请旨在涵盖可包括在由所附权利要求限定的本发明范围内的所有替代、修改和等同物。因此，包括优选实施方案的以下实施例将用于说明所述成分、方法和配套元件的实践，应理解所示的细节仅是示例性的，并且仅出于对优选实施方案的说明性讨论的目的，并且其呈现是为了提供被认为是关于本发明的配方程序、原理和概念方面的有用且容易理解的描述。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的基本属性的情况下，本文所述的发明可以以其他特定形式实施，因此希望本发明的实施方式和实施例在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的，参考所附权利要求，而不是前述说明，因此，在权利要求的等同物的含义和范围内的所有变化都应包含在其中。
实施例
实施例1：产生麝香葡萄籽和葡萄皮液体和粉末提取物
(1)将314磅葡萄籽和59磅皮放入敞口蒸汽锅中。
(2)将100加仑的分级蒸气压缩蒸馏水加入到容器中的葡萄籽和葡萄皮中。
(3)将分级蒸气压缩蒸馏水中的葡萄籽和葡萄皮在最高约175℉至200℉下加热约1小时至约2小时。萃取在大气压下进行。最高温度设定为200℉，以避免煮沸葡萄籽、葡萄皮和水，因为沸腾可以破坏酚类化合物，降低最终提取物中的总酚类化合物含量。在加热期间，每15至30分钟以5加仑的增量添加另外的分级蒸汽压缩蒸馏水，以达到总共140加仑的水。在加热期间，通过用桨叶搅拌来搅拌葡萄籽、葡萄皮和分级蒸汽压缩蒸馏水的混合物。在使用开放式蒸汽釜的同时，任何能够在大气压下保持所需量的水和葡萄籽和皮的容器都是合适的。
(4)加热后，降低温度，将釜中的内容物冷却至约170℉至约180℉，然后通过600目不锈钢筛过滤。将滤液收集在不锈钢桶中。
(5)将山梨酸钾以0.1％w/v添加至(3)的葡萄籽和葡萄皮滤液中。
(6)将(5)的滤液在约35℉至约40℉的温度下冷藏至少24小时，然后通过1微米过滤器过滤。将有机食品级酒精(95％)以2％(v/v)加入到提取物中以产生葡萄籽和葡萄皮液体提取物。通过该方法形成的液体提取物用于实施例5中描述的研究中。
进行以下步骤以产生葡萄籽和葡萄皮粉末提取物。
(7)通过喷雾干燥将液体提取物加工成粉末提取物。将液体提取物雾化，将喷雾引入44英寸×32英寸的干燥器中。用天然气进行干燥，流速为18,000-22,000cfm，温度范围为约200-400℉(例如，入口温度约为400℉，出口温度约为200℉)。所得粉末提取物的残留水分含量约为3.0-3.4％。
通过该方法形成的粉末提取物可以例如包封或重构以形成液体。对于实施例6和7中描述的研究，将根据该实施例中所述制备的粉末提取物配制在羟丙甲纤维素胶囊中。
在3-6个月内在室温下评估在羟丙甲纤维素胶囊中配制的粉末提取物的稳定性。3-6个月后，初始总酚水平为301.4±18.0mg/g(n＝3)和296.6±22.5mg/g(n＝3)。储存6个月后没有微生物污染的证据。
表1中提供了如上所述制备的液体提取物的示例性分析。使用高效液相色谱(HPLC)进行分析；脚注如下所述。ND表示“未检测到”。
表1.液体提取物组分分析
试验1：根据Wang，S.Y.等人进行的分析，草莓果实中的白藜芦醇含量受采前条件的影响(Resveratrol Content in Strawberry Fruit is Affected by PreharvestConditions)，J.Agr.Food Chem.2007,55：8269-8274。检出限：0.05μg/mL。
试验2：根据Lui，X.等人进行的分析，通过HPLC同时测定黄蜀葵花中七种活性黄酮醇(Simultaneous determination of seven active flavonols in the flowers ofabelmoschus manihot by HPLC)。J.Chromatogr.Sci.2009,47：206-210。
试验3：根据Urska，V.等人进行的分析，通过优化的酸甲醇分解鞣花丹宁(rubusellagitannins)聚合作用的浓度和平均程度(Concentration and mean degree ofpolymerization of rubus ellagitannins evaluated by optimized acidmethanolysis)，J.Agric.Food Chem.2006,54：4469-4475。
试验4：根据Heudi，O.等人进行的分析，通过使用紫外线检测的反相高效液相色谱法分离水溶性维生素进行分析：应用于多维氨化预混物(Separation of water-solublevitamins by reversed-phase high performance liquid chromatography with ultra-violet detection:Application to polyvitaminated premixes)。J.Chromatography2005,1070：49-56。检出限：硫胺-0.2μg/mL，烟酰胺-0.2μg/mL，吡哆胺-0.1μg/mL。
试验5：根据Chen，G.等人进行的分析，中国草药中的褪黑素(Melatonin inChinese medicinal herbs)，Life Sciences，2003,73：19-26。
试验6：根据Santasania，C.T.等人进行的分析，应用报告194—儿茶素在AscentisTM RP-Amide上的LC-MS分析(Application Report 194-LC-MS Analysis ofCatechins on AscentisTM RP-Amide)，2004，可在sigma-aldrich.com/supelco获得分析。
试验7：根据Cheng，G.W.等人进行的分析，发育中的草莓果实中苯丙氨酸氨裂解酶(pal)的活性以及花青素和酚类的浓度(Activity of phenylalanine ammonia-lyase(pal)and concentrations of anthocyanins and phenolics in developingstrawberry fruit.)。J.Am.SOC.Hortic.Sci.1991,116(5)：865-869。花色素苷结果表示为每升毫克氰化物-3-葡糖苷当量。
试验8：根据Chen，J.等人进行的分析，通过高效液相色谱测定细叶小苦荬(DC)中的七种黄酮类化合物(Determination of Seven Flavonoids in Ixeridium gracile(DC.)。J.AOAC Int.2009,92：773-778。检出限：0.14μg/mL。
试验9：根据Lin，L.L.等人进行的分析，使用HPLC结合UV和荧光检测筛选抗癌化合物白皮杉醇的有效样品制备方法(An effective sample preparation approach forscreening the anticancer compound piceatannol using HPLC coupled with UV andfluorescence detection)J.Chromatogr.B Analyt.Technol.Biomed Life Sci.2007,853：175-182。检出限：0.14μg/mL。
试验10：根据Robbins，RJ等人进行的分析，用于计量含有可可和巧克力的样品中的黄烷醇和原花青素的正相高压液相色谱-荧光检测方法的方法性能和多实验室评估(Method performance and multi-laboratory assessment of a normal phase highpressure liquid chromatography-fluorescence detection method for thequantification of flavanols and procyanidins in cocoa and chocolatecontaining samples,)，J.Chromatorg.A 2009,1216：4831-4840。检出限：0.9μg/mL。
如上所述制备的粉末提取物的示例性分析示于图1A-1B中。从其被配制的胶囊中取出粉末提取物(p-MGE)(446mg总粉末提取物)。还对市售的葡萄籽产品(“优质麝香葡萄籽补充剂(Premium Muscadine Grape Seed Supplement)”，Nature's Pearl，Advance NC)进行了比较分析。使用没食子酸作为标准，使用比色Folin-Ciocalteau方法的改进来测量总酚。将来自商业产品的粉末和内容物重新悬浮在水中并使用TissueLyzerTM(Qiagen)均化。数据表示为图1A中每克粉末或固体的mg酚类，n＝3，**表示p<0.01。本公开的粉末提取物含有比含有磨碎的葡萄籽的市售胶囊明显更多的酚类物质。通过岛津超高效液相色谱(UPLC)耦合到质谱检测(UPLC-MS)，以及与标准品的对比，还测定和识别了粉末提取物和市售的磨碎葡萄籽胶囊中的单个多酚类物质——儿茶素、没食子酸、表儿茶素、鞣花酸、原花青素和儿茶素没食子酸酯(cat-gall)。数据表示为图1B中每克粉末的mg。评估的各个酚类化合物在两种产品之间是相当的，或者在本公开的粉末提取物中有显著提高。
实施例2：麝香葡萄籽提取物的制备
(1)将450磅葡萄籽放入敞口蒸汽锅中，并加入100加仑分级蒸汽压缩蒸馏水。如在实施例1，使用开放式蒸汽釜，但是任何能够在大气压下容纳所需量的水和葡萄籽和皮的容器都是合适的。
(2)将分级蒸气压缩蒸馏水中的葡萄籽在最高约175℉至200℉下加热约1小时至约2小时。设定最高温度为200℉以避免煮沸葡萄籽和水，因为沸腾会破坏酚类化合物。在加热期间，每15至30分钟以5加仑的增量添加另外的分级蒸汽压缩蒸馏水，以达到总共140加仑的水。
(3)加热后，降低温度，将水中的葡萄籽冷却至约170℉至约180℉，然后通过600目不锈钢筛过滤。将滤液收集在不锈钢桶中。
(4)将山梨酸钾以0.1％w/v添加至(3)的葡萄籽滤液中。
(5)将(4)的滤液在约35℉至约40℉的温度下冷藏至少24小时，然后通过1微米过滤器过滤。将有机食品级醇加入以2％(v/v)加入到提取物中以产生葡萄籽液体提取物。
使用上述方法制备的葡萄籽液体提取物可以与使用实施例3中描述的方法制备的葡萄皮液体提取物组合(混合)。使用实施例2中描述的方法制备的葡萄皮液体提取物、或葡萄皮液体提取物和葡萄籽液体提取物的组合，可以如实施例1所述进行喷雾干燥，以产生粉末提取物，其可以例如包封或重构以形成液体。
实施例3：麝香葡萄皮提取物的制备
(1)将200磅葡萄皮放入敞口蒸汽锅中，并加入100加仑分级蒸汽压缩蒸馏水。如在实施例1和2，使用敞口蒸汽釜，但是任何能够在大气压下保持所需量的水和葡萄籽和皮的容器都是合适的。
(2)将葡萄皮在分级蒸汽压缩蒸馏水中在约175℉加热至最高200℉约1小时至约2小时。最高温度为200℉，避免煮沸葡萄皮和水及破坏酚类化合物。在加热期间，每15至30分钟以5加仑的增量添加另外的分级蒸汽压缩蒸馏水，总共加入140加仑的水。
(3)加热后，降低温度，将水中的葡萄皮冷却至约170℉至约180℉，然后通过600目不锈钢筛过滤。将滤液收集在不锈钢桶中。
(4)然后将山梨酸钾以0.1％w/v加入至葡萄皮滤液中。
(5)然后将滤液在约35℉至约40℉的温度下冷藏至少24小时，然后通过1微米过滤器过滤。添加有机食品级酒精至2％以产生葡萄皮液体提取物。
在一些方面，葡萄皮提取物中的总酚含量可为至少约3g/L至约8g/L.
葡萄皮液体提取物，单独或与使用实施例2中描述的方法制备的葡萄籽液体提取物的一部分组合。葡萄皮液体提取物、或葡萄皮液体提取物和使用实施例2中描述的方法制备的葡萄籽液体提取物组合，可以如实施例1中所述进行喷雾干燥，以产生粉末提取物，其可以例如包封或重构以形成液体。
实施例4：使用已知的麝香葡萄籽和葡萄皮提取物在人癌细胞中的体外研究
本实施例中描述的研究使用通过与本公开中描述的方法不同的方法制备的麝香葡萄籽液体提取物或麝香葡萄皮液体提取物进行。特别地，萃取过程在加压容器中进行，萃取温度达到至少212℉(沸腾)。
A.麝香葡萄籽和葡萄皮提取物对癌细胞增殖的抑制作用
将活跃生长的人前列腺、乳腺、肺、胶质母细胞瘤、结肠、皮肤和白血病细胞(2或3种不同的细胞系)植板到24孔板的各孔中，并用递增浓度的来自麝香葡萄籽或皮的提取物处理7天，以确定提取物是否减少前列腺癌细胞增殖。来自葡萄籽和皮的提取物减少了所有七种类型癌症的增殖，包括人前列腺癌(LnCaP和PC3细胞；图2A-2B)、乳腺癌(ZR-75-1雌激素受体阳性乳腺癌细胞、MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞和SKBR3HER2过表达乳腺癌细胞；图2C-2E)、肺癌(A549和SK-LU-1细胞；图2F-2G)、胶质母细胞瘤(U87和U373细胞)；图2H-2I)，结肠癌(HCT116和HT29细胞；图2J-2K)、皮肤癌(SKMEL28和RPMI 7951细胞；图2L-2M)和白血病(THP-1急性人单核细胞白血病细胞、HL60急性人早幼粒细胞白血病细胞和K562慢性人髓性白血病细胞；图2N-2P)。响应取决于所使用的提取物的剂量，并且与葡萄皮提取物相比，用葡萄籽提取物获得类似的响应。
B.麝香葡萄籽或葡萄皮提取物对MAP激酶活性的抑制
以递增的时间段将人MDA-MB-231或ZR-75-1乳腺癌细胞与50μg/mL麝香葡萄籽或葡萄皮提取物一起温育。使用来自Cell Signaling的针对磷酸化-ERK1/ERK2的抗体通过蛋白质印迹杂交在细胞提取物中计量丝裂原活化蛋白(MAP)激酶活性。使用β-肌动蛋白作为上样内参，通过光密度测定法计算磷酸化-ERK活性的降低。如图3A和图3B所示，来自麝香葡萄籽和葡萄皮的提取物分别引起磷酸化-ERK的显著降低，表明提取物显著减少增殖。葡萄籽对葡萄皮提取物的反应没有显著差异。
总之，实施例4中描述的体外结果表明，从麝香葡萄籽或麝香葡萄皮中分离的这些提取物抑制前列腺、乳腺、肺、脑(胶质母细胞瘤)、结肠和皮肤癌以及白血病细胞的生长。乳腺癌细胞生长的减少与促生长蛋白激酶、MAP激酶ERK1和ERK2的活性降低有关。这些结果表明，麝香葡萄提取物可能会减少肿瘤的生长。
实施例5：通过已知的液体麝香葡萄提取物(l-MGE)预防乳腺癌和肺癌
本实施例中描述的研究用实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮液体提取物进行。以下，该液体提取物被称为“l-MGE”。
A部分：在c-neu小鼠中通过l-MGE预防乳腺肿瘤形成
雌性FVB-Tg(MMTV)NKAMul/J转基因小鼠，其中活化的大鼠Erbb2(c-neu)致癌基因在小鼠乳腺肿瘤病毒启动子的指导下在乳腺中特异性表达(c-neu小鼠)，在6-8个月大的时候形成乳腺肿瘤(相当于人类乳腺癌)，可以作为预防乳腺癌的模型。从3周龄起(断奶时)开始用来自麝香葡萄籽和葡萄皮的液体提取物(l-MGE)处理c-neu小鼠，并且一旦肿瘤可触知(在25周时年龄)就将其处死或在肿瘤融合时(31周龄)将其处死。对于25克小鼠，l-MGE的剂量每天为约1.0毫克酚类物质(相当于70千克男性每天约10汤匙或148毫升液体提取物，平均浓度为20,000毫克酚类物质/升的l-MGE)。将l-MGE加入饮用水中，每周更换两次。与含有l-MGE的水相比，接受常规水的小鼠在水或食物摄入没有差异。在25或31周时处死时，取出乳腺组织并称重，以确定处理是否减少了乳腺肿瘤的生长。此外，确定小鼠的总重量；还取出心脏和肾脏并称重以用于随后的组织学评估。
十六(16)只小鼠平均被处理21周，十八(18)只小鼠平均被处理31周(3周龄断奶时开始处理)。对于21周的小鼠，10只小鼠饮用普通饮用水(内参)，6只小鼠饮用l-MGE；对于31周龄小鼠，10只小鼠饮用普通饮用水(内参)，8只小鼠饮用含有l-MGE的水。体重、心脏和肾脏重量的一般参数示于图4A-4C、图5A-5B和图6A-6B中。在25周龄时，处理或未处理小鼠的体重没有差异(图4A)。在31周龄时，饮用水和饮用l-MGE的小鼠总体重存在显著差异(图4B)。然而，这是由于小鼠肿瘤的尺寸大；没有肿瘤的31周龄小鼠的体重没有差异(图4C)。在25或31周龄的小鼠饮水(内参)或饮用l-MGE的心脏重量或肾重量没有显著差异，分别如图5A-5B和图6A-6B所示。处理期间小鼠的饮食习惯没有变化，与身体、心脏或肾脏重量没有大变化相符合。这些结果表明小鼠对l-MGE的处理具有良好的耐受性。
肿瘤在雌性c-neu小鼠的整个乳腺组织中发育，并且在约25周龄时可触知。对25周龄c-neu小鼠中的个体乳腺肿瘤进行计数，取出并称重，以确定总肿瘤质量。在未处理的25周龄c-neu小鼠的乳腺组织中平均有11.8±2.1个肿瘤，而在用l-MGE处理的小鼠的乳腺组织中肿瘤的数量减少到5.4±0.9，减少54％(p＝0.0327)，如图7所示。收集自25周龄未处理小鼠的的肿瘤重1.3±0.3g，而用收集自用l-MGE处理的25周龄小鼠肿瘤平均重量为0.3±0.08g，减少77％(p＝0.0132)，如图8A所示。31周龄c-neu小鼠的乳腺肿瘤已融合，取出整个肿瘤块并称重。用l-MGE处理的31周龄c-neu小鼠的肿瘤质量也减小，从平均9.2±1.2g到平均3.6±1.4g，减少61％(p＝0.0012)，如图8A所示。这表明l-MGE同时显著降低了乳腺肿瘤的多发率和肿瘤负荷。
将来自25周龄处死的小鼠的乳腺组织固定在4％福尔马林中，石蜡包埋并切成5微米切片，用于免疫组织化学分析。将切片与针对Ki67的抗体一起温育，作为细胞增殖的量度。如图9所示，与未处理的小鼠相比，饮用l-MGE的25周龄小鼠的肿瘤增殖细胞数量显著减少。在来自未处理小鼠的切片中，Ki67染色的细胞数为6.8±1.4，而用l-MGE处理的小鼠切片中每个视野为2.9±1.0个细胞，减少57％(p＝0.384)。这些结果表明，l-MGE减少细胞增殖，与培养的乳腺癌细胞中观察到的细胞数减少相符合。
将来自在25周龄处死的c-neu小鼠的乳腺组织切片也与针对磷酸化-ERK1/2的抗体一起温育，作为活性ERK1/2MAP激酶活性的量度。如图10所示，用l-MGE处理的c-neu小鼠中磷酸化ERK1/2显著降低，从未处理小鼠组织的10.5±3.1％到2.9±0.9％(n＝7-12，p＝0.0375)，减少72％。由于ERK1/2在活化后自动磷酸化，磷酸化ERK1/2的减少表明用l-MGE处理的小鼠的肿瘤组织中增殖性MAP激酶活性降低。
将来自饮用常规水(内参)或l-MGE的c-neu小鼠的肿瘤切片与针对内皮细胞标记物CD34的抗体一起温育，并通过形态学和阳性CD34免疫反应性的组合来鉴定血管。如图11所示，饮用l-MGE的小鼠的肿瘤具有的血管少于饮用普通水的小鼠，从未处理小鼠组织中的5.7±0.6个血管/视野到3.6±0.6个血管/视野(n＝7-12，p＝0.0226)，减少37％。这表明葡萄提取物抑制血管生成。
在来自c-neu小鼠的乳腺肿瘤组织切片中计量间质性肿瘤纤维化，并用非特异性胶原染色剂苦味酸-天狼星红染色。与内参相比，通过l-MGE施用显著降低了胶原蛋白反应产物(图12)。计量苦味酸-天狼星红染色的相对量，并且肿瘤内胶原的量表示为每个视野的纤维化百分比。用MGE处理使间质纤维化减少90％以上，从内参小鼠肿瘤中每个视野2.7±0.7％纤维化到l-MGE处理小鼠肿瘤中每个视野0.1±0.05％纤维化(n＝7-12，p＝0.0005)，表明该提取物减少了乳腺肿瘤中与癌症相关的纤维化。总之，这些研究表明，l-MGE通过减少增殖、血管生成和纤维化来同时降低乳腺肿瘤负荷和多发率，表明麝香葡萄提取物可能代表了预防乳腺癌的新型营养保健品。
共同地，用l-MGE处理c-neu小鼠减少了肿瘤负荷和多发率，与增殖标志物Ki67的减少、促生长蛋白激酶活性、血管数量和组织纤维化相关。这些结果表明，麝香葡萄提取物可以预防乳腺癌。
B部分：在c-neu小鼠中通过l-MGE预防肺肿瘤形成
发育中的胎儿对经胎盘暴露后的香烟烟雾、烧烤食品和空气污染中的饮食与环境致癌物的致癌作用高度敏感。母体和胎儿组织对毒物的氧化代谢导致DNA损伤，这最终可导致儿童期癌症的发生。由于癌症形成的潜伏期，在子宫内暴露于致癌物甚至可能使个体在以后易于发育癌症。将BALB/c雄性小鼠与C57BL/6雌性小鼠交配以作为子宫内暴露于环境毒物的模型。怀孕小鼠在妊娠第17天通过腹膜内注射45mg/kg剂量的溶解在橄榄油中的3-甲基胆蒽来处理，以诱导胎儿肺肿瘤。注射橄榄油载体(0.5mL/0.35kg)作为内参。第0天被认为是检测到阴道栓塞的第一天。断奶后，小鼠组仅接受饮用水或含有l-MGE(约1.0mg酚类/25g小鼠)的水，并在12月龄时处死。
尽管上述所有小鼠均发育了肺肿瘤，但与l-MGE处理的动物相比，内参小鼠的肿瘤多发率更高(6.8±0.4总肿瘤对4.2±0.5总肿瘤，n＝26-32，p＝0.0001)，如图13A-13B所示。与饮用常规水的内参小鼠中发现的总肿瘤组织相比，l-MGE还显著降低了雌性小鼠的总肿瘤负荷约48％(12.4±1.9g对6.5±1.2g，n＝26-32，p＝0.014)，如图14A-14B所示。这些结果表明，l-MGE降低了在子宫内暴露于3-甲基胆蒽的小鼠的雌性后代的肺肿瘤的多发率和负担。
将一年后处死的雌性小鼠的肺组织固定在4％福尔马林中，石蜡包埋并切成5微米切片，用于免疫组织化学分析。将切片与抗体一起温育以增殖细胞核抗原(PCNA)，作为细胞增殖的量度。如图15所示，与来自内参动物的肿瘤相比，来自施用l-MGE的小鼠的肿瘤组织切片具有显著降低的PCNA(22.4±1.8对14.2±1.3，p＝0.0009)，表明部分l-MGE通过减少肿瘤细胞增殖来降低肿瘤负荷。将来自饮用常规水或l-MGE的雌性小鼠的肺肿瘤切片与针对内皮细胞标记物CD34的抗体一起温育，并通过形态学和阳性CD34免疫反应性的组合鉴定血管。与饮用常规水的雌性小鼠相比，用l-MGE处理显著降低肺肿瘤组织中的血管密度(20.5±2.2对11.3±1.3，p＝0.0012)，如图16所示，表明葡萄提取物抑制血管生成。
总的来说，这些结果表明，l-MGE减少了雌性小鼠中的肿瘤负荷和多发率、增殖标记物PCNA和血管数量，其母体在子宫内用化学致癌物处理以使得后代易于发育肺癌。这些结果表明，从麝香葡萄中分离的提取物可能代表了一种新的营养保健品，用于预防由于在子宫内暴露于环境毒物引起的肺部肿瘤。
实施例6：麝香葡萄粉末提取物(p-MGE)在啮齿动物中的毒性评估
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上文实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
对p-MGE进行啮齿动物毒性试验的主要目的是确定不会引起不良反应或危及生命的剂量范围。在小鼠中进行对p-MGE的毒性试验，以评估提取物对小鼠以及它们的心脏、肝脏、肺和肾脏的总体健康的影响。
将雄性C57黑色小鼠(8周龄)随机分组，基于通过测量总酚类物质所测定的p-MGE的总酚类含量，以单独接受饮用水(内参)或饮用水中四个递增剂量的p-MGE。对小鼠的每日观察包括评估体重减轻(急速的或进行性的体重减轻)，衰弱性腹泻、脱水或皮肤饱满程度降低、水肿、可观的腹部肿大或腹水、进行性皮炎、粗糙的毛发或由于缺乏梳理而出现的蓬乱外观，表明疼痛的驼背姿势，由于食欲不振导致的嗜睡或持续性倦怠、咳嗽、呼吸困难、鼻涕、黄疸、紫绀、苍白/贫血、头部不适当或头部晃动表明的神经系统症状、出自任何孔窍的流血、或任何干扰日常活动的症状(例如，进食或饮水、走动或消亡(elimination))。在处死之前，将小鼠置于代谢笼中24小时，测量食物摄入和粪便产生并收集尿液以计量肾损伤的标志物。在处理的第4周，通过尾套体积描记法测定清醒小鼠的血压，并使用非侵入性的小动物VEVO超声成像系统在M和B模式下评估用异氟醚麻醉的小鼠的心脏功能，以测量或计算射血分数、缩短分数、每搏输出量、心率和心输出量。处理一个月后处死小鼠；将组织(心脏、肾脏、肺、肝、脾和脑)称重，在4％福尔马林中固定，包埋在石蜡中，以5微米切片并用苏木精和曙红(H&E)染色，由我们机构的动物资源计划中的兽医病理学家进行分析，以评估任何严重的结构异常。
测试了四种浓度的p-MGE。待测试的浓度范围基于先前的研究，先前的研究显示出用l-MGE长期处理的c-neu转基因小鼠中乳腺肿瘤的数量和大小显著减少，并且在如上文实施例5中所述的肺癌的胎盘模型中，具有相似的肺肿瘤大小和数量的减少。在那些研究中，液体麝香葡萄提取物/小鼠/天中1mg酚类物质的每日浓度在降低肿瘤多发率和剂量方面是有效的。对于小鼠的毒性研究，测试的四种剂量的p-MGE是0.25、0.5、1.0和2.0mg酚类物质/小鼠/天，在其饮用水中施用至小鼠。由于该年龄的平均小鼠重约25g或0.025kg，这相当于10、20、40和80mg酚类物质/kg/天的剂量范围。
在以四种剂量施用p-MGE的4周期间，没有观察到腹泻、脱水、水肿、腹部增大、毛发脱落、梳理减少，或程度降低的活动、食欲、饮水或呼吸。没有任何指示表明有滑膜、黄疸或紫绀或任何神经系统不适的迹象(不适当的头部运动或头部摇晃)。任何孔窍都没有出血或流出。这些结果表明小鼠没有任何影响其正常日常活动或健康的病理。
在处理期结束时称重小鼠，以确定p-MGE对总体重的影响。尽管用3种较低浓度的p-MGE处理小鼠对体重没有影响，但与未处理的内参组相比，用最高浓度的p-MGE处理的小鼠的平均体重略微降低(图17))。然而，与在处理的最后一周测量的未处理小鼠相比，对食物摄入(图18A)、粪便产生(图18B)或尿量(图18C)没有影响，表明p-MGE对饮食行为的影响微小。
在处死时，取出各种器官(心脏、肺、肝、肾、脾和脑)并称重，并将用每剂量p-MGE处理的小鼠的器官重量与未处理的内参组进行比较。将每个器官的一部分固定在福尔马林中，切片并用H&E染色，由兽医病理学家进行评估。
在处死时，取出心脏、肺、肝、肾，脾和脑的一部分(皮质、小脑、下丘脑和脑干中的区域)并称重，并且用每剂量p-MGE处理的小鼠的器官重量将与未处理的内参组进行比较。将切片在4％多聚甲醛中固定过夜，置于70％乙醇中2天，包埋在石蜡中，以5微米切片并用H&E染色。将载玻片(slide)提交给动物资源计划的病理学部门，并由兽医病理学家以盲法的方式进行检查。检查结果列于下表2中并总结如下。代表性图像也在图19中提供。
表2.组织切片的病例分析
wnl＝在正常范围内；pvl＝血管周围淋巴细胞；mfp＝多灶性支气管纤维化；emh＝髓外造血。
所有治疗组小鼠的心脏似乎都在正常范围内；内参小鼠的一颗心脏有血管周围淋巴细胞。内参组和所有治疗组的小鼠肺部均在正常范围内，除了用最低浓度的p-MGE处理的组中的一只小鼠，其具有不寻常的肺损伤。虽然大多数小鼠的肝脏似乎是正常的，但是所有组的小鼠都有一定程度的髓外造血，甚至是内参组的小鼠；这种类型的造血在小鼠肝脏中并不罕见。此外，一些小鼠患有肝糖原贮积病，这在某种程度上是生理性的，而不是创伤的迹象。小鼠的脾脏通常在正常范围内，其中一只在最高p-MGE的治疗组中的小鼠具有一些髓外造血作用。虽然小鼠大脑的不同区域被检查并且通常在正常范围内，但是两只小鼠具有表皮样囊肿，其被认为是良性错构瘤，根据其位置和大小，其可能干扰正常的神经功能；然而，这些通常是无临床症状的，因为尺寸的缓慢增加允许神经系统对占据空间的团块(mass)的存在进行适应和补偿。
用递增剂量的p-MGE处理的小鼠心脏的重量没有差异，如图20所示，对心脏的结构也没有任何影响，如表格2和图19所示。经处理的小鼠和内参小鼠之间的血压也相似(图21)。未经处理的小鼠的心脏之一具有血管周围淋巴细胞，但来自用p-MGE处理的小鼠的所有心脏都在正常范围内。与未处理的内参小鼠相比，用p-MGE处理的小鼠的心脏参数——射血分数、缩短分数、心输出量、每搏输出量和心率——都是相似的(如图22A-22E所示)。这些结果表明p-MGE对心脏或脉管系统的结构或功能没有影响。
与未处理的内参小鼠相比，用p-MGE处理的小鼠的肺重量没有差异(图23A)，并且肺的结构均在正常范围内，除了最低p-MGE治疗组中的一只小鼠有不寻常的肺部损伤(见表2)。加上提取物对呼吸缺乏任何可观察到的影响，这些结果表明p-MGE对肺结构或功能没有影响。
用两种最低p-MGE浓度(0.25和0.5mg酚类物质/小鼠/天)和最高p-MGE浓度(2.0mg酚类物质/小鼠/天)处理的小鼠肝脏的重量与未处理小鼠肝脏的重量没有差异。然而，与内参相比，1.0mg酚类物质/小鼠/天中小鼠肝脏的重量略微增加(图23B)。大多数小鼠肝脏似乎具有正常结构，尽管所有组中的小鼠都有一定程度的髓外造血，即使在内参组中也是如此；病理学家指出，这种类型的造血在小鼠肝脏中并不罕见(见表2)。此外，一些小鼠有肝糖原贮积病，病理学家指出这是生理性的，而不是创伤的迹象。
将小鼠的肾脏称重，与未处理的小鼠相比，用p-MGE处理的小鼠的肾脏重量没有差异(图23C)。如上所述，尿量没有差异，如图18C所示。测量尿白蛋白和尿血管紧张素原(Aogen)以评估肾功能，并将其值表示为尿肌酐的函数。与未处理的小鼠相比，作为肾功能的量度，用增加浓度处理4周的小鼠的尿液中尿白蛋白的量没有差异(图24A)，并且与相同动物的小球或小管中缺乏任何病理学一致(见表2)。此外，未经处理和经过处理的小鼠之间的尿Aogen量没有差异(图24B)，表明p-MGE不损伤肾，与通过病理学评估的肾小球和肾小管缺乏病理学一致(见表2)。
用p-MGE处理的小鼠的脾重量与未处理的内参小鼠没有显著差异(图23D)，并且小鼠的脾脏通常在正常范围内，其中一只小鼠处于最高p-MGE治疗组中具有一些髓外造血的(参见表2)。
用p-MGE处理的小鼠脑的重量与未处理的小鼠没有显著差异(图23E)。大脑被细分为四个区域——皮质、小脑、下丘脑和脑干——并且每个区域由兽医病理学家检查。检查的所有大脑区域都在正常范围内；然而，两只小鼠患有表皮样囊肿，被认为是良性错构瘤，病理学家指出，根据其位置和大小，可能会干扰正常的神经功能，但通常临床上无症状，因为尺寸的缓慢增加允许神经系统对占据空间的团块的存在进行适应和补偿(见表2)。
总的来说，这些结果表明，用剂量为0.05、0.1、0.2和0.4mg酚类物质/mL/天的p-MGE处理小鼠4周，对体重、器官重量(心脏、肺、肝脏、肾、脑或者脾)或结构、心脏功能和血压、或肾功能没有影响。这些结果表明，在测试剂量下，小鼠对p-MGE的耐受性良好。
用于小鼠毒性研究的p-MGE剂量为0.05、0.1、0.2和0.4mg酚类物质/mL/天。当小鼠每天饮用约5mL时，这对应于将所测试的p-MGE通过饮用水施用至小鼠，其剂量为0.25、0.5、1.0和2.0mg总酚类物质/小鼠/天。由于该年龄的平均小鼠重约25g或0.025kg，这对应于10、20、40和80mg总酚类物质/kg/天的剂量范围。基于人类成年患者的平均质量70kg，这对应于成年人类的700、1400、2800和5600mg酚类物质/天的剂量范围。这相当于服用5、10、21和42粒胶囊/天，因为p-MGE胶囊含有162mg总酚类物质/胶囊。用于治疗小鼠的酚类物质的量和在这些剂量下的无毒性，表明患者可以很好地耐受相应数量的胶囊中的酚类物质的量。
实施例7：p-MGE对怀孕的影响
本实施例中描述的研究是用实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行的。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
用p-MGE处理怀孕的大鼠，测量提取物对母体及其后代的健康的影响，以确定施用至育龄妇女和怀孕母亲的p-MGE的安全性。对Sprague-Dawley大鼠在交配前一周和整个怀孕期间施用p-MGE(饮用水中0.2mg/mL)。在妊娠第19天(大鼠正常妊娠21天)，用VEVO 2100扫描怀孕大鼠，以测量子宫和脐血流量并确定心血管功能。将大鼠置于代谢笼中以测量尿液排泄、食物和水摄入，作为对母体健康的评估。在妊娠第21天，测量怀孕大鼠的血压并处死大鼠/大鼠幼仔，测量幼仔数、幼仔重量和幼仔的健康状况。
通过心脏超声评估在其饮用水中施用p-MGE的怀孕母体的心脏健康。与饮用常规水的怀孕大鼠相比，p-MGE对心肌收缩力和收缩功能的参数(每搏输出量、射血分数、缩短分数或心输出量)没有影响。对去向生长中的幼崽的血流量(按照流过脐带静脉的血流量来测量)也没有影响。这些结果表明，p-MGE不会损害怀孕母体的心血管健康。p-MGE处理对食物或水摄入、或尿量没有影响，这是通过将怀孕母体在妊娠第10-20天置于代谢笼中24小时来测量的。通过尾套体积描记法测量的血压在饮用常规水或p-MGE的怀孕大鼠中也没有差异。母体各种器官(胰腺、肝脏、脾脏、肺脏、脑、心脏和肾脏)的重量在饮用普通水或p-MGE的怀孕母体中没有差异。最后，与内参相比，施用p-MGE的母体所生的幼崽数量或施用p-MGE的母体的幼崽长度没有差异。
总的来说，在心血管功能、血压、体重，或母体的器官重量、或幼崽的数量或长度方面，这些结果表明，给育龄妇女或孕妇施用p-MGE不会对母体或其后代的一般健康产生不利影响。幼崽内部器官的组织学分析正在进行中。
实施例8：p-MGE对AngII诱导的高血压的作用
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
在具有血管紧张素II(Ang II)诱导的高血压的大鼠中测量p-MGE对高血压和高血压诱导的心脏损伤的作用。Sprague-Dawley大鼠(雄性，8-12周龄)用常规饮用水(内参)、单独使用p-MGE(饮用水中总酚类物质含量为0.2mg/mL)、单独使用Ang II(24μg/kg/h通过植入渗透微型泵)、或者p-MGE和Ang II处理4周。对于250g大鼠，该量的p-MGE对应于约20mg酚类物质/kg/天。在用Ang II处理前1周开始施用p-MGE。通过尾套体积描记术每周记录血压，同一个体在一天中的同一时间记录。在使用异氟烷镇静的大鼠中，使用具有21MHz频率转导的VisualSonics Vevo 2100高分辨率成像系统进行超声心动图。在中乳头水平以M模式胸骨旁短轴视图进行扫描以计量心脏参数，在二尖瓣环以4室视图进行组织多普勒，以及以4室视图进行脉冲波多普勒，从而测量跨瓣流入。
饮用常规水的大鼠的收缩压在4周处理期间没有变化(基线为118.6±2.4mm Hg，4周时为123.1±2.3mm Hg)。在4周时间内，输注Ang II显著增加收缩压，从120.4±2.4mm Hg增加到213.1±6.8mm Hg。在用Ang II处理或未用Ang II处理的大鼠中，在饮用水中加入p-MGE并未改变收缩压，如图25所示。在处理4周结束时，称重大鼠，以确定p-MGE是否对体重有影响。尽管Ang II在4周处理期间减轻了体重，但是在不存在或存在Ang II的情况下，p-MGE对体重没有影响，如图26所示。在处死时，取出心脏并称重，解剖并测量胫骨，以确定心脏重量/胫骨长度，作为心脏肥大的总量度。在任何治疗组中心脏重量/胫骨长度没有差异(数据未显示)。这些结果表明用p-MGE处理不会加剧Ang II诱导的高血压或Ang II诱导的体重减轻。
使用VisualSonics Vevo 2100高分辨率成像系统，在中乳头水平以M模式胸骨旁短轴视图测量心脏的射血分数和缩短分数，作为收缩功能的量度。如图27A-27B所示，与正常血压大鼠相比，高血压大鼠的心脏射血分数和缩短分数均没有不同。此外，p-MGE对正常血压或高血压大鼠的心脏射血分数或缩短分数没有影响。这表明Ang II和p-MGE均不影响心肌收缩力。
为了测量p-MGE对左心室重塑的影响，对用p-MGE处理4周后的血压正常和Ang II依赖性高血压大鼠的左心室后壁的厚度、舒张末期左心室的直径和左心室壁的厚度进行测量，使用中乳头肌水平的M模式胸骨旁短轴视图。如图28A-28C所示，Ang II增加了左心室后壁的厚度以及相对壁厚度(图A和C)，同时减小了左心室的直径(图B)，表明Ang II或Ang II依赖性血压升高引起左心室肥大、增加心室壁厚和减小心室腔。在正常血压或高血压大鼠中，共同施用p-MGE对左心室的壁厚度或内径没有影响。这些结果表明Ang II引起左心室重塑，而共同施用p-MGE既不会加剧也不会减少左心室重塑。
舒张功能测量为e'，以评估左心室的松弛，以及E/e'，以评估左心室的充盈压。如图29A-29B所示，用Ang II进行的4周处理减少了e'，表明Ang II或Ang II介导的血压升高降低了左心室在心脏舒张期间放松的能力。尽管用p-MGE处理倾向于防止e'降低，但结果没有达到统计学意义。然而，通过用Ang II处理显著增加E/e'，并且通过共同施用p-MGE防止了E/e'的增加。这些结果表明Ang II引起舒张功能障碍，并且共同施用p-MGE改善了Ang II诱导的舒张功能障碍。
将经处理的大鼠的心脏切片固定在福尔马林中，包埋在石蜡中并切成5微米的切片。每个心脏的切片用苦味酸-天狼星红染色，以识别总胶原沉积。如图30A-30B所示，AngII增加了间质纤维化的量，显示为代表性图像中红色染色的增加并在图中计量。与p-MGE共同施用减弱了Ang II介导的胶原蛋白的增加从而减少总胶原染色，这将降低左心室的硬度。这可以解释提取物降低心室硬度和减少舒张功能障碍的能力。
处理过的大鼠心脏的切片也用针对小麦胚芽凝集素的抗体染色，以勾勒出个体心肌细胞的细胞膜。然后测定平均横截面积(MCSA)，如图31A-31B所示。Ang II或Ang II介导的高血压增加左心室肌细胞的MCSA，引起心脏肥大。共同施用p-MGE显著减弱Ang II介导的肌细胞面积增加，表明p-MGE减少心肌细胞肥大。心脏肥大的这种减少也可能有助于p-MGE降低舒张功能障碍的能力。
总之，这些结果证明p-MGE不会加剧Ang II诱导的高血压和心脏损伤。此外，该提取物显著减弱舒张功能障碍，与心脏间质纤维化和心肌细胞大小的减少相关。这些结果表明p-MGE可安全地用于高血压患者，并可保护心脏免受高血压引起的纤维化和舒张功能障碍。
实施例9：麝香葡萄籽和皮粉末提取物(p-MGE)在乳腺肿瘤中的功效
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
通过测量以递增剂量的p-MGE处理的雌性小鼠中的肿瘤生长来确定p-MGE对乳腺肿瘤生长的影响。无胸腺小鼠的第4腹股沟乳房垫(雌性，15-20克，5-6周龄)注射3×106活跃生长的MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞(在基质胶中悬浮50:50)。将小鼠分组饲养在具有HEPA过滤空气的笼中，12小时光照/黑暗循环，并可选地喂食常规大鼠食物。使用卡尺在清醒的动物中每周测量肿瘤大小两次，并使用半椭球((4/3πr3)/2)的公式计算肿瘤体积。当肿瘤达到100mm3的大小时，将小鼠随机分配并用于饮用水中0.05、0.1、0.2或0.4mg酚类物质/mL的p-MGE处理(对于25g小鼠，相当于0.25、0.5、1和2mg酚类物质/小鼠/天的剂量)；内参小鼠饮用常规水。处理4周后，处死小鼠并称重肿瘤。
在无胸腺小鼠中生长的人三阴性乳腺肿瘤的体积在4周时间内增加。用p-MGE处理导致肿瘤体积的呈剂量依赖性地减小，在处理4周后，所有四个剂量与内参小鼠显著不同，如图32A所示。与饮用常规水的小鼠(内参)相比，肿瘤的重量也呈剂量依赖性地减小，如图32B所示。
为了确定通过p-MGE减少肿瘤生长的机制，从未处理的肿瘤(内参)和用0.1mg酚类物质/mL处理的肿瘤、以及对参与细胞的关键蛋白和酶作编码的基因中分离RNA，通过RT-PCR计量生长。如图32C所示，丝裂原活化蛋白(MAP)激酶磷酸酶(MAKP1)，也称为双特异性磷酸酶1(DUSP)，通过用p-MGE处理显著增加。由于DUSP1降低MAP激酶的活性，DUSP1的增加可以解释在乳腺癌细胞中观察到的MAP激酶活性的降低。相反，与内参小鼠相比，来自用p-MGE处理的小鼠的肿瘤中血小板衍生生长因子(PDGF)显著降低，如图32D所示。由于PDGF是参与MAP激酶信号传导的主要生长因子，因此p-MGE诱导的PDGF减少也可通过用p-MGE处理来参与肿瘤生长的减少。细胞周期的调节在肿瘤生长中也是重要的并且是复杂的，涉及许多调节蛋白、蛋白激酶和细胞周期蛋白。与内参小鼠的肿瘤相比，p-MGE显著增加用p-MGE处理的小鼠的肿瘤中的p21，如图32E所示。由于p21是调节细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶/细胞周期蛋白活性的抑制剂，如图32F的途径，其通过用p-MGE处理而减少也可参与p-MGE诱导的肿瘤大小的减少。
总之，这些结果表明，0.05至0.4mg/mL的p-MGE的浓度降低了无胸腺小鼠中人三阴性乳腺肿瘤的体积和重量。MAP激酶磷酸酶DUSP1的相关增加、生长因子PDGF的减少和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂p21的增加，可参与用p-MGE处理的小鼠中乳腺肿瘤生长的减少，表明用p-MGE可能是一种治疗女性乳腺癌的新方法。
实施例10：p-MGE对脑特异性转移细胞的影响
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
发育了特异性转移至脑的三阴性乳腺癌细胞系，以研究p-MGE在体外和体内对脑特异性三阴性乳腺癌的作用。通过在动脉内注射后通过同源宿主的脑来连续选择细胞(5x)，在韦克福里斯特药物学院(Wake Forest School of Medicine)开发了两种同种异体的小鼠三阴性乳腺癌转移模型('三阴性'4T1.luc2-Br5在Balb/c小鼠中和在C57Bl/6小鼠中的ER+Eo771.luc-Br5)。由此产生的细胞对大脑具有高度特异性。获得另外三种人脑转移细胞系(HER2+MDA-MB-361和MCF7-HER2-Br3由Pat Steeg博士友情提供，'三重阴性'MDA-MB-231Br由Janet Price博士友情提供)。通过测量集落生长、增殖、DNA损伤和细胞凋亡，来将这些细胞系用于测试p-MGE对转移生长的影响。
将4T1.luc2-Br5和ER+Eo771.luc-Br5的细胞以集落形成密度接种在6孔组织培养板中并使其粘附过夜，之后用p-MGE处理它们并使细胞生长10-14天。集落形成效率计算为形成的集落数作为接种细胞的百分比，然后针对内参归一化。如图33所示，在7.5μg/mL的剂量下，p-MGE使4T1.luc2-Br5细胞的集落形成存活率降低50％。Eo771.luc.Br5细胞对p-MGE稍微更敏感，在5μg/mL时显示33％抑制，在7.5μg/mL时显示91％抑制。
为了开始鉴定抑制转移性脑细胞生长的分子机制，将细胞与p-MGE一起温育(10μg/mL、4或24小时)，并通过蛋白质印迹分析探测细胞裂解物。如图34A所示，用针对活化的丝裂原活化蛋白(MAP)激酶的抗体，磷酸化的ERK1/2，探测细胞裂解物。使用ImageJ通过光密度测定法获得ERK1/2相对于总ERK1/2蛋白的相对磷酸化。与其相应的内参相比，p-MGE处理24小时引起致4T1.luc2.Br5细胞系中磷酸化ERK降低68±3％(p<0.05)，而未在Eo771.luc.Br5，MDA-MB-231Br或MCF7.HER2.Br3细胞系中观察到ERK1/2磷酸化的一致显著变化，表明增殖蛋白激酶可参与p-MGE诱导的4T1三阴性脑特异性细胞中细胞生长的抑制，但不参与所有脑特异性转移性乳腺癌细胞。
还用针对细胞周期蛋白D1的抗体探测脑特异性裂解物，以确定p-MGE是否通过细胞周期的减少来减少细胞生长。细胞周期蛋白D1是细胞周期演进和增殖的主要调节因子。如图34B所示，数据表明p-MGE处理24小时降低4T1.luc2.Br5、Eo771.luc.Br5和MDA-MB-231Br细胞中的细胞周期蛋白D1蛋白水平，表明该提取物可调节细胞周期以减少增殖。
最后，用针对PARP和半胱天冬酶3的抗体探测脑特异性乳腺癌细胞裂解物，以确定p-MGE是否增加细胞凋亡以作为减少乳腺癌细胞生长的机制。如图35所示，用p-MGE处理(10μg/mL，24小时)诱导了4T1.luc2.Br5细胞中的细胞凋亡，这通过蛋白质印迹检测裂解的PARP以及半胱天冬酶3的活性裂解形式得到证明。相反，在这些条件下，在Eo771.luc.Br5、MDA-MB-231Br或MCF7.HER2.Br3中未观察到PARP或半胱天冬酶3裂解(图35和未显示)。这些结果表明p-MGE刺激一些脑特异性乳腺癌细胞但不是所有脑特异性乳腺癌细胞的细胞凋亡，作为减少细胞生长的机制的一部分。
实施例11：p-MGE对乳腺癌增殖和迁徙的影响[新]
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
A.三阴性乳腺癌(TNBC)
为了确定p-MGE对转移性乳腺癌生长的影响，我们在使用IncuCyte Zoom实时成像系统的体外研究中评估了三阴性乳腺癌(TNBC)细胞增殖和迁徙的能力。如图36A和图36B所示，通过增加p-MGE的浓度，MDA-MB-231人TNBC细胞的增殖以剂量依赖性方式降低。处理48小时后，25μg/mL p-MGE使生长从2.7±0.2减少至1.4±0.1个细胞核/mm2，与未处理或内参细胞相比抑制了48％。如图37A-37C所示，在另外3种TNBC细胞系中观察到类似的呈剂量依赖性地增殖减弱：(1)BT549人TNBC细胞，处理48小时后，25μg/mL p-MGE使生长从1.6±0.1减少至0.9±0.1核/mm2，与未处理或内参细胞相比抑制了44％；(2)BT-20人TNBC细胞，处理48小时后，25μg/mL p-MGE使生长从1.5±0.1减少至1.1±0.1个细胞核/mm2，与未处理细胞或内参细胞相比抑制了27％；(3)4T1小鼠TNBC细胞，处理48小时后，25μg/mL p-MGE使生长从3.0±0.3降低至1.2±0.2％汇合，与未处理或内参细胞相比抑制了60％。递增浓度的p-MGE使ERK1和ERK2的磷酸化和活化在10μg/mL p-MGE下降低40％，在20μg/mL p-MGE下降低80％，如图38A-38D所示，这表明p-MGE降低MAP激酶活性以减少三阴性乳腺癌细胞的增殖。
为了鉴定通过p-MGE抑制三阴性乳腺癌细胞生长所涉及的途径，将4T1小鼠三阴性乳腺癌细胞在还原血清培养基中预温育24小时，然后与20μg/mL p-MGE以从1到12小时的递增时间段温育。根据制造商的说明，在TRIzol中分离RNA，并将其提交给韦克福里斯特大学(Wake Forest University)综合癌症中心基因组学核心，以便使用RNAseq分析基因表达谱。在12小时的时间内用p-MGE处理改变了许多基因；将需要通过RT-PCR和蛋白质印迹杂交的进一步分析来验证基因表达的这些变化。这些基因阵列的EPIG(一种提取微阵列基因表达模式和鉴定共表达基因的方法)全局基因模式分析鉴定了9种不同模式的2009个基因，这些模式通过p-MGE处理上调、下调或无显著改变，如图39所示。由p-MGE上调的基因家族包括29个涉及炎症或脂多糖(LPS)反应的基因、272个参与病毒防御或干扰素β(IFNβ)反应的基因和741个参与自体吞噬或内质网(ER)应激反应的基因。与此相对，被下调的有96个涉及核小体组装或先天免疫反应的基因、748个涉及细胞周期或细胞分裂的基因(与MAP激酶信号传导和参与细胞周期调节的蛋白质的变化一致)。四种额外的基因模式显示没有显著的富集。
TNBC是一种侵袭性的乳腺癌，转移到身体的各种器官，包括肺、肝、骨和脑，并且转移性乳腺癌往往是患有TNBC女性死亡的原因。作为级联导致转移性生长的第一步，TNBC细胞从原发性肿瘤迁徙出，渗入血流中以迁移至远处位点，渗出到组织中并增殖以形成转移性肿瘤。使用IncuCyteTM Zoom系统分析TNBC细胞的迁徙，以测量通过剥蚀汇合的单层细胞中心的800μm区域而形成的“伤口”的运动。测试的细胞系是4T1细胞、MB-MDA-231细胞和BT-549细胞。用MB-MDA-231进行的实验的代表性图像组示于图40A中。剥蚀区域被视为跨过每个图像的中央浅灰色水平条带，图像顶部和底部的中灰色区域是剥蚀区域每侧的汇合单元区域。然后记录来自剥蚀的条带上方和下方的细胞迁移进入伤口的距离，并在24小时至48小时用浓度增加的p-MGE处理期间，每2小时测量一次。随着最深灰色的区域侵入浅灰色剥蚀区域，在t＝12h和t＝24h的图像中可视化细胞的迁徙。如图40B所示，MDA-MB-231人TNBC细胞进入剥蚀区的运动随时间增加；迁移距离的减少取决于p-MGE的量。类似地，如图40C和图40D所示，在处理期间4T1细胞迁移入伤口，细胞迁徙呈剂量依赖性地减少。在评估BT-549TNBC细胞的实验中获得了类似的结果(数据未显示)。
总之，这些结果表明p-MGE减少TNBC细胞的增殖和迁徙，这将减少TNBC向远处转移位点的迁徙/侵袭。p-MGE降低MAP激酶ERK1/2的磷酸化和活化。最近的基因表达谱已经鉴定了大量基因，这些基因在用p-MGE温育的4T1三阴性乳腺癌细胞中上调、下调或不改变，表明提取物通过许多途径参与细胞生长调节。这些结果表明p-MGE可以减少TNBC的原发性和侵袭性生长，TNBC是这种乳腺癌侵袭形式的主要死亡原因。
B.HER2过度表达乳腺癌
人表皮生长因子受体2(HER2)过表达乳腺癌的特征在于HER2的表达增加。HER2阳性乳腺癌是一种侵袭性的乳腺癌，常常转移到体内的各种器官，包括肺、肝、骨和脑。雌激素受体(ER)或孕酮受体(PR)可能存在或可能不存在于HER2乳腺癌中。尽管针对HER2过表达乳腺癌的靶向治疗包括单克隆抗体治疗性曲妥珠单抗，市售名20％患有原发性疾病的患者和70％患有转移性疾病的患者对该药物没有反应，且70％的患者最初对对该药物没有反应仍进展为转移性疾病。因此，对于患有原发性或转移性HER2阳性乳腺癌的患者显然需要额外的药物。本研究使用IncuCyte Zoom实时成像系统评估了p-MGE对HER2阳性人SKBr3乳腺细胞体外增殖能力的影响。将细胞接种到96孔板中并用递增浓度的p-MGE处理，以μg酚类物质/mL培养基计算。在48小时测量细胞增殖，并将其计量为仅用水处理的内参小鼠中的增殖百分比。如图41A所示，通过增加p-MGE的浓度，SKBr3细胞的增殖以剂量依赖性方式降低；与内参相比，用40μg/mL p-MGE处理使增殖减少60％。
为了确定参与抑制HER2过表达乳腺癌细胞的分子机制，以递增的时间段将SKBr3细胞与20μg/mL p-MGE一起温育，并使用抗体通过蛋白质印迹分析细胞裂解物，施用(1)对于在丝氨酸473上磷酸化的AKT抗体，(2)对于在苏氨酸308上磷酸化的AKT抗体，和(3)对于磷酸化mTOR(p-mTOR)的抗体。使用GelDoc分析凝胶，并通过分析每泳道上样的蛋白质的总量将免疫反应条带归一化用于上样。在乳腺癌细胞和肿瘤中激活的主要途径之一是AKT/蛋白激酶B途径，导致增殖和存活增加。如图41B和图41C所示，用20μg/mL p-MGE处理SKBr3细胞分别引起在丝氨酸473或苏氨酸308上磷酸化的AKT的时间依赖性降低。处理16小时后，p-MGE使丝氨酸473或苏氨酸308上的AKT磷酸化降低60％。响应于磷酸化Akt而活化的主要靶标是雷帕霉素的哺乳动物靶标mTOR。用递增浓度的p-MGE处理SKBr3细胞也引起磷酸化和活化的mTOR的呈剂量依赖性地递增，如图41D所示。处理16小时后，通过p-MGE将mTOR的磷酸化降低50％。
这些结果证明用p-MGE处理过表达HER2的乳腺癌细胞减少了可能参与增殖减少的AKT/mTOR信号传导，表明该提取物可能是HER2乳腺癌患者的有用治疗方法。
实施例12：p-MGE与辐射组合的功效
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
超过三分之二的癌症患者在其疾病过程中接受放射治疗。放射治疗，无论是作为部分/全脑放射治疗还是作为靶向伽玛刀治疗，有时通过手术，仍然是治疗乳腺癌患者脑转移性病变的标准治疗方法。我们在存在和不存在辐射的情况下用p-MGE处理脑特异性乳腺癌细胞，以确定组合治疗的效果。将4T1.luc2.BR5或Eo771.luc.Br5细胞系的小鼠脑特异性转移性乳腺癌细胞以集落形成密度接种于6孔培养板中24小时，然后用p-MGE处理24小时。在24小时药物处理后，对细胞进行假辐照或以～4Gy/min的剂量率用1-6Gy的137Cs射线辐照，并将细胞再温育10-14天。那时，集落用结晶紫染色，含有≧50细胞的集落被评为集落性存活者。分数存活率(f)计算为形成的集落数除以接种的细胞数乘以假辐照细胞的植板效率。针对单独药物的杀灭校正组合模态存活曲线以评估p-MGE的放射增敏潜力。如图42A和图42B所示，用p-MGE处理没有显著增加辐射敏感性。但是如图42C和图42D所示，施用p-MGE和2Gy辐射(用于治疗患有脑转移的患者的相关部分剂量)导致比单独治疗更大的损失，表明累加效应。
这些结果表明p-MGE可以安全地与放射疗法组合使用，并且组合疗法可以比任何单独的疗法更有效。
实施例13：p-MGE与他莫昔芬组合的功效
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
基于肿瘤细胞表面上雌激素受体(ER)的存在，大多数乳腺肿瘤属于ER+亚型。通过用受体拮抗剂如他莫昔芬、或通过阻断雌激素产生的药物(芳香酶抑制剂)阻断雌激素受体，可以显著降低ER+乳腺肿瘤的生长，这些药物通常用作治疗ER+乳腺癌的标准治疗方法。通过测量单独或在ER+受体拮抗剂他莫昔芬的情况下(施用至小鼠食物中)用p-MGE处理的雌性小鼠的ER+肿瘤生长，来测定p-MGE在减少ER+乳腺肿瘤生长中的功效。将无胸腺小鼠(雌性，15-20g，5-6周龄)的第4个腹股沟乳房垫注射1×106活跃生长的ZR-75-1或MCF7人ER+乳腺癌细胞。将小鼠分组饲养在具有HEPA过滤空气的笼中，12小时光照/黑暗循环，并可选地喂食常规大鼠食物。使用卡尺在清醒的动物中每周测量肿瘤大小两次，并使用半椭球(4/3πr3)/2)的公式计算肿瘤体积。当肿瘤达到30mm3的大小时，将小鼠随机分配用0.1mg酚类物质/mL饮用水(对应于25g小鼠，剂量为0.5mg酚类物质/小鼠/天)、大约32mg剂量/kg/天的他莫昔芬(TAM，通过用含有他莫昔芬的食物替代常规小鼠食物来施用)，或者用p-MGE与他莫昔芬的组合来处理；内参小鼠饮用常规水。对含有ZR-75-1人ER+乳腺肿瘤的小鼠处理7周、或对含有MCF7ER+乳腺肿瘤的小鼠处理5周后，处死小鼠并取出肿瘤并称重。
ZR-75-1ER+乳腺肿瘤或MC7ER+肿瘤的大小和重量在处理期间增加，分别如图43和图46所示。用p-MGE处理显著降低了ZR-75-1或MCF肿瘤的生长，表明该提取物在ER+乳腺肿瘤中是有效的。正如所料，他莫昔芬通过阻断雌激素受体减少增殖来减少ER+肿瘤的生长。在ZR-75-1和MCF肿瘤中，与单独的p-MGE或他莫昔芬的作用相比，p-MGE和他莫昔芬的组合进一步减少了肿瘤生长。在ZR-75-1和MCF7肿瘤中均观察到肿瘤重量的类似减少，如图44和47所示。通过用p-MGE、他莫昔芬或其组合处理，ZR-75-1肿瘤的肿瘤体积和重量的减少与增殖标志物Ki67阳性的细胞数量的减少有关，如图45所示。
总之，这些结果证明p-MGE减少了ER+人乳腺肿瘤的生长。与单独的任一处理相比，用p-MGE与雌激素受体拮抗剂他莫昔芬的组合处理进一步减少了肿瘤生长，表明p-MGE和他莫昔芬可以组合使用。这些结果表明，对于ER+乳腺癌患者，单独使用或与雌激素受体拮抗剂他莫昔芬(其是ER+乳腺癌女性的标准治疗方法)组合使用的p-MGE治疗可能是一种新型治疗方法。
实施例14：p-MGE对LNCaP前列腺肿瘤的作用
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
通过测量用递增剂量的p-MGE处理的小鼠中的LNCaP前列腺肿瘤生长来确定p-MGE的功效。在无胸腺小鼠(雄性，15-20g，5-6周龄)的下腹侧皮下注射1.6x106个LNCaP人前列腺癌细胞(在Matrigel基质胶中悬浮50:50)。将小鼠分组饲养在具有HEPA过滤空气的笼中，12小时光照/黑暗循环，并可选地喂食常规大鼠食物。使用卡尺在清醒的动物中每周测量肿瘤大小两次，并使用半椭球(4/3πr3)/2)的公式计算肿瘤体积。当肿瘤达到100mm3的大小时，将小鼠随机分组，用递增剂量的p-MGE，饮用水中0.05、0.1、0.2和0.4mg酚类物质/mL(相当于对于25克小鼠，为0.25、0.5、1和2mg酚类物质/小鼠/天)来处理；内参小鼠饮用常规水。处理5周后，处死小鼠并称重肿瘤。
在5周处理期间，在未处理的小鼠中，在裸鼠侧腹中生长的前列腺肿瘤的体积增加至765.2±101.8mm 3，而用0.1mg酚类物质/mL处理的小鼠的肿瘤体积增加至364.2±108.9mm 3，使用0.4mg酚/mL，小鼠的肿瘤体积增加至190.2±26.4mm 3，如图48所示。来自饮用常规水(内参)或递增浓度的p-MGE的小鼠的前列腺肿瘤的重量也减少，如图49所示。将肿瘤固定在多聚甲醛中，包埋在石蜡中，切片并用针对作为增殖的标志物的Ki67的抗体染色。如图50所示，用0.1mg酚类物质/mL处理导致每个视野Ki67阳性细胞数减少36％，表明p-MGE减少前列腺肿瘤细胞的增殖。
肿瘤切片也用CD34抗体染色，其对内皮细胞进行标记，以鉴定肿瘤中的血管并确定p-MGE对血管数量的影响。如图51所示，用0.1mg酚类物质/mL处理显著减少了血管数量。从内参和p-MGE处理的肿瘤中分离RNA，并通过RT-PCR测量血管生成因子“血管内皮生长因子(VEGF)”和“胎盘生长因子(PLGF)”的相对表达，如图52所示。与内参相比，用p-MGE处理减少了前列腺肿瘤中的VEGF和PLGF，表明促血管生成因子的减少与p-MGE诱导的血管减少有关。
总之，这些结果显示p-MGE在小鼠模型中减少人前列腺肿瘤生长，与增殖和血管生成的减少相关，表明p-MGE可能是前列腺癌的有效治疗方法。
实施例15：p-MGE对辐射诱导的纤维化的影响
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。以下，粉末提取物被称为“p-MGE”。
A.p-MGE和辐射诱导的肌肉纤维化
许多患有癌症的患者接受放射治疗作为其标准治疗的一部分。例如，患有软组织肉瘤的患者通常用放射治疗，导致骨骼肌纤维化和关节挛缩。用放射治疗可导致肌肉组织和邻近真皮内的胶原逐渐沉积。组织内胶原蛋白沉积的增加降低了组织的弹性并导致功能性硬化，这是接受放射治疗的个体痛苦和发病的重要和严重来源。
B.p-MGE在辐照后防止骨骼肌纤维化骨骼肌
软组织肉瘤的放射治疗涉及对肌肉的辐照，导致肌肉内的胶原沉积和肢体的硬化。为了确定p-MGE对辐射诱导的骨骼肌纤维化的影响，16周龄雌性瑞士白化病小鼠的右后肢接受了模拟治疗患有肢体肉瘤的人的放射治疗模拟过程(4个总分数的7.3Gy(Gy)/分数，每周两次提供，持续两周)。在放射治疗前，p-MGE(0.1mg/mL)在饮用水中连续给药6天，在放射治疗完成后连续给药6周。胫前(TA)肌肉被加工用于组织学检查，并检查形态学[苏木精和曙红(H&E)染色]和纤维化(Masson's Trichrome染色)的变化。被辐照的肌肉显示出明显的活动性炎症区域，主要包含在子宫内膜空间中，如图53所示。定性地，在用p-MGE处理的小鼠的被辐照的肌肉中这种炎症似乎减轻了。Masson's Trichrome染色用于鉴定组织纤维化的区域，并使用ImageJ软件计量。用p-MGE处理将放射治疗诱导的纤维化减少至未辐照的水平，如图54所示。
为了确定p-MGE诱导的纤维化减少的机制，8周龄雌性无胸腺小鼠的右后肢接受了一个放射治疗过程，再次通过应用生物等效剂量模拟软组织肉瘤的治疗。用于治疗人类四肢肉瘤的方法：每周两次提供总分数为7.3Grey(Gy)/分数的四个分数，持续两周，并在开始放射治疗之前6天和整个研究期间在饮用水(0.1mg/mL)中提供p-MGE。在放射治疗的六周完成时表征纤维化和胶原沉积的生物标志物。转化生长因子β(TGFβ)是已知的胶原蛋白生成刺激物，并且在辐照后猪的骨骼肌内增加。在放射8周结束时在小鼠中观察到增加的肌内TGFβ，并且p-MGE处理显著降低了辐射诱导的TGFβ产生，如图55A所示。TGFβ信号传导促进结缔组织生长因子(CTGF)的产生，结缔组织生长因子是组织纤维化的另一个标志。如图55B所示，放射治疗也增加了CTGF的产生，其通过共同施用p-MGE显著降低。TGFβ还启动SMAD信号传导，增加胶原蛋白的产生；SMAD蛋白质是这样的蛋白质家族：其在磷酸化后进入细胞核并充当转录因子以增加促纤维化蛋白质的产生。放射治疗增加了SMAD2的表达，这通过施用p-MGE显著降低，如图55C所示。这些结果表明，放射治疗激活TGBβ/CTGF/SMAD途径以增加组织纤维化，并且p-MGE通过减弱该途径来减少纤维化。
C.p-MGE减少辐射诱导的骨损伤
每年170万新癌症诊断中的大约一半将用治疗性电离放射治疗。由于癌症筛查和治疗方面的改进降低了大多数类型癌症的患者死亡率，因此放射治疗引起的骨折也是一个主要问题。特别令人虚弱的是股骨和盆腔功能不全骨折，这些骨折在接受盆腔放射治疗宫颈癌、直肠癌和肛门癌的患者中发生率很高；由放射治疗引起的颌骨坏死也发生在头颈癌的幸存者身上。因此，放射治疗是癌症患者骨损伤和骨折的主要危险因素，其作为功能障碍、疼痛和死亡的主要来源。临床上发生的放射治疗引起的骨损伤的原因尚不清楚，但历史上归因于对成骨细胞的持续损伤，这导致骨形成和骨矿物质密度降低。然而，放射治疗也迅速增加骨再吸收破骨细胞的数量和活性，导致骨质流失。
为了确定p-MGE对破骨细胞形成的影响，在用0.0001、0.0002或0.0004μg/mL的p-MGE预处理24小时后，用2Gy辐照处理破骨细胞前体(RAW264.7细胞)。单次2Gy剂量的辐射相当于一种分次放射治疗，已知在暴露的第一周内会增加破骨细胞数量，导致急性骨质流失；该剂量的辐射还在啮齿动物的辐射位点诱导显著的早期骨丢失，并且在细胞培养模型中增加破骨细胞的形成。如图56所示，在2Gy辐照之前用0.0001、0.0002和0.0004μg/mL的p-MGE处理破骨细胞前体RAW264.7细胞24小时，防止了在第7天观察到的早期辐射诱导的破骨细胞数量的增加。这表明用葡萄提取物治疗可以减少辐射诱导的活性破骨细胞的增加，这可能会减少骨吸收并防止骨质流失。
这些研究表明，p-MGE通过减少导致促纤维化蛋白的表达增加de TGBβ/CTGF/SMAD途径，来保护肌肉免受辐射诱导的纤维化。此外，p-MGE降低了成骨细胞形成中的辐射诱导增加。这些结果表明，对用放射疗法治疗的患者施用p-MGE可以减少辐射诱导的纤维化和成骨细胞形成的增加，导致相关的肌肉僵硬和骨质流失的减少。
实施例16：与其他麝香葡萄产品比较的p-MGE的表征
本实施例中描述的研究用通过实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物进行。具体地，粉末提取物由上述实施例5中所述的液体提取物制备。下面，液体提取物被称为“l-MGE”，粉末提取物被称为“p-MGE”。
使用改进的比色Folin-Ciocalteau方法和没食子酸作为标准，分析来自由麝香葡萄制成的9种不同市售产品的胶囊的内容物的总酚类物质含量/胶囊。将胶囊储存在环境温度(室温约65℉-72℉)下，并且当测试时，将胶囊的内容物重新悬浮在水中并使用TissueLyzerTM(Qiagen)进行匀浆，然后测量总酚类物质。酚类物质的量按每胶囊来计量，如图57所示。分析的市售产品描述于下表3中。胶囊的总酚类物质的含量各有不同，从高达178.9mg±6的p-MGE到来自Biopower Nutrition(BP)的麝香葡萄籽产品的11.8mg±0.9。与Earth Natural Supplements的麝香浆果(Muscadine Berries)产品相比，基于mg酚类物质/克粉末，p-MGE制剂每粒胶囊的总酚含量高12.4倍，总酚含量高14.9倍。
存在于四种产品中的单个多酚——儿茶素、没食子酸、表儿茶素、鞣花酸、原花青素和儿茶素-没食子酸酯(cat-gall)——岛津超高效液相色谱(UPLC)与质谱检测(UPLC-MS)相结合来测量并通过与标准比较来识别。如图58所示，单个酚类成分的UHPLC-MS分析表明，p-MGE主要含有表皮素、没食子酸、原花青素、儿茶素和儿茶素-没食子酸酯。由籽制成的自然珍珠(Nature’s Pearl，NP)主要含有表皮素和没食子酸，而用皮生产的来自麝香葡萄天然物有限公司(Muscadine Naturals)的麝香葡萄升级版膳食补充剂，以及Muscadinx(一种皮/籽产品)，主要含有鞣花酸和没食子酸。与其他补充剂相比，p-MGE含有显著较高水平的表皮素[22.0±0.7mg/g]、没食子酸[13.5±0.6mg/g]、原花青素B[7.1±0.3mg/g]、鞣花酸[4.7±0.4mg/g]、儿茶素[2.7±0.1mg/g]和儿茶素没食子酸酯[1.8±0.1mg/g]。包括白藜芦醇、槲皮素和杨梅素的其他酚类物质在所有四种分析产品中都低于测定检出限。在所测试的麝香葡萄糖产品中，p-MGE含有最高的总酚含量，这反映了更高水平的表皮素、没食子酸、鞣花酸、儿茶素和原花青素。
表3.由麝香葡萄制成的市售产品的比较
1DOM：制造日期；ED：有效期限。
2清空每种产品的胶囊并称重内容物。列出的这些值是测试的3个胶囊中产物的量的平均值。
3以10mg/mL的浓度制备胶囊内容物的含水提取物(使用Tissuelyzer，然后除去不溶物质)。使用Folin-Ciocalteau方法并将没食子酸作为标准测量提取物中酚类物质的总量。然后计算每种产品的原始粉末的总酚类物质(mg酚/克)。这些值是测试的3个胶囊的平均值。
4然后使用从ft nt 2和3(mg酚类/胶囊)测定的值计算每个胶囊中总酚类物质的浓度，其绘制在图57中所示的图中。
在制备p-MGE期间，液体制剂(l-MGE)通过喷雾膜技术进行商业加工，以制备粉末形式的MGE然后将其包封。通过UHPLC-MS分析将p-MGE与l-MGE进行比较。如图59的摹图所示，其放大了以分子量约为500至2000存在的种类，两种制剂之间存在明显差异，如红框中所示。p-MGE含有的在分子量706和1033处具有峰值的组分，在l-MGE中明显不存在，而l-MGE含有的在分子量730和1288处具有峰值的组分，在p-MGE中明显不存在。正在进行的研究正在评估这些峰值的识别。
使用Folin-Ciocalteau方法在两年的时间内测量3种不同p-MGE制剂中的总酚类物质，以确定产物的稳定性。测试批次为：批号#013-1(“p-MGE2”；DOM：1/13/15)(用于实施例18中描述的1期试验)；批号#086-1(“p-MGE3”；DOM：3/27/15)；和批号#219-1(“p-MGE4”；DOM：8/7/15)。如下表4所示，在两年的测试期间，3种p-MGE制剂的酚类物质含量相当稳定。
表4.测试麝香葡萄提取物粉末的总酚类物质(mg没食子酸/g粉末MGE)
*在马萨诸塞州Southborough的Brunswick实验室2015年4月17日(p-MGE2)、2015年5月5日(p-MGE3)和2015年7月10日(p-MGE4)测量。
**在指定日期，于北卡罗来纳州Winston-Salem的WFSM细胞和分子生物学核心实验室中测量。
测试了p-MGE的微生物含量以及农药和重金属。如下表5所示，在16个月期间，需氧菌计数、酵母和霉菌计数、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠杆菌科和铜绿假单胞菌计数低或不存在。此外，农药、汞、铅、镉和砷都很低，并且受到监管限制。
表5.测试麝香葡萄提取物粉末的微生物、农药和重金属
测试 10/30/2015* 2/14/2017**
需氧菌计数 <10cpu/g <10cpu/g
酵母和霉菌计数 <10cpu/g <10pcu/g
大肠杆菌 无 无
金黄色葡萄球菌 无 无
沙门氏菌 无 无
肠杆菌科 <10cpu/g ND
铜绿假单胞菌 ND 无
农药 ND 符合USP
汞 ND 0.16ppm
铅 ND 0.05ppm
镉 ND <0.01ppm
砷 ND 0.19ppm
ND——未检测出
*测量在自然珍珠，Advance，北卡罗来纳州；p-MGE2(批号#013-1；DOM1/13/15；用于第1阶段)
**在加拿大魁北克省LABOFINE测量；p-MGE2
实施例18：评估具有晚期恶性肿瘤的受试者中用p-MGE治疗的临床研究A.晚期恶 性肿瘤中麝香葡萄籽和皮粉末提取物(p-MGE)的1期研究标题为“晚期恶性肿瘤中的麝香葡萄提取物(MGE)的阶段1研究”的1期临床试验(IND 128937)正在进行中，已于2016年1月9日开始(ClinicalTrials.gov Identifier：NCT02583269)。试验中使用的治疗剂是根据实施例1中描述的方法制备的麝香葡萄籽和葡萄皮粉末提取物(p-MGE)，并在羟丙甲纤维素胶囊中配制成162mg总酚类物质(440mg总粉末提取物)。研究设计是标准的3+3剂量逐步增加统计设计，从每天2片(早晨和晚上)的剂量开始，逐步发展为每天4、6、8和10片(早上一半，其余的在晚上)。患者群体是具有转移性或不可切除的恶性肿瘤的成年患者，其已经失败或拒绝标准疗法。该研究的目的是确定对该患者群体中的成年患者施用p-MGE的安全性和最大耐受剂量。次要目标是评估服用p-MGE的患者的酚类物质水平、细胞因子和生长因子的变化，以观察总体反应率、无演进生存期和总体生存率，从而评估整体生活质量和疲劳，并评估对p-MGE治疗的黏着度。研究状态是开放和正在应募中的。
纳入研究的标准包括任何18岁以上的成人具有转移性或不可切除的实体瘤恶性肿瘤。所有患者必须有对标准疗法失败或拒绝。患者需要具有≤2的ECOG状态，足够的器官/骨髓功能，绝对中性粒细胞计数>1000/mcL，血小板计数≥50,000/mcL，正常机构限制内的总胆红素，天冬氨酸氨基转移酶(AST)(血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶[SGOT]/丙氨酸氨基转移酶(ALT)(血清谷氨酸丙酮酸转氨酶[SGPT])≤2.5X机构上限或正常，肌酐清除率≥40mL/min，在开始研究前2周内稳定补充剂并在研究期间不改变意愿，预期寿命>3个月，并且愿意和有能力同意参加研究。排除标准包括应募2周内接受过任何化疗或放疗，接受过任何研究性的癌症指向药物，对p-MGE或类似化合物的过敏反应历史，无法服用口服药物或由于肠切除或胃肠道疾病导致的吸收不良史，在应募前21天存在无法控制性腹泻或持续恶心/呕吐并需要每天止吐治疗，以及不受控制的并发疾病，包括感染、充血性心力衰竭、不稳定型心绞痛、心律失常、可能限制依从性或怀孕或哺乳的精神疾病/社交情况。患有原发性脑肿瘤的患者也被排除在外。
患者将在研究过程中接受全面支持看护(血液制品、抗生素、止吐药、抗炎药或麻醉镇痛药的输液、慢性伴随病症的药剂、危及生命的医学问题的治疗)。
主要结果测量将是在4周时评估的剂量限制性毒性(DLT)。如果患者继续接受治疗，将在第4周、第8周和之后每4周评估不良事件/毒性。
如上所述，该研究的结构为3+3剂量逐步增加研究，并且正在进行中。1级：三(3)名患者每天2粒胶囊(324mg总酚类物质)治疗30天。如果治疗耐受良好并且患者的肿瘤没有演进，则这3名患者将继续治疗(再持续30天，然后监测)。2级：第2组3名患者每天用4粒胶囊(总酚类物质含量648mg)治疗，30天后评估。如果这种治疗耐受性良好，并且患者的肿瘤没有演进，则这3名患者将再次继续治疗(再过30天，然后监测)。3级：将遵循相同的格式，每天施用6粒胶囊(972mg总酚类物质)。对于4级，将遵循相同的格式，每天施用8个胶囊(972mg总酚类物质)(目前正在应募)，随后，5级，每天施用10个胶囊(1620mg总酚类物质)。如果这些组中的任何一组具有剂量限制性毒性，则将另外3名患者以该剂量治疗。如果另外3名患者没有毒性，则在研究中使用下一剂量。
在该单点研究(single-site study)的第1年中，应募了10名个体，3名女性和7名男性。其中，90％为70岁或以上，90％为非西班牙裔白人，10％为非西班牙裔黑人。在第一份年度报告时(报告第一年的研究，从2016年1月9日到2017年1月8日，如下表所示)，9名受试者已完成治疗。在这9例中，2例因为不良体验提前终止研究，在2级(每天4粒)中提前终止研究1例，并且在第2级增加另外3例患者。在临床试验的第2年的前2个月，来自1年入组的第10名患者离开了研究，另外4名患者参加了研究。1级(n＝3)在10周内完成；2级(n＝7)在20周内完成，以及3级(n＝3)在5周内完成。除1名参与者外，所有患者似乎都符合他们预约的剂量，并在家中完成服药日志。
p-MGE施用的预期不良事件(AE)是胃肠胀气、腹泻、恶心、消化不良和腹部绞痛。在第一份年度报告中，仅报告了两个等级为2级或更高的AE，这些AE可能归因于p-MGE；一名受试者患有3级便秘，另一名受试者患有2级腹泻，两者均可能归因于p-MGE。患有3级便秘的患者因疑似肠梗阻住院。进一步的检查显示疾病演进是可能引起他的症状的原因。最终确定患者患有进行性转移性疾病，并且不确定p-MGE是否在他的症状中起作用。在第1年没有提交IND安全报告，参加研究时没有参与者死亡。在临终关怀护理或死亡之前，按照方案从研究中移除有疾病演进的那些人。
前9名参与者的平均研究时间为7.4周，范围为1至20周。离开研究的原因是疾病演进(1名患者)、剂量限制性毒性(1名患者)、退出临终关怀(1名患者)或不遵从(1名患者)。按组分类的前14名癌症诊断包括：胰腺(3)、支气管(1)、直肠(1)、肝内胆管(1)、泌尿生殖系统/前列腺(4)、腹膜肉瘤(1)、肺(2)和甲状腺瘤(1)。
患者的临床评估包括一名患有结肠直肠癌的患者，其经历了p-MGE的临床改善，通过血液工作评估肿瘤标志物的稳定性，并且在8周时对成像中的治疗具有混合响应。该患者接受最低剂量并在肿瘤演进前保持研究5个月。第二名患有胃肠原发肿瘤的患者在疾病演进前以第二剂量完成了6个半月的治疗。在第1阶段临床试验的该阶段的结果表明，对于总日剂量为972mg总酚类物质，p-MGE在每天最多6个胶囊(AM中3个和PM中3个)的剂量下具有良好的耐受性。
将在8周评估总体响应率(CR、PR和SD)。使用Kaplan-Meier方法评估无演进生存期和总生存期，每6±2周进行随访直至演进，监测存活研究终点(中位存活率和相关的95％置信区间；最后接触日期的检查)。如与治疗方案相遵循地，还将评估生活质量(癌症一般疗法(FACT-G)测量)和疲劳(使用PROMIS疲劳简表进行的功能评估)。
B.晚期前列腺和乳腺癌中麝香葡萄籽和皮粉末提取物(p-MGE)的2期研究
预计将于2017年启动关于p-MGE对晚期前列腺癌和乳腺癌影响的两期2期临床研究，并准备向FDA提交IND申请。如用于I期临床试验的A部分所述，将使用相同的p-MGE制剂。
前列腺癌患者的2期临床试验将是对具有生物化学复发的前列腺癌的男性中p-MGE与安慰剂的随机、双盲、安慰剂内参研究。患者群体将是患有前列腺腺癌的男性，其确定的治疗是完整的，没有转移但具有上升的前列腺特异性抗原(PSA)。预计将有200名患者随机分入安慰剂组和治疗组，每天将接受8粒胶囊，并且每三个月随访一次。最初终点评估将在9个月时进行，最长可达12个月的随访，以测量复发和存活率。主要结果将是PSA增加率的降低和无病生存。与接受安慰剂的患者相比，接受p-MGE的患者的PSA增加率显著降低，或无病生存期的长度增加，这将被解释为提取物对转移性前列腺癌症的积极影响。
乳腺癌患者的2期临床试验将是一项对于在之前6个月内完成辅助化疗的三阴性乳腺癌女性患者的随机、双盲、安慰剂内参研究。患者群体将是患有1-3期三阴性乳腺癌的女性(160名患者)，其将被随机分配至安慰剂组或p-MGE治疗组(8个胶囊/天的水平)。最初终点将在6个月时进行疲劳评估。患者将每6个月针对复发和生存结果被跟进一次，至多24个月。与服用安慰剂的相比，服用p-MGE的三阴性乳腺癌的女性测量的疲劳显著减少(由PROMIS-疲劳评估)，由CES-D评估的情绪改善，由匹兹堡睡眠质量指数评估的睡眠障碍减少，癌症治疗功能评估[FACT]-Cog评估的认知主诉减少，改善的与整体健康相关的生活质量(FACT-B)，改善的在简易体能状况量表(Short Physical Performance Battery)上的体能，6分钟步行中的体能，峰值VO2，以及通过双能量X射线吸收测定法(DXA)测定的肥胖减少，将被解释为提取物对转移性三阴性乳腺癌的积极影响。
本公开中提及的所有印刷专利和公开均通过引用整体并入本文。

Claims (63)

1.一种由葡萄籽、葡萄皮或其组合制造液体提取物的方法，该方法包括：
(a)提供葡萄籽、葡萄皮或其组合；
(b)将葡萄籽、葡萄皮或其组合与蒸馏水接触以形成提取混合物；
(c)在120℉至200℉的温度范围内加热提取混合物，在此加热期间加入另外的蒸馏水；
(d)冷却提取混合物；
(e)过滤提取混合物以除去固体，从而形成滤液；
(f)在滤液中加入食品防腐剂；
(g)冷却滤液，以形成冷却的滤液；以及
(h)过滤冷却的滤液，从而产生液体提取物。
2.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述葡萄籽、葡萄皮或其组合得自选自下组的葡萄：圆叶葡萄、釀酒葡萄、美洲葡萄、河岸葡萄、夏葡萄、沙地葡萄、紫葛葡萄、霜葡萄和山葡萄。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述葡萄籽、葡萄皮或其组合得自圆叶葡萄。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蒸馏水是分级蒸汽压缩蒸馏水。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述葡萄籽是提供的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中使所述葡萄籽与蒸馏水接触包含的比例为：约4.5磅葡萄籽比约0.5加仑水至约4.5磅葡萄籽比约2.5加仑水。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中使所述葡萄籽与蒸馏水接触包含的比例为：约4.5磅葡萄籽比约1加仑水。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中添加所述另外的蒸馏水以实现的比例为约1磅葡萄籽比约0.92加仑水至约1磅葡萄籽比约4.6加仑水。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述葡萄皮是提供的。
10.根据权利要求1-4或9中任一项所述的方法，其中使所述葡萄皮与蒸馏水接触包括的比例为：约2磅葡萄皮比约0.5加仑水至约2磅葡萄皮比约1.25加仑水。
11.根据权利要求1-4、9或10中任一项所述的方法，其中使所述葡萄皮与蒸馏水接触包括的比例为：约2磅葡萄皮比约1加仑水。
12.根据权利要求1-4或9-11中任一项所述的方法，其中添加所述另外的蒸馏水以实现的比例为约1磅葡萄皮比约0.92加仑水至约1磅葡萄皮比约4.6加仑的水。
13.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中葡萄籽和葡萄皮的组合是提供的。
14.根据权利要求1-4或13中任一项所述的方法，其中葡萄籽和葡萄皮的组合具有的比例为：约50％葡萄籽比50％葡萄皮(重量/重量(w/w))至约85％葡萄籽比15％葡萄皮。
15.根据权利要求1-4、13或14中任一项所述的方法，其中使葡萄皮和葡萄籽的组合与蒸馏水接触的比例包括：约3.7磅葡萄籽和葡萄皮的组合比约0.5加仑水至约3.7磅葡萄籽和葡萄皮的组合比约2.5加仑的水。
16.根据权利要求1-4或13-15中任一项所述的方法，其中使葡萄皮和葡萄籽的组合与蒸馏水接触包括约3.7磅葡萄皮和葡萄籽的组合比约1.0加仑的水。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述加热进行约1至约6小时。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述加热进行约1至约2小时。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在加热过程中将另外的蒸馏水以多个部分加入到提取混合物中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在加热期间约每5分钟至约每60分钟将一部分另外的蒸馏水添加到所述提取混合物中。
21.根据权利要求19所述的方法，其中在加热期间约每15至约每30分钟将一部分另外的蒸馏水添加到所述提取混合物中。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述提取混合物冷却至约40℉至约170℉的温度。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过筛眼孔径为约20微米至约50微米的过滤器过滤所述提取混合物。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述食品防腐剂以约0.1％至约20％(重量/体积(w/v))的量加入至滤液中。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述食品防腐剂以约0.1％至约1％(w/v)的量加入至滤液中。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述防腐剂包括山梨酸钾、柠檬酸、乙酸或维生素E中的至少一种。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述滤液在约35℉至约45℉的温度下冷却。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述滤液冷却约24小时至约120小时。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述滤液冷却约24小时。
30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中过滤冷却的滤液包括：将冷却的滤液通过筛孔尺寸为约1微米至约10微米的过滤器。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将食品级乙醇加入到步骤(g)的过滤的冷却滤液中，从而产生液体提取物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述食品级乙醇为约190标准(95％乙醇)。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述食品级乙醇由玉米、小麦、甘蔗或葡萄制成。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述食品级乙醇是有机食品级乙醇。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中加入步骤(g)的过滤的冷却滤液中的食品级乙醇的体积为液体提取物体积的约2％至约5％。
36.一种制造葡萄衍生的液体提取物的方法，包括：
(a)提供通过权利要求1-8或17-35中任一项所述的方法制备的葡萄籽液体提取物；
(b)提供通过权利要求1-4、9-12或17-35中任一项所述的方法制备的葡萄皮液体提取物；
(c)将葡萄籽液体提取物和葡萄皮液体提取物以约50:50至约85:15(体积/体积(v/v))的比例混合，从而形成葡萄衍生的液体提取物。
37.一种通过权利要求1-36中任一项所述的方法制备的液体提取物。
38.一种制备葡萄衍生的粉末提取物的方法，包括对根据权利要求37所述的液体提取物进行喷雾干燥。
39.一种通过权利要求38所述的方法制备的葡萄衍生的粉末提取物。
40.一种葡萄衍生的粉末提取物，其包含约25％至50％(重量/重量(w/w))的总酚类化合物。
41.一种葡萄衍生的粉末提取物，其包含至少约30％(重量/重量(w/w))的总酚类化合物。
42.一种葡萄衍生的粉末提取物，其包含每克粉末提取物约250-500mg的总酚类化合物。
43.一种葡萄衍生的粉末提取物，其包含浓度为至少约6mg/g粉末提取物的没食子酸或鞣花酸中的至少一种。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的葡萄衍生的粉末提取物，其中当进行高效液相色谱、质谱分析时，所述提取物包含分子量为706和1033的独特组分。
45.根据权利要求39-44中任一项所述的葡萄衍生的粉末提取物，其中所述提取物包含的分子量为730或1288的组分的量使得当进行高效液相色谱、质谱分析时，分子量为730或1288的组分不出现在在分析中生成的色谱图中的最大的30％的峰中。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的葡萄衍生的粉末提取物，其中所述提取物的总酚类物质含量在至少6个月的时期内保持稳定，其特征在于在6个月时总酚含量降低不超过10％。
47.一种治疗患有疾病、疾病风险增加或有复发风险的受试者的方法，该方法包括向受试者以药学有效量施用权利要求37所述的液体提取物、权利要求39-43中任一项所述的粉末提取物、或包含两者任一的制剂。
48.根据权利要求47所述的方法，其中每剂量的粉末提取物或制剂的总酚类化合物含量为约30-50％(mg/mg)。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述粉末提取物或制剂的每剂量包含约150-500mg的总酚类化合物。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的每日总剂量的液体提取物或粉末提取物，其包含每kg体重至少约10mg的总酚类化合物。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的每日总剂量的液体提取物或粉末提取物，其包含每kg体重约10mg、20mg、40mg或80mg的总酚类化合物。
52.根据权利要求47-51中任一项所述的方法，其中所述受试者每天至少两次施用每剂量的粉末提取物或制剂。
53.根据权利要求47所述的方法，其中每剂量的液体提取物或制剂的总酚类化合物含量为约20mg/mL。
54.根据权利要求47或53所述的方法，其中所述液体提取物的剂量包含约2.5g至约3.5g的总酚类化合物。
55.根据权利要求47-54中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症。
56.根据权利要求55中任一项所述的方法，其中施用所述提取物抑制癌症相关的细胞生长或增殖、血管生成、炎症或纤维化中的至少一种。
57.根据权利要求55或56所述的方法，其中所述癌症包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、成胶质细胞瘤、肺癌、皮肤癌、白血病或淋巴瘤中的至少一种。
58.根据权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌或HER2过表达乳腺癌中的至少一种。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌包括脑转移性乳腺癌。
60.根据权利要求55-59中任一项所述的方法，其中所述提取物与化学治疗剂或放射疗法中的至少一种组合施用。
61.根据权利要求47-54中任一项所述的方法，其中所述疾病是高血压诱导的纤维化。
62.根据权利要求47-54中任一项所述的方法，其中所述疾病是辐射诱导的纤维化。
63.根据权利要求47-54中任一项所述的方法，其中所述疾病是辐射诱导的骨流失。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114377067A (zh) * 2020-10-22 2022-04-22 中国科学院上海营养与健康研究所 葡萄籽提取物在制备靶向清除肿瘤微环境衰老细胞及抑制肿瘤的药物中的用途

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3494980A1 (en) * 2017-12-08 2019-06-12 Oguzhan Doganlar Spider web extract, method of preparation, and use for treating prostate cancer
WO2022036316A1 (en) * 2020-08-14 2022-02-17 North Carolina State University Methods to use flavonoids for inhibition of sars-cov-2 and treatment of covid-19
US20240000880A1 (en) * 2020-12-04 2024-01-04 Institute Of Materia Medica , Chinese Academy Of Medical Scicences A pharmaceutical composition for preventing and treating lung injury, a preparation method therefor and a use thereof
CN112980772A (zh) * 2021-03-09 2021-06-18 广东医科大学 一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法
KR102803123B1 (ko) * 2021-11-22 2025-05-07 경상국립대학교산학협력단 포도껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 주름개선용 조성물
WO2024026416A1 (en) * 2022-07-27 2024-02-01 Shaklee Corporation Botanical extract blend for use in skin care

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6544581B1 (en) * 1999-06-22 2003-04-08 Canandaigua Wine Company, Inc. Process for extraction, purification and enrichment of polyphenolic substances from whole grapes, grape seeds and grape pomace
CN103435661A (zh) 2013-08-13 2013-12-11 新疆西部牧业股份有限公司 一种葡萄籽多酚物质的提取方法
US20150259315A1 (en) * 2014-03-14 2015-09-17 Constellation Brands, Inc. Grape extract, dietary supplement thereof, and processes therefor
WO2015184291A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 Shaklee Corporation Chardonnay grape seed extract

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114377067A (zh) * 2020-10-22 2022-04-22 中国科学院上海营养与健康研究所 葡萄籽提取物在制备靶向清除肿瘤微环境衰老细胞及抑制肿瘤的药物中的用途

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