CN112980772A - 一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物学检测技术领域，公开了一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，包括：制备葡萄籽提取物，加水稀释获得花青素溶液；将建模小鼠进行高脂饲料饲养28天；令小鼠空腹6小时后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖浓度；对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食28天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片；使用试剂盒进行胰岛β细胞凋亡情况的观察。本发明使用葡萄籽提取物作为花青素来源进行小鼠胰岛β细胞自噬效果检测，检测效果更好；糖尿病小鼠建模能够实现对糖尿病病体组织的获取，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒仅需进行切片的洗涤和染色，检测效果展现更直观。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学检测技术领域，尤其涉及一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法。
背景技术
目前，自噬是细胞利用溶酶体降解已受损的大分子物质和细胞器的过程，自噬连续不断清理错误折叠的蛋白质、有害的代谢产物、老化的线粒体等细胞器，从而保持胰岛β细胞的正常状态。研究表明，花青素具有很强的自由基清除和抗氧化活性能力，在预防心血管疾病、肿瘤、糖尿病中发挥着重要的作用。桑树果实花色苷提取物素通过抗氧化应激抑制胰岛β细胞凋亡，从而预防糖尿病。但是目前暂无检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，无法为糖尿病防治提供理论依据。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前暂无检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，无法为糖尿病防治提供理论依据。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法。
本发明是这样实现的，一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：
步骤一，称取原料葡萄籽，将葡萄籽洗净后进行干燥；将干燥的葡萄籽粉碎，过80～120目筛，得到葡萄籽粉末。
步骤二，向葡萄籽粉末中加入粉末质量体积5～9倍量、温度为100～110℃的热水搅拌20～25min，过滤，得滤液A。
步骤三，将滤液A过大孔树脂DM21吸附，并用水洗杂，得滤液B；所述大孔树脂的加入量为所述滤液量的1.0～1.3倍。
步骤四，向滤液B中加入浓度为60％的乙醇，超声提取得到葡萄籽提取液；将葡萄籽提取液进行真空干燥，得到葡萄籽提取物。
步骤五，将葡萄籽提取物直接过LSK11树脂，收集流出液；将流出液用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物20～30min，得到纯化的葡萄籽提取物。
步骤六，将纯化的葡萄籽提取物减压浓缩为婆美度为15～20的浓缩液，并进行喷雾，得产品葡萄籽提取物；加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂。
步骤七，将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28～30天；令小鼠空腹6～8h后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型。
步骤八，对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食，喂食时间为28～30天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，分离获得小鼠胰岛β细胞。
步骤九，将获得的小鼠胰岛β细胞接种于培养瓶中，预培养3～5天，得预培养体系；将所述预培养体系无菌注入材质为FEP的细胞培养袋中。
步骤十，将含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液的细胞培养基注入培养基保存袋中；利用联通管将所述细胞培养袋和培养基保存袋进行连接，所述联通管上设置有可拆卸的三通止流阀。
步骤十一，将所述细胞培养袋置于培养箱中进行培养，所述培养箱内设置温度为37℃，CO2浓度为5％；将所述培养基保存袋置于4℃冰箱内培养小鼠胰岛β细胞，利用流式细胞技术构建小鼠胰岛β细胞凋亡模型。
步骤十二，将培养后的小鼠胰岛β细胞使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片。
步骤十三，使用碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒作为检测用试剂盒，并将已固定的冠状切片使用二甲苯进行2次脱蜡。
步骤十四，依次用100％、95％、75％乙醇进行水化，水化共进行三次，每次1min；使用PBS缓冲液进行二次洗涤，后进行染色，并室温孵育10min；使用PBS缓冲液进行三次洗涤，观察试剂盒胰岛β细胞凋亡情况的显示结果。
进一步，步骤四中，所述超声提取中的超声频率为35～45Hz，超声时间为30～40min，超声提取温度为40～50℃。
进一步，步骤五中，所述用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物时，低温等离子体气氛为体积比为1～2:1的O2和N2。
进一步，步骤六中，所述减压浓缩的条件为-0.05～-0.1MPa，40～65℃；所述喷雾时的进口温度为180～200℃，出口温度为85～95℃。
进一步，步骤七中，所述建模小鼠为3～5月龄的雄性SD小鼠，体重为200～240克。
进一步，步骤七中，所述高脂饲料按照质量份数由麸皮10～15份、玉米10～12份、豆粕8～15份、酪蛋白6～8份、麦芽糊精10～12份、大豆油3～6份、胆固醇1～2份组成。
进一步，步骤八中，所述对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食时，花青素溶液摄入量为每天10ml。
进一步，步骤九中，所述无菌注入的方法包括：在无菌操作台上，取一个50mL注射器，去掉推塞后，悬挂于支架上，同时利用软管将注射器的套筒与细胞培养袋的进样口连接，然后注入所述预培养体系。
进一步，步骤十二中，所述组织固定剂为植物单宁与缓冲溶液的混合液，所述植物单宁与缓冲溶液的混合液的体积比为1:40。
进一步，所述缓冲溶液为氢氧化钠、柠檬酸、尿素、磷酸与去离子水的混合溶液。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明使用葡萄籽提取物作为花青素来源进行小鼠胰岛β细胞自噬效果检测，花青素含量高，检测效果更好；糖尿病小鼠建模能够实现对糖尿病病体组织的获取，方便实现检测；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒仅需进行切片的洗涤和染色，即可实现显色，检测效果展现更直观。利用本发明所述方法进行小鼠胰岛β细胞的培养，培养过程从预培养后就封闭式培养，可以规避避免细菌污染；完全培养基在4℃保存，因子效价稳定，避免了营养物质37℃降解，每天的检测更加方便快捷，成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法的流程图。
图2是本发明实施例提供的制备葡萄籽提取物的流程图。
图3是本发明实施例提供的使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行胰岛β细胞凋亡情况的观察的流程图。
图4～图5是本发明实施例提供的使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行胰岛β细胞凋亡情况的检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：
S101，制备葡萄籽提取物，加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂；将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28～30天。
S102，令小鼠空腹6～8h后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型。
S103，对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食，喂食时间为28～30天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，分离获得小鼠胰岛β细胞。
S104，将获得的小鼠胰岛β细胞接种于培养瓶中，预培养3～5天，得预培养体系；将所述预培养体系无菌注入材质为FEP的细胞培养袋中。
S105，将含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液的细胞培养基注入培养基保存袋中；利用联通管将所述细胞培养袋和培养基保存袋进行连接，所述联通管上设置有可拆卸的三通止流阀。
S106，将所述细胞培养袋置于培养箱中进行培养，所述培养箱内设置温度为37℃，CO2浓度为5％；将所述培养基保存袋置于4℃冰箱内培养小鼠胰岛β细胞，利用流式细胞技术构建小鼠胰岛β细胞凋亡模型。
S107，将培养后的小鼠胰岛β细胞使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片；使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行胰岛β细胞凋亡情况的观察。
本发明实施例提供的步骤S101中，所述建模小鼠为3～5月龄的雄性SD小鼠，体重为200～240克。
本发明实施例提供的步骤S101中，所述高脂饲料按照质量份数由麸皮10～15份、玉米10～12份、豆粕8～15份、酪蛋白6～8份、麦芽糊精10～12份、大豆油3～6份、胆固醇1～2份组成。
本发明实施例提供的步骤S103中，所述对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食时，花青素溶液摄入量为每天10ml。
本发明实施例提供的步骤S104中，所述无菌注入的方法包括：在无菌操作台上，取一个50mL注射器，去掉推塞后，悬挂于支架上，同时利用软管将注射器的套筒与细胞培养袋的进样口连接，然后注入所述预培养体系。
本发明实施例提供的步骤S107中，所述组织固定剂为植物单宁与缓冲溶液的混合液，所述植物单宁与缓冲溶液的混合液的体积比为1:40。
本发明实施例提供的缓冲溶液为氢氧化钠、柠檬酸、尿素、磷酸与去离子水的混合溶液。
如图2所示，本发明实施例提供的葡萄籽提取物的制备方法包括：
S201，称取原料葡萄籽，将葡萄籽洗净后进行干燥；将干燥的葡萄籽粉碎，过80～120目筛，得到葡萄籽粉末。
S202，向葡萄籽粉末中加入粉末质量体积5～9倍量、温度为100～110℃的热水搅拌20～25min，过滤，得滤液A。
S203，将滤液A过大孔树脂DM21吸附，并用水洗杂，得滤液B；所述大孔树脂的加入量为所述滤液量的1.0～1.3倍。
S204，向滤液B中加入浓度为60％的乙醇，超声提取得到葡萄籽提取液；将葡萄籽提取液进行真空干燥，得到葡萄籽提取物。
S205，将葡萄籽提取物直接过LSK11树脂，收集流出液；将流出液用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物20～30min，得到纯化的葡萄籽提取物。
S206，将纯化的葡萄籽提取物减压浓缩为婆美度为15～20的浓缩液，并进行喷雾，得产品葡萄籽提取物；加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂。
本发明实施例提供的步骤S204中，所述超声提取中的超声频率为35～45Hz，超声时间为30～40min，超声提取温度为40～50℃。
本发明实施例提供的步骤S205中，所述用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物时，低温等离子体气氛为体积比为1～2:1的O2和N2。
本发明实施例提供的步骤S206中，所述减压浓缩的条件为-0.05～-0.1MPa，40～65℃；所述喷雾时的进口温度为180～200℃，出口温度为85～95℃。
如图3所示，本发明实施例提供的使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行胰岛β细胞凋亡情况观察的方法包括：
S301，使用碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒作为检测用试剂盒；将已固定的冠状切片使用二甲苯进行2次脱蜡。
S302，依次用100％、95％、75％乙醇进行水化，水化共进行三次，每次1min；使用PBS缓冲液进行二次洗涤，后进行染色，并室温孵育10min。
S303，使用PBS缓冲液进行三次洗涤，观察试剂盒显示结果。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例1
制备葡萄籽提取物，加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂。
将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28天；令小鼠空腹6小时后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型；对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食，喂食时间为28天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，对切取组织使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片。
实施例2
使用碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒作为检测用试剂盒；将实施例1制备的冠状切片使用二甲苯进行2次脱蜡；依次用100％、95％、75％乙醇进行水化，水化共进行三次，每次1分钟；使用PBS缓冲液进行二次洗涤，后进行染色；使用PBS缓冲液进行三次洗涤，观察试剂盒显示结果。染色结果如图4所示。
实施例3
使用碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒作为检测用试剂盒；将实施例1制备的冠状切片使用二甲苯进行2次脱蜡；依次用100％、95％、75％乙醇进行水化，水化共进行三次，每次1分钟；使用PBS缓冲液进行二次洗涤，后进行染色，并室温孵育10分钟；使用PBS缓冲液进行三次洗涤，观察试剂盒显示结果。染色结果如图5所示。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：
步骤一，称取原料葡萄籽，将葡萄籽洗净后进行干燥；将干燥的葡萄籽粉碎，过80～120目筛，得到葡萄籽粉末；
步骤二，向葡萄籽粉末中加入粉末质量体积5～9倍量、温度为100～110℃的热水搅拌20～25min，过滤，得滤液A；
步骤三，将滤液A过大孔树脂DM21吸附，并用水洗杂，得滤液B；所述大孔树脂的加入量为所述滤液量的1.0～1.3倍；
步骤四，向滤液B中加入浓度为60％的乙醇，超声提取得到葡萄籽提取液；将葡萄籽提取液进行真空干燥，得到葡萄籽提取物；
步骤五，将葡萄籽提取物直接过LSK11树脂，收集流出液；将流出液用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物20～30min，得到纯化的葡萄籽提取物；
步骤六，将纯化的葡萄籽提取物减压浓缩为婆美度为15～20的浓缩液，并进行喷雾，得产品葡萄籽提取物；加水稀释获得花青素溶液，作为检测试剂；
步骤七，将建模小鼠进行高脂饲料饲养，饲养时间为28～30天；令小鼠空腹6～8h后，抽取饲养后小鼠的尾静脉血，测定血糖，血糖浓度高于16.7mmol/L的小鼠作为糖尿病小鼠模型；
步骤八，对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食，喂食时间为28～30天；切取饲养后糖尿病小鼠的胰腺组织，分离获得小鼠胰岛β细胞；
步骤九，将获得的小鼠胰岛β细胞接种于培养瓶中，预培养3～5天，得预培养体系；将所述预培养体系无菌注入材质为FEP的细胞培养袋中；
步骤十，将含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液的细胞培养基注入培养基保存袋中；利用联通管将所述细胞培养袋和培养基保存袋进行连接，所述联通管上设置有可拆卸的三通止流阀；
步骤十一，将所述细胞培养袋置于培养箱中进行培养，所述培养箱内设置温度为37℃，CO2浓度为5％；将所述培养基保存袋置于4℃冰箱内培养小鼠胰岛β细胞，利用流式细胞技术构建小鼠胰岛β细胞凋亡模型；
步骤十二，将培养后的小鼠胰岛β细胞使用组织固定剂进行固定；用石蜡包埋，作冠状切片；
步骤十三，使用碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒作为检测用试剂盒，并将已固定的冠状切片使用二甲苯进行2次脱蜡；
步骤十四，依次用100％、95％、75％乙醇进行水化，水化共进行三次，每次1min；使用PBS缓冲液进行二次洗涤，后进行染色，并室温孵育10min；使用PBS缓冲液进行三次洗涤，观察试剂盒胰岛β细胞凋亡情况的显示结果。
2.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤四中，所述超声提取中的超声频率为35～45Hz，超声时间为30～40min，超声提取温度为40～50℃。
3.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤五中，所述用低温等离子体气氛处理葡萄籽提取物时，低温等离子体气氛为体积比为1～2:1的O2和N2。
4.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤六中，所述减压浓缩的条件为-0.05～-0.1MPa，40～65℃；所述喷雾时的进口温度为180～200℃，出口温度为85～95℃。
5.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤七中，所述建模小鼠为3～5月龄的雄性SD小鼠，体重为200～240克。
6.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤七中，所述高脂饲料按照质量份数由麸皮10～15份、玉米10～12份、豆粕8～15份、酪蛋白6～8份、麦芽糊精10～12份、大豆油3～6份、胆固醇1～2份组成。
7.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤八中，所述对糖尿病小鼠进行花青素溶液喂食时，花青素溶液摄入量为每天10ml。
8.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤九中，所述无菌注入的方法包括：在无菌操作台上，取一个50mL注射器，去掉推塞后，悬挂于支架上，同时利用软管将注射器的套筒与细胞培养袋的进样口连接，然后注入所述预培养体系。
9.如权利要求1所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤十二中，所述组织固定剂为植物单宁与缓冲溶液的混合液，所述植物单宁与缓冲溶液的混合液的体积比为1:40。
10.如权利要求9所述检测花青素诱导小鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，所述缓冲溶液为氢氧化钠、柠檬酸、尿素、磷酸与去离子水的混合溶液。
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