CN114752590A - 一种高效且经济的猪肌肉干细胞的分离方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效且经济的猪肌肉干细胞的分离方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过组合不同消化肌肉组织的酶，确定不同组合酶释放单细胞的能力，选取最高效经济的酶组合消化方式(链霉蛋白酶与分散酶组合)，最后通过差速纯化方法得到了大量的肌肉干细胞。本发明进一步公开了如何高效消化猪肌肉组织的方法，可以在降低成本的同时或许最多的肌肉干细胞。应用本酶组合消化分离方法，可以稳定获得总单细胞数为4.6‑6×106个细胞/g，猪肌肉干细胞数为8‑15×105个细胞/g(以CD29，CD56双阳性比例)。分离得到的肌肉干细胞有较强的分化能力，为细胞培养肉种子细胞的研究与实际生产提供了高效经济的分离方法。

Description

一种高效且经济的猪肌肉干细胞的分离方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种高效且经济的猪肌肉干细胞的分离方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
近年来随着我国社会经济的飞速发展，肉类农产品的供求出现了严重的不平衡。传统的畜牧业资源消耗多，对环境污染严重，还存在着动物福利与动物疫病等一系列问题，矛盾日益突出，亟需发展绿色的肉类生产技术。细胞培养肉是近些年兴起的一项具有颠覆性的肉类生产技术，是依据动物肌肉生长修复机理，利用体外培养获得肉类的一种技术。培养肉的生产首先需要获得肌肉干细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞等种子细胞。其中最有前途的是肌肉干细胞，它们是肌肉的主要成体干细胞。
肌肉干细胞，是位于肌肉组织基膜和肌细胞膜之间的一类单核干细胞，一般条件下处于静息状态。当肌肉受到损伤时，肌肉干细胞内的信号通路等会被激活，开始增殖为成肌细胞，随后进行分化修复损伤的肌肉。一部分可以与其他成肌细胞融合为新的多细胞核肌管，从而形成肌纤维；另一部分自我更新补充干细胞，以保持自身干细胞池。肌肉干细胞经过分离提取可以实现体外培养，进行增殖、分化，形成肌肉组织。肌肉干细胞培养首要需解决的问题就是在体外分离得到纯度高的肌肉干细胞。一些分离方法已经被报道，但并没有文献报道对消化酶进行系统的比较工作，大多数是利用胶原酶对肌肉组织进行消化，但胶原酶本身价格高昂，消化能力强的胶原酶价格更贵，且根据其打断肌纤维的机理，并不能很好的释放单细胞，往往需要配合胰酶消化以达到更好的分离效果，但胰酶容易对肌肉干细胞造成损伤。因此，寻找最佳的酶组合消化方式对于细胞培养肉的成本降低和研究发展具有重大的意义。
现有的肌肉干细胞的分离大多是基于流式分选仪器进行细胞分选，流式分选是一门较为难掌握的实验技术，流式分选往往需要经验丰富的实验人员进行操作。流式分选的过程往往会对细胞造成一定程度的损伤，在后续的细胞培养时，往往需要较长的时间细胞才能得以恢复从而进行增殖。并且，流式分选仪器造价和后续保养费用昂贵不是所有实验室都能配备。依赖于流式分选的肌肉干细胞分离方法往往会陷入推广困难，难以工业化的境地。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种低成本消化肌肉组织的复合酶制剂，所述复合酶制剂包括链霉蛋白酶、胰酶、分散酶和胶原酶D中的一种或两种。
本发明的一种实施方式中，所述复合酶制剂为链霉蛋白酶，或链霉蛋白酶和胰酶，或链霉蛋白酶和分散酶，或链霉蛋白酶和胶原酶D。
本发明的一种实施方式中，所述复合酶制剂为链霉蛋白酶和分散酶。
本发明的一种实施方式中，所述复合酶制剂中链霉蛋白酶和分散酶的添加比例为1:1。
本发明的一种实施方式中，所述复合酶制剂中，链霉蛋白酶的工作浓度为0.8～1.2mg/mL，胰酶的工作浓度为0.1～0.5％，分散酶的工作浓度为0.8～1.2mg/mL，胶原酶的工作浓度为0.8～1.2mg/mL。
本发明的第二个目的是提供一种低成本、高效率分离肌肉干细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
将猪肌肉组织剪碎后置于含有复合酶制剂的基础培养基中孵育消化；
将消化得到的细胞接种于培养皿静置1～2h后，将上清接种于铺有基底胶(matrigel)的培养皿中培养。
在一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：
S1：选取3日龄的幼猪，采用CO2安乐处死，在无菌环境下将猪解剖，除菌处理获得猪肌肉组织；
S2：将S1获得的猪肌肉组织用手术刀切碎，去除脂肪和结缔组织，得到碎肌肉组织；
S3：将S2获得的碎肌肉组织置于含有1％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗和复合酶制剂的DMEM培养液中37℃孵育消化50-80min，每隔5-15min用5-20mL医用注射器吹打消化混合物，直到达到消化终点获得消化混合物；
S4：向S3获得的消化混合物加入1倍体积的含有2％胎牛血清的PBS缓冲液，再加入等体积的含有2％胎牛血清的PBS缓冲液，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群悬浮液；
S5：将S4所述悬浮液反复吹打混合均匀，通过70μm的滤网过滤，离心收集沉淀；将细胞重悬，并通过40μm的滤网过滤，2000rpm条件下离心5min，弃去上清获得细胞沉淀；
S6：向S5获得的细胞沉淀中按0.8～1.2mL/g细胞的比例加入红细胞裂解液，混匀并冰浴5～7min，加入10倍体积的预冷的含有2％胎牛血清的PBS缓冲液，2000rpm条件下离心8-10min，弃去上清获得单细胞沉淀；用生长培养基重悬沉淀，获得单细胞群悬液；
S7：将单细胞群悬液接种于培养皿静置1～2h后，将上清接种于铺有matrigel的培养皿中培养，贴壁细胞即为猪肌肉干细胞。
在一种实施方式中，S1所述除菌处理为用无菌水将猪外表洗净后在70-75％乙醇中浸泡3min，随后用灭菌的手术器械取出猪背部与腿部肌肉，并用含有1％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液与1％庆大霉素的PBS缓冲液中清洗两遍并保存。
在一种实施方式中，S2所述的将猪肌肉组织切碎至0.5-1.5mm3。
在一种实施方式中，S3所述碎肌肉和复合酶制剂的质量体积比例为1:4-1:6。
在一种实施方式中，S3所述消化的终点为消化混合物顺畅通过10-16G的注射器针头。
在一种实施方式中，S6所述的生长培养基为含有15％胎牛血清和1％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液的DMEM培养基。
在一种实施方式中，S7中所述的培养皿中含有2～4mL的生长培养基。
本发明还提供上述复合酶制剂和上述方法在培养肉领域中的应用。
有益效果：
1、本发明提供的猪肌肉干细胞的分离方法高效且经济，分离过程中受污染几率小，利用链霉蛋白酶与分散酶，可以在较短时间内使得肌肉组织消化充分，获得最多的细胞释放数(4.5-6×106单细胞/g)，且肌肉干细胞比例(18-25％)较其他组高。
2、本发明中利用差速贴壁法分离猪肌肉干细胞，相较于流式分选细胞，差速纯化在得到高纯度的肌肉干细胞同时，可以大大缩短纯化时间和成本，提高细胞存活率，为猪的肌肉干细胞的培养提供了高效经济的分离提取方法，有助于猪肌肉干细胞分离方法的推广以及培养肉的工业化生产。
附图说明
图1为G1-G4不同酶消化力作用对比图。
图2为G1-G4总贴壁细胞计数与MTT结果分析图。
图3为G1-G4总单细胞群CD29+CD56+双阳比例分析图。
图4为G4-G7不同酶消化力作用对比图。
图5为G4-G7总贴壁细胞计数与MTT结果分析图。
图6为G4-G7总单细胞群CD29+CD56+双阳比例分析图。
图7为G4-G7差速纯化后培养48h Pax7表达免疫荧光图。
图8为G4-G7差速纯化后培养48h MyoD表达免疫荧光图。
图9为G4-G7差速纯化后培养48h MyHC表达免疫荧光图。
图10为差速贴壁法与流式分选所获的肌肉干细胞培养后第一代CD29,CD56占比分析图。
图11为差速贴壁法与流式分选所获的肌肉干细胞Pax7，MyoD表达比例对比图。
具体实施方式
实施例1：链霉蛋白酶消化能力的确定
实验过程中均在无菌环境(生物安全柜或超净台)下操作，手术器械均经过高压灭菌。
(1)获取猪肌肉组织
选取3日龄的幼猪，采用CO2安乐处死，用无菌水将猪外表洗净，随后将其置于在75％乙醇中浸泡3min。随后用无菌PBS缓冲液清洗两次。然后，于生物安全柜中使用高压灭菌手术器械无菌将猪解剖，去除内脏；再用手术刀与手术剪刀将猪背部与腿部肌肉取出。取出的肌肉组织用含有1％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗(Antibiotic-Antimycotic，AA)与1％庆大霉素(GEN)的PBS缓冲液清洗2次，随后保存在含有1％AA与1％GEN的PBS缓冲液中。
(2)剪切肌肉组织
于生物安全柜中将肌肉组织放入培养皿中，用手术刀将肌肉组织切碎，并在过程中剔除脂肪、结缔等组织，尽量在较短的时间内将肌肉组织切碎至1mm3。
(3)消化获得肌肉干细胞单细胞群
首先将5g碎肌肉组织置于4组(G1，G2，G3，G4)含有不同消化酶的DMEM培养液的50mL离心管中，不同组别的酶组合以及酶的用量如表1所示，酶组合中的酶的添加比例为1:1。碎肌肉组织(g)和酶液(mL)的质量体积比例为1:4-1:6。37℃孵育消化60-70min，每隔15-20min用10-20mL医用注射器吹打消化混合物，直到达到消化终点，消化的终点为消化混合物顺畅通过10-16G的注射器针头。
向获得的消化混合物加入1倍体积的含有2％胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液，并充分混合均匀。混合液2000rpm离心5min，收集沉淀，加入3mL 0.25％胰蛋白酶液进行二次消化，37℃孵育7-10min，向获得的消化混合物加入0.5倍体积的FBS终止胰蛋白酶消化，并加入等体积的含有2％FBS的PBS缓冲液，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群悬浮液。
表1不同酶组合方式
Figure BDA0003470498110000041
Figure BDA0003470498110000051
(4)过滤网纯化细胞
将步骤(3)的单核细胞群悬浮液反复吹打混合均匀，通过70μm的滤网过滤，获得的滤液2000rpm离心5min收集沉淀；再用2％FBS的PBS缓冲液重悬沉淀，并通过40μm的滤网过滤，获得的滤液在2000rpm条件下离心5min，弃去上清，收集细胞沉淀。
(5)裂解红细胞
按1mL/g肌肉量的比例加入ACK红细胞裂解液，充分重悬，冰上孵育5-7min；随后加入10倍体积的预冷的含有2％FBS的PBS终止裂解，2000rpm，离心8-10min，弃去上清，得到不同消化方式所获取的单细胞沉淀，分别称作沉淀G1，沉淀G2，沉淀G3，沉淀G4。如图1所示，观察沉淀，发现链霉蛋白酶消化组织完全，三种胶原酶消化有胶原组织残留。用1mL生长培养基(含有15％FBS、1％AA和1％GEN的DMEM培养基)重悬单细胞沉淀，得到四组不同的总单细胞群悬液。
(6)对所获得的单细胞总细胞群进行细胞活力、细胞鉴定等分析
1)细胞活力测定：取少许(5)所获得的单细胞群悬液进行血球计数板计数，取其中5000个细胞接种于预镀有matrigel的96孔板中，37℃、5％CO2条件下进行培养，12h后更换新鲜生长培养基，待细胞贴壁生长后，进行MTT实验，吸净培养基，用无酚红的DMEM培养液按1:4稀释MTT工作母液，每孔加入100μL，37℃培养4h；去除MTT(保证吸干净)，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，37℃摇床孵育15min；使用酶标仪检测吸光度波(波长570nm)，分析数据。结果如图2所示，通过计数与MTT实验共同验证，相比于不同的胶原酶，使用链霉蛋白酶可以更好的释放单细胞。
2)肌肉干细胞鉴定：取(5)所获得的单细胞群悬液：其中含有1.0×105个细胞，离心弃上清，所获沉淀用PBS清洗一次去除残留的生长培养基，随后将细胞沉淀，重悬于100μL含有1％BSA的PBS溶液中，加入表面标志物抗体组合FITC-CD31(1:20)，FITC-CD45(1:20)，PE-CD56(1:40)，APC-CD29(1:40)染色，冰上孵育30-45min；细胞悬液，350g，离心5min收集细胞，预冷的PBS洗涤两次。将细胞重悬于含1％BSA的PBS缓冲液中；使用流式细胞仪首先处理空白对照组细胞，得到空白对照结果；再对实验组细胞进行分析，首先确定CD31、CD45阴性细胞比例，其次在CD31、CD45阴性细胞中圈出CD56和CD29双阳性的细胞确定比例，此类细胞即为肌肉干细胞，最终确定肌肉干细胞比例。结果如图3所示。
肌肉组织消化情况如图1所示，由残留沉淀可以看出，胶原蛋白酶所消化的组织有明显的胶状物残留，而链霉蛋白酶可以将肌肉组织消化完全。释放单细胞数结果如图2所示，血球计数板计数与MTT实验双验证表明，相比于胶原蛋白酶，应用组别G4链霉蛋白酶消化可以释放4.5-6×106/g的总单细胞数，而其余组别释放单细胞数仅有G4：3.0×106/g，G5：2.8×106/g，G7：3.5×106/g。利用流式检测本发明，链霉蛋白酶的消化能力大于胶原酶的消化能力，且释放的总单细胞数最多。
(7)获得的单细胞群纯化培养
将剩余的(5)所获得的单细胞群悬液按5g肌肉所获得的细胞/孔量分别接种于六孔板中，静置1.5h，随后取上清接种于铺有matrigel的六孔板中，补足生长培养基总体积3mL/孔，此时贴壁的细胞为肌肉干细胞。
实施例2最终酶组合消化方式的确定
链霉蛋白酶确定之后，将链霉蛋白酶与胰酶，胶原酶，分散酶分别组合为G4，G5，G6，G7(见表1)。除G4组别需要胰酶二次消化以外，其余3组无需二次消化。其余步骤该四组酶组合分离肌肉干细胞的方法与G1-G4相同。具体步骤如下：
(2)剪切肌肉组织
将保存的肌肉组织于生物安全柜/超净台中放入培养皿中，用手术刀将肌肉组织切碎，并在过程中剔除脂肪、结缔等组织，尽量在较短的时间内将肌肉组织切碎至1mm3。
(3)消化获得肌肉干细胞单细胞群
首先将5g碎肌肉组织置于4组含有不同消化酶(G4，G5，G6，G7，其中G5，G6，G7两种酶按照1：1的比例同时加入)的DMEM培养液的50mL离心管中，碎肌肉组织(g)和酶液(mL)的质量体积比例为1:4-1:6，不同组别的酶组合以及酶的用量如表1所示。37℃孵育消化60-70min，每隔15-20min用5-20mL医用注射器吹打消化混合物，直到达到消化终点，消化的终点为消化混合物顺畅通过10-16G的注射器针头。
向获得的消化混合物加入1倍体积的含有2％FBS的PBS缓冲液，并充分混合均匀。混合液2000rpm离心5min，收集沉淀。G5，G6，G7组加入等体积的含有2％FBS的PBS缓冲液，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群悬浮液。
G4组收集沉淀后，需再次加入3mL的0.25％胰蛋白酶液进行二次消化，37℃孵育7-10min，向获得的消化混合物加入0.5倍体积的FBS终止胰蛋白酶消化，并加入等体积的含有2％FBS的PBS缓冲液，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群悬浮液。
(4)过滤网纯化细胞
将步骤(3)的单核细胞群悬浮液反复吹打混合均匀，通过70μm的滤网过滤，获得的滤液2000rpm离心5min收集沉淀；用2％FBS的PBS缓冲液重悬细胞沉淀，并通过40μm的滤网过滤，获得的滤液在2000rpm条件下离心5min，弃去上清，收集细胞沉淀。
(5)裂解红细胞
按1mL/g肌肉量的比例加入ACK红细胞裂解液，充分重悬，冰上孵育5-7min；随后加入10倍体积的预冷的含有2％FBS的PBS终止裂解，2000rpm，离心8-10min，弃去上清，得到不同消化方式所获取的单细胞沉淀，分别称作沉淀G4，沉淀G5，沉淀G6，沉淀G7，如图4所示。用1mL生长培养基重悬单细胞沉淀，得到四组不同的总单细胞群悬液。
(6)对所获得的单细胞总细胞群进行细胞数、细胞活力、细胞鉴定等分析
1)细胞活力测定：取少许所获得的细胞进行计数，取其中5000个细胞接种于预镀有matrigel的96孔板中，37℃、5％CO2条件下进行培养，12h后更换新鲜生长培养基，待细胞贴壁生长后进行MTT实验，吸净培养基，用无酚红的DMEM培养液按1:4稀释MTT工作母液，每孔加入100μL，37℃培养4h；去除MTT(保证吸干净)，每孔加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，37℃摇床孵育15min；使用酶标仪检测吸光度波(波长570nm)，分析数据。结果如图5所示，通过计数与MTT实验共同验证，相比于其他组别，使用链霉蛋白酶与中性蛋白酶组合可以更好的释放单细胞。
2)肌肉干细胞鉴定：取(5)所获得的单细胞群悬液：其中含有1.0×105个细胞，离心弃上清，所获沉淀用PBS清洗一次去除残留的生长培养基，随后将细胞沉淀，重悬于100μL含有1％BSA的PBS溶液中，用抗体组合FITC-CD31(1:20)，FITC-CD45(1:20)，PE-CD56(1:40)，APC-CD29(1:40)染色，冰上孵育30-45min；细胞悬液，350g，离心5min收集细胞，预冷的PBS洗涤两次。将细胞重悬于含1％BSA的PBS缓冲液中；使用流式细胞仪确定CD56和CD29双阳性的细胞比例，此类细胞即为肌肉干细胞，最终确定肌肉干细胞比例。结果如图6所示。
应用本发明获取的单细胞群，总单细胞量可达到4.5-6×106/g，CD56和CD29双阳性的细胞比例达18-25％。而其他组别可获得总单细胞数分别为：组别G4：3.0×106/g，G5：2.8×106/g，G7：3.5×106/g。而CD56和CD29双阳占比三组别基本与G6组一致，按照总单细胞数与流式占比计算，四组分别可获得最大肌肉干细胞的数量为：G4：7.5×105/g，G5：7×105/g，G6：15×105/g，G7：8.7×105/g。故应用本发明可以获得的总单细胞群数最多，获得的肌肉干细胞总量最多。
(7)获得的单细胞群纯化培养
将剩余的(5)所获得的单细胞群悬液按5g肌肉所获得的细胞/孔量分别接种于六孔板中，静置1.5h，随后取上清接种于铺有matrigel的六孔板中，补足生长培养基总体积3mL/孔，此时贴壁的细胞为肌肉干细胞。
实施例3：各组肌肉干细胞Pax7、MyoD表达鉴定
实施例2中步骤(7)差速纯化后获取的细胞悬液(G4-G7)，取5000个细胞接种于96孔板中，细胞贴壁48h后进行Pax7，MyoD检测。另取10000个细胞接种于96孔板中，培养基为完全培养基，配方如下：含有15％FBS、10ng/mLbFGF、1％AA和1％GEN的DMEM培养基。
1)用50μL4％多聚甲醛(4℃预冷)固定，室温下通透15min后除去多聚甲醛，用PBS缓冲液小心清洗3次；
2)加入50μL 0.5％TritonX-100处理15min后，去除溶液，用PBS缓冲液小心清洗3次，；
3)加封闭液，室温孵育30min；去除溶液，用PBS缓冲液小心清洗3次；
4)分别加入在1％BSA的PBS中稀释的Pax7或MyoD抗体(1:100)，用锡箔纸包被后4℃孵育过夜；
5)过夜处理后，放至室温1h后，用PBS清洗3次，每次5min。加入在1％BSA的PBS溶液中1:200稀释的荧光标记的二抗，用锡箔纸包住后，37℃孵育1-1.5h(此后操作均注意避光)。
6)用PBS洗三次，加入50μL的20μM DAPI，室温避光孵育10min，用PBS洗三次，每次5min，加入抗淬灭封片剂。在荧光显微镜下观察拍照，各组Pax7和MyoD表达情况如图7和图8所示。
应用本发明方法获取的肌肉干细胞，G6组别经过48h培养后，肌肉干细胞标志物Pax7表达占比60％左右，在所有组别中占比最高。激活标志物MyoD表达高于90％以上。
实施例4：各组肌肉干细胞诱导分化
实施例2步骤(7)差速纯化后获取的各组肌肉干细胞(G4-G7)在matrigel预处理的细胞培养板培养3-5天，培养基为完全培养基(含有15％FBS、10ng/mLbFGF、1％AA和1％GEN的DMEM培养基)。细胞达到95％密度时，进行诱导分化实验。将其用37℃预热的PBS清洗一次，加入分化培养基(97％DMEM培养基、2％马血清和1％AA)。在37℃培养3-4天后，在显微镜下观察，出现大量细胞融合的肌管则为分化完全。分化结束后进行MyHC检测。
1)用50μL4％多聚甲醛(4℃预冷)固定，室温下通透15min后除去多聚甲醛，用PBS缓冲液小心清洗3次；
2)加入50μL 0.5％TritonX-100处理15min后，去除溶液，用PBS缓冲液小心清洗3次，；
3)加封闭液，室温孵育30min；去除溶液，用PBS缓冲液小心清洗3次；
4)分别加入在1％BSA的PBS中稀释的MyHC抗体(1:100)，用锡箔纸包被后4℃孵育过夜；
5)过夜处理后，放至室温1h后，用PBS清洗3次，每次5min。加入在1％BSA的PBS溶液中1:200稀释的荧光标记的二抗，用锡箔纸包住后，37℃孵育1-1.5h(此后操作均注意避光)。
6)用PBS洗三次，加入50μL的20μM DAPI，室温避光孵育10min，用PBS洗三次，每次5min，加入抗淬灭封片剂。在荧光显微镜下观察拍照，各组MyHC表达情况如图9所示。
应用本发明方法获取的肌肉干细胞，经过诱导分化后，分化率高达90％以上。而G4、G5、G7组别的分化率大约为85-90％，分化率相比于G6组别较低。
对比例1：
通过本发明所使用的酶组合(链霉蛋白酶和分散酶)消化肌肉组织释放肌肉干细胞，使用差速贴壁法和流式分选分别纯化所获得得肌肉干细胞群。差速贴壁法每个肌肉组织大约可以获得8-15×105个肌肉干细胞，本研究采用流式分选每克肌肉可以获得5-8×105个肌肉干细胞。
差速贴壁法：所获得的单细胞群悬液按5g肌肉获得细胞/孔量分别接种于六孔板中，静置1.5h，随后取上清接种于铺有matrigel的六孔板中，此时贴壁的细胞为肌肉干细胞。
流式分选法：将获取的单细胞群重悬于完全培养基中，用抗体组合FITC-CD31(1:20)，FITC-CD45(1:20)，PE-CD56(1:40)，APC-CD29(1:40)染色，冰上孵育30-45min；所述抗体的分选策略为先选取CD31，CD45的阴性细胞，再选取CD56和CD29的阳性细胞，即为猪的肌肉干细胞。
如图10所示，将两种纯化方式所获取的细胞进行体外培养后，第一代细胞消化进行流式抗体CD29，CD56孵育，进行流式分析，发现两者细胞CD29，CD56双阳占比都大约为80-85％，两者相差不大，且对培养后细胞进行Pax7，MyoD免疫荧光分析(图11)，发现第一代细胞两者Pax7比例分别为67.3％和64％，MyoD占比分别为98％和100％，两者Pax7，MyoD表达比例也相差不大，鉴于流式分析耗时较长，成本较高，且经过长时间流式分选获取的肌肉干细胞生长速度较慢，相对于贴壁差速法，细胞展开速度较慢。故采取差速贴壁法可以较快较低成本的获得肌肉干细胞。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种低成本消化肌肉组织的复合酶制剂，其特征在于，所述复合酶制剂包括链霉蛋白酶、胰酶、分散酶和胶原酶D中的一种或两种。
2.根据权利要求1的复合酶制剂，其特征在于，所述复合酶制剂为链霉蛋白酶，或链霉蛋白酶和胰酶，或链霉蛋白酶和分散酶，或链霉蛋白酶和胶原酶D。
3.根据权利要求2的复合酶制剂，其特征在于，所述复合酶制剂为链霉蛋白酶和分散酶。
4.根据权利要求1～3任一所述复合酶制剂，其特征在于，链霉蛋白酶的工作浓度为0.8～1.2mg/mL，胰酶的工作浓度为0.1～0.5％，分散酶的工作浓度为0.8～1.2mg/mL，胶原酶的工作浓度为0.8～1.2mg/mL。
5.一种低成本、高效率分离肌肉干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将猪肌肉组织剪碎后置于含有复合酶制剂的基础培养基中孵育消化；
将消化得到的细胞接种于培养皿静置1～2h后，将上清接种于铺有基底胶的培养皿中培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：
S1：选取幼猪，处死，在无菌环境下将猪解剖，除菌处理获得猪肌肉组织；
S2：将S1获得的猪肌肉组织切碎，去除脂肪和结缔组织，得到碎肌肉组织；
S3：将S2获得的碎肌肉组织置于含有抗生素和权利要求1～4任一所述复合酶制剂的DMEM培养液中孵育消化，直到达到消化终点获得消化混合物；
S4：向S3获得的消化混合物加入含有2％胎牛血清的PBS缓冲液，混合均匀，得到含有肌肉干细胞的单核细胞群悬浮液；
S5：将S4所述悬浮液过滤，离心收集沉淀；将细胞重悬，并再次通过滤网过滤，离心，弃去上清获得细胞沉淀；
S6：向S5获得的细胞沉淀中加入红细胞裂解液，混匀并冰浴，加入含有2％胎牛血清的PBS缓冲液，离心，弃去上清获得单细胞沉淀；用生长培养基重悬沉淀，获得单细胞群悬液；
S7：将S6获得的单细胞群悬液接种于培养皿静置1～2h后，将上清接种于铺有基底胶的培养皿中培养，贴壁细胞即为猪肌肉干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S3所述碎肌肉和复合酶制剂的质量体积比例为1:4-1:6。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S6所述的生长培养基为含有15％胎牛血清和1％青霉素-链霉素-两性霉素B三抗溶液的DMEM培养基。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S7中所述的培养皿中含有2-4mL的生长培养基。
10.权利要求1～4任一所述复合酶制剂和权利要求5～9任一方法在培养肉领域中的应用。
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