CN102140438A - 猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪骨骼肌卫星细胞(Skeletal Muscle Satellite Cell，SMSC)体外培养方法，包括以下步骤：样品采集；培养皿的预处理；骨骼肌纤维的移植；单根肌纤维的移除；SMSC的传代培养；SMSC的鉴定；SMSC纯度检测；建立了一种简单易行、高纯度的猪SMSC体外培养方法，为SMSC介导的基因转移，肌肉组织再生和发育机理研究提供材料，同时为骨骼肌单根肌纤维或SMSC移植治疗肌相关疾病奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种猪骨骼肌卫星细胞(Skeletal Muscle Satellite Cell，SMSC)体外培养方法。
背景技术
骨骼肌卫星细胞(Skeletal Muscle Satellite Cell，SMSC)体外培养，目前主要在小鼠、大鼠、兔等上进行。猪在解剖结构，器官大小和生命周期与人类高度相似，是最接近人类的模式动物，对其研究越来越受到广大学者的青睐。猪SMSC分离培养方法多采用胰酶、胶原酶分步或者链酶蛋白酶一步消化，这些方法分离培养的SMSC主要是增殖能力低下的成肌细胞和非成肌细胞(成纤维细胞)，纯度低，不能满足SMSC介导的基因转移，阻碍了对肌肉组织再生和发育机理的研究，同时也无法满足细胞移植治疗肌相关疾病的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立简单易行、高纯度的猪SMSC体外培养方法，为SMSC介导的基因转移，肌肉组织再生和发育机理研究提供材料，同时为骨骼肌单根肌纤维或SMSC移植治疗肌相关疾病奠定基础。
采用如下技术方案：
一种猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，包括以下步骤：
(1)样品采集
用含0.5％的新洁尔灭清洗大白猪0.5h，电击处死；然后在无菌操作台上，在肌肉组织两端肌腱上操作，小心、完整剥离趾长伸肌，进一步剥离为四小块，以利于酶充分消化；
(2)培养皿的预处理
用基质胶涂布培养板，并将其置于37℃、5％CO2培养箱中4h以上；临用时，紫外灯照射30min后，用PBS洗涤备用；
(3)骨骼肌纤维的移植
将采集的趾长伸肌样品用PBS清洗2遍，加入等体积的Ⅰ型胶原酶，放入37℃水浴锅预消化60-90min后，转移至用马血清涂渍的玻璃皿中，用广口巴斯德吸管充分吹打，若吹打不开，则继续返回消化，直至有大量的单根肌纤维游离出来，选择完整未受损且呈光亮的单根肌纤维，用细口弯头吸管移入培养皿中清洗3次，以1根/孔的密度接种于24孔板中央，5min后，加入培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养，重复以上步骤，直至获得足够量的单根肌纤维为止；
(4)单根肌纤维的移除
培养3d后，用细口巴斯德吸管小心的将单根肌纤维吸出，以去除视野中的杂质；
(5)SMSC的传代培养
当细胞密度达到70％左右时，用0.25％的胰酶于37℃，5％CO2的培养箱中消化5min，然后用等体积的培养基终止消化，1500g离心7min，弃去上清液，重悬，红细胞计数器计数后，重新接种培养；
(6)SMSC的鉴定；
(7)SMSC纯度检测；
其中所用培养基采用如下培养基：
NaHCO3：2.3g/L
HEPES：2.6g/L
Gibco胎牛血清：20％(体积百分比)
Gibco马血清：10％(体积百分比)
鸡胚提取物：1％
青霉素：5×104U/L
连霉素：5×104U/L
三蒸水：80％(体积百分比)
PH：7.2-7.4。
建立一种简单易行、高纯度的猪SMSC体外培养方法，为SMSC介导的基因转移，肌肉组织再生和发育机理研究提供材料，同时为骨骼肌单根肌纤维或SMSC移植治疗肌相关疾病奠定基础。
附图说明
图1 SMSC的形态学变化；A：将分离得到的单根肌纤维置于培养基中培养48h，倒置显微镜下观察，肌纤维上有许多凸起，同时有少量的细胞从肌纤维上迁移出来。B：培养72h后，可见有细胞从单根肌纤维上迁出，逐渐开始贴壁，并由圆形变为梭形或纺锤形。C：连续培养4d，移除单根肌纤维后的细胞。D：传代培养2d的细胞，可见细胞密度适中且分布均一。
图2 细胞免疫荧光检测SMSC早期特异表达的标记蛋白(Pax7)及成肌标记蛋白(MyoD、Myogenin)；A、B和C：Pax7呈阳性表达；D、E和F：MyoD呈阳性表达；G、H和I：Myogenin免疫染色呈阳性，且仅表达于细胞核。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
1、实验动物
1-3日龄的健康大白猪，由西北农林科技大学畜禽生态养殖场提供。
2、样品采集
用含0.5％的新洁尔灭清洗大白猪0.5h，电击处死。然后在无菌操作台上，在两端肌腱上操作，小心、完整剥离趾长伸肌(Extensor Digitorum Longus，EDL)，同时根据其特殊的组成机构，由肌腱处，进一步剥离为四小块，以利于酶充分消化。
3、培养皿的预处理
用基质胶涂布培养板，并将其置于37℃、5％CO2培养箱中4h以上。临用时，紫外灯照射30min后，用PBS洗涤备用。
4、骨骼肌纤维的移植
将采集的EDL样品用PBS清洗2遍，加入等体积的Ⅰ型胶原酶，放入37℃水浴锅预消化60-90min后，转移至用马血清涂渍的玻璃皿中，用广口巴斯德吸管充分吹打，若吹打不开，则继续返回消化，直至有大量的单根肌纤维游离出来，选择完整未受损且呈光亮的单根肌纤维，最好是有时候还能观察到其跳动，用细口弯头吸管移入培养皿中清洗3次，以1根/孔的密度接种于24孔板中央，5min后，加入培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养，重复以上步骤，直至获得足够量的单根肌纤维为止(图1A和1B)。
5、单根肌纤维的移除
培养3d后，用细口巴斯德吸管小心的将单根肌纤维吸出，以去除视野中的杂质(图1C)。
6、SMSC的传代培养
当细胞密度达到70％左右时，用0.25％的胰酶于37℃，5％CO2的培养箱中消化5min，然后用等体积的培养基终止消化，1500g离心7min，弃去上清液，重悬，红细胞计数器计数后，重新接种培养(图1D)。
7、SMSC的鉴定
为确定分离得到的细胞SMSC，对其早期特异性表达的Pax7进行免疫荧光染色，结果显示：Pax7呈阳性表达(图2A)，且与蓝色的Hochest细胞核染(图2B)叠加后，完全重叠(图2C)，表明分离的细胞为SMSC。对培养4d的SMSC免疫荧光染色结果显示，MyoD呈阳性表达(图2D、2E和2F)，且表达于有丝分裂细胞的胞质中。继续培养至第6d时，Myogenin免疫染色也呈阳性，但是仅表达于细胞核(图2G、2H和2I)。结果表明分离得到的细胞确实为SMSC，且具有成肌分化特性。
8、SMSC纯度检测
通过计算Pax7呈阳性表达的细胞数(图2A)与核染数(总细胞数)(图2B)的比值计算SMSC的纯度，结果得出，分离得到的SMSC纯度为90％以上(图2C)。
上述各培养基成分如下：
NaHCO3：2.3g/L
HEPES：2.6g/L
Gibco胎牛血清：20％(体积百分比)
Gibco马血清：10％(体积百分比)
鸡胚提取物：1％
青霉素：5×104U/L
连霉素：5×104U/L
三蒸水：80％(体积百分比)
PH：7.2-7.4
采用本发明的方法，首先，通过肌腱继续将EDL剥离为四小块，解决了大动物整块完整的肌肉组织消化难的问题，同时满足了单根肌纤维的培养要求；其次，由于猪的年龄，品种等差异，消化时间难于抓握，所以选择了消化强度柔和的Ⅰ型胶原酶消化，同时提前取出吹打并观察，保证消化时间的最优化；最后，由于SMSC的培养是一个高耗能的过程，所以我们在培养基的配备中，选择了优质的，高浓度的胎牛血清，并添加了鸡胚提取物或FGF，以使其快速分裂增殖。
由于在消化，吹打过程中，难免会将附着于单根肌纤维的SMSC消化下来，所以在挑取完足够量的单根肌纤维后，还可以将其余的肌肉组织用等体积的培养基终止消化，而后用400目，200目筛网过滤，离心，重悬后接种培养SMSC。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种猪骨骼肌卫星细胞体外培养方法，包括以下步骤：
(1)样品采集
用含0.5％的新洁尔灭清洗大白猪0.5h，电击处死；然后在无菌操作台上，在两端肌腱上操作，小心、完整剥离趾长伸肌，进一步剥离为四小块，以利于酶充分消化；
(2)培养皿的预处理
用基质胶涂布培养板，并将其置于37℃、5％CO2培养箱中4h以上；临用时，紫外灯照射30min后，用PBS洗涤备用；
(3)骨骼肌纤维的移植
将采集的趾长伸肌样品用PBS清洗2遍，加入等体积的Ⅰ型胶原酶，放入37℃水浴锅消化60-90min后，转移至用马血清涂渍的玻璃皿中，用广口巴斯德吸管充分吹打，若吹打不开，则继续返回消化，直至有大量的单根肌纤维游离出来，选择完整未受损且呈光亮的单根肌纤维，用细口弯头吸管移入培养皿中清洗3次，以1根/孔的密度接种于24孔板中央，5min后，加入培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养，重复以上步骤，直至获得足够量的单根肌纤维为止；
(4)单根肌纤维的移除
培养3d后，用细口巴斯德吸管小心的将单根肌纤维吸出，以去除视野中的杂质；
(5)SMSC的传代培养
当细胞密度达到70％左右时，用0.25％的胰酶于37℃，5％CO2的培养箱中消化5min，然后用等体积的培养基终止消化，1500g离心7min，弃去上清液，重悬，红细胞计数器计数后，重新接种培养；
(6)SMSC的鉴定；
(7)SMSC纯度检测；
其中所用培养基采用如下培养基：
NaHCO3：2.3g/L
HEPES：2.6g/L
Gibco胎牛血清：20％(体积百分比)
Gibco马血清：10％(体积百分比)
鸡胚提取物：1％
青霉素：5×104U/L
连霉素：5×104U/L
三蒸水：80％(体积百分比)
PH：7.2-7.4。
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