CN110760475A - 一种鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法。所述鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法包括以下步骤：采用SPF鸡，取其肌肉组织，加入含有I型胶原酶与胰酶比例为1－2:1的混合酶溶液，37℃下消化，再经两次30min的差速贴壁纯化后，得到目的细胞。该方法有效解决了现有技术中细胞活率低、分离数量少、可保存性差的缺陷和不足。

Description

一种鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法。
背景技术
国内外常用的静态肌肉卫星细胞的分离纯化往往需要使用昂贵的荧光激活细胞分选仪(FACS)或磁激活细胞分选仪(MACS)，操作复杂且代价较高[1]。而目前应用的简便实验室分离方法一般为组织贴壁法、两步消化法、单酶解法：1.组织贴壁法耗时长，所得细胞数少、活率较低已逐渐淘汰[2]；2.两步消化法常用两种酶分两步消化，耗时长、易污染、细胞活率低、贴壁性差(需提前包被明胶等促贴壁物质)、数量少[3-5]；3.单酶解法常只用胶原酶消化，获得细胞量少，消化不完全，有组织碎片残留，保存性差[6]。并且目前成功分离的细胞以鼠源为主，鸡源的基本没有具有很好分离效果的方法。现有技术中采用的诱导分化手段为采用马血清诱导分化，但马血清价格昂贵、常规试验室一般没有，且分化效果一般。
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发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种无特定病原体(Specific PathogenFree,SPF)鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法。该方法综合了松散肌肉纤维和游离纤维基质层细胞等原理，对提取细胞使用的酶、贴壁介质、纯化细胞的方法以及后续的细胞分化方法进行优化，最大限度地解决了现有技术中细胞活率低、分离数量少、可保存性差的缺陷和不足。消化后经简单两次30min左右的差速贴壁纯化，即可得到目的细胞，而以往纯化常要使用高通量仪器或者两到三次历经2-24h的差速贴壁去除杂细胞。并且在后续的诱导细胞分化中，本发明采用开创性地使用低浓度血清诱导分化，得到了很好的效果。
本发明的鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法，包括以下步骤：采用SPF鸡，取其肌肉组织，加入含有I型胶原酶与胰酶比例为1－2:1的混合酶溶液，37℃下消化，再经两次30min的差速贴壁纯化后，得到目的细胞。
所述混合酶溶液I型胶原酶与胰酶的比例优选2：1。混合酶溶液中还包括适量的EDTA和磷酸盐缓冲液。
本发明方法中，细胞贴壁纯化后，将培养液换成含4％胎牛血清的培养基，诱导分化。
一个具体的操作实例包括如下步骤：
1、分离细胞
(1)取鸡肌肉组织；
(2)用生理缓冲液冲洗肌肉组织并剪碎肌肉至肉糜状；
(3)将肉糜转移至离心管中静置5min，去除上清；
(4)加入组织块两倍体积的自制混合酶溶液，置37℃摇床中消化30min；
(5)消化完毕加入同等体积培养基终止消化；
(6)将消化液依次过100目和400目细胞过滤筛，得到细胞悬液；
(7)1500r，10min，离心，去除上清，得到细胞沉淀。
2、纯化细胞
(1)完全培养基重悬细胞沉淀，移入培养板中进行差速贴壁30min；
(2)取未贴壁细胞悬液移入新的培养板中二次差速贴壁，以此完成纯化。
3、诱导分化细胞：细胞贴壁后，将培养液换成含4％胎牛血清的培养基，诱导分化。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.本发明选用自主研制的混合酶的方法，缩短分离时间、减少污染以及对细胞的损伤，综合了松散肌肉纤维和游离纤维基质层细胞等原理，对提取细胞使用的酶、贴壁介质、纯化细胞的方法以及后续的细胞分化方法进行优化，最大限度地解决了现有技术中细胞活率低、分离数量少、可保存性差的缺陷和不足
2.该方法采用含4％胎牛血清的培养基诱导分化细胞，代替了传统的2％的马血清、1％-2％鸡胚提取物制成的培养基，降低了成本、更加简便快捷，提高了在普通实验室操作的可行性。
3.该方法选用DMEM-F12培养基，在F12培养基中加入青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)、胎牛血清(15％)配成完全培养基(pH7.6)的方法，该培养基比传统的DMEM培养基更适宜细胞生长。
4.该方法不需要用多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶原包被培养板，以此减少杂质污染、降低成本、减少实验前期准备时间，且细胞贴壁效果很好。
5.该方法比细胞分选仪法更加简便易行，且耗时短、价格低廉，不需要使用大型仪器设备，在普通实验室即可完成操作，并且稳定、高效；以该方法获得的鸡肌肉卫星细胞比传统实验室方法获得的细胞活力更高，数量更多、更易贴壁，可传代性更强，分化率更高，可用于药理及毒理试验并可在临床细胞移植中推广。
附图说明
图1：不同倍数显微镜下未分化细胞形态。
图2：不同时间诱导分化后细胞形态(X4)。
图3：特异标志蛋白Dismin免疫荧光染色(X10)。
图4：未分化细胞标志性基因Pax7 PCR产物电泳图。
图5：分化前后细胞静息标志基因Pax7表达量。
图6：分化后细胞分化标志性基因MyHC与分化中标志性基因MyOD1 PCR产物电泳图。
图7：分化前后细胞分化标志基因MyHC表达量。
图8：细胞活率对比。
图9：包被促贴壁物质诱导分化后(X4)。
图10：未包被促贴壁物质诱导分化后(X4)。
图11：传统诱导分化法诱导48h(X4)。
图12：低浓度血清诱导分化法诱导48h(X4)。
图13：传统慢速差速贴壁法(X10)。
图14：优化快速差速贴壁法(X10)。
图15：各比例混合酶分离后细胞活率。
图16：传统方法分离细胞复苏24h(X10)。
图17：优化方法分离细胞复苏24h(X10)。
具体实施方式
实施例一
(一)前期准备
12胚龄SPF鸡蛋(济南鑫盛达生物工程有限公司)、100目细胞过滤筛(biosharp)、400目细胞过滤筛(biosharp)、完全培养基、自制混合酶溶液、分化培养基
②完全培养基配方：DMEM-F12培养基(Gibco) 180ml
胎牛血清(Gibco) 30ml(即15％)
双抗 4ml(即2％)
③诱导分化培养基配方：DMEM-F12培养基(Gibco) 48ml
胎牛血清(Gibco) 2ml(即4％)
④双抗配方：青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)混合溶液
Figure BDA0002302451970000042
超纯水(DDW)1000ml
(二)操作过程
1、分离细胞
①取12胚龄SPF鸡蛋，酒精棉消毒大头，无菌镊子敲开取出鸡胚置于无菌操作台；
②酒精棉球擦拭腿部，消毒并去除表皮、被毛、血液；
③取髋关节以下腿部，去除筋膜、脂肪、骨等非肌肉组织；
④用PBS缓冲液冲洗肌肉组织，去除血块，并用弯头眼科剪剪碎肌肉至肉糜状；
⑤将肉糜转移至15ml离心管中，吹打，静置5min，去除上清(若剩余较多上清，可1500r，5min离心)；
⑥加入组织块两倍体积的自制混合酶溶液，置37℃恒温气浴摇床中消化30min，每隔10分钟上下颠倒一次；
⑦消化完毕后加入同等体积完全培养基终止消化；
⑧将消化液依次过100目和400目细胞过滤筛，得到细胞悬液；
⑨1500r，10min，离心，去除上清，得到细胞沉淀。
2、纯化细胞
①培养基重悬细胞沉淀，移入10cm培养板中，置于37℃培养箱中培养30min；
②取未贴壁细胞悬液移入新的10cm培养板中二次差速贴壁(同上)，以此去除成纤维细胞；
③48h后换液，去除培养基中组织碎片、死细胞以及不贴壁的红细胞，以此完成纯化。
3、诱导分化细胞
①细胞贴壁后，待细胞生长至70％密度，可进行诱导分化；
②弃老废培养基，用PBS缓冲液涮洗两遍；
③将培养液换成含诱导分化培养基
4、鉴定细胞
(1)细胞形态
①由图1可见，细胞生长旺盛、排列整齐、杂质较少(图1A)；靠近的细胞接触生长相互连接(图1B)；高倍镜下可明显观察到细胞在分化前呈梭形(图1C)。
②由图2可见，诱导分化后12h时细胞汇集成簇，相互连接(图2A)；24h时形成少量肌管(图2B)；48h时分化完成，肌管粗大、排列整齐(图2C)。
(2)免疫荧光鉴定细胞由图3可见，由特异标志蛋白Dismin免疫荧光染色蛋白抗体进行免疫荧光鉴定，DAPI染核定位细胞(图3A)，特异性标志蛋白--结蛋白(Dismin)抗体与细胞中蛋白结合良好，荧光强度强(图3B)，可以看出蛋白处于细胞质中，符合卫星细胞特性(图3C)。
(3)RT-PCR鉴定细胞
①由图4可见，静息状态下的细胞在155bp左右处有一清晰明显的条带条；
②由图5可见，静息标志基因Pax7在分化前与分化中的表达量呈显著性差异；
③由图6可见，分化标志性基因MyHC与分化中标志性基因MyOD1电泳条带清晰明显；
④由图可见，分化标志性基因MyHC在分化前后中的表达量呈极显著差异。
(三)优化对比实验
1、细胞活率对比
根据当前的现有技术，国内外文献参考。两步消化法是传统分离方法中最优、最多人选用的，因此我们将其与本发明混合酶分离法进行对比(两步消化法步骤具体参照Yang J等人的方法[5])。
为了避免鸡胚批次、实验操作、分离环境的不同，我们采用同一批次SPF鸡胚，并且同时进行。除了使用的消化酶不同，其他材料、试剂均相同。实验步骤同上。
采用实验室常规传统测定细胞活率的台盼蓝法，测定细胞活率。(以下数据为四次分离试验中，各测定两次的值)
(1)操作过程
将分离纯化培养24h贴壁后的细胞消化下来，离心重悬后，吸取少量细胞悬液与台盼蓝以9：1进行混合，在3min内用细胞计数板分别计算染色与未染色细胞数(染色即为已死细胞)。
(2)实验结果
表1.混合酶消化法
Figure BDA0002302451970000061
细胞活率＝未染色细胞数/细胞总数×100％
由表1根据公式得出平均值为88.08％。
表2.传统两步消化法
Figure BDA0002302451970000062
细胞活率＝未染色细胞数/细胞总数×100％
由表2根据公式得出平均值为78.57％。
根据表1、表2可以计算出两种消化方法得到的活率分别为88.08％和78.57％，呈现差异极显著(P＜0.05)；由图8可见，混合酶消化法的细胞活率显著提高。
2、细胞贴壁介质
由于传统方法所得细胞活率低，因此需要将培养板/瓶事先包被促贴壁物质，例如：多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶原等。这既耗时又耗材，且由于事先包被了物质，因此使得细胞中存在杂质，一定程度上影响了后续的实验进行。
本方法首次摒弃了包被这一环节，将细胞直接铺布于细胞瓶中，细胞在12h后贴壁生长，且生长状况良好。
由图9可见，包被过促贴壁物质的细胞在诱导分化汇聚成簇时，出现大量黑团杂质；
由图10可见，未包被促贴壁物质的细胞子诱导分化汇聚成簇时，仅有少量杂质。
3、诱导分化培养基的优化
传统诱导分化培养基采用的是含2％马血清与1％-2％鸡胚提取物的培养基进行诱导分化，但是一般常规实验室没有马血清，且鸡胚提取物没有商品化的销售渠道，只能自行制备，且其保存性不佳，这给诱导分化带来了很大的困难。
本方法根据根据肌肉卫星细胞在非事宜环境下会自我更新分化这一特性，采用了低浓度血清诱导分化这一方法，采用含4％胎牛血清的培养基进行诱导分化，分化效果良好、且更加简便、价格低廉。
由图11、12对比可见，优化后的诱导分化培养基分化效果良好。
4、纯化细胞方法的优化
目前纯化细胞的方法分为两种，一是使用高通量细胞分选仪器进行精密的分选，该方法得到的细胞纯度高，但是需要昂贵的仪器，且分选前还要进行繁琐的细胞标记处理，因此不适于实验室中高效快速的分离；二是传统差速贴壁法，该法根据肌肉卫星细胞首次贴壁需要12h这一特性，慢速差速贴壁，一般需要进行一次1.5h和一次12h的两次更换培养皿。
本方法反其道而行之，根据成纤维细胞在30min左右就能贴壁这一特性，采用快速连续差速贴壁，也就是连续两次30min的更换培养皿，这一改进大大减小了纯化细胞的时间和工作量，且纯化效果良好。
由图13、14可见，优化后的纯法方法在快速的前提下依旧能够保证细胞纯化的效果。
5、混合酶溶液筛选试验
本方法综合了松散肌肉纤维和游离纤维基质层细胞等原理分离细胞，因此我们采用Ⅰ型胶原酶和胰酶制备混合酶溶液。
根据本实验室前期摸索的常用Ⅰ型胶原酶(0.1％，即15mgⅠ型胶原酶)与胰酶(0.25％，即25mg胰酶配比2mgEDTA)的工作浓度，我们将其分为三个组别用同一批SPF鸡胚同时取材，用台盼蓝筛选出最适浓度。
(1)I型胶原酶：胰酶＝1:1
Figure BDA0002302451970000081
②实验操作方法同活率对比试验
③实验结果见表3
表3.混合消化酶1:1细胞活率
Figure BDA0002302451970000082
(2)I型胶原酶：胰酶＝1:2(考虑经济耗材因素，采取I型胶原酶减半量)
Figure BDA0002302451970000083
②实验操作方法同活率对比试验
③实验结果见表4
表4.混合消化酶1:2细胞活率
Figure BDA0002302451970000084
(3)I型胶原酶：胰酶＝2:1(考虑经济耗材因素，采取胰酶减半量)
Figure BDA0002302451970000085
Figure BDA0002302451970000091
②实验操作方法同活率对比试验
③实验结果见表5
表5.混合酶2:1细胞活率
Figure BDA0002302451970000092
(4)结论
由表3、4、5以及图15可见，三种比例混合酶中I型胶原酶与胰酶为1:1与2:1两种比例没有差异，而其与1:2比例呈差异极显著(P＜0.05)。
综合材料消耗以及经济方面，选用2:1比例的混合酶作为最优。
6、保存性对比实验
我们将传统分离方法与混合酶分离法分离所得细胞采用传统DMSO方法冻存细胞，保存两个月后复苏、对比。
由图16、17可见，优化方法分离的细胞冻存复苏后，活率明显高于传统的方法。

Claims (4)

1.一种鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：采用SPF鸡，取其肌肉组织，加入含有I型胶原酶与胰酶比例为1－2:1的混合酶溶液，37℃下消化，再经两次30min的差速贴壁纯化后，得到目的细胞。
2.根据权利要求1所述鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法，其特征在于，I型胶原酶与胰酶的比例为2：1。
3.根据权利要求1所述鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法，其特征在于，混合酶溶液中还包括适量的EDTA和磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述鸡肌肉卫星细胞的分离培养方法，其特征在于，细胞贴壁纯化后，将培养液换成含4％胎牛血清的培养基，诱导分化。
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