CN105543164A - 一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法：将泌乳期奶牛的乳腺组织剪切成组织块后用胶原酶/透明质酸酶消化液消化，将消化后呈乳糜状的组织块接种在培养皿进行培养，1～2天后组织块周围即有细胞游离出组织并贴壁生长，之后培养期间，每天采用机械刮除法去除梭形样成纤维细胞，直至大约4～5天后大量铺路石样乳腺上皮细胞成簇成片生长并互相融合时进行首次传代。首次传代时利用差速消化法使用胰蛋白酶消除可能混杂的极少量成纤细胞，即得到纯度很高的奶牛乳腺上皮细胞。本方法中乳腺上皮细胞可以在短时间从乳糜状组织中迁出；并且主要采用机械刮除法去除少量混杂的成纤维细胞污染，因此获得的乳腺上皮细胞损伤小、纯度高。

Description

一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种快速分离奶牛乳腺上皮细胞的方法。
背景技术
奶牛乳腺炎是对奶牛养殖业危害最大、最常见的疾病之一。奶牛乳腺炎所带来的危害引导着国内外学者对乳腺炎从病因、发病机理、诊断、治疗以及预防等多角度、多方面进行了深入的研究，而对乳腺炎的研究最为常用的就是建立体外乳腺上皮细胞感染的乳腺炎细胞模型。此外，乳腺上皮细胞被公认为是制作乳腺生物反应器的靶细胞，即利用体外培养的乳腺上皮细胞，基于转基因技术平台使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品，如小分子多肽或蛋白质。另外，乳腺上皮细胞也是从细胞水平研究乳蛋白表达、奶牛乳腺发育和泌乳机制以及作为抗病转基因奶牛育种供体细胞的有利工具。
从1957年Lasfargures利用胶原酶消化法第一次实现乳腺上皮细胞的直接培养开始(LasfarguesEY.Cultivationandbehaviorinvitroofthenormalmammaryepitheliumoftheadultmouse[J].TheAnatomicalRecord,1957,127(1):117-129.)，对奶牛乳腺上皮分离培养的研究和探索已经有半个多世纪的历史。目前对奶牛乳腺上皮分离的方法有酶消化法、组织块培养法、机械破碎法和乳汁分离法等。酶消化法是通过胶原酶、透明质酸酶或者胰蛋白酶等作用于剪成碎块的组织，获得分散的细胞后经离心、洗涤等步骤接种培养，此方法对于酶的选择及消化时间比较难于掌握，消化不足则不易获得可用于足以扩大再培养的细胞数量，消化过度会导致细胞的损伤。组织块培养法是将乳腺组织剪成1mm3左右小块直接接种于培养皿，加入培养基培养直到乳腺上皮从组织块周围迁出生长，该方法最大的不足是耗时长，一般1周或者是更长时间才有细胞迁出，而且往往是成纤维细胞最先迁出生长，需要传代数代以后才有可能获得相对较纯的乳腺上皮细胞，传代次数的过多极易导致乳腺上皮细胞的老化。机械破碎法就是通过物理学处理手段，将组织块解离成分散的细胞后用滤网过滤，离心弃去上清液，用培养液悬浮后接种培养，单一使用该方法对乳腺上皮细胞这种分化程度较高的细胞易造成伤害，细胞的存活率相对较低。乳汁分离法是采用离心法收集乳汁后从中提取乳腺上皮细胞，经过体外诱导培养获得乳腺上皮细胞，该方法分离的乳腺上皮细胞虽然没有成纤维细胞的污染，但是因为乳汁中乳腺上皮细胞含量少，且为自然脱落的细胞，组胞活性差，很难维持生长。
除对奶牛乳腺上皮细胞进行原代分离培养外，研究者们还在努力建立永生化的奶牛乳腺上皮细胞系。1991年加拿大的Huynh等利用SV40大T抗原基因转染奶牛原代乳腺上皮细胞，建立了永生化的奶牛乳腺上皮MAC-T细胞系(HuynhHT,RobitailleG,TurnerJD.Establishmentofbovinemammaryepithelialcells(MAC-T):aninvitromodelforbovinelactation[J].Experimentalcellresearch,1991,197(2):191-199.)。之后，在1995年Huynh等(HuynhH,PollakM.HH2A,animmortalizedbovinemammaryepithelialcellline,expressesthegeneencodingmammaryderivedgrowthinhibitor(MDGI)[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Animal,1995,31(1):25-29.)和1996年zavizion等(ZavizionB,vanDuffelenM,SchaefferW,etal.Establishmentandcharacterizationofabovinemammaryepithelialcelllinewithuniqueproperties[J].InVitroCellular&DevelopmentalBiology-Animal,1996,32(3):138-148.)相继建立了H2A和BME-UV等永化生细胞系。这些永化生的细胞系虽然保持着部分与起源细胞相似的生物学特性和功能，但在使用的过程中出现了形态上的分化或没有腺上皮的典型特点，有的尚未得到其它实验室的检验，而且只是用于实验室之间的交流使用，到目前为止尚没有商品化的奶牛乳腺上皮细胞系可为研究人员使用。
综上所述，由于无商品化的奶牛永生化细胞系，以及其在使用过程中性状和功能的不确定性，而原代细胞系更能代表体内器官的功能特性，再加上一般体外培养的奶牛乳腺上皮细胞可以稳定培养数月，能满足细胞实验的基本要求。因此，目前大多数实验室首选分离奶牛原代乳腺上皮细胞进行研究，因此，对乳腺上皮分离培养的方法不断完善显得尤其重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有奶牛乳腺上皮细胞分离培养技术的不足，提供一种快速分离高纯度原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1)将奶牛乳腺组织剪切成0.5～1mm3大小的组织块，将所述组织块用磷酸盐缓冲液清洗后置于胶原酶/透明质酸酶消化液中消化30～40分钟；
2)经过步骤1)后，通过离心收集消化成乳糜状的组织块，将消化成乳糜状的组织块接种在培养皿中，并向培养皿中加入细胞培养液，然后于37℃进行培养；培养1～2天后，开始每天机械刮除从消化成乳糜状的组织块迁出生长的成纤维细胞，保留同样迁出生长的乳腺上皮细胞，并且每隔1～2天更换细胞培养液1次，直到培养至5～7天时机械刮除所述培养皿中所有残余组织块，然后弃掉细胞培养液，并用磷酸盐缓冲液冲洗；
3)经过步骤2)后，向所述培养皿中加入胰蛋白酶消化液进行短时消化，短时消化过程中每隔1～2分钟进行观察，待乳腺上皮细胞簇最外层的细胞开始变圆时弃掉胰蛋白酶消化液，并用磷酸盐缓冲液冲洗，然后(短时消化后)向所述培养皿中再次加入胰蛋白酶消化液并进行传代。
优选地，所述步骤1)中，奶牛乳腺组织的获取方法包括以下步骤：无菌采集泌乳期奶牛乳腺组织，经表面消毒处理后在不含脂肪组织、结缔组织少且富含乳腺小叶的部位切取一部分乳腺组织。
优选地，所述表面消毒处理包括以下步骤：将奶牛乳腺组织用75％酒精冲洗30～40秒后，再用含抗生素的磷酸盐缓冲液冲洗3～5次。
优选地，所述胶原酶/透明质酸酶消化液按照每毫升DMEM/F12培养液中加入0.5～1.5mg胶原酶、200～300μg透明质酸酶、100IU青霉素、100μg链霉素和0.2～0.5μg两性霉素B进行配制。
优选地，所述步骤1)中，胶原酶/透明质酸酶消化液的用量为每1克剪切成0.5～1mm3大小的组织块使用2～4毫升。
优选地，所述细胞培养液为含有体积分数为10～20％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.2～0.5μg/mL两性霉素B的DMEM/F12培养液。
优选地，所述步骤2)中，细胞培养液的用量为每1克剪切成0.5～1mm3大小的组织块对应使用2～3毫升。
优选地，所述胰蛋白酶消化液按照每100毫升磷酸盐缓冲液中加入0.2～0.5g胰蛋白酶进行配制。
优选地，所述步骤3)中，培养皿中胰蛋白酶消化液的加入量均为每1克剪切成0.5～1mm3大小的组织块对应加入1～2毫升。
优选地，所述短时消化的时间为小于3分钟。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将乳腺组织块经酶消化液预处理消化成乳糜状小块。这种处理可以初步消化乳腺小叶间的结缔组织以及细胞间连接蛋白，松散组织，以利于乳腺上皮细胞从组织块迁出生长(消化时间过长会使组织块过度消化，时间过短则不利于组织块贴壁后细胞的快速迁出)，与传统的组织块培养法相比，大大缩短了细胞从组织块迁出的时间，本发明一般在接种1～2天后上皮细胞即可迁出生长，而传统的组织块培养法往往需要1周或者更长的时间，而且往往成纤维细胞先迁出，上皮细胞则需要更长的时间，这样就容易导致分离得到的乳腺上皮细胞活性低，后续培养容易发生老化。
(2)本发明未采用胶原酶或透明质酸酶消化后的单个细胞进行培养，而是采用初步消化后的乳糜状组织块贴壁法进行分离乳腺上皮细胞，发现本发明方法从组织块迁出的细胞绝大多数为乳腺上皮细胞，而且成簇成片生长，与少数的成纤维细胞生长区域存在明显的界限，采用机械刮除法很容易去除成纤维细胞，而现有胶原酶或透明质酸酶消化法收集单个分散的细胞进行培养时，成纤维细胞和乳腺上皮细胞混杂生长，不易去除成纤维细胞。
(3)本发明在首次传代前采用多次机械刮除法去除少量成纤维细胞污染，仅在首次传代时利用1次差速胰蛋白酶消化法去除可能混有的极少量成纤维细胞，期间减少了因胰蛋白酶多次处理而可能导致的乳腺上皮细胞老化，因此本发明采用多次机械刮除法结合1次胰酶差速消化法分离到乳腺上皮细胞比传统的多次利用差速消化法，可分离到纯度更高、活性更好的乳腺上皮细胞。
(4)采用本发明方法获得的乳腺上皮细胞具有旺盛的增殖能力，可用于研究乳蛋白表达、奶牛乳腺发育及奶牛泌乳机制细胞水平的研究，也可作为制作乳腺生物反应器的靶细胞和抗病转基因奶牛育种核移植的供体细胞。
附图说明
图1为乳糜状组织块接种到直径为60mm培养皿后的示意图。
图2相差显微镜下观察结果；A：组织块接种培养皿培养1-2天后细胞从组织迁出的代表性图片；B：在上皮细胞簇(团)周围可见少数成纤维细胞，利用机械刮除法可去除；C：首次传代以前，上皮细胞不断增殖，上皮细胞团不断扩大过程中的代表性图；D：首次传代后培养1至2天，上皮细胞生长状态良好，呈铺路石样生长，图示为代表性图片。
图3为乳腺上皮细胞经红色荧光素PE标记的荧光抗体角蛋白或波形蛋白免疫荧光染色结果(其中细胞核经DAPI染料进行染色，以成纤维细胞作为对照组)；A：乳腺上皮细胞角蛋白阳性；B：乳腺上皮细胞波形蛋白阴性；C：成纤维细胞角蛋白阴性；D：成纤维细胞波形蛋白阳性。注：细胞核为蓝色荧光，目的蛋白为红色荧光。
具体实施方式
为了使本发明的目的和技术方案更加完整和清楚，以下结合附图及实施例，对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的实施例仅用以解释本发明，但不用于限定本发明。
(1.1)组织消化液(胶原酶/透明质酸酶消化液)配制
按照每毫升DMEM/F12培养液中加入1mg胶原酶(0.25～1.0FALGPAUnits/mg)，250μg透明质酸酶(400～1000Unit/mg)，100IU青霉素、100μg链霉素和0.25μg两性霉素B进行配制，过滤除菌后于-20℃保存，使用前解冻并在水浴锅预热至37℃。
(1.2)细胞培养液
含有体积百分比为10％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B的DMEM/F12培养液。特别说明：未加入表皮细胞生长因子、氢化可的松、催乳素等文献报道培养奶牛乳腺上皮细胞时在培养液中的额外添加物。
(1.3)胰蛋白酶消化液
按照100毫升磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffersolution，PBS，下文除特别限定说明，均与此处含义相同)中加入0.25g胰蛋白酶配制而成，过滤除菌，置于4℃备用。
(2)乳腺组织取材及预处理
2.1由屠宰场无菌采集因骨折而淘汰的泌乳期奶牛乳腺组织(以获取活性高的乳腺上皮细胞)，置于所述细胞培养液中，4℃低温保存，迅速带回实验室。
2.2为避免组织可能的污染，在无菌工作台中，用75％酒精冲洗乳腺组织30～40秒，然后用含有100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.25μg/mL两性霉素B的PBS冲洗组织3～5次，选取不含脂肪组织、结缔组织少且富含乳腺小叶的部位切取一部分乳腺组织，用眼科剪刀剪切为大约1mm3的组织碎块，并且在剪切过程中，尽量剔除结缔组织。最后PBS冲洗组织碎块，直至PBS清亮无乳汁为止。
(3)原代培养
将共计约1克组织块悬浮于含有2毫升组织消化液的60mm培养皿中，在含5％的CO2细胞培养箱中37℃消化30分钟，消化结束后，离心弃掉消化液，收集经粗略消化后的乳糜状组织块，用PBS洗涤后将组织块以1cm横向纵向间隔依次接种于60mm培养皿(图1)中，倒置于含5％CO2的细胞培养箱中，于37℃略干燥2～3分钟，待组织块贴壁后翻转培养皿并缓慢加入3毫升所述细胞培养液后继续置于含5％CO2的细胞培养箱中，于37℃进行培养。
(4)成纤维细胞去除
培养1～2天后显微镜下即可观察到有细胞(乳腺上皮细胞远多于成纤维细胞)从组织块周围迁出并贴壁生长(图2中A)，之后培养期间每隔1天更换细胞培养液1次，待迁出的细胞生长至成簇时，根据形态学判定，随时采用机械刮除法刮除呈梭形样的成纤维细胞，保留呈铺路石样生长的乳腺上皮细胞(图2中B)，培养至5～7天(即培养1～2天后继续培养4～5天)，此时大量铺路石样乳腺上皮细胞成片生长并开始相互融合(图2中C)，即可进行首次传代。
(5)首次传代
首次传代前，机械刮除所有残余组织块(包括有细胞迁出和没有细胞迁出的组织块)，只保留贴壁生长的乳腺上皮细胞，弃掉陈旧培养液，PBS冲洗2～3次，利用成纤维细胞比上皮细胞对胰蛋白酶更敏感的特点，加入所述胰蛋白酶消化液1～2毫升并于37℃进行消化，每隔1～2分钟于相差显微镜下观察，直到上皮细胞簇最外层的一至两层上皮细胞呈圆形时(通常小于3分钟)，弃掉消化液，用PBS冲洗2～3次，以去除可能混有的极少量成纤维细胞。然后再次向培养皿加入所述胰蛋白酶消化液1～2毫升，置于含5％CO2的细胞培养箱37℃消化3～5分钟后，加入2毫升所述细胞培养液中止消化，并且用1毫升枪头吹打至细胞从培养皿脱落，最后将细胞悬液离心，用所述细胞培养液重悬细胞，重新种板并培养(含5％CO2的细胞培养箱，37℃)得到的细胞即为纯度很高的乳腺上皮细胞(图2中D)。
(6)传代培养及细胞冻存和复苏
首次传代培养的细胞，后续按照实验室常规细胞培养方法进行再次传代培养，并按照常规细胞冻存及复苏方法进行细胞的冻存和复苏。
(7)上皮细胞纯度鉴定
7.1形态学鉴定
在相差显微镜下，本方法分离的奶牛乳腺上皮细胞在形态上均呈铺路石样生长(图2)。
7.2波形蛋白和角蛋白的表达鉴定
文献报到(HuH,WangJ,BuD,etal.InvitrocultureandcharacterizationofamammaryepithelialcelllinefromChineseHolsteindairycow[J].PloSone,2009,4(11):e7636.)：上皮细胞表达角蛋白，不表达波形蛋白；成纤维细胞表达波形蛋白，不表达角蛋白。
在荧光显微镜下，本方法分离培养的乳腺上皮细胞经红色荧光素PE标记的抗体进行免疫荧光染色后，所有细胞均呈角蛋白阳性(图3中A有红色荧光)，波形蛋白阴性(图3中B无红色荧光)，蓝色荧光为细胞核经DAPI染料标记后显示的荧光，表明本方法可分离到高纯度的奶牛乳腺上皮细胞。图3中C和D为成纤维细胞对照组，分别为角蛋白阴性，波形蛋白阳性，蓝色荧光为细胞核经DAPI染料标记后显示的荧光。
本发明分离的奶牛乳腺上皮细胞可以用于细胞水平的生物学研究、制作乳腺生物反应器的靶细胞，以及作为抗病转基因牛核移植的供体细胞。

Claims (10)

1.一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将奶牛乳腺组织剪切成0.5～1mm3大小的组织块，将所述组织块用磷酸盐缓冲液清洗后置于胶原酶/透明质酸酶消化液中消化30～40分钟；
2)经过步骤1)后，通过离心收集消化成乳糜状的组织块，将消化成乳糜状的组织块接种在培养皿中，并向培养皿中加入细胞培养液，然后于37℃进行培养；培养1～2天后，开始每天机械刮除从消化成乳糜状的组织块迁出生长的成纤维细胞，保留同样迁出生长的乳腺上皮细胞，并且每隔1～2天更换细胞培养液1次，直到培养至5～7天时机械刮除所述培养皿中所有残余组织块，然后弃掉细胞培养液，并用磷酸盐缓冲液冲洗；
3)经过步骤2)后，向所述培养皿中加入胰蛋白酶消化液进行短时消化，短时消化过程中每隔1～2分钟进行观察，待乳腺上皮细胞簇最外层的细胞开始变圆时弃掉胰蛋白酶消化液，并用磷酸盐缓冲液冲洗，短时消化后向所述培养皿中再次加入胰蛋白酶消化液并进行传代。
2.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤1)中，奶牛乳腺组织的获取方法包括以下步骤：无菌采集泌乳期奶牛乳腺组织，经表面消毒处理后，在不含脂肪组织、结缔组织少且富含乳腺小叶的部位切取一部分乳腺组织。
3.根据权利要求2所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述表面消毒处理包括以下步骤：将奶牛乳腺组织用75％酒精冲洗30～40秒后，再用含抗生素的磷酸盐缓冲液冲洗3～5次。
4.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述胶原酶/透明质酸酶消化液按照每毫升DMEM/F12培养液中加入0.5～1.5mg胶原酶、200～300μg透明质酸酶、100IU青霉素、100μg链霉素和0.2～0.5μg两性霉素B进行配制。
5.根据权利要求1或4所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤1)中，胶原酶/透明质酸酶消化液的用量为每1克剪切成0.5～1mm3大小的组织块使用2～4毫升。
6.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述细胞培养液为含有体积分数为10～20％胎牛血清、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.2～0.5μg/mL两性霉素B的DMEM/F12培养液。
7.根据权利要求1或6所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤2)中，细胞培养液的用量为每1克剪切成0.5～1mm3大小的组织块对应使用2～3毫升。
8.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述胰蛋白酶消化液按照每100毫升磷酸盐缓冲液中加入0.2～0.5g胰蛋白酶进行配制。
9.根据权利要求1或8所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述步骤3)中，培养皿中胰蛋白酶消化液的加入量均为每1克剪切成0.5～1mm3大小的组织块对应加入1～2毫升。
10.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：所述短时消化的时间为小于3分钟。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106190952A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种上皮细胞的扩增制备方法
CN110373376A (zh) * 2019-04-08 2019-10-25 北京农学院 奶牛乳腺上皮细胞损伤模型及其构建方法和应用
CN110951673A (zh) * 2019-12-20 2020-04-03 广西大学 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法
CN111117965A (zh) * 2020-01-08 2020-05-08 宁波市医疗中心李惠利医院 一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法
CN111378614A (zh) * 2020-03-18 2020-07-07 中国农业大学 单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法
CN112458040A (zh) * 2020-12-23 2021-03-09 四川农业大学 一种成年牦牛瘤胃上皮细胞的分离培养方法
CN112852717A (zh) * 2021-04-06 2021-05-28 河南牧业经济学院 一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法
CN113215098A (zh) * 2021-06-04 2021-08-06 安徽医科大学第一附属医院 一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法
CN115261303A (zh) * 2022-08-03 2022-11-01 新疆农业大学 一种适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302494A (zh) * 2008-06-23 2008-11-12 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种奶牛乳腺细胞体外分离培养方法
CN104195100A (zh) * 2014-08-29 2014-12-10 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种乳腺上皮细胞的体外培养方法
CN104726401A (zh) * 2015-02-13 2015-06-24 中国医科大学 一种利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法
CN105316279A (zh) * 2014-07-17 2016-02-10 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心 一种高效分离纯化乳腺上皮细胞的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101302494A (zh) * 2008-06-23 2008-11-12 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种奶牛乳腺细胞体外分离培养方法
CN105316279A (zh) * 2014-07-17 2016-02-10 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心 一种高效分离纯化乳腺上皮细胞的方法
CN104195100A (zh) * 2014-08-29 2014-12-10 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种乳腺上皮细胞的体外培养方法
CN104726401A (zh) * 2015-02-13 2015-06-24 中国医科大学 一种利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XUEQING LIU ET AL.: "establishment and evalution of a new method tissue reshift for isolation of goat mammary epithelial cells", 《JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY ADVANCES》 *
李吉霞等: "牛乳腺上皮细胞的分离培养", 《黑龙江畜牧兽医》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106190952A (zh) * 2016-07-19 2016-12-07 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种上皮细胞的扩增制备方法
CN110373376A (zh) * 2019-04-08 2019-10-25 北京农学院 奶牛乳腺上皮细胞损伤模型及其构建方法和应用
CN110951673A (zh) * 2019-12-20 2020-04-03 广西大学 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法
CN111117965A (zh) * 2020-01-08 2020-05-08 宁波市医疗中心李惠利医院 一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法
CN111378614A (zh) * 2020-03-18 2020-07-07 中国农业大学 单层致密奶牛乳腺上皮细胞培养方法
CN112458040A (zh) * 2020-12-23 2021-03-09 四川农业大学 一种成年牦牛瘤胃上皮细胞的分离培养方法
CN112852717A (zh) * 2021-04-06 2021-05-28 河南牧业经济学院 一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法
CN112852717B (zh) * 2021-04-06 2023-10-13 河南牧业经济学院 一种高效分离培养猪乳腺上皮细胞的方法
CN113215098A (zh) * 2021-06-04 2021-08-06 安徽医科大学第一附属医院 一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法
CN113215098B (zh) * 2021-06-04 2023-02-24 安徽医科大学第一附属医院 一种低成本原代小鼠脾脏网状成纤维细胞体外分离和培养方法
CN115261303A (zh) * 2022-08-03 2022-11-01 新疆农业大学 一种适用于母马乳腺上皮细胞体外培养的方法

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