CN110951673A - 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法 - Google Patents

一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110951673A
CN110951673A CN201911328267.2A CN201911328267A CN110951673A CN 110951673 A CN110951673 A CN 110951673A CN 201911328267 A CN201911328267 A CN 201911328267A CN 110951673 A CN110951673 A CN 110951673A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
mammary epithelial
epithelial cells
induction
vitro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911328267.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110951673B (zh
Inventor
黄奔
张丹丹
叶升
朱少倩
刘权辉
覃梁珊
石德顺
胡吉刚
谢小莲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi Yipeng Biotechnology Co Ltd
Guangxi University
Original Assignee
Guangxi Yipeng Biotechnology Co Ltd
Guangxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi Yipeng Biotechnology Co Ltd, Guangxi University filed Critical Guangxi Yipeng Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201911328267.2A priority Critical patent/CN110951673B/zh
Publication of CN110951673A publication Critical patent/CN110951673A/zh
Priority to PCT/CN2020/099117 priority patent/WO2021120582A1/zh
Priority to US17/795,607 priority patent/US20230066648A1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN110951673B publication Critical patent/CN110951673B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0631—Mammary cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法，抑制TGFbeta R1及其相关位点的表达，实现体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞。本发明填补了利用小分子化合物诱导成纤维细胞向乳腺上皮细胞转分化技术的一个空白；为体外研究乳腺生物反应器、乳腺发育分化、乳腺癌以及成纤维细胞转分化为其他类型的功能性细胞的研究提供研究平台。

Description

一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细 胞的方法
技术领域
本发明属于细胞转分化技术领域，尤其是涉及一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法。
背景技术
乳腺上皮细胞是研究乳腺生长发育、泌乳机制以及验证乳腺组织特异性表达载体有效性的体外模型。目前原代乳腺上皮细胞培养大都采用胶原酶消化法和组织块培养法。利用胶原酶消化乳腺组织，再经过密度梯度离心可以得到较纯净的上皮细胞。组织块培养法操作过程简单，节约组织样品，而且避免了消化和离心对细胞造成的不良影响。但是细胞从组织块中长出所需的时间较长，成纤维细胞等结缔组织细胞最先长出，上皮细胞大量出现较为滞后。无论是采用胶原酶消化法还是组织块培养法，原代乳腺上皮细胞的培养均得到上皮细胞和成纤维细胞的混合物。
但是不管是用胶原酶消化法，还是组织块培养法，都存在乳腺上皮细胞体外增值能力有限以及泌乳功能缺失的问题。
近几年，利用小分子化合物组合在人，鼠等多个物种实现了神经细胞、心肌细胞、胰腺细胞和肝细胞等多种细胞的转化。但是目前还没有使用任何方法在任何物种上将终末分化的体细胞诱导转分化为乳腺上皮细胞的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法，本发明填补了利用小分子化合物诱导成纤维细胞向乳腺上皮细胞转分化技术的一个空白，用体细胞进行诱导，源源不断的持续获得低代数有功能的乳腺上皮细胞。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法，抑制TGFbeta R1及其相关位点的表达。
优选的，使用小分子化合物或基因干扰抑制TGFbeta R1及其相关位点，所述小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189中的一种或两种以上。
本发明还提供一种用于体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的诱导培养基，包括基础液、KSR、非必需氨基酸、β-巯基乙醇以及小分子化合物；优选的，小分子化合物为VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189中的一种或两种以上；且在最终培养基中，VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189的浓度分别为0～4mM、0～80μM、0～80μM、0～8μM、0～80μM、0～80μM、0～80μM、0～80μM，以上各物质浓度不同时为0。
优选的，小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox，且在最终培养基中，各自的浓度依次分别为0.0625～4mM、1.25～80μM、1.25～80μM、0.125～8μM、1.25～80μM；优选的，浓度依次为0.25～2mM、5～40μM、5～40μM、0.5～4μM、5～40μM；更优选的，以上组分中的Repsox用SB431542、SB525334、LDN193189中的一种替代。
优选的，基础液、KSR、非必需氨基酸、β-巯基乙醇的体积比为78:20:1:1；更优选的，所述基础液为N2B27，包括Knockout DMEM/F12、N2(100×)、Neurobasal、B27(50×)、Glutamine(100×)；且几者的体积比为99:1:97:2:1。
本发明同时提供如上所述的诱导培养基在体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞中的应用。
本发明也提供如上一种使用诱导培养基进行体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法，包括如下步骤，
1)将体细胞接种于培养皿中，接种后加入高糖DMEM+10％FBS培养基，置于5％二氧化碳，湿度95％，37℃的培养箱中；
2)培养8～24h后，更换如权利要求3～5任一项所述的诱导培养基；再继续诱导培养8天，其中每间隔两天更换一次新的诱导培养基；获得转分化的乳腺上皮细胞。
优选的，还包括步骤3)，将步骤2)转分化的乳腺上皮细胞用胰酶消化后传代至使用Matrix基质预处理的培养板上；更换乳腺上皮培养基继续培养，培养后进行传代或冻存；其中Matrix基质中Matrix与明胶体积百分比为1：50-100。
如上所述的方法或如上所述诱导培养基或如上所述的应用或如上所述的使用诱导培养进行转分化的方法中，所述体细胞来源于人、小鼠、大鼠、兔、猪、羊、山羊、牛或水牛；所述体细胞为耳部成纤维细胞或表皮细胞。
相对于现有技术，本发明所述的一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法，具有以下优势：
(1)本发明填补了利用小分子化合物诱导成纤维细胞向乳腺上皮细胞转分化技术的一个空白。因为目前还没有使用任何方法在任何物种上将终末分化的体细胞诱导转分化为乳腺上皮细胞的报道。
(2)本发明为体外研究乳腺发育分化以及乳腺癌的研究提供研究平台。
(3)本发明为体外研究成纤维细胞转分化为其他类型的功能性细胞提供研究平台。
(4)本发明为转基因乳腺生物反应器的生产提供新的方法。可以在体细胞中过表达一个药用蛋白的外源基因然后再进行诱导，诱导后的乳腺上皮细胞就可以表达这个药用蛋白，比获得转基因动物去生产药用蛋白需要的时间更快。
(5)本发明还可以避免了乳腺上皮细胞体外增殖能力有限以及泌乳功能缺失的问题。因为个体的成纤维细胞是普遍存在的，即使乳腺上皮细胞在体外培养时没有功能了或者是失去了增殖能力，可以用成纤维细胞进行诱导，源源不断的持续获得低代数有功能的乳腺上皮细胞。
附图说明
图1为小分子化合物诱导成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞的时间途径。
图2为小分子化合物诱导成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞的形态变化过程。
图3为转分化山羊乳腺上皮细胞(CiMECs，左)和乳汁分离培养的山羊乳腺上皮细胞(GMECs，右)具有相似的细胞形态特征。
图4为免疫荧光结果显示BFRTV诱导成纤维细胞转分化获得的乳腺上皮细胞(CiMECs)表达乳腺上皮细胞特异性抗原E-cadherin、KRT8、KRT18、CD49f、EpCAM、SOX9。
图5为定量PCR的结果显示BFRTV诱导成纤维细胞转分化获得的乳腺上皮细胞(CiMECs)显著表达乳腺上皮细胞标记基因。同时成纤维细胞标记基因的表达显著下调。
图6为WB结果显示BFRTV诱导成纤维细胞转化得到的乳腺上皮细胞(CiMECs)表达beta酪蛋白(CSN2)和乳铁蛋白(LTF)。
图7为整体调整BFRTV浓度诱导成纤维细胞获得的CiMECs的细胞形态图。
图8为不同浓度下单独使用Repsox(R诱导培养基)都可以将成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞的形态图。
图9为其他抑制剂(SB431542，SB525334,LDN193189)诱导成纤维细胞8天后的细胞形态图。不管小分子化合物组合(BFTV4/BFTV5/BFTVL)还是单独使用小分子化合物SB431542(4)，SB525334(5),LDN193189(L)都可以将成纤维细胞诱导为乳腺上皮细胞。
图10为干扰TGFbeta R1的表达诱导成纤维细胞八天形成与BFRTV诱导类似的细胞形态图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。这些实施例根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
下面结合实施例来详细说明本发明。
下述方法中，使用的培养基如下所示：
1、诱导培养基(BFRTV)成分：
基础液(N2B27)：200mL体系：
Figure BDA0002328933060000051
诱导培养基(BFRTV)：100mL体系
Figure BDA0002328933060000052
Figure BDA0002328933060000061
其中，BFTV诱导培养基为上述BFRTV培养基去掉小分子化合物R；
R诱导培养基为N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇+Repsox(R)；
BFTV4诱导培养基为用10μM SB431542(4)代替BFRTV培养基中的小分子化合物R；
BFTV5诱导培养基为用5μM SB525334(5)代替BFRTV培养基中的小分子化合物R；
BFTVL诱导培养基为用1μM LDN193189(L)代替BFRTV培养基中的小分子化合物R；
SB431542(4)诱导培养基为N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇+10μMSB431542(4)；
SB525334(5)诱导培养基为N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇+5μM SB525334(5)；
LDN193189(L)诱导培养基为N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇+1μMLDN193189(L)。
以上各诱导培养基中，N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇的体积比例不变，仅仅调整小分子化合物的浓度。
2、乳腺上皮培养基成分(以100mL示例)
88.38mL DMEM/F12+10mL FBS+0.5mL氢化可的松(200X)+0.1mL肝素(1000X)+0.01mL EGF(10000X)+0.01mL IGF-1(10000X)+1mL青链霉素(100X)
实施例1
利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法以及进行检测的实验，具体操作如下：
1、采用组织贴壁法分离培养黑山羊的耳缘成纤维细胞(GEFs)，为后续诱导使用提供细胞材料。
选择日龄30-60天的山羊，进行耳缘皮肤消毒，然后用手术刀剪取边缘组织块，放入含有双抗的PBS缓冲液中冲洗2-3遍，高糖DMEM+10％FBS(体积百分比)培养基中保存。在实验室中进行组织块处理，首先进行酒精消毒，PBS缓冲液中去除毛发和软骨，去除干净后PBS缓冲液清洗三次。将处理后的组织块置于1.5mL离心管中，用眼科剪剪切至合适大小，并均匀铺至60mm的细胞培养皿中，倒置放于培养箱。待组织块贴壁状态良好时，加入DMEM培养液进行贴壁培养，每2d更换一次培养基。待原代培养的单层细胞在培养皿中汇合度达80-90％即可进行传代，弃去旧培养液，0.25％胰蛋白酶(质量百分比)进行消化，然后高糖DMEM+10％FBS(体积百分比)培养基进行中和。收集细胞悬液，离心(1200r/min，3min)后弃上清，细胞重悬后均匀接种。
2、将成纤维细胞以5×105的密度接种至60mm的培养皿中，高糖DMEM+10％FBS(体积百分比)培养8-24h后，更换诱导培养基BFRTV，然后置于37℃，5％CO2培养箱继续培养8天，其中每间隔两天更换一次培养基。诱导过程中细胞的形态变化如图2所示，诱导8天后获得诱导转分化的乳腺上皮细胞(CiMECs)。
3、待培养至第8天时，可以将CiMECs进行传代，接种至用Matrix(Matrix与明胶的体积比为1：50)预处理的板上，然后使用乳腺上皮细胞培养基进行培养，待细胞汇合度到90％左右，方可传代或冻存，用于后续检测。诱导8天及传代后的CiMECs的细胞形态跟GMECs类似(图3)。
4、对诱导培养基BFRTV诱导4天(BFRTV-4d)、8天(BFRTV-8d)细胞以及转分化的乳腺上皮细胞(CiMECs)进行了乳腺上皮细胞的特异性抗原的检测。
具体步骤如下：质量百分比4％多聚甲醛(PFA)室温固定培养板中BFRTV-4d，BFRTV-8d，CiMECs的细胞30min；阻断液清洗三次，每次清洗5min；然后加1％TritonX-100(体积百分比)透化细胞，室温15min；阻断液再次清洗三次；随后加入5％驴血清封闭非特异性位点，室温条件下封闭2h；用TBP(Tritonx-BSA-PBS)清洗三次，每次5min；加入一抗，置于4℃孵育过夜；次日，将培养板置于室温条件下，复温20min，随后用TBP清洗3次，每次5min，避光加入二抗和Hoechst混合液，室温孵育1h；TBP溶液洗3次，即可进行荧光显微镜观察拍照实验。免疫荧光染色结果显示(图4)，BFRTV-4d，BFRTV-8d，CiMECs和GMECs一样均表达乳腺上皮细胞的标记性抗原，E-cadherin、细胞角蛋白8(KRT8)、细胞角蛋白18(KRT18)、整合素-α6(CD49f)、EpCAM和SOX9，而山羊耳部成纤维细胞(GEFs)不表达。
5、定量PCR(qPCR)检测乳腺上皮细胞标志基因的表达。
具体操作步骤如下：(1)总RNA提取。弃培养基，PBS洗三次，加入1ml预冷的TRIZOL冰上裂解5min；加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s，置于冰上5min；12000r/min，4℃离心15min；取上层水相转移到预冷的异丙醇中，颠倒混匀后冰上放置5min；12000r/min，4℃离心10min；弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇(体积百分比)，指尖轻弹管底使RNA悬浮，充分洗涤RNA和管壁，7500r/min，4℃离心8min；弃上清液，待沉淀呈半透明状时，加入适量DEPC水完全溶解RNA，取1μL进行纯度和完整性检测，其余进行反转录或者冻于-80℃冰箱。(2)cDNA模板制备。使用Vazyme R223-01合成试剂盒，按说明书进行。(3)荧光定量PCR。使用VazymeQ711-02/03试剂，按说明书进行。qPCR结果显示(图5)，与BFRTV-0d相比，BFRTV-4d、BFRTV-8d、CiMECs和GMECs高表达乳腺上皮细胞相关标记基因CDH1、EPCAM、KRT19、ITGA6、INSR、PRLR、ELF5、LTF，而成纤维细胞标记基因COL6A2和FBN1的表达水平显著下调。
6、WB检测泌乳相关蛋白的表达。结果显示(如图6)，BFRTV-4d、BFRTV-8d、CiMECs和GMECs明显表达乳腺上皮细胞特异性分泌蛋白，包括乳铁蛋白(LTF)和beta酪蛋白(CSN2)。
具体操作步骤如下：细胞在含有蛋白酶抑制剂的变性裂解缓冲液中溶解30分钟，12,000rpm/min,4℃离心10min；用BCA蛋白检测试剂盒测定裂解液中的蛋白浓度；用12％蛋白胶(质量百分比)进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后将蛋白转移到硝化纤维素滤膜，脱脂奶粉室温封闭1小时；孵育一抗，4℃过夜；次日，孵育二抗，室温1h；进行显影。
综上所述，通过上述形态学观察比较，标记基因和特异性抗原的检测以及泌乳能力的鉴定，可以证明利用五种小分子化合物(BFRTV)诱导转分化得到的细胞是具有泌乳功能的乳腺上皮细胞。
实施例2
以关中奶山羊的耳缘成纤维细胞为实验对象，对现使用的五种小分子化合物进行了浓度调整，在基础液不变的情况下，整体调整了BFRTV的浓度。结果表明(如图7)，其余实验步骤以及实验参数与实施例1相同；诱导后细胞仍然可以出现类似BFRTV的细胞形态，也就是说0.5倍到4倍之内的BFRTV浓度都可以将其诱导为乳腺上皮细胞。
通过筛选发现单独使用TGFbeta R1的抑制剂Repsox(R诱导培养基)就可以获得类似BFRTV诱导培养基诱导获得的乳腺上皮细胞(CiMECs)，然后又对R进行浓度筛选，结果显示(如图8)1-8倍浓度范围内均可以产生乳腺上皮细胞。同时还使用了TGFbeta R1以及其相关位点抑制剂SB431542(4)，SB525334(5)，LDN193189(L)代替BFRTV里面的小分子化合物R，分别组成了BFTV4，BFTV5，BFTVL诱导培养基，也可以将成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞。另外单独使用SB431542(4)，SB525334(5)，LDN193189(L)诱导培养基也仍然可以将成纤维细胞诱导转分化为乳腺上皮细胞(如图9)。说明抑制TGFbeta R1及其相关位点的小分子化合物是获得转分化乳腺上皮细胞(CiMECs)的关键。
实施例3
利用基因干扰技术来下调TGFbeta R1在成纤维细胞上的表达也可以诱导成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞。
首先我们构建慢病毒重组质粒pSicoR-Ef1a-mCh TGFBR1 shRNA，然后使用Lipofectamine 3000将其和VSVG，NRF一起共转染293T细胞进行慢病毒包装，最后使用包装好的慢病毒感染成纤维细胞。再将慢病毒感染后的细胞培养在BFTV诱导培养基，37℃，95％饱和湿度，5％CO2培养箱。结果发现，培养8天后可以形成类似BFRTV培养基诱导获得的乳腺上皮细胞(图10)。说明抑制TGFbeta R1的表达是体外诱导获得转分化乳腺上皮细胞(CiMECs)的关键。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法，其特征在于：抑制TGFbeta R1及其相关位点的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使用小分子化合物或基因干扰抑制TGFbeta R1及其相关位点，所述小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189中的一种或两种以上。
3.一种用于体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的诱导培养基，其特征在于：包括基础液、KSR、非必需氨基酸、β-巯基乙醇以及小分子化合物；优选的，小分子化合物为VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189中的一种或两种以上；且在最终培养基中，VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189的浓度分别为0～4mM、0～80μM、0～80μM、0～8μM、0～80μM、0～80μM、0～80μM、0～80μM，以上各物质浓度不同时为0。
4.根据权利要求3所述诱导培养基，其特征在于：小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox，且在最终培养基中，各自的浓度依次分别为0.0625～4mM、1.25～80μM、1.25～80μM、0.125～8μM、1.25～80μM；优选的，浓度依次为0.25～2mM、5～40μM、5～40μM、0.5～4μM、5～40μM；更优选的，以上组分中的Repsox用SB431542、SB525334、LDN193189中的一种替代。
5.根据权利要求3所述的诱导培养基，其特征在于：基础液、KSR、非必需氨基酸、β-巯基乙醇的体积比为78:20:1:1；更优选的，所述基础液为N2B27，包括Knockout DMEM/F12、N2(100×)、Neurobasal、B27(50×)、Glutamine(100×)；且几者的体积比为99:1:97:2:1。
6.如权利要求3～5任一项所述的诱导培养基在体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞中的应用。
7.一种使用诱导培养基进行体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤，
1)将体细胞接种于培养皿中，接种后加入高糖DMEM+10％FBS培养基，置于5％二氧化碳，湿度95％，37℃的培养箱中；
2)培养8～24h后，更换如权利要求3～5任一项所述的诱导培养基；再继续诱导培养8天，其中每间隔两天更换一次新的诱导培养基；获得转分化的乳腺上皮细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：还包括步骤3)，将步骤2)转分化的乳腺上皮细胞用胰酶消化后传代至使用Matrix基质预处理的培养板上；更换乳腺上皮培养基继续培养，培养后进行传代或冻存；其中Matrix基质中Matrix与明胶体积百分比为1：50-100。
9.权利要求1～2任一项所述方法或权利要求3～5任一项所述诱导培养基或权利要求6所述的应用或权利要求7～8任一项所述的方法中，所述体细胞来源于人、小鼠、大鼠、兔、猪、羊、山羊、牛或水牛；所述体细胞为耳部成纤维细胞或表皮细胞。
CN201911328267.2A 2019-12-20 2019-12-20 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法 Active CN110951673B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911328267.2A CN110951673B (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法
PCT/CN2020/099117 WO2021120582A1 (zh) 2019-12-20 2020-06-30 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法
US17/795,607 US20230066648A1 (en) 2019-12-20 2020-06-30 Method for inducing transdifferentiation of somatic cells into mammary epithelial cells in vitro using small molecule compound

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911328267.2A CN110951673B (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110951673A true CN110951673A (zh) 2020-04-03
CN110951673B CN110951673B (zh) 2022-04-22

Family

ID=69983177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911328267.2A Active CN110951673B (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230066648A1 (zh)
CN (1) CN110951673B (zh)
WO (1) WO2021120582A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112143758A (zh) * 2020-09-29 2020-12-29 广西大学 一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法
CN112831473A (zh) * 2021-02-02 2021-05-25 广西大学 一种过表达smad3诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法
WO2021120582A1 (zh) * 2019-12-20 2021-06-24 广西大学 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法
CN113278585A (zh) * 2021-03-26 2021-08-20 广西大学 一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113564221B (zh) * 2021-07-27 2023-04-25 吉林大学 一种烟酸通过gpr109a受体制备缓解奶牛乳腺纤维化药物的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000046351A2 (en) * 1999-02-04 2000-08-10 Mcgill University Platform for the differentiation of cells
CN105543164A (zh) * 2016-02-29 2016-05-04 西北农林科技大学 一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法
CN112143758A (zh) * 2020-09-29 2020-12-29 广西大学 一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法
CN112831473A (zh) * 2021-02-02 2021-05-25 广西大学 一种过表达smad3诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法
WO2021120582A1 (zh) * 2019-12-20 2021-06-24 广西大学 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003018767A2 (en) * 2001-08-27 2003-03-06 Advanced Cell Technology, Inc. Trans-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies
CN109517784B (zh) * 2018-11-14 2020-03-06 洛阳师范学院 一种类角膜上皮细胞、组织工程化角膜上皮及制备与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000046351A2 (en) * 1999-02-04 2000-08-10 Mcgill University Platform for the differentiation of cells
CN105543164A (zh) * 2016-02-29 2016-05-04 西北农林科技大学 一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法
WO2021120582A1 (zh) * 2019-12-20 2021-06-24 广西大学 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法
CN112143758A (zh) * 2020-09-29 2020-12-29 广西大学 一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法
CN112831473A (zh) * 2021-02-02 2021-05-25 广西大学 一种过表达smad3诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CARLOS L. ARTEAGA 等: "The multifunctional role of transforming growth factor (TGF)-βs on mammary epithelial cell biology", 《BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT》 *
PAIVI J. MIETTINEN 等: "TGF-β Induced Transdifferentiation of Mammary Epithelial Cells to Mesenchymal Cells: Involvement of Type I Receptors", 《THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY》 *
吴玉莲 等: "山羊GATA3基因克隆及其真核表达载体构建", 《中国畜牧兽医》 *
李兰玉 等: "小分子化合物促进体细胞重编程为多能干细胞的研究进展", 《黑龙江畜牧兽医》 *
李莹莹 等: "胰岛素样生长因子-Ⅰ、肝细胞生长因子、转化生长因子-β1、干扰素-γ对奶牛乳腺上皮细胞增殖活性的影响", 《中国畜牧兽医》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021120582A1 (zh) * 2019-12-20 2021-06-24 广西大学 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法
CN112143758A (zh) * 2020-09-29 2020-12-29 广西大学 一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法
CN112143758B (zh) * 2020-09-29 2023-04-21 广西大学 一种利用转分化乳腺上皮细胞制备转基因乳腺生物反应器的方法
CN112831473A (zh) * 2021-02-02 2021-05-25 广西大学 一种过表达smad3诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法
CN112831473B (zh) * 2021-02-02 2022-10-14 广西大学 一种过表达smad3诱导体细胞重编程为乳腺上皮细胞的方法
CN113278585A (zh) * 2021-03-26 2021-08-20 广西大学 一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法
CN113278585B (zh) * 2021-03-26 2023-09-15 广西大学 一种体外诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230066648A1 (en) 2023-03-02
CN110951673B (zh) 2022-04-22
WO2021120582A1 (zh) 2021-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110951673B (zh) 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法
Ishikawa et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor
CN107217028B (zh) 一种含附属器的组织工程皮肤及其制备方法
KR101562366B1 (ko) 메타크릴레이트화된 젤라틴을 포함하는, 심근세포분화 유도용 세포 지지체
Choi et al. Engineered extracellular microenvironment with a tunable mechanical property for controlling cell behavior and cardiomyogenic fate of cardiac stem cells
Manira et al. Comparison of the effects between animal-derived trypsin and recombinant trypsin on human skin cells proliferation, gene and protein expression
Wang et al. Hair follicle stem cells isolated from newborn Yangtze River Delta White Goats
AU2018215170B2 (en) Differentiation control method for pluripotent stem cells
JP7510998B2 (ja) 肺がん固形腫瘍の初代細胞と肺がん胸水の初代腫瘍細胞の培養方法およびキット
CN114606186B (zh) 一种提高脐带间充质干细胞增殖的方法
Hanson et al. Transplanting embryonic stem cells onto damaged human corneal endothelium
Bourland et al. Isolation and culture of human dermal microvascular endothelial cells
Nejaddehbashi et al. Isolating human dermal fibroblasts using serial explant culture
Chun et al. 3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover
CN107427535A (zh) 经修饰的血凝块
Anderson et al. Prolonging culture of primary human keratinocytes isolated from suction blisters with the Rho kinase inhibitor Y-27632
Gao et al. Isolation, culture and phenotypic characterization of human sweat gland epithelial cells
JP2010158206A (ja) ヒト心筋前駆細胞の選別方法
Cha et al. A method of isolation and culture of microvascular endothelial cells from mouse skin
Pokrywczynska et al. Optimization of porcine urothelial cell cultures: Best practices, recommendations, and threats
Somuncu et al. In vitro artificial skin engineering by decellularized placental scaffold for secondary skin problems of meningomyelocele
CN111770988A (zh) 一种蛋白在细胞培养中的应用
CN109266604A (zh) 包含干细胞活性物质的组合物及其制备方法
Wu et al. SENP1 is required for the growth, migration, and survival of human adipose-derived stem cells
CN108872603B (zh) 一种用于肝癌干细胞的鉴定方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant