CN113278585A - 一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，通过单一小分子化合物或者基因敲除或者基因过表达提高cAMP的浓度或上调PKA、CREB的表达或抑制AMPK、ALK2、ALK3、P38、JNK的表达。本专利诱导小分子化合物单一和安全，诱导时间短、诱导效率高、诱导作用位点和基因明确以及分子调控机制清楚，可以将其应用于人神经退行性疾病的临床治疗中，为神经退行性疾病的治疗提供一种更加安全高效的治疗手段。由于神经元没有分裂增殖能力，因此我们利用本专利可以将有分裂增殖能力的成纤维细胞和星形胶质细胞在体内外进行诱导，源源不断的在体内外获得大量的诱导神经元。

Description

一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法
技术领域
本发明属于干细胞领域，尤其是涉及一种高效诱导人体细胞重编程为神 经元细胞的方法。
背景技术
利用转染外源转录因子以及小分子化合物组合等诱导方法，在人、小鼠 等多个物种均已经实现将终末分化体细胞重编程为神经元。2015年裴钢课题 组报道了利用7个小分子化合物组合，将阿尔茨海默症患者的成纤维细胞重 编程为神经元。2005年Brueckner B等利用6种小分子化合物的组合，将人 星形胶质细胞诱导为神经元。这些小分子化合物抑制了非神经元基因的表 达，促进神经元特异基因的表达，通过对于诱导后细胞的延长培养，最终获 得成熟的功能性神经元。
虽然现在诱导神经元的方法种类有很多，但是均存在诱导时间过长 (20～30天)，诱导效率偏低(10％～30％)，方法过度繁琐以及潜在的生 物安全风险偏高等缺点。在细胞治疗应用方面来看，现有技术由于使用的诱 导因素过多、诱导时间过长、效率偏低都会大大降低临床治疗的效果，增加 潜在的治疗副作用以及生物安全性的担忧。在机理方面来说，现有的技术是 使用多种小分子化合物的联合作用，作用的信号通路交错，作用位点繁杂， 无法准确揭示体细胞向神经元命运的转化是如何决定的。目前没有任何技术 阐述可以利用单一小分子化合物将体细胞重编程为神经元细胞，并且也未能 完全阐明体细胞重编程为神经元的机理。
而本发明的诱导体系可以在只使用单个小分子化合物或者单一基因的 调控作用的前提下两天内将体细胞重编程为具有TUJ1阳性的神经元细胞 (最高阳性率约80％)。更重要的是，前人使用的小分子化合物组合的方法 无法阐述细胞命运转化的机理。我们的发现清楚的阐明了人体细胞重编程为 神经元细胞的分子调控路径，确定了单一小分子化合物或者单一基因的调控 作用可以诱导人体细胞重编程为神经元细胞。另外本发明中提到的重编程的 关键调控位点前人都还没有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞 的方法，以克服现有技术的缺陷,确定了单一小分子化合物或者单一基因的 调控作用可以诱导人体细胞重编程为神经元细胞。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，提高cAMP的浓度 或上调PKA、CREB任一位点的表达或抑制AMPK、ALK2、ALK3、P38、 JNK任一位点的表达。
优选地，使用小分子化合物、基因干扰、基因敲除或基因过表达提高 cAMP的浓度或上调PKA、CREB任一位点的表达或抑制AMPK、ALK2、 ALK3、P38、JNK任一位点的表达，优选地，小分子化合物包括cAMP激 活剂、cAMP、cAMP类似物、PKA激活剂、CREB激活剂、AMPK抑制剂、 ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂中的一种或两种以 上。
诱导人体细胞重编程为神经元细胞的各作用位点及作用该位点的小分 子化合物，作用位点包括cAMP(提高浓度),PKA(激活/上调表达)， CREB(激活/上调表达)，ALK2/3(抑制/下调表达)，JNK(抑制/下调表 达),P38(抑制/下调表达),AMPK(抑制/下调表达)。下列任何单一小分 子化合物，包括(不仅限于)cAMP/PKA/CREB激活剂(Forskolin/Colforsin/ 8-Bromo-cAMP/Dibutyryl-cAMP(Bucladesine)/cAMP及其类似物等)，ALK2/ 3抑制剂(LDN-193189/LDN-193189-2HCl/K02288/LDN-212854/LDN-2141 17/ML347/DMH1/等)，JNK抑制剂(SP600125/Resveratrol/JNK-IN-8/JNK- Inhibitor VIII/DB07268/IQ-1S/Bentamapimod(AS602801)/Tanzisertib(CC-930)/ BI-78D3/JNK InhibitorIX/UrolithinB/LoureirinB/LoureirinB/Falcarindiol/Cucu rbitacinIIb/MulberrosideA/Trans-ZeatinAstragaloside IV等)，P38抑制剂(SB 203580/Doramapimod(BIRB796)/SB202190(FHPI)/Ralimetinib dimesylate/VX -702/PH-797804/VX-745/TAK-715/PD169316/TA-02/SD0006/Pamapimod/BM S-582949/SB239063/Losmapimod(GW856553X)/Skepinone-L/SEA0400/AUDA /PraeruptorinA/MulberrosideA/UM-164/Trans-Zeatin/3'-Hydroxypterostilbene/P exmetinib(ARRY-614)等)，AMPK抑制剂(Dorsomorphin/Dorsomorphin(Co mpoundC)/Dorsomorphin(CompoundC)2HCl/WZ4003/ON123300/HTH-01-015 /Doxorubicin(Adriamycin)HCl/GSK690693/XMD-17-51等)，都可以诱导人皮 肤成纤维细胞、人卵泡颗粒细胞、人星形胶质细胞等体细胞重编程为功能性 神经元的方法。
本发明的第二目的在于提供一种用于高效诱导人体细胞重编程为神经 元细胞的诱导培养基，包括基础液、KSR以及小分子化合物，优选地，小分 子化合物包括cAMP激活剂、cAMP、cAMP类似物(如DBcAMP、8-Cl-cAMP 等)、PKA激活剂、CREB激活剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3 抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂中的一种或两种以上。
优选地，小分子化合物包括Forskolin、8-Bromo-cAMP、LDN193189、 cAMP、cAMP类似物、SP600125、SB203580、Dorsomorphin，且在最终培 养基中，各自的浓度依次分别为0-100μM、0-500μM、0-25μM、0-10mM、 0-10mM、0-10μM、0-5μM、0-100μM，以上各物质浓度不同时为0；优选地， 各自的浓度依次分别为5-20μM、5-50μM、0.5-5μM、0.5-5mM、0.5-5mM、 0.5-5μM、0.1-2.5μM、0.5-20μM；更优选地，各自的浓度依次分别为10μM、 50μM、2.5μM、1mM、1mM、1μM、0.5μM、10μM。
优选地，基础液、KSR的体积比为80:20；优选地，基础液为N2B27， 包括KnockoutDMEM/F12、N2(100×)、Neurobasal、B27(50×)、 Glutamine(100×)；且几者的体积比为99:1:97:2:1。
本发明的第三目的在于提供上述的诱导培养基在体内外诱导体细胞重 编程为神经元细胞中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种使用诱导培养基进行体外诱导体细胞 重编程为神经元细胞的方法，包括如下步骤：
1)将体细胞接种于培养皿中，接种后加入高糖DMEM+10％FBS，置于 5％二氧化碳，湿度95％，37℃的培养箱，培养过夜后更换如权利要求3-5 任一项所述的诱导培养基，诱导培养48h后获得诱导神经元(CiNCs)；
2)将培养基更换为神经元成熟培养基，继续促进诱导后的神经元进一 步成熟，72h后更换为神经元培养基，可进行长时间培养。
优选地，神经元成熟培养基的成分包括体积比为1:1的DMEM/F12和 Neurobasal，0.5％N2(体积百分比)，1％B27(体积百分比)，100μM cAMP， 20ng/mL bFGF，20ng/mL BDNF，20ng/mL GDNF，20ng/mL NT3，100U/mL 青霉素和0.1mg/mL链霉素。
优选地，神经元培养基的成分包括体积比1:1的DMEM/F12：Neurobasal， 0.5％N2(体积百分比)，1％B27(体积百分比)，20ng/mL bFGF，20ng/mL BDNF，20ng/mL GDNF，20ng/mL NT3，100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉 素。
所述体细胞来源于人、猴子或小鼠；所述体细胞为皮肤成纤维细胞、卵 泡颗粒细胞或星形胶质细胞。
相对于现有技术，本发明所述的高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞 的方法具有以下有益效果：
(1)本专利填补了利用单一小分子化合物诱导终末分化人体细胞重编 程为功能性神经元的一个空白。
(2)本专利填补了调控单一基因的表达(PKA、CREB、JNK)诱导终 末分化人体细胞重编程为功能性神经元的一个空白。
(3)本专利在使用单一小分子化合物的条件下，在仅仅两天左右的诱导 时间下，就能获得大约80％TUJ1阳性率的神经元细胞。相比于前人的工作， 诱导时间大大缩短，诱导效率大大提高。
(4)本专利利用单一小分子化合物作用通路明确以及作用位点清晰的特 点，阐明了体细胞重编程为神经元的整个重编程过程的分子调控路径为 cAMP-PKA-CREB-JNK以及其关键调控基因为PKA、CREB和JNK。此机 理还未曾有人明确阐述。
(5)本专利诱导小分子化合物单一和安全，诱导时间短、诱导效率高以 及机制清楚，可以将其应用于人神经退行性疾病的临床治疗中，为神经退行 性疾病的治疗提供一种更加安全高效的治疗手段。我们利用本专利可以将成 纤维细胞和星形胶质细胞在体内外进行诱导，源源不断的在体内外获得大量 的诱导神经元，从而利用再生的这些诱导神经元达到在临床上治疗神经退行 性疾病的目的。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的 示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在 附图中：
图1为实施例1单一小分子化合物Forskolin诱导人皮肤成纤维细胞重 编程为神经元的时间途径；
图2为实施例1单一小分子化合物Forskolin诱导人皮肤成纤维细胞重 编程为神经元的形态变化过程；
图3为实施例1单一小分子化合物Forskolin诱导人皮肤成纤维细胞重 编程为神经元的免疫荧光结果；
图4为实施例1单一小分子化合物Forskolin诱导人皮肤成纤维细胞重 编程为神经元的定量PCR的结果；
图5为通过小分子化合物、基因过表达或者基因敲除的诱导方法影响重 编程调控路径上的单个不同位点。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术 人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明， 均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，具体为：使用小分 子化合物、基因干扰、基因敲除或基因过表达提高cAMP的浓度或上调PKA、CREB任一位点的表达或抑制AMPK、ALK2、ALK3、P38、JNK任一位点 的表达，其中，小分子化合物包括cAMP激活剂、cAMP、cAMP类似物、 PKA激活剂、CREB激活剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、 P38抑制剂、JNK抑制剂中的一种或两种以上。
一、调控神经元细胞重编程分子路径(cAMP、PKA、CREB、AMPK、 ALK2、ALK3、P38、JNK)任一位点(提高cAMP的浓度或上调PKA、CREB 的表达或抑制AMPK、ALK2、ALK3、P38、JNK的表达)的小分子化合物 诱导培养基成分：
基础液(N2B27)：200mL体系：
Figure BDA0002994768290000071
诱导培养基：100mL体系：
N2B2780mL
KSR(血清替代物) 20mL
小分子化合物 名称及浓度详见表1和表2。
表1各作用位点的代表性小分子化合物诱导浓度及效率以及作用位点基因验证
Figure BDA0002994768290000072
Figure BDA0002994768290000081
表2各作用位点的小分子化合物列表
Figure BDA0002994768290000091
Figure BDA0002994768290000101
Figure BDA0002994768290000111
二、神经元成熟培养基成分：DMEM/F12：Neurobasal＝1:1(体积比)， 0.5％N2(体积百分比)，1％B27(体积百分比)，100μM cAMP，20ng/mL bFGF，20ng/mL BDNF，20ng/mLGDNF，20ng/mL NT3，100U/mL青霉素 和0.1mg/mL链霉素。
三、神经元培养基成分：DMEM/F12：Neurobasal＝1:1(体积比)，0.5 ％N2(体积百分比)，1％B27(体积百分比)，20ng/mL bFGF，20ng/mL BDNF， 20ng/mL GDNF，20ng/mL NT3，100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
四、诱导过程：
1、以60mm培养皿为标准，人体细胞接种密度为5×105个，接种后加 入高糖DMEM+10％FBS(成纤维细胞培养基/FM)置于5％二氧化碳，湿度 95％，37℃的培养箱，培养过夜后更换上述神经元诱导培养基，诱导48h后 获得诱导神经元(CiNCs)。
2、诱导培养48h后得到的诱导神经元，将其培养基更换为上述神经元 成熟培养基，继续促进诱导后的神经元进一步成熟，72h后再次更换为神经 元培养基可长时间培养。
实施例1
运用此诱导重编程的方法已成功将人皮肤成纤维细胞(BJ)重编程为具 有功能性的神经元。
整体的实验诱导如图1所示。
具体操作如下：
将人皮肤成纤维细胞以5×105的密度接种至60mm的培养皿中，接种24 小时内更换神经元诱导培养基(N2B27+KSR+10μM Forskolin)，置于37℃， 5％CO2培养箱培养48小时。诱导过程中细胞的形态变化如图2所示，诱导 48小时后获得TUJ1阳性率80％的诱导神经元(CiNCs)。
待诱导48小时后，更换为神经元成熟培养基进一步促进CiNCs成熟， 72小时后，再更换为神经元培养基，可进行长时间培养。
我们对人皮肤成纤维细胞以及神经元诱导培养(N2B27+10μM Forskol in)诱导48小时的细胞，进行了神经元的标记性抗原的免疫荧光检测。具体 步骤如下：4％多聚甲醛(PFA)室温固定培养板中人皮肤成纤维细胞、F-48h 的细胞30min；阻断液清洗三次，每次清洗5min；然后加1％TritonX-100 透化细胞，室温15min；阻断液再次清洗三次；随后加入5％驴血清封闭非 特异性位点，室温条件下封闭2h；用TBP(Tritonx-BSA-PBS)清洗三次， 每次5min；加入一抗，置于4℃孵育过夜；次日，将培养板置于室温条件 下，复温20min，随后用TBP清洗3次，每次5min，避光加入二抗和Hoechst 混合液，室温孵育1h；TBP溶液洗3次，即可进行荧光显微镜观察拍照实 验。免疫荧光染色结果显示(见图3)，诱导神经元细胞(F-48h)表达神经 元的标记性抗原，TUJ1、MAP2，而人皮肤成纤维细胞不表达。
定量PCR(qPCR)检测神经元标志基因的表达。具体操作步骤如下： (1)总RNA提取。弃培养基，PBS洗三次，加入1ml预冷的TRIZOL冰上裂 解5min；加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s，置于冰上5min；12000r/min， 4℃离心15min；取上层水相转移到预冷的异丙醇中，颠倒混匀后冰上放置 5min；12000r/min，4℃离心10min；弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇， 指尖轻弹管底使RNA悬浮，充分洗涤RNA和管壁，7500r/min，4℃离心 8min；弃上清液，待沉淀呈半透明状时，加入适量DEPC水完全溶解RNA， 取1μL进行纯度和完整性检测，其余进行反转录或者冻于-80℃冰箱。(2) cDNA模板制备。使用Vazyme R223-01合成试剂盒，按说明书进行。(3)荧 光定量PCR。使用Vazyme Q711-02/03试剂，按说明书进行。qPCR结果显 示(图4)，与人皮肤成纤维细胞(F-0h)相比，诱导神经元细胞(F-48h)高 表达神经元相关标记基因NeuroD1、tubulin、Ascl1等，而成纤维细胞标记 基因Col1A1的表达水平显著下调。
实施例2
与实施例1不同之处在于使用的神经元诱导培养基为N2B27+KSR+10m M cAMP。免疫荧光检测结果显示诱导得到的神经元细胞表达神经元标志性 抗原TUJ1,MAP2以及NeuN(见图5)。
实施例3
与实施例1不同之处在于使用的神经元诱导培养基为N2B27+KSR+10μ M 8-Bromo-cAMP。免疫荧光检测结果显示诱导得到的神经元细胞表达神经 元标志性抗原TUJ1,MAP2以及NeuN(见图5)。
实施例4
与实施例1不同之处在于使用的神经元诱导培养基为N2B27+KSR+10 μMDorsomorphin。免疫荧光检测结果显示诱导得到的神经元细胞表达神经 元标志性抗原TUJ1,MAP2以及NeuN(见图5)。
实施例5
与实施例1不同之处在于使用的神经元诱导培养基为N2B27+KSR+5μM LDN193189。免疫荧光检测结果显示诱导得到的神经元细胞表达神经元标志 性抗原TUJ1,MAP2以及NeuN(见图5)。
实施例6
与实施例1不同之处在于使用的神经元诱导培养基为 N2B27+KSR+5μMSB203580。免疫荧光检测结果显示诱导得到的神经元细胞 表达神经元标志性抗原TUJ1,MAP2以及NeuN(见图5)。
实施例7
与实施例1不同之处在于使用的神经元诱导培养基为N2B27+KSR+10μ MSP600125。免疫荧光检测结果显示诱导得到的神经元细胞表达神经元标志 性抗原TUJ1,MAP2以及NeuN(见图5)。
实施例8
首先构建PKA基因的过表达重组质粒(pLVX-PKA-IRES)。采用Trizol 法从目的基因(PKA)高表达的细胞中提取RNA，反转录后，设计引物， 以cDNA为模板PCR扩增PKA基因完整编码区序列。随后将PCR产物进 行琼脂糖电泳，切下PKA基因片段对应的胶块，进行胶回收。胶回收后测 定DNA浓度，获得目的基因片段。对过表达空载体(pLVX-IRES)质粒用 限制性内切酶进行双酶切，酶切完成后，质粒进行琼脂糖电泳及胶回收，测 定胶回收产物浓度，并与PKA基因片段进行同源重组。再将重组产物转化 大肠杆菌T1感受态细胞，在含氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板培养基 上涂布，置于37℃培养箱导致培养12～16h。挑取单克隆，在含Amp+的LB 液体培养基中继续培养。将菌液进行菌落PCR鉴定，选取鉴定正确的菌液 用质粒提取试剂盒提取质粒进一步酶切鉴定。将鉴定正确的质粒送公司进行 测序。最后测序正确的质粒对应的菌液进行扩大培养，用去内毒质粒提取试 剂盒提取重组过表达质粒(pLVX-PKA-IRES)。
再进行病毒包装以及细胞感染诱导神经元转分化。将HEK-293T细胞进 行复苏，置于37℃、5％CO2培养箱中，待细胞汇合度达50％～60％时，采 用脂质体转染法使用无血清DMEM培养基稀释LipofectamineTM3000试剂， 充分混匀。使用无血清DMEM培养基稀释DNA(重组过表达质粒 pLVX-PKA-IRES、病毒包装质粒NRF和病毒包膜质粒VSVG＝5：3：2), 制备DNA预混液后添加P3000TM试剂，充分混匀。在已稀释的 LipofectamineTM3000试剂中加入稀释的DNA(比例为Lip3000：DNA＝2.5： 1)。室温孵育10min，将DNA-脂质体复合物共转染HEK-293T细胞，于 37℃、5％CO2培养，48～72h后收集病毒上清液，4℃、2000r/min离心10 min后用0.45μm过滤器过滤。将过滤后的病毒液与培养基按照1:1的混合 比例直接感染人皮肤成纤维细胞(5×105)，2天后更换培养基(N2B27+KSR)， 置于37℃，5％CO2培养箱继续培养2天。接着更换为神经元成熟培养基继 续培养3天，进一步促进CiNCs成熟。最后更换为神经元培养基，可进行长 时间培养。
最后对诱导神经元的验证。我们对上述诱导得到的神经元细胞进行了神 经元的标记性抗原的免疫荧光检测。具体步骤如下：4％多聚甲醛(PFA) 室温固定培养板中人皮肤成纤维细胞、F-48h的细胞30min；阻断液清洗三 次，每次清洗5min；然后加1％TritonX-100透化细胞，室温15min；阻断 液再次清洗三次；随后加入5％驴血清封闭非特异性位点，室温条件下封闭2 h；用TBP(Tritonx-BSA-PBS)清洗三次，每次5min；加入一抗，置于4℃ 孵育过夜；次日，将培养板置于室温条件下，复温20min，随后用TBP清洗3次，每次5min，避光加入二抗和Hoechst混合液，室温孵育1h；TBP溶 液洗3次，即可进行荧光显微镜观察拍照实验。免疫荧光染色结果显示(见 图5)，诱导神经元细胞表达神经元的标记性抗原，TUJ1、MAP2和NeuN。
实施例9
与实施例8不同之处在于过表达的基因为CREB。免疫荧光检测结果显 示诱导得到的神经元细胞表达神经元标志性抗原TUJ1,MAP2以及NeuN (见图5)。
实施例10
首先构建JNK基因敲除重组质粒(U6-sgJNK-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-p uro)。选取JNK基因外显子，用MIT张峰实验室的sgRNA设计工具进行 靶向sgJNK的设计，在sgJNK的引物上添加限制性内切酶的粘性末端以便 于与空载体(U6-sgRNA-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-puro)进行连接。将公司合 成的引物干粉用ddH2O稀释至工作浓度，配置退火体系，进行退火。通过 限制性内切酶对空载体进行线性化后插入sgJNK，连接后转化感受态大肠杆 菌，在含氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板培养基上涂布，置于37℃培 养箱导致培养12～16h。挑取单克隆，在含Amp+的LB液体培养基中继续培 养。将菌液进行菌落PCR鉴定，选取鉴定正确的菌液用质粒提取试剂盒提 取质粒进一步酶切鉴定，将鉴定正确的质粒送公司进行测序。最后测序正确 的质粒对应的菌液进行扩大培养，用去内毒质粒提取试剂盒提取含sgJNK表 达原件的质粒，用于转染细胞。
然后进行JNK基因敲除病毒的包装及细胞感染。将HEK-293T细胞进 行复苏，置于37℃、5％CO2培养箱中，待细胞汇合度达50％～60％时，采 用脂质体转染法使用无血清DMEM培养基稀释LipofectamineTM3000试剂， 充分混匀。使用无血清DMEM培养基稀释DNA(Cas9质粒、病毒包装质粒psPAX2和pMDG2＝5：3：2)，制备DNA预混液后添加P3000TM试剂，充分混匀。在已稀释的LipofectamineTM3000试剂中加入稀释的DNA(比例为 Lip3000：DNA＝2.5：1)。室温孵育10min，将DNA-脂质体复合物共转染 HEK-293T细胞，于37℃、5％CO2培养，48-72h后收集病毒上清液，4℃、 2000r/min离心10min后用0.45μm过滤器过滤。将过滤后的病毒液与培养 基按照1:1的混合比例直接感染人皮肤成纤维细胞(5×105)，2天后更换培养基(N2B27+KSR)，置于37℃，5％CO2培养箱继续培养2天。接着更换 为神经元成熟培养基继续培养3天，进一步促进CiNCs成熟。最后更换为神 经元培养基，可进行长时间培养。
最后对诱导神经元的验证。我们对上述诱导得到的神经元细胞进行了神 经元的标记性抗原的免疫荧光检测。具体步骤如下：4％多聚甲醛(PFA) 室温固定培养板中人皮肤成纤维细胞、F-48h的细胞30min；阻断液清洗三 次，每次清洗5min；然后加1％TritonX-100透化细胞，室温15min；阻断 液再次清洗三次；随后加入5％驴血清封闭非特异性位点，室温条件下封闭2 h；用TBP(Tritonx-BSA-PBS)清洗三次，每次5min；加入一抗，置于4℃ 孵育过夜；次日，将培养板置于室温条件下，复温20min，随后用TBP清洗 3次，每次5min，避光加入二抗和Hoechst混合液，室温孵育1h；TBP溶 液洗3次，即可进行荧光显微镜观察拍照实验。免疫荧光染色结果显示(见 图5)，诱导神经元细胞表达神经元的标记性抗原，TUJ1、MAP2和NeuN。
因此上述这些实施例子的结果证明单一小分子化合物或者基因敲除/过 表达调控信号通路(cAMP、PKA、CREB、AMPK、ALK2、ALK3、P38、 JNK)上任一位点都可以诱导人体细胞高效重编程为神经元细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本 发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在 本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的方法，其特征在于：提高cAMP的浓度或上调PKA、CREB任一位点的表达或抑制AMPK、ALK2、ALK3、P38、JNK任一位点的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使用小分子化合物、基因干扰、基因敲除或基因过表达提高cAMP的浓度或上调PKA、CREB任一位点的表达或抑制AMPK、ALK2、ALK3、P38、JNK任一位点的表达，优选地，小分子化合物包括cAMP激活剂、cAMP、cAMP类似物、PKA激活剂、CREB激活剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂中的一种或两种以上。
3.一种用于高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的诱导培养基，其特征在于：包括基础液、KSR以及小分子化合物，优选地，小分子化合物包括cAMP激活剂、cAMP、cAMP类似物、PKA激活剂、CREB激活剂、AMPK抑制剂、ALK2抑制剂、ALK3抑制剂、P38抑制剂、JNK抑制剂中的一种或两种以上。
4.根据权利要求3所述的用于高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的诱导培养基，其特征在于：小分子化合物包括Forskolin、8-Bromo-cAMP、LDN193189、cAMP、cAMP类似物、SP600125、SB203580、Dorsomorphin，且在最终培养基中，各自的浓度依次分别为0-100μM、0-500μM、0-25μM、0-10mM、0-10mM、0-10μM、0-5μM、0-100μM，以上各物质浓度不同时为0；优选地，各自的浓度依次分别为5-20μM、5-50μM、0.5-5μM、0.5-5mM、0.5-5mM、0.5-5μM、0.1-2.5μM、0.5-20μM；更优选地，各自的浓度依次分别为10μM、50μM、2.5μM、1mM、1mM、1μM、0.5μM、10μM。
5.根据权利要求3所述的用于高效诱导人体细胞重编程为神经元细胞的诱导培养基，其特征在于：基础液、KSR的体积比为80:20；优选地，基础液为N2B27，包括Knockout DMEM/F12、N2(100×)、Neurobasal、B27(50×)、Glutamine(100×)；且几者的体积比为99:1:97:2:1。
6.如权利要求3～5任一项所述的诱导培养基在体内外诱导体细胞重编程为神经元细胞中的应用。
7.一种使用诱导培养基进行体外诱导体细胞重编程为神经元细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将体细胞接种于培养皿中，接种后加入高糖DMEM+10％FBS，置于5％二氧化碳，湿度95％，37℃的培养箱，培养过夜后更换如权利要求3-5任一项所述的诱导培养基，诱导培养48h后获得诱导神经元(CiNCs)；
2)将培养基更换为神经元成熟培养基，继续促进诱导后的神经元进一步成熟，72h后更换为神经元培养基，可进行长时间培养。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：神经元成熟培养基的成分包括体积比为1:1的DMEM/F12和Neurobasal，0.5％N2(体积百分比)，1％B27(体积百分比)，100μM cAMP，20ng/mL bFGF，20ng/mL BDNF，20ng/mL GDNF，20ng/mL NT3，100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：神经元培养基的成分包括体积比1:1的DMEM/F12：Neurobasal，0.5％N2(体积百分比)，1％B27(体积百分比)，20ng/mL bFGF，20ng/mL BDNF，20ng/mL GDNF，20ng/mL NT3，100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素。
10.权利要求1-2任一项所述方法或权利要求3-5任一项所述诱导或权利要求6所述的应用或权利要求7-9任一项所述的方法中，所述体细胞来源于人、猴子或小鼠；所述体细胞为皮肤成纤维细胞、卵泡颗粒细胞或星形胶质细胞。
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