KR100794362B1 - Ｎａｎｏｇ를 이용한 아스트로사이트의 신경줄기세포로의역분화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Nanog를 이용하여 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물과 방법에 관한 것으로, 역분화된 신경줄기세포는 아스트로사이트, 뉴런 및 올리고덴드로사이트로의 분화능을 가진다.

Nanog, Ink4A/Arf-/- astrocyte, p53-/- astrocyte, 신경줄기세포(neural stem cell), 역분화 (de-differentiation)

Description

Ｎａｎｏｇ를 이용한 아스트로사이트의 신경줄기세포로의 역분화{De-differentiation of astrocytes into neural stem cell using Nanog}

도 1은 면역세포화학법(Immunocytochemistry)를 통해 Nanog 단백질의 과발현을 확인한 결과를 나타낸다.

도 2 는 역분화 유도를 보여주는 것으로, A는 Sphere 형성을, B는 direct sphere 형성 (Direct sphere formation) (left:phase contrast, right:GFP detection)을 보여준다 (direct sphere는 single cell을 neural stem cell 배양 조건에서 배양했을 때 형성되는 것을, sphere는 single cell을 astrocyte 배양 조건에서 attach를 시킨 후, 12시간 후에 안정이 되었을 때 neural stem cell 배양 조건으로 배양했을 때 형성되는 것을 의미한다).

도 3은 신경줄기세포 마커의 발현을 면역세포화학법으로 살펴본 결과이다. A-C 는 Neural stem cell을, D-K 는 Neural stem cell-like cell (Ink4a/Arf^-/-astrocyte Nanog #2,#4, p53^-/-astrocyte Nanog #4,6) 을 나타낸다.

도 4는 Nanog 유전자의 발현이 세포 성장을 촉진시키는 것을 보여준다. A 는 성장곡선 분석(Growth curve analysis)을 B 는 저-밀도 씨딩 어세이(Low density seeding assay)를 한 결과이다.

도 5는 신경세포 유사 세포를 인 비트로 분화(In vitro differentiation)를 유도하였을 때의 아스트로사이트, 뉴런, 올리고덴드로사이트로 각각 분화되는 것을 보여준다. (A-C: Neural stem cell, D-K: Neural stem cell like cell, D-G Ink4a/Arf^-/-astrocyte Nanog GFP #2,H-J:#4, K:p53^-/-astrocyte Nanog GFP#4,L-O:#6)

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신경줄기세포 (Neural stem cells: NSCs)는 신경계에 존재하는 전구세포(progenitor cell)의　서브타입 (subtype)으로 아스트로사이트 (astrocytes), 올리고덴드로사이트 (oligodendrocytes), 뉴런 (neurons)으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 중추신경계 (Central nervous system: CNS)와 말초신경계 (peripheral nervous system: PNS)에서 분리하여 Multicellular neurospheres를 만들 수 있고 이 세포가 각각의 조건에서 glial lineage와 neural lineage로 분화하게 된다 (Sally Temple et al. 2001). 이러한 신경줄기세포는 난치병의 치료에 응용되어 현재 세포치료의 한 가지 방법으로 연구되고 있으며 성체줄기세포의 하나로 윤리적인 문제가 거의 없기 때문에 많이 연구되고 있는 실정이다. 최근에 역분화에 관련된 연구가 진행되고 있는 상황에서 성체줄기세포의 중요성이 좀 더 강조되고 있다. 이러한 성체줄기세포는 배아줄기 세포보다 얻기 쉽지만 실제로 적용하기에 아직 어려운 부분이 많다. 또한 다른 사람의 성체줄기세포를 사용할 땐 면역거부 반응이란 문제도 제기될 수 있다. 따라서 자신의 세포를 이용하여 역분화를 유도할 경우 현재 제기되고 있는 문제를 해결 할 수 있다. 이와 같은 취지에서 이미 분화가 진행된 세포를 이용하여 역분화를 유도하는 것이 중요하다. 현재 세포 융합 (Cell fusion), 핵 이식 (Nuclear transfer) 등의 방법을 이용하여 역분화를 유도하는 연구가 진행 중에 있고 또 다른 방법을 이용한 그룹으로 Alexis J (Lancet 2004)는 피부에서 분리한 세포를 신경줄기세포 배양 조건에서 배양했을 때 신경줄기세포의 특성을 가지고 있다고 보고하였다. 또한, Toru K. (Genes & Development 2004)은 올리고덴드로사이트 전구체 (oligodendrocyte　precursors)를 신경줄기세포로 역분화 시켰음을 보고하였다.　 이 그룹은 2000년부터 이와 관련된 논문을 연구하여 발표하였고, 최근 2004년 논문에서 각 분화 단계에서 유전자의 발현이 크로마틴 리모델링 (chromatin remodeling)과 히스톤 변형 (histone modification)에 관련이 있다고 보고하였다.

본 연구에서는 기존의 여러 가지 방법의 문제점을 해결하고, 좀 더 사용하기에 적절한 방법을 확립하고자 하였다. 배아줄기세포 (Embryonic stem cell)의 특성인 자가재생 (self-renewal)을 조절하고 있는 유전자로 알려져 있으며 전사인자 (transcription factor)중의 하나를 선별하고 과발현을 유도하여 신경줄기세포 (neural stem cell)로의 분화를 연구하였다. 우리가 선별한 Nanog 유전자는 줄기세포의 pluripotent한 성격을 유지시키는데 관여하고 있는 유전자이다. Nanog 유전자는 homeodomain protein으로 전사 촉진자 (transcription activator)로 작용하고 있다 (Kaoru Mitsui, 2003).　 Nanog 유전자는 줄기세포의 유지 (maintence)과 분화 (differentiation)를 조절하는 key로 알려져 있다. Nanog 유전자는 배아 줄기세포 (embryonic stem cell)뿐 아니라, 생식세포종 (germ cell tumor)에서도 발현량이 높게 나타나고 있지만 앞에서 언급한 바와 같이 분화가 진행되면 발현량이 감소하여 최종 분화(terminal differentiation)상태에선 발현량이 없다 (Ian Chambers et al.,2003).

Nanog 유전자는 2003년 Cell에 게재된 후 연구가 곳곳에서 진행되어, 현재 Nanog 유전자에 의해 조절되고 있는 유전자에 대한 연구 성과가 발표되고 있다 (Paromita Deb-Rinker et al.,2005, Guangin Pan et al.,2005). 또한, 최근에 BBRC에 게재된 논문에서는 NIH3T3 cell에 Nanog 유전자를 과발현시켰을 경우, 생장 속도 (growth rate)가 빨라진다는 것을 언급하고 있다 (Jingyu Ahang et al., 2005).

이런 배경하에, 이미 분화된 아스트로사이트에 Nanog 유전자를 과발현시키면 자가재생능과 아스트로사이트 (astrocyte), 뉴런 (neuron), 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte)로의 분화능을 가지는 신경줄기세포-유사 세포(neural stem cell-like cell)로 역분화될 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 Nanog 단백질 또는 Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 아스트로사이트 (astrocyte)를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Nanog 단백질 또는 Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계를 포함하는 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 신경줄기세포를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 신경줄기세포를 아스트로사이트, 뉴런 또는 올리고덴드로사이트로 분화시키는 방법을 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 Nanog 단백질 또는 Nanog단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 아스트로사이트 (astrocyte)를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "신경줄기세포-유사 세포 (neural stem cell-like cells)"란 뉴런, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등의 세포로 분화될 수 있는 다분화능을 가지는 줄기세포 (multipotent stem cell)로, 체세포의 역분화에 의하여 기원한 줄기세포이다. 본 발명에서 신경줄기세포-유사 세포는 신경줄기세포로 기술되기도 한다.

본 발명자는 아스트로사이트에서 Nanog를 과발현시킬 경우, 이미 분화된 세포 타입인 아스트로사이트가 다분화능을 가지는 신경줄기세포-유사 세포 (multipotent neural stem-like cell)로 역분화 (de-differentiation)되는 것을 발 견하였다.

본 발명의 Nanog는 단백질 또는 이의 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 제공된다.

본 발명의 조성물에 사용되는 Nanog는 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 Nanog를 포함한다. 또한, 신경세포로의 역분화에 사용되는 본 발명의 Nanog 단백질은 이의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 Nanog 단백질의 변이체를 포함한다.　

Nanog 단백질의 변이체란 Nanog의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있다. 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체이다

바람직하게는, Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 형태로 제공된다.

Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.

상기한 Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.

하나의 바람직한 양태에서, Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열은 Nanog 단백질을 발현하는 벡터인 조성물이다.

본 발명에서 용어,“벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.　

본 발명에서 용어,“작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.　 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.　 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.　 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다.　 바 람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 전달하거나 (Wolff et al. Science,　247:1465-8, 1990: Wolff et al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀 (Liposome), 양이온성 고분자 (Cationic polymer)등을 이용하여 세포내로 전달할 수 있다.　 리포좀은 유전자 전달을 위하여 DOTMA나 DOTAP등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다.

또 다른 바람직한 양태로서, Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 Nanog 단백질을 발현하는 바이러스인 조성물이다.

본 발명에서 용어, “바이러스”는 Nanog 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 패키징 세포로 형질전환 및 감염시켜 제작한, Nanog를 발현하는 바이러스를 의미한다.　

본 발명의 Nanog 단백질을 발현하는 바이러스 제조에 사용될 수 있는 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등을 포함하며 이로 제한되지 않는다.　 바람직하게는, 레트로바이러스이다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, pBabe puro 벡터에 Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열를 포함하는 벡터(pBabe puro Nanog IRES EGFP)를 패키징 세포인 PT67 세포로 형질전환하여 Nanog 단백질을 발현하는 바이러스를 제조하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 Nanog 단백질 또는 Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계를 포함하는 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, (i) 아스트로사이트를 배지에서 배양하는 단계; (ii) Nanog 단백질 또는 nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계; 및 (iii) 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화로 유도하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 (i) 단계에서 아스트로사이트 배양하는 배지는 당 분야에서 신경줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다.　 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.　 또한, 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다. 바람직하게는 bFGF를 포함하는 배지이다.

상기 방법의 (ii) 단계에서 처리되는 Nanog 단백질 또는 nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 상기한 바와 같다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 신경줄기세포에 관한 것이다.

본 발명의 역분화 방법으로 제조된 신경줄기세포는, 신경줄기세포 특이적인 마커인, Nestin, CD133, Sox2이 신경줄기세포와 같은 수준으로 발현하며 일반적인 신경줄기세포와 동일한 분화능을 가지는 것을 확인하였다. 　또한, 본 발명의 역분화 방법으로 제조된 신경줄기세포는 자가재생 (self-renewal)의 특징을 가졌다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 신경줄기세포를 아스트로사이트, 뉴런 또는 올리고덴드로사이트로 분화시키는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 조성물과 방법에 따라 제조된 신경줄기세포를 당 분야에 알려진 통상적인 아스트로사이트, 뉴런 또는 올리고덴드로사이트 분화 조건에서 분화를 유도할 경우, 각각의 세포로 분화가 유도되는 것을 각 세포 특이적인 마커의 발현으로 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 연구방법

1. Ink4a/Arf^-/-astrocyte, p53^-/-astrocyte와 마우스 신경줄기세포 배양

Ink4a/Arf^-/-astrocyte, p53^-/-astrocyte는 FBS (HyClone) 10%,　 penicillin/streptomycin 1%, L-glutamine 1%(cambrex)가 포함되어 있는　 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM (high glucose, Hyclone)) 에서 배양하였다. 대조군으로 사용된 neural stem cell은 E13.5일령의 mouse에서 분리하여 Insulin(sigma), apo-transferrin(sigma), selenium(sigma), progesteron(sigma), penicillin/streptomycin(cambrex)가 포함되어 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium/F12(DMEM/F12, Gibco) 배지(N2)에 serum-replacement인 B27(Gibco)과 human recombinant basic FGF, human recombinant EGF(R&D) 를 첨가하여 배양을 하였다.

2. 레트로바이러스-매개 감염 (Retroviral-mediated infection)

pBabe puro Nanog IRES EGFP (human Nanog (NCBI accession No.: NM_024865) cDNA와 pIRES-EGFP vector에서 유래한 IRES EGFP부분을 pBabe puro에 리가이션하여 제조하였다) 와 pBabe puro EGFP를 PT67 packaging cell line (Clontech)에 Lipofectamine (Invitrogen)을 사용하여 형질전환 (transfection)을 한 후 푸로마이신 (puromycine)(3ug/ml)(BD science)로 선별하였다. 이와 같이 만들어진 세포주 (cell line)는 90% 이상 되었을 때 상등액 (supernatant)을 취하여 0.45um (Millipore)로 필터링 (filtering)을 하여 세포 잔해 (cell debris)를 제거한 후에 polybrene (sigma)을 첨가하여 10시간 간격으로 분리한 마우스 아스트로사이트 세포에 두 번 감염 (infection)을 하였다. 그 후에 푸로마이신 (puromycine)(0.5ug/ml)로 선별하였다.

3. 성장 커브 분석 및 저 밀도 씨딩 분석 (Growth curve analysis and low density seeding assay)

12 웰 플레이트에 1×10⁴의 세포를 씨딩을 하고 12시간 후부터 6일 동안 매일 0.01% crytal violet stain을 하였다. 10% 아세트산 (acetic acid)로 추출(extract)을 한 후, spectrophotometer 600nm에서 밀도를 측정하여 세포 성장 속도 (cell growth rate)를 확인하였다. 저 밀도 씨딩 분석 (Low density seeding assay)는 6 웰 플레이트에 300개의 세포를 씨딩시킨 후, 2주일 후에 다시 0.01% crystal violet으로 염색 (stain)을 하여 성장 속도를 확인하였다.

4 역분화 유도(Induction of de-differentiation)

역분화는 신경줄기세포 배양 조건과 동일하게 배양하면서 유도하였다. 이 때 두 가지 방법을 사용하여 배양하였으며 그 중 하나는 6 웰 플레이트에 1×10⁵의 세 포를 플레이팅을 한 후 12시간 후에 Insulin(sigma), apo-transferrin(sigma), selenium(sigma), progesteron(sigma), penicillin/streptomycin(cambrex)가 포함되어 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium/F12(DMEM/F12, Gibco) 배지(N2)에 serum-replacement인 B27(Gibco)과 human recombinant basic FGF, human recombinant EGF(R&D)를 첨가한 교체하여 배양하는 것이다. 매일 bFGF를 처리하고, 배지는 이틀에 한 번 바꿔주면서 배양하였다. 또 다른 한 가지 방법은 적정 배양 조건에서 배양하던 세포를 트립신화 (trypinization)한 후에 3×10⁵씩 60mm 박테리아 배양 플레이트 (bacterial culture plate)에 씨딩을 하여 Insulin(sigma), apo-transferrin(sigma), selenium(sigma), progesteron(sigma), penicillin/streptomycin(cambrex)가 포함되어 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium/F12(DMEM/F12, Gibco) 배지(N2)에 serum-replacement인 B27(Gibco)과 human recombinant basic FGF, human recombinant EGF(R&D) 첨가된 배지에서 배양을 하는 것이다.

5. 면역세포화학법 (Immunocytochemistry) 방법으로 과발현 (overexpression) 확인 및 각 마커(marker) 확인

Neurosphere는 4% paraformaldehyde (EMS)로 1시간동안 4℃에서 고정 (fixation)을 한 후 20% 수크로즈 (sucrose)를 첨가하여 4℃에서 shaking overnight을 하였다. 그 후 OCT compound로 8 웰 챔버 슬라이드 (8 well chamber slide)(Nunc)에 cryopreservation을 하였다. 8-10um로 section을 한 후 염색을 하였다. 10% Normal goat serum (JacksonImmunoresearch) +0.1% BSA (sigma)+0.3% Triton X-100 (sigma)이 포함된 PBS로 blocking을 한후 anti-nestin (chemicon), anti-CD133 (MACS), anti-Sox2 (sigma), anti-Nanog (R&D)을 사용하여 4℃에서 overnight로 반응을 시킨 후에 RT에서 anti-mouse-cy3 (Jackson Immunoresearch), anti-rabbit-FITC (Molecular probe), anti-goat-cy3 (Zymed)로 반응을 시킨 후 마지막으로 DAPI(sigma)를 사용하여 핵 염색 (nuclear stain)을 하였다. 염색을 한 후에 Zeiss confocal (Carl Zeiss)로 확인을 하였다. 분화된 세포의 경우 위와 같은 방법으로 염색을 하였고, 이 때 사용한 항체는 anti-GFAP (Dako), anti-S100β (Zymed), anti-β-tubulin Ⅲ (covance), anti-Map2a (sigma), anti-TH (sigma), anti-O4(R&D)m anti-CNPase(chemicon)였다.

6. 인 비트로 분화 (In vitro differentiation)

PLO (poly-L-ornithinte) (sigma)와 laminin 혹은 fibronectin(sigma)으로 코팅 한 후에,　아래와 같은 분화 조건에서 배양을 하였다.

아스트로사이트(astrocyte)로의 분화는 10% FBS (Hyclone)이 포함된 DMEM(Hyclone, high glucose)에 human recombinant bFGF와 EGF(R&D)를 첨가하거나 CNTF(recombinant rat ciliary　 neurotrophic factor(upstate)에서 5-7일 동안 배 양하여 분화를 유도하였다.

뉴런(neuron)으로의 분화는 serum replacement인 B27(Gibco)이 포함되어 있는 N2 배양액에 human recombinant FGF를 4일 동안 처리를 한 후, 8일 동안은 FGF를 없는 배지에서 배양을 하였다. 다른 방법으로는 RA(retinoic acid, sigma)를 1-10μM으로 첨가하여 7-14일 동안 배양을 하였다.　 또 다른 방법으로 사용한 것은 1-10Mm의 농도의 VPA(valproic acid, sigma)를 1-10μM 농도의 RA(retinoic acid, sigma)과 함께 첨가하여 7-14일 동안 배양하여 분화를 유도하였다.

올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)로의 분화는 serum replacement인 B27이 첨가된 N2 배양액에 PDGF-AA(platelet derived growth factor-AA, R&D)와 T3(3,3,5-triiodo-L-thyronine, sigma), human recombinant basic FGF와 EGF(R&D)를 함께 첨가하여 20일 동안 배양하여 분화를 유도하였다.

위에서 언급한 조건에서 배양을 하고, 각각의 분화된 세포의 모양을 관찰하면서, 각각의 분화 마커로 사용되는 항체를 사용하여 면역세포화학법(mmunocytochemstry)으로 확인을 하였다.

실시예 2: 연구 결과

이미 분화가 진행된 Ink4a/Arf^-/-astrocyte, p53^-/-astrocyte에 retroviral transduction system을 사용하여 Nanog(human) 유전자를 과발현시켰다. 면역세포화 학법 (Immunocytochemistry)로 과발현 여부를 Nanog 항체를 사용하여 확인을 하고 유전자 바로 뒤에 있는 GFP의 발현으로 다시 확인을 하였다 (도 1).

그 후 신경줄기세포의 배양 조건을 사용하여 역분화를 유도하였다. 먼저 일정한 수 (1×10⁵)의 세포를 6 웰 플레이트에 씨딩을 한 후에 12시간 후부터 신경줄기세포 (neural stem cell) 배양 조건에서 배양을 한 결과 배양한지 3-4일여만에 신경줄기세포와 같은 모습을 보임을 관찰할 수 있었다. 또한 일정한 수 (3×10⁵)의 세포를 60mm 박테리아 플레이트(bacterial plate)에 신경줄기세포와 동일한 배양 조건에서 배양을 한 결과 여전히 신경줄기세포와 같은 모습을 보이고 있음을 관찰할 수 있었다. 반면에 대조구 벡터인 pBabe puro EGFP가 감염된 세포에서는 전자의 방법으로 했을 때는 neurosphere가 형성되지 않았으나, 후자의 방법으로 했을 때는 neurosphere가 형성되고 있는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 Nanog 유전자가 감염되어 발현되고 있는 세포보다 크기와 수가 적었다 (도 2). 일주일이 지난 후부터 neurosphere를 다른 플레이트로 옮긴 후 계속해서 배양하였을 때도 신경줄기세포와 동일한 모습을 보였다. Nanog 유전자를 통해 만들어진 세포가 자가재생 (self-renewal)의 성격이 있는지 subsphere formation assay를 한 결과 닷 단세포에서 sphere가 형성되는 것을 1주정도 지난 후부터 관찰할 수 있었다 (data not shown).

이 세포가 신경줄기세포와 동일한 특성을 가지는 세포인지를 확인하기 위해서 각각의 마커를 사용하여, 면역세포화학법을 실시하였다. Nestin, CD133, Sox2로 신경줄기세포에서 가장 많이 발현되고 있는 마커를 사용하여 염색을 한 결과 신경줄기세포에서 발현되고 있는 것과 동일하게 neural stem cell-like cell에서도 발현되고 있었다. 이 때 만들어진 neurosphere를 cryo-section을 하여 확인을 한 결과 nestin, CD133, Sox2의 발현을 확인 할 수 있었다 (도 3).

이렇게 만들어진 neurosphere를 하나씩 PLO와 laminin으로 코딩을 한 4 웰 플레이트에 씨딩하고 아스트로사이트의 배양 조건에서 배양을 하였다. 이와 같은 방법으로 각각 6개의 클론을 얻었다. 성장 속도를 비교하여, 가장 성장 속도가 빠른 2개의 클론을 선별하였다. 성장 커버 분석을 통해 Ink4a/Arf^-/-astrocyte에 Nanog 유전자가 과발현된 경우는 #2, #4, p53^-/-astrocyte에 Nanog 유전자가 과발현된 경우는 #4, #6이 6개의 클론중에서 성장 속도가 빨랐다 (도 4).

Neural stem cell-like cell이 neural stem cell과 같이 분화 능력이 있는지 확인하기 위해서 아스트로사이트 (astrocyte), 뉴런 (neuron), 올리고덴트로사이트 (oligodendrocyte)로의 분화를 상기한 방법으로 유도하고, 분화 유무를 각각의 분화 마커에 특이적인 항체를 사용하여 확인한 결과, 신경줄기세포와 같이 세 가지 방향으로 분화가 되는 것을 확인할 수 있었다. 우선 아스트로사이트로 분화를 유도했을 때. GFAP, S100이 발현되고 있었고, 뉴런으로 분화는 β- tubulin Ⅲ (Tuj1)와 Map2a의 발현으로 확인을 하였다. 또한 올리고덴트로사이트의 마커인 O4, CNPase역시 올리고덴트로사이트로의 분화 조건을 주었을 때 발현되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 5).

이 연구를 통해서 Nanog 유전자는 Ink4a/Arf^-/-astrocyte, p53^-/-astrocyte세포를 neural stem cell-like cell로 역분화시키는데 관여하는 중요한 유전자이며, 이렇게 역분화된 neural stem cell-like cell은 아스트로사이트, 뉴런, 올리고덴트로사이트로 다시 분화되는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 기술한 바와 같이, Nanog를 이용하여 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도할 수 있으며, 역분화된 신경줄기세포는 다양한 질병치료에 사용될 수 있다.

Claims (10)

1. Nanog 단백질 또는 Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 아스트로사이트 (astrocyte)를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 Nanog 단백질을 발현하는 벡터인 조성물.
3. 제1항에 있어서, Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 Nanog 단백질을 발현하는 바이러스인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 역분화된 신경줄기세포가 아스트로사이트 (astrocyte), 뉴런 (neuron) 및 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte)로의 분화능을 가지는 신경줄기세포인 조성물.
5. Nanog 단백질 또는 Nanog 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계를 포함하는 생체 외(in vitro) 또는 인간을 제외한 동물의 생체 내(in vivo)에서 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 역분화된 신경줄기세포가 아스트로사이트, 뉴런 및 올리고덴드로사이트로의 분화능을 가지는 신경줄기세포인 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 방법이 (i) 아스트로사이트를 배지에서 배양하는 단계; (ii) Nanog 단백질 또는 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계; 및 (iii) 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화로 유도하는 단계를 포함하는 방법.
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