CN101400791A - 使用nanog将星形胶质细胞去分化为神经干细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种使用Nanog诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞的组合物和方法。该去分化的神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。

Description

使用NANOG将星形胶质细胞去分化为神经干细胞
技术领域
神经干细胞(NSCs)是神经系统的祖细胞的亚型，它具有分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的能力。从中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)开始，神经干细胞形成多细胞神经球，它们在各自的背景条件下分化为胶质系和神经系细胞(SallyTemple等人，2001)。这些神经干细胞用于治疗不治之症，并且研究其作为用于细胞治疗的潜在方法。由于神经干细胞是没有存在太多伦理问题的成体干细胞，所以对其进行了广泛研究。近来活跃开展的去分化研究正在增强成体干细胞的重要性。成体干细胞比胚胎干细胞更容易获得，但是在其实际应用上仍有许多困难。此外，除非使用自身来源的干细胞，否则免疫排斥反应也是一个问题。因此，使用病人自身的细胞诱导去分化可以解决当前的问题。为了这个目的，必须诱导已经分化了的细胞去分化。现在，正在进行广泛研究，使用例如细胞融合和核移植的方法来诱导去分化。在使用不同方法的另一个研究组中，Alexis J.报道了分离自皮肤的细胞在神经干细胞培养条件下培养时具有神经干细胞的特性(Lancet 2004)。此外，Toru K.成功地将少突胶质细胞前体去分化为神经干细胞(Genes & Development 2004)。这个研究组自2000年起已经发表了关于此问题的文章，并且在2004年的一篇文章中报道了各阶段的基因表达与染色质重塑和组蛋白修饰有关。
背景技术
在本发明中，提出了一种前述介绍方法的问题的解决途径，并且建立了一种新的适合的使用方法。在本发明中，选择并过表达一种已知调控自我更新的胚胎干细胞特性的转录因子来研究其分化为神经干细胞。这个选择的基因，鉴别为“Nanog”基因，与维持胚胎干细胞的多能性(plurapotency)有关。作为同源结构域蛋白质之一，Nanog蛋白质起转录激活子作用(Kaoru Mitsui，2003)。Nanog基因已知为调控干细胞的保持和分化的关键因子。Nanog基因不仅在胚胎干细胞还在生殖细胞肿瘤中大量表达，但是如上所述，由于表达量随着分化过程降低，它不在终末分化期中表达(Ian Chambers等人，2003)。由于Nanog基因2003年在Cell上第一次公开，随后进行了大量其它研究。现在，发表了Nanog基因调控的基因的结果(Paromita Deb-Rinker等人，2005，GuanginPan等人，2005)。此外，近来BBRC上发表的一篇文章显示NIH3T3细胞的生长率随着Nanog基因的过表达而增加(Jingyu Ahang等人，2005)。
根据本发明，本发明者在此背景下进行了深入和彻底的研究，获得的发现是其中Nanog的过表达诱导已分化的星形胶质细胞去分化为能够自我更新并分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的神经干细胞样的细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞的组合物，其包含Nanog蛋白质或包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料。
本发明的另一个目的是提供一种诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞的方法，其包含用Nanog蛋白质或包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理的步骤。
本发明的又一个目的是提供使用此方法制备的神经干细胞。
本发明的再一个目的是提供一种分化去分化的神经干细胞为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的方法。
附图简述
本发明的上述和其它目的、特征和其它优点将从以下附图的详述中更清楚地理解，其中：
图1显示了免疫细胞化学分析的Nanog蛋白质的过表达；
图2显示了诱导去分化，其中显示了球形成(A)和直接球形成(B)(左：相差，右：GFP检测)(当在适合于神经干细胞的条件下培养单细胞时形成直接球，而仅在适合于星形胶质细胞的培养条件下后，在适合于神经干细胞的条件下培养单细胞并稳定12小时时形成球)；
图3显示了用免疫细胞化学分析的神经干细胞标记物的表达，其中分化为神经干细胞(A至C)和神经干细胞样的细胞(Ink4a/Arf-/-星形胶质细胞Nanog#2，#4，p53-/-星形胶质细胞Nanog#4，6)(D至K)；
图4显示了生长曲线分析(A)和低密度接种检测(B)测定的Nanog基因对细胞生长的影响；和
图5显示了神经干细胞样的细胞体外分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞(A-C：神经干细胞、D-K：神经干细胞样的细胞、D-G：Ink4a/Arf-/-星形胶质细胞NanogGFP#2、H-J：#4、K：p53-/-星形胶质细胞Nanog GFP #4、L-O：#6)。
实现本发明的最佳方式
根据本发明的实施例，本发明涉及一种能够诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞的组合物，其中包含Nanog蛋白质或包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料。
如本文所用的术语“神经干细胞样的细胞”表示从体细胞去分化的能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多能干细胞。在本发明中，神经干细胞样的细胞还描述为神经干细胞。
本发明新近公开了当Nanog过表达时，虽然已经分化，星形胶质细胞仍可以去分化为多能神经干细胞样的细胞。
在本发明中，Nanog以蛋白质或编码Nanog蛋白质的核苷酸形式提供。
只要是来自于哺乳动物，例如人、马、绵羊、猪、山羊、骆驼、羚羊和狗，任何Nanog均可用于本发明的组合物。此外，本发明的用于去分化为神经细胞的Nanog蛋白质可以是野生型或其变异体。
术语“Nanog蛋白质变异体”是指自然或人工产生的Nanog蛋白质，其中Nanog蛋白质在氨基酸序列上由于氨基酸的缺失、插入、非保守取代或保守取代或它们的组合而与野生型有一个或多个氨基酸不同。变异体是与天然蛋白质具有相同生物活性的功能同等物，尽管它们的物理和/或化学性质被修饰。优选地，变异体增强了对物理和化学环境的结构稳定性或生理活性。
在本发明的一个优选实施方案中，Nanog是包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料的形式。
编码Nanog蛋白质的核苷酸序列是编码野生型或上述变异体类型的Nanog蛋白质的核苷酸序列，其中序列的一个或多个碱基可在碱基的缺失、插入、非保守取代或保守取代或它们的组合上不同。此核苷酸序列可分离自天然产生的物质或用化学方法合成。
编码Nanog蛋白质的核苷酸序列既可以是单链也可以是双链的DNA分子(基因组、cDNA)或RNA分子。
在本发明的一个优选实施例中，包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列包含在允许Nanog蛋白质表达的载体中。
如本文所用的术语“载体”是指包含DNA序列的DNA构建体，该DNA序列被可操作地连接于能够影响所述DNA在适合的宿主细胞中表达的控制序列上。
如本文所用的术语“可操作地连接”是指核酸表达调控序列和编码靶蛋白质的第二核酸序列间的功能性连接，以能完成一般的功能。重组载体的可操作地连接可使用本领域众所周知的基因重组技术制备，并且位点特异性DNA的断裂和连接可使用本领域公知的酶进行。
适合于本发明使用的载体包括信号序列或用于膜靶向或分泌的前导序列或表达调控元件，例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸化信号和增强子，并且可根据它们的目的以多种形式构建。载体的启动子可以是组成型的或是可诱导的。此外，表达载体包括允许选择包含载体的宿主细胞的选择标记，并且当它们是复制的表达载体时包括一个复制起点。此载体可以是自我复制的，或者可以是整合至宿主细胞的DNA上。
本发明中有用的载体可以是质粒载体、粘粒载体或病毒载体，优选病毒载体。病毒载体的实例包括但是不限制于来源于逆转录病毒例如HIV(人类免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽类肉瘤病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)等等、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒的载体。
包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料可以载体的形式作为裸露DNA(Wolff等人，Science，247：1465-8，1990；Wolff等人，J.Cell Sci.103：1249-59，1992)，或在例如脂质体或阳离子聚合物的帮助下引入细胞。为了在基因转染中使用，脂质体是阳离子磷脂，例如DOTMA和DOTAP制成的磷脂膜。当与负电荷核苷酸以一定比例混合时，阳离子脂质体形成核苷酸-脂质体复合物。
在本发明的另一个优选实施方案中，包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料可以是在表达其中的Nanog蛋白质的病毒。
如本文所用的术语“病毒”涉及用携带编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的病毒载体转化或转染包装细胞制备的Nanog表达病毒。
根据本发明的Nanog表达病毒的制备中有用的病毒实例包括但是不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒。优选逆转录病毒。在以下实施例中，Nanog表达病毒通过转化携带编码Nanog蛋白质(pBabe puro Nanog IRES EGFP)的核苷酸序列的重组pBabe puro载体至PT67包装细胞中制备。
在另一个实施例中，本发明涉及诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞的方法，包含用Nanog蛋白质或包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理的步骤。
更详细地，此方法包含步骤(i)在培养基中培养星形胶质细胞；(ii)用Nanog蛋白质或包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理培养基；和(iii)诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞。
任何用于培养神经干细胞的常规培养基可以用作在步骤(i)中星形胶质细胞的培养基。培养基通常包含碳源、氮源和微量元素组分。此外，培养基可包括抗生素，例如青霉素、链霉素和庆大霉素。培养基优选包含bFGF。
步骤(ii)中用于处理细胞的Nanog蛋白质或包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料如上所述。
在另一个实施方案中，本发明涉及如前所述方法制备的神经干细胞。
已证实通过根据本发明的去分化制备的神经干细胞表达同样水平的神经干细胞特异性标记物Nestin、CD133和Sox2，并且具有与一般神经干细胞相同的分化能力。通过根据本发明的去分化制备的神经干细胞还显示了自我更新的特性。
在另一个实施方案中，本发明涉及分化根据前述方法去分化的神经干细胞为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的方法。
当使用本发明的组合物和方法去分化的神经干细胞处于本领域众所周知的用于星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的各自的分化条件下时，分化为各自细胞可通过检测特异于各自细胞的标记物的表达来监测。
本发明的更好理解可通过以下实施例获得，它们用于理解而不用于限制本发明。
实施例1：实验方法
1.Ink4a/Arf-/-星形胶质细胞、p53-/-星形胶质细胞和小鼠神经干细胞的培养
Ink4a/Arf-/-星形胶质细胞和p53-/-星形胶质细胞在补充10％FBS(HyClone)、1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺(Cambrex)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM(高糖，HyClone))中培养。用作对照的神经干细胞分离自小鼠(E13.5)且在包含胰岛素(Sigma)、转铁蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/链霉素(Cambrex)，补充B27无血清(Gibco)、人重组碱性FGF和人重组EGF(R&D)的达尔伯克改良伊格尔培养基/F12(DMEM/F12，Gibco)(N2)中培养。
2.逆转录病毒介导的感染
pBabe puro Nanog IRES EGFP(来源于pIRES-EGFP载体的人Nanog(NCBI登记号：NM_024865)cDNA和IRES EGFP与pBabe puro连接以构建pBabe puro Nanog IRES EGFP)或pBabe puro EGFP使用脂质体转染试剂(Lipofectamine)(Invitrogen)转染至PT67包装细胞株(Clontech)中且在嘌呤霉素(3μg/ml)(BD science)存在下选择。转化细胞株生长至90％或更高密度(confluency)后，上清液通过过滤器(0.45μm)(Millipore)以除去细胞碎片，然后上清液两次使用以感染星形胶质细胞，两次间间隔10小时使用1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)(Sigma)分离。随后在嘌呤霉素(0.5μg/ml)存在下进行选择。
3.生长曲线分析和低密度接种检测
以每孔1×104个细胞接种至12孔板12小时后，每天用0.01％结晶紫染色共六天。醋酸提取后，使用分光光度计在600nm检测密度以确定细胞生长率。对于低密度接种检测，每孔300个细胞接种于6孔板中，且两周后用0.01％结晶紫染色以监测生长率。
4.诱导去分化
在与用于神经干细胞的相同的培养条件下诱导去分化。作为一个方法，细胞培养使用两种不同的方法来进行。细胞以1×105个细胞/孔的密度接种于6孔板上并在培养基换为补充B27无血清(Gibco)、人重组碱性FGF和人重组EGF(R&D)、包含胰岛素(Sigma)、转铁蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/链霉素(Cambrex)的新鲜达尔伯克改良伊格尔培养基/F12(DMEM/F12，Gibco)(N2)时培养。细胞每天用bFGF处理，且培养基每隔一天换为新鲜培养基。或者，已在适当条件下培养的细胞用胰蛋白酶作用，然后以3×105个细胞的密度接种至60mm细菌培养平板上。补充B27无血清(Gibco)、人重组碱性FGF和人重组EGF(R&D)、包含胰岛素(Sigma)、转铁蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/链霉素(Cambrex)的达尔伯克改良伊格尔培养基/F12(DMEM/F12，Gibco)用作培养基。
5.通过免疫细胞化学测定过表达和各自的标记物
用4％多聚甲醛(EMS)在4℃固定1小时后，在神经球在4℃振动培养过夜前加入20％蔗糖。然后，神经球使用OCT化合物低温冷藏于8孔小室载玻片(Nunc)中且在切成8～10μm后染色。用包含10％正常羊血清(Jackson ImmunoResearch)+0.1％BSA(Sigma)+0.3％聚乙二醇辛基苯基醚X-100(Sigma)的PBS封闭后，切片用抗-nestin(Chemicon)、抗-CD133(MACS)、抗-Sox2(Sigma)和抗-Nanog(R&D)在4℃培养过夜然后与抗-小鼠-cy3(Jackson ImmunoResearch)、抗-兔-FITC(分子探针)和抗-山羊-cy3(Zymed)室温反应，最后用DAPI(Sigma)核染色。蔡司共焦透镜(Carl Zeiss)用于染色后的检查。分化的细胞以上述相同方式染色。在这方面，抗-GFAP(Dako)、抗-S100β(Zymed)、抗-β-微管蛋白III(Covance)、抗-Map2a(Sigma)、抗-TH(Sigma)、抗-04(R&D)和抗-CNP酶(Chemicon)用作抗体。
6.体外分化
用PLO(聚-L-鸟氨酸)(Sigma)和层粘连蛋白或纤维粘连蛋白(Sigma)包被后，细胞在下面给出的分化条件下培养。
为了分化为星形胶质细胞，细胞培养在补充10％FBS(HyClone)的DMEM(HyClone，高糖)中在人重组bFGF和EGF(R&D)或CNTF(重组大鼠睫状神经营养因子)(Upstate)存在下进行5～7天。
通过在包含B27(Gibco)无血清、补充人重组FGF的N2培养基中培养细胞4天并然后在无FGF培养基中培养8天诱导其分化为神经元。或者，细胞在1～10μm RA(维甲酸，Sigma)存在下培养7～14天。作为其它选择，细胞在1～10mM VPA(丙戊酸，Sigma)和1～10μm RA(维甲酸，Sigma)的共存在下培养7～14天以20天诱导分化为神经元。
通过在补充B27无血清的N2培养基中在PDGF-AA(血小板衍生的生长因子-AA，R&D)、T3(3，3，5-三碘-L-甲腺原氨酸，Sigma)、人重组碱性FGF和EGF(R&D)的存在下培养诱导分化为少突胶质细胞。
当在前述分化条件下培养时，监测细胞的形态学并使用特异于细胞的各自分化标记物的抗体进行免疫细胞化学以检测分化结果。
实施例2：结果
人Nanog基因使用逆转录转导系统在已分化的Ink4a/Arf-/-星形胶质细胞和p53-/-星形胶质细胞中过表达。使用Nanog抗体通过免疫细胞化学证实过表达并通过检测正在此基因下游定位的GFP的表达再次证实(图1)。
然后，使用用于神经干细胞的培养条件诱导去分化。星形胶质细胞以每孔1×105个细胞的密度接种于6孔板上，并且12小时后，细胞在适合于神经干细胞的条件下培养。培养3-4天内，观察到细胞具有神经干细胞样的形态。当细胞以3×105个细胞/板的密度接种于60mm细菌平板上且在与神经干细胞相同的条件下培养时，还观察到它们具有神经干细胞的形态。相反，当培养根据前述方法用对照载体pBabe puro EGFP转染的细胞时，没有形成神经球。在后面的方法中，观察神经球，但是与表达Nanog基因的细胞相比，其在尺寸上较小并且在数量上较少(图2)。一周后，观察到神经球具有与当神经干细胞转移至新平板并在其上培养时相同的形态。为了检测用Nanog基因去分化的细胞是否能够自我更新，进行子球(subsphere)形成检测。结果是一周后在单细胞中形成的球(数据未列出)。
为了发现这些细胞是否具有与神经干细胞相同的特性，使用各自的标记物进行免疫细胞化学。在这方面，染色后，主要大量表达于神经干细胞的标记物nestin、CD133和Sox2还以相同方式在神经干细胞中观察到。此外，因此形成的神经球的冷冻切片确证了nestin、CD133和Sox2的表达(图3)。
由此形成的神经球细胞接种于PLO和层粘连蛋白包被的4孔板且在星形胶质细胞的培养条件下培养。结果获得六个克隆。选择比其它克隆显示更快生长率的两个克隆。当Ink4a/Arf-/-星形胶质细胞中Nanog基因过表达时，在#2和#4克隆中观察到最快的生长率，当p53-/-星形胶质细胞中Nanog基因过表达时，在#4和#6克隆中观察到最快的生长率(图4)。
为了检测神经干细胞样的细胞是否能像神经干细胞一样分化，以与上述相同的方式诱导分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。通过用针对各自标记物的特异性抗体的分析，发现神经干细胞样的细胞像神经干细胞一样分化为细胞的三种类型。分化为星形胶质细胞的鉴别用GFAP和S100的表达来进行，分化为神经元的鉴别用β-微管蛋白III(Tuj1)和Map2a的表达来进行。此外，用于分化为少突胶质细胞的04和CNPO酶的表达用其分化条件来鉴别(图5)。
总之，通过此研究获得的数据说明Nanog基因在Ink4a/Arf-/-星形胶质细胞和p53-/-星形胶质细胞去分化为神经干细胞样的细胞中起着重要作用，并且这些去分化的神经干细胞样的细胞可以分化回星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。
工业应用性
如前描述，Nanog在诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞中是有用的，并且去分化的神经干细胞可用于多种疾病的治疗。
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11.T.Kuroda，M.Tada，H.Kubota，H.Kimura，S.Y.Hatano，H.Suemori，N.Nakatsuji and T.Tada.Octamer and Sox elements are required for transcriptionalcis regulation of Nanog gene expression.Mol.Cell Biol.2005年；25：2475-485

Claims (10)

1.一种用于诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞的组合物，其中星形胶质细胞包含Nanog蛋白质或包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料是允许Nanog蛋白质表达的载体。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料是表达所述Nanog蛋白质的病毒。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述去分化的神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。
5.一种用于诱导星形胶质细胞去分化为神经干细胞的方法，所述方法包含用Nanog蛋白质或包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述去分化的神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。
7.如权利要求5所述的方法，所述方法包含以下步骤：
(i)在培养基中培养星形胶质细胞；
(ii)用Nanog蛋白质或包含编码Nanog蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理；和
(iii)诱导所述星形胶质细胞分化为神经干细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述步骤(i)的培养基包含bFGF。
9.一种使用权利要求5的方法制备的神经干细胞。
10.一种将使用权利要求5的方法制备的神经干细胞分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的方法。
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