KR100794359B1 - Ｓｈｈ를 이용한 아스트로사이트의 신경줄기세포로의역분화 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Shh (sonic hedgehog)를 이용하여 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물과 방법에 관한 것으로, 역분화된 신경줄기세포는 아스트로사이트, 뉴런 및 올리고덴드로사이트로의 분화능을 가진다.

Shh(sonic hedgehog), 아스트로사이트 (astrocyte), 신경줄기세포 (neural stem cell), 역분화 (de-differentiation)

Description

Ｓｈｈ를 이용한 아스트로사이트의 신경줄기세포로의 역분화{De-differentiation of astrocytes into neural stem cell using Shh}

도 1은 Shh 처리에 의한 아스트로사이트의 신경줄기세포로의 역분화를 보여준다. A, B 는 마우스 아스트로사이트에 Shh를 처리한 후 형성된 neurosphere를 C) 신경줄기세포에 Shh를 처리한 후 형성된 neurosphere를 나타낸다.

도 2는 신경줄기세포 특이적인 마커의 발현을 면역세포화학방법을 이용하여 확인한 결과이다.

도 3은 신경세포-유사 세포를 인 비트로 분화 (in vitro differentiation)을 유도하였을 때 아스트로사이트, 뉴런, 올리고덴드로사이트로 각각 분화되는 것을 보여준다. A-C 는 Neural stem cell 을, D-G 는 Neural stem cell like cell을 나타낸다.

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중추신경계 (Neural stem cells: NSCs)은 신경계에 존재하는 전구세포 (progenitor cell)의　서브타입 (subtype)으로 아스트로사이트 (astrocytes), 올리고덴드로사이트 (oligodendrocytes), 뉴런 (neurons)으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 중추신경계 (Central nervous system: CNS)와 말초신경계 (peripheral nervous system: PNS)에서 분리하여 Multicellular neurospheres를 만들 수 있고 이 세포가 각각의 조건에서 glial lineage와 neural lineage로 분화하게 된다 (Sally Temple et al. 2001). 이 신경줄기세포는 난치병의 치료에 응용되어 현재 세포치료의 한 가지 방법으로 연구되고 있다. 이러한 신경줄기세포는 성체줄기세포의 하나로 윤리적인 문제가 거의 없기 때문에 많이 연구되고 있는 실정이다. 최근에 역분화에 관련된 연구가 진행되고 있는 상황에서 성체줄기세포의 중요성이 좀 더 강조되고 있다. 이러한 성체줄기세포는 배아줄기 세포보다 얻기 쉽지만 실제로 적용하기에 아직 어려운 부분이 많다. 또한 다른 사람의 성체줄기세포를 사용할 땐 면역거부 반응이란 문제도 제기될 수 있다. 따라서 자신의 세포를 이용하여 역분화를 유도할 경우 현재 제기되고 있는 문제를 해결 할 수 있다. 이와 같은 취지에서 이미 분화가 진행된 세포를 이용하여 역분화를 유도하는 부분이 중요하다. 현재　세포 융합 (Cell fusion), 핵치환 (Nuclear transfer)등의 방법을 이용하여 역분화를 유도하는 연구가 진행 중에 있고 또 다른 방법을 이용한 그룹으로 Alexis J (Lancet 2004)는 피부에서 분리한 세포를 신경줄기세포 배양 조건에서 배양했을 때 신경 줄기세포의 특성을 가지고 있다고 보고하였다. 또한, Toru K. (Genes & Development 2004)은 올리고덴드로사이트 전구체 (oligodendrocyte precursors)를 신경줄기세포로 역분화시켰음을 보고하였다.　 이 그룹은 2000년부터 이와 관련된 논문을 연구하여 발표하였고, 최근 2004년 논문에서 각 분화 단계에서 유전자의 발현이 크로마틴 리모델링 (chromatin remodeling)과 히스톤 수식 (histone modification)에 관련이 있다고 보고하였다.

본 연구에서는 기존의 여러 가지 방법의 문제점을 해결하고, 좀 더 사용하기에 적절한 방법을 확립하고자 하였다. 발생 프로그램 (Developmented program)에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 헤지호그 패밀리 (hedgehog family)중에서 신경줄기세포 (Neural stem cell)에 작용하는 Sonic Hedgehog를 사용하였다. Shh는 Gli1에서 Bmi-1 그리고 N-myc으로 이어지는 신호전달 경로 (signaling pathway)의 상위단계 조절인자이다. Shh는 발생상에서 신경관(neural tube)형성에 작용하고, follicular epithelium의 distal tips에서 발현되고 있다. 또한, 신경전구세포 (neural progenitor cell)의 중식을 증가시킨다고 알려져 있다(Pleasantin Mill et al., 2005).

이런 배경하에, Shh를 이미 분화된 마우스 아스트로사이트에 처리하면 아스트로사이트 (astrocyte), 뉴런 (neuron), 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte)로의 분화능을 가지는 신경줄기세포-유사 세포(neural stem cell-like cell)로 역분화시킬 수 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 Shh 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 아스트로사이트 (astrocyte)를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Shh 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계를 포함하는 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 신경줄기세포를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 신경줄기세포를 아스트로사이트, 뉴런 또는 올리고덴드로사이트로 분화시키는 방법을 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 Shh 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 아스트로사이트 (astrocyte)를 신경줄 기세포로 역분화를 유도하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "신경줄기세포-유사 세포 (neural stem cell-like cell)"란 뉴런, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등의 세포로 분화될 수 있는 다분화능을 가지는 줄기세포 (multipotent stem cell)로, 체세포의 역분화에 의하여 기원한 신경줄기세포이다. 본 발명에서 신경줄기세포-유사 세포는 신경줄기세포로 기술되기도 한다.

본 발명자는 아스트로사이트에서 Shh를 과발현시킬 경우, 이미 분화된 세포 타입인 아스트로사이트가 다분화능을 가지는 신경줄기세포-유사 세포 (multipotent neural stem-like cell)로 역분화 (de-differentiation)되는 것을 발견하였다.

본 발명의 Shh는 단백질의 형태로 제공된다.

본 발명의 조성물에 사용되는 Shh는 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 Shh를 포함한다. 또한, 신경세포로의 역분화에 사용되는 본 발명의 Shh 단백질은 이의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 Shh 단백질의 변이체를 포함한다.

Shh 단백질의 변이체란 Shh의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있다. 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체이다

바람직하게는, Shh 단백질의 형태로 제공된다. 예들 들어, Shh를 처리하여 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하기 위하여 통상적으로 사용되는 배지에 Shh 단백질을 처리하면 된다.

Shh 단백질은 상기 배지에 유효 농도로 포함되도록 한다.　 배지의 종류와 배양 방법 등 당 분야에서 잘 알려진 요소에 따라 Shh 단백질의 유효 농도는 영향을 받을 수 있다.　 본 발명의 구체적인 실시에서는, 500ng /ml의 양으로 처리하였다.

또한, Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 형태로 제공될 수 있다.

Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.

상기한 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.

하나의 바람직한 양태에서, Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드는 서열은 Shh 단백질을 발현하는 벡터인 조성물이다.

본 발명에서 용어,“벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.　

본 발명에서 용어,“작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.　 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.　 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.　 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다.　 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.　

Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 전달하거나 (Wolff et al. Science,　247:1465-8, 1990: Wolff et al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀 (Liposome), 양이온성 고분자 (Cationic polymer)등을 이용하여 세포내로 전달할 수 있다.　 리포좀은 유전자 전달을 위하여 DOTMA나 DOTAP등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다.

또 다른 바람직한 양태로서, Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 Shh 단백질을 발현하는 바이러스인 조성물이다.

본 발명에서 용어, “바이러스”는 Shh 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 패키징 세포로 형질전환 및 감염시켜 제작한, Shh를 발현하는 바이러스를 의미한다.　

본 발명의 Shh 단백질을 발현하는 바이러스 제조에 사용될 수 있는 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등을 포함하며 이로 제한되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 Shh 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계를 포함하는 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, (i) 아스트로사이트를 배지에서 배양하는 단계; (ii) Shh 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리 하는 단계; 및 (iii) 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화로 유도하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 (i) 단계에서 아스트로사이트 배양하는 배지는 당 분야에서 신경줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다.　 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.　 또한, 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다. 바람직하게는 bFGF를 포함하는 배지이다.

상기 방법의 (ii) 단계에서 처리되는 Shh 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산은 상기한 바와 같다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 신경줄기세포에 관한 것이다.

본 발명의 역분화 방법으로 제조된 신경줄기세포는, 신경줄기세포 특이적인 마커인, Nestin, CD133, Sox2이 신경줄기세포와 같은 수준으로 발현하며 일반적인 신경줄기세포와 동일한 다분화능을 가지는 것을 확인하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 신경줄기세포를 아스트로사이트, 뉴런 또는 올리고덴드로사이트로 분화시키는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 조성물과 방법에 따라 제조된 신경줄기세포를 당 분야에 알려진 통상적인 아스트로사이트, 뉴런 또는 올리고덴드로사이트 분화 조건에서 분화를 유 도할 경우, 각각의 세포로 분화가 유도되는 것을 각 세포 특이적인 마커의 발현으로 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 연구 방법

1. 마우스 아스트로사이트 (mouse astrocyte)와 마우스 신경줄기세포 (mouse neural stem cell) 배양

마우스 아스트로사이트 (Mouse astrocyte)는 E13.5일령의 태아 (fetus)의 뇌 (brain)에서 분리하여 FBS (HyClone) 10%,　penicillin/streptomycin 1%, L-glutamine 1%(cambrex)가 포함되어 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM (high glucose, Hyclone) 에서 배양하였다. 대조군으로 사용된 neural stem cell은 Insulin(sigma), apo-transferrin(sigma), selenium(sigma), progesteron(sigma), penicillin/streptomycin(cambrex)가 포함되어 있는 Dulbecco's modified Eagle's medium/F12(DMEM/F12, Gibco) 배지(N2)에 serum-replacement인 B27(Gibco)과 human recombinant basic FGF, human recombinant EGF(R&D) 를 첨가하여 배양을 하였다.

2. 역분화 (de-differentiation)의 유도

역분화는 신경줄기세포 (Neural stem cell) 배양 조건과 동일하게 배양하면서 유도하였다. 이 때 두 가지 방법을 사용하여 배양하였으며 한 방법은 6-well plate에 1×10⁵의 세포를 프레이팅한 후, 12시간 후에 Shh(sonic hedgehog, R&D)처리를 시작하는 것으로, 처리 농도는 500ng/ml으로 하였다. 2, 4, 6일 동안 마우스 아스트로사이트 배양 조건에 Shh를 첨가하여 배양을 한 후 신경줄기세포 배양 조건으로 바꾸어 배양을 하였다. 또 한 가지 방법은 신경줄기세포 배양 조건으로 바꾼 후에도 Shh를 계속 처리하는 것이다.

3. 면역세포화학법 (Immunocytochemistry)로 각각의 마커 확인

Neurosphere는 4% paraformaldehyde (EMS)로 1시간 동안 4℃에서 고정을 한 후 20% 수크로즈를 첨가하여 4℃에서 shaking overnight을 하였다. 그 후 OCT compound로 8well chamber slide (Nunc)에 cryopreservation을 하였다. 8-10um로 section을 한 후 염색을 하였다. 10% Normal goat serum (JacksonImmunoresearch) +0.1% BSA (sigma)+0.3% Triton X-100 (sigma)이 포함된 PBS로 blocking을 한후 anti-nestin (chemicon), anti-CD133 (MACS), anti-Sox2 (sigma)을 사용하여 4℃에서 overnight로 반응을 시킨 후에 RT에서 anti-mouse-cy3 (Jackson Immunoresearch), anti-rabbit-FITC (Molecular probe), anti-goat-cy3 (Zymed)로 반응을 시킨 후 마지막으로 DAPI (sigma)를 사용하여 핵 염색 (nuclear stain)을 하였다. 염색을 한 후에 Zeiss confocal (Carl Zeiss)로 확인을 하였다. 분화된 세포의 경우 위와 같은 방법으로 염색을 하였고, 이 때 사용한 항체는 anti-GFAP (Dako), anti-S100β (Zymed), anti-β-tubulin Ⅲ (covance), anti-Map2a (sigma), anti-TH (sigma), anti-O4 (R&D)m anti-CNPase (chemicon)였다.

4. 인 비트로 분화 (In vitro differentiation)

PLO (poly-L-ornithinte) (sigma)와 laminin 혹은 fibronectin (sigma)로 코딩한 후에,　아래와 같은 분화 조건에서 배양을 하였다.

아스트로사이트(astrocyte)로의 분화는 10% FBS(Hyclone)이 포함된 DMEM(Hyclone, high glucose)에 human recombinant bFGF와 EGF(R&D)를 첨가하거나 CNTF(recombinant rat ciliary neurotrophic factor(upstate)에서 5-7일 동안 배양하여 분화를 유도하였다.

뉴런(neuron)으로의 분화는 serum replacement인 B27(Gibco)이 포함되어 있는 N2배양액에 human recombinant FGF를 4일동안 처리를 한 후, 8일 동안은 FGF를 없는 배지에서 배양을 하였다. 다른 방법으로는 RA(retinoic acid, sigma)를 1-10 μM으로 첨가하여 7-14일 동안 배양을 하였다.　 또 다른 방법으로 사용한 것은 1-10Mm의 농도의 VPA(valproic acid, sigma)를 1-10μM 농도의 RA(retinoic acid, sigma)과 함께 첨가하여 7-14일 동안 배양하여 분화를 유도하였다.

올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)로의 분화는 serum replacement인 B27이 첨가된 N2 배양액에 PDGF-AA(platelet derived growth factor-AA, R&D)와 T3(3,3,5-triiodo-L-thyronine, sigma), human recombinant basic FGF와 EGF(R&D)를 함께 첨가하여 20일 동안 배양하여 분화를 유도하였다.

위에서 언급한 조건에서 배양을 하고, 각각의 분화된 세포의 모양을 관찰하면서, 각각의 분화 마커로 사용되는 항체를 사용하여 면역세포화학법(immunocytochemstry)으로 확인을 하였다.

실시예 2 : 연구 결과

이미 분화가 진행된 마우스 아스트로사이트 (mouse astrocyte)에 신경전구세포 (neural progenitor cell)의 증식 (proliferation)을 증가시키는 역할을 하는 Shh를 처리하였다. 마우스 아스트로사이트 (Mouse astrocyte) 배양 조건에 Shh를 500ng/ml씩 매일 첨가한 후, 신경줄기세포 (neural stem cell) 배양 조건에서 배양을 시작하였다. 신경줄기세포 배양 조건에서 배양을 시작한 후, 세포의 모양이 신경줄기세포와 비슷한 모습으로 바뀌어 가는 것을 관찰할 수 있었다. Neurosphere가 형성된 후에는 더이상 Shh를 첨가하지 않았다. 일단 neurosphere가 형성된 후에는 계속해서 유지가 되었다 (도 1).

이와 같은 방법으로 마우스 아스트로사이트를 역분화를 유도하였다. Shh 처리를 2, 4, 6일간 day별로 처리를 한 후 신경줄기세포의 배양 조건으로 바꾼 후에 역분화가 진행되는지를 확인하였다. Shh 처리를 시작한지 6일째 되는 날부터 신경줄기세포 배양조건으로 바꾼 경우에 neurophere가 더 잘 형성되고 있었다. 이렇게 만들어진 세포는 게속해서 유지가 되었다.

이 세포가 신경줄기세포와 동일한 특성을 가지는 세포인지를 확인하기 위해서 각각의 마커를 사용하여, 면역세포화학방법을 이용하였다. Nestin, CD133, Sox2로 신경줄기세포에서 가장 많이 발현되고 있는 마커를 사용하여 염색을 한 결과 신경줄기세포에서 발현되고 있는 것과 동일하게 신경줄기세포-유사 세포(neural stem cell-like cell)에서도 발현되고 있었다. 이 때 만들어진 neurosphere를 cryo-section을 하여 확인을 한 결과 nestin, CD133, Sox2의 발현을 확인 할 수 있었다 (도 2).

신경줄기세포-유사 세포가 신경줄기세포와 같이 분화 능력이 있는지 확인하기 위해서 아스트로사이트, 뉴런, 올리고덴드로사이트로의 분화를 유도하였다. 먼저 몇 가지 조건을 사용하여 분화를 상기한 방법으로 유도하고, 분화 유무를 각각의 분화 마커에 특이적인 항체를 사용하여 확인한 결과, 신경줄기세포와 같이 세 가지 방향으로 분화가 되는 것을 확인할 수 있었다. 우선 아스트로사이트로 분화를 유도했을 때. GFAP, S100이 발현되고 있었고, 뉴런으로 분화는 β-tubulinⅢ(Tuj1)와 Map2a의 발현으로 확인을 하였다. 또한 올리고덴드로사이트의 마커인 O4, CNPase역시 올리고덴드로사이트로의 분화 조건을 주었을 때. 발현되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 3).

이 연구를 통해서 Shh chemical은 마우스 아스트로사이트를 신경줄기세포-유사 세포 (neural stem cell-like cell)로 역분화시키는데 관여하는 중요한 chemical이며, 이렇게 역분화된 신경줄기세포-유사 세포는 아스트로사이트, 뉴런, 올리고덴드로사이트로 다시 분화되는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 기술한 바와 같이, Shh 을 이용하여 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도할 수 있으며, 역분화된 신경줄기세포는 다양한 질병치료에 사용될 수 있다.

Claims (10)

1. Shh (sonic hedgehog) 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 아스트로사이트 (astrocyte)를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 Shh 단백질을 발현하는 벡터인 조성물.
3. 제1항에 있어서, Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 Shh 단백질을 발현하는 바이러스인 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 역분화된 신경줄기세포가 아스트로사이트 (astrocyte), 뉴런 (neuron) 및 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte)로의 분화능을 가지는 신경줄기세포인 조성물.
5. Shh 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계를 포함하는 생체 외(in vitro) 또는 인간을 제외한 동물의 생체 내(in vivo)에서 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 역분화된 신경줄기세포가 아스트로사이트, 뉴런 및 올리고덴드로사이트로의 분화능을 가지는 신경줄기세포인 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 방법이 (i) 아스트로사이트를 배지에서 배양하는 단계; (ii) Shh 단백질 또는 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계; 및 (iii) 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화로 유도하는 단계를 포함하는 방법.
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