KR101211624B1 - Ｓｈｈ, ＦＧＦＲ 티로신 키나아제 억제제, ＭＥＫ 억제제와 ＧＳＫ 억제제를 이용하여 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물 및 이를 이용한 배아줄기세포 유사세포의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 a) Shh (Sonic hedgehog) 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 및 b) FGFR 티로신 키나아제 억제제 (FGFR tyrosine kinase inhibitor), MEK/ERK 억제제 (mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated kinase inhibitor)와 GSK 억제제 (glycogen synthase kinase inhibitor)를 포함하는 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물 및 이를 이용한 배아줄기세포 유사세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 기존의 역분화 유도 주요인자인 4개 유전자 (Oct4, Sox2, Klf4, and C-Myc/Oct4, Sox2, Nanog, Lin28) 등 유전자의 도입 없이 저분자성 화학물질인 PD173074 (FGFR tyrosine kinase inhibitor), PD0325901 (MEK inhibitor)과 CHIR99021 (GSK3β inhibitor)을 처리하여 상대적으로 간단한 방법으로 역분화 유도 인자의 수를 최소화하면서 전분화능을 갖는 배아줄기세포 유사세포를 제공할 수 있는 이점이 있다.

Description

Ｓｈｈ, ＦＧＦＲ 티로신 키나아제 억제제, ＭＥＫ 억제제와 ＧＳＫ 억제제를 이용하여 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물 및 이를 이용한 배아줄기세포 유사세포의 제조방법{Generation composition for induced pluripotent stem cells with Shh, FGFR tyrosine kinase inhibitor, MEK inhibitor and GSK inhibitor treatment and method of manufacturing induced pluripotent stem cells using the same}

본 발명은 Shh, FGFR 티로신 키나아제 억제제, MEK 억제제와 GSK 억제제를 이용하여 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물 및 이를 이용한 배아줄기세포 유사세포의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 Bmi1을 조절하는 상위 조절인자인 Shh (Sonic hedgehog), 저분자성 물질 FGFR 티로신 키나아제 억제제, MEK 억제제와 GSK 억제제를 처리하여 체세포로부터 리프로그래밍 과정을 통해 배아줄기세포와 같은 세포를 유도하는 새로운 조성물 및 이를 이용하여 유전자 도입 없이 저분자성 물질만을 이용하는 새로운 역분화 배아줄기세포 유사세포의 제조방법을 제시하는 것이다.

줄기세포는 정상적인 체세포와 다르게 무한히 분열할 수 있는 능력을 가지며 적합한 환경 조건 아래에서 특정 세포로 분화하는 능력을 가진다. 그 분화 능력은 줄기세포의 특성에 따라 전분화능(pluripotency), 다분화능(multipotency), 또는 단일분화능(unipotency) 으로 정의되어진다. 따라서 줄기세포를 배양을 통해 증식시킨 후 특정 세포로 분화를 시키는 기술은 세포 치료라는 측면에서 여러 질병을 치료할 수 있는 잠재력을 가지고 있다 할 수 있다.

조혈줄기세포(hematopoietic stem cell), 골수줄기세포(bone marrow stem cell), 신경 줄기세포(neural stem cell) 등의 줄기세포는 성체에서도 존재하므로 환자 본인으로부터 추출할 수 있어 질병 치료 시 면역 거부반응이라는 문제점을 극복할 수 있는 장점이 있다. 이러한 장점은 기존의 장기이식에서 장기 제공자의 확보가 어려웠던 부분을 극복할 수 있다.

하지만, 지금까지 알려진 견해에 따르면 성체줄기세포는 단지 다분화능으로, 분화할 수 있는 능력에 한계를 가진다. 이는 곧 조직 특이줄기세포는 같은 조직유형의 세포로만 분화할 수 있다는 것인데, 중추신경계(central nervous system) (Science 255, 1707-1710 1992; Science 287, 1433-1438 2000), 골수(bone marrow) (Science 276, 71-74, 1997; Science 287, 1442-1446, 2000; Science 284, 143-147, 1999), 망막(retina) (Science 287, 2032-2036, 2000)와 골격근(skeletal muscle) (Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14482-14486, 1999; Nature 401, 390-394, 1999)에서 분리된 줄기세포는 분화능력 역시 유사조직 계통으로만 분화가 가능하다는 것을 의미한다. 그 예로 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell)는 혈액에 관련된 세포로, 신경줄기세포(neural stem cell)는 신경세포(neuron) 또는 신경아교세포(glial cell)로, 골수줄기세포(bone marrow stem cell)는 중배엽세포(mesodermal cell)로 분화가 가능하다. 뿐만 아니라 이론적으로 무한히 증식 가능한 성체줄기세포이지만, 현재까지의 보고로는 이러한 성체줄기세포를 인 비트로(in vitro) 상에서 증식시키는데 어려움이 있으며 실제 환자로부터 많은 양의 세포를 분리해 내는 것 또한 어렵다.

전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)는 앞에서 열거한 성체줄기세포가 가지고 있던 여러 가지 단점들을 극복해 줄 수 있는 훌륭한 자원이다. 이 세포는 인체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화가 가능하며 인비트로(in vitro) 상에서 무한히 증식이 가능하다. 현재까지 알려진 전분화능 줄기세포로는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 배아종양세포(embryonic carcinoma cell)가 있으며 그 중 배아줄기세포는 가장 많은 연구가 이루어져 특정 세포들로의 분화 방법 및 동물질병 모델 연구한 기능성 검증과 임상 이용시 다양한 질병들에 대한 치료 가능성을 보여주었다.

하지만 이러한 배아줄기세포 역시 성체줄기세포처럼 임상이용을 위해 극복해야만 하는 단점들이 존재한다. 우선, 배아줄기세포를 얻기 위해서는 수정된 배아를 파괴해야 하므로 윤리적인 문제점을 가지고 있으며 배아줄기에서 분화된 세포를 환자에 이식했을 경우 면역 거부반응이 일어난다는 문제점을 가지고 있다.

때문에 배아줄기세포의 이러한 문제점들을 극복하기 위해서 다양한 접근 방법이 시도되었는데 그 중 가장 각광을 받은 것이 분화된 세포에서 미분화된 세포로의 역분화 유도 (reprogramming)이다. 역분화는 분화된 세포를 이용하여 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포를 만들어내는 것을 총칭하며, 이러한 방법으로는 1) 핵치환 (nuclear transfer), 2) 핵융합 (cell fusion), 3) 세포추출물 처리 (cell extract treatment), 그리고 4) 유전자 도입을 통한 역분화(induced pluripotent stem cell;iPS cell) 기술이 있다 (Cell 132, 567-582, 2008).

iPS cell 기술은 현재까지 연구되어 오던 어떤 기술보다 배아줄기세포에 가까운 세포를 만들어 내는데 성공했으며 이러한 결과와 기작을 증명하기 위해 처음 기술이 발표되었던 2006년 이후 현재까지 수많은 연구 논문들이 쏟아져 나오고 있는 실정이다. 기본적으로는 마우스 또는 인간의 체세포에 4개의 유전자 (역분화 유도인자; Oct4, Sox2, Klf4, and C-Myc/Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)를 도입한 후 배아줄기세포 배양조건에서 장기간 배양 했을 경우 배아줄기세포와 유사한 특성의 줄기세포가 확립될 수 있었으며 이는 배아줄기세포와의 유전자발현 (gene expression), 후성학적 특성 (epigenetics), 인 비트로/인 비보 (in vitro/in vivo) 에서의 삼배엽성 분화 능력 (three germ layer differentiation), 테라토마 (teratoma) 형성 능력, 키메라 마우스 생성 (chimeric mouse generation) 그리고 키메라 마우스의 생식 가능 (germline transmission) 등의 특성이 상당히 유사한 것으로 증명되었다 (Cell 126, 663-676, 2006; Science 318, 1917-1920, 2007).

하지만, 이러한 역분화 과정의 기작은 역분화 유도를 위해 사용된 유전자의 수가 너무 많아 자세한 기작을 규명하기 어렵기 때문에 현재까지 밝혀진 수준이 미미한 상태이다. 또한, 역분화 유도기술이 확립이 되었음에도 실제 치료적용을 위해서는 기술적으로 간편하고 효율이 높은 방법을 계속해서 개발해야만 하고 이렇게 개발된 기술들은 모두 효율과 안전성 측면에서 평가되어야 한다.

최근 발표된 연구 결과에 따르면, 암억제 유전자인 p53의 비활성화 (inactivation)는 iPS 세포의 생성 효율을 증가시킨다고 보고되었다 (Nature 460, 1132-1135, 2009). p53유전자는 Ink4a/Arf locus에 의해 조절되는데 이 locus는 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 발현이 조절되며 Arf 에 의해 생성된 p19^Arf 는 p53유전자를, Ink4a에 의해 생성된 p16^Ink4a 는 Rb 유전자의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이 두 가지 유전자 p16^Ink4a 와 p19^Arf 의 발현을 억제 시킨 경우 p19^Arf 만을 억제시킨 경우 보다 iPS 생성 효율이 증가되었다는 보고도 있다 (Nature, 460, 1140-1144, 2009).

Polycomb group(PcG) 단백질은 후생유전학적 유전자 억제자 (epigenetic gene silencer)로써 PcG 단백질의 하나인 Bmi1은 p16^Ink4a 와 p19^Arf의 발현을 억제시킴으로써 p53과 Rb의 발현을 억제시킨다고 보고 되어있다 (Genes Dev, 2678-2690, 1999). 또한 Bmi1은 염색질(chromatin)의 구조를 변화시켜 타겟 유전자의 발현을 억제한다고 알려져 있으며 이러한 특성으로 인해 신경줄기세포 (neural stem cell) 및 조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell)의 자가재생 (self-renewal)에서 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다. 이에 따라 본 발명자들의 기존 연구에서는 마우스의 성상세포(astrocyte)에 Bmi1을 과발현(overexpression) 시켜 신경줄기세포(neural stem cell)로의 역분화에 성공했음을 보고 하였으며 이렇게 역분화된 신경줄기세포의 특성은 실제 마우스에서 분리한 신경줄기세포와 상당 부분 유사하였는데 그 중 역분화 유도인자 중 하나이자 신경줄기세포의 자가재생에 중요한 역할을 하는 유전자인 Sox2의 발현이 증가됨을 확인하였다 (Biochem Biophys Res Commun. 371, 267-272, 2008). 또한, Bmi1을 조절하는 상위 조절인자인 Shh (Sonic hedgehog)을 처리하고 신경줄기세포의 배양 조건에서 배양한 결과 신경줄기세포와 같은 세포가 형성이 되고, 아스트로사이트 (astrocyte), 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte), 뉴런 (neuron)으로 분화 유도가 되는 것을 확인하여 2008년 특허 등록을 하였다 (제 10-0794359호).

일반 체세포의 경우 역분화를 하기 위해서는 4개 (Oct4, Sox2, Klf4, C-Myc) 혹은 3개(Oct4, Sox2, Klf4)의 유전자가 필요하지만 이 유전자를 내재적으로 발현(endogenously expression) 하는 세포에 한해서는 유전자의 도입이 추가적으로 필요하지는 않은 것으로 알려져 있다. 그중 대표적인 것이 마우스/사람의 신경줄기세포에 Oct4 유전자 하나만을 도입하여 역분화줄기세포를 확립했다는 연구 결과이며 이는 신경줄기세포가 내재적으로 Sox2, Klf4, C-Myc을 발현하기 때문이다 (Nature, 461, 649-653, 2009).

또한, 역분화 유도 과정 중에 중간단계 (intermediate state)인 pre-iPS cells의 경우에 PD0325901 (MEK inhibitor)과 CHIR99021 (GSK3β inhibitor)을 처리함으로써 완전히 리프로그래밍된 세포 (fully reprogrammed cells)로의 유도가 가능하였다는 것이 보고된 바 있다 (PLoS One, 6, 2237-2247, 2008).

그러나 아직까지 유전자 도입 없이 Shh 및 화학물질 처리만으로 역분화 유도가 가능하고 이를 이용하여 전분화능을 가진 배아줄기세포 유사세포를 제조하는 방법은 알려진 바가 없다.

따라서 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 마우스의 체세포에 Bmi1을 조절하는 상위 조절인자인 Shh를 처리하여 신경줄기세포의 배양 조건에서 배양을 한 후에, 부분적으로 리프로그래밍된 세포를 완전 리프로그래밍된 세포로 전환시키는 저분자성 물질 PD173074, PD0325901과 CHIR99021을 마우스 배아줄기세포 배양액에 함께 처리하고 피더 셀 (feeder cell) 위로 옮기고 확인한 결과 배아줄기세포와 유사한 특성을 지니는 역분화 줄기세포주가 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 하여, 유전자 도입 없는 역분화 줄기세포의 유도 방법을 확립할 수 있었다. 이렇게 확립된 세포군은 유전자발현 (gene expression), 후성학적 특성 (epigenetics), 테라토마 (teratoma) 형성 능력이 마우스 배아줄기세포와 매우 유사함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 Shh, 저분자성 물질인 FGFR 티로신 키나아제 억제제, MEK 억제제와 GSK 억제제를 이용하여 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 Shh, 저분자성 물질인 FGFR 티로신 키나아제 억제제, MEK 억제제와 GSK 억제제를 이용하여 유전자 도입 없이 체세포로부터 배아줄기세포와 유사한 특성을 지니는 전분화성 역분화 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 생산된 배아줄기세포 유사세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 a) Shh (Sonic hedgehog) 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 및 b) FGFR 티로신 키나아제 억제제 (FGFR tyrosine kinase inhibitor), MEK/ERK 억제제 (mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated kinase inhibitor)와 GSK 억제제 (glycogen synthase kinase inhibitor)를 포함하는 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 ⅰ) 체세포에 Shh (Sonic hedgehog) 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계; ⅱ) 신경줄기세포 배양조건에서 배양하는 단계; 및 ⅲ) FGFR 티로신 키나아제 억제제 (FGFR tyrosine kinase inhibitor), MEK/ERK 억제제 (mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated kinase inhibitor)와 GSK 억제제 (glycogen synthase kinase inhibitor)를 처리하는 단계를 포함하여 구성되는 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC) 유사 세포"는 전분화성을 가지는 세포를 의미하며, 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가-재생산 및 3종류의 모든 배아 층으로부터 유래된 어떠한 세포로 발달할 수 있는 능력을 포함하는 배아줄기세포의 특성을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 배아줄기세포 유사세포는 배아줄기세포, 유도된 전분화성 줄기세포, 또는 유도 만능 줄기세포로도 기술되기도 한다.

본 발명의 배아줄기세포 유사세포를 유도함에 있어서, 출발 체세포의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기(embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한(matured) 체세포를 이용해도 된다. 배아줄기세포 유사세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유아세포이며, 본 발명에서 섬유아세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 섬유아세포를 포함한다.

섬유아세포 세포는 배지에서 배양한 후 사용될 수 있는데, 상기 섬유아세포를 배양하는 배지는 당해 분야에서 섬유아세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DMEM (high glucose, w/o sodium pyruvate) + 10% FBS (Fetal bovine serum) + 0.1mM non-essential amino acid + 1% penicilin/streptomycin + 0.1mM β-mercaptoethanol) 배지에서 배양하였다.

본 발명의 Shh는 단백질 또는 이의 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산의 형태로 제공된다. 본 발명의 Shh는 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 Shh를 포함하며, 바람직하게는 인간 Shh이다. 또한, 배아줄기세포 유사세포로의 역분화에 사용되는 본 발명의 Shh 단백질은 이의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 Shh 단백질의 변이체를 포함한다.

상기 Shh 단백질의 변이체란 Shh의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있다. 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체이다.

바람직하게는, Shh는 단백질의 형태로 제공된다. 예를 들어, Shh를 처리하여 체세포를 배아줄기세포 유사세포로 역분화를 유도하기 위하여 통상적으로 사용되는 배지에 Shh 단백질을 처리하면 된다. 이렇게 Shh를 단백질 형태로 제공하면 용이하게 Bmi1을 유도할 수 있어, 역분화를 유도하기 위해 도입해야 하는 유전자수를 최소화할 수 있는 이점이 있다.

Shh 단백질은 상기 배지에 유효 농도로 포함되도록 한다. 배지의 종류와 배양방법 등 당분야에서 잘 알려진 요소에 따라 Shh 단백질의 유효 농도는 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 500ng/ml의 양으로 처리하였다.

또한, Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산의 형태로 제공된다.

상기 Shh을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.

상기한 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.

상기 Shh 단백질을 코딩하는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 도입하거나(Wolff et al. Science,1990: Wolffet al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포내로 도입될 수 있다. 리포좀은 유전자 도입을 위하여 DOTMA나 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murineleukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associatedvirus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 방법의 (ⅱ) 단계의 신경줄기세포 배양 조건은 당해 분야에서 신경줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 DMEM/F12 + B27 + N2 + 1% penicillin/streptomycin + 20 ng/ml bFGF + 20 ng/ml EGF를 이용하였다. 상기 배양조건에서 배양하였을 때, 신경줄기세포와 같은 세포가 형성된다 (도 1a-1c).

구체적인 일 양태에 의하면, 본 발명은 상기 단계 ⅱ)에서 7일 이상 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기 배양기간을 거쳐야 배아줄기세포에서 발현되는 주요 유전자들의 발현과 유사한 발현양상을 보이고 세포치료 등으로 사용시 분화효율을 높일 수 있다.

상기 단계 ⅲ)에서 "FGFR 티로신 키나아제 억제제"는 FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor) 티로신 키나아제 활성을 억제하는 물질들을 의미한다. FGFR은 리셉터 활성 및 신호 전달에 필요한 티로신 키나아제 활성을 갖는 세포 표면 리셉터이다 (Nature, 453, 519-523).

상기 본 발명의 조성물에 포함되는 FGFR 티로신 키나아제 억제제는 바람직하게 PD173074를 의미한다. 상기 PD173074는 ERK1/2 활성화를 통해 줄기세포의 자가재생 뿐만 아니라 혈관생성을 저해시켜 FGFR 신호를 억제한다. 상기 PD173074는 N-[2-[[4-(diethylamino)butyl]amino]-6-(3,5-dimethoxyphenyl)pyrido[2,3-d] pyrimidin-7-yl]-N'-(1,1-dimethylethyl)-urea로 표시된다. 그러나, 상기 화합물 외에도 모든 FGFR 티로신 키나아제 억제제가 본 발명의 범주에 속하게 됨은 당업자에게 있어서 자명하다.

본 발명에서 상기 "MEK/ERK 억제제"란 MEK/ERK (mitogen-activated protein kinase/extracellular regulated kinase) 신호전달과정에 관여하는 ERK1/2 및 ERK1/2의 업스트림 (upstream) 분자인 MEK1/2를 표적으로 하는 물질들을 의미한다.

상기 MEK (mitogen-activated protein kinase)는 세포질 내의 MAP 카이네이즈 신호전달계 말단에 작용하는 효소로서 세포 밖의 신호를 핵 내부로 전달하는 중요한 매개체 역할을 하며, 미엘린 기저 단백질 (myelinbasic protein)의 트레오닌(Thr) 잔기를 시험관 내에서 인산화 (phosphorylation)시킨다. ERK는 고등생물에 존재하는 대표적인 MAP 카이네이즈로서 외부 신호에 의해 트레오닌 (Thr)과 티로신 (Tyr) 잔기를 인산화시킨다. 이와 같은 트레오닌과 티로신 잔기의 인산화는 MAP 카이네이즈 활성화에 결정적인 역할을 하므로, 이들 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환될 경우에는 효소가 활성화되지 않는다는 것이 보고되었다.

본 발명의 조성물에 포함되는 MEK/ERK 억제제는 바람직하게는 PD0325901 또는 U0126를 의미한다. 상기 U0126은 1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis[2-aminophenylthio]butadiene로 표시된다. 그러나, 상기 화합물 외에도 모든 MEK/ERK 신호전달 억제제가 본 발명의 범주에 속하게 됨은 당업자에게 있어서 자명하다. ERK1/2는 MEK 1/2에 의해서 활성화되며 MEK 1/2 의 활성을 억제하면 ERK1/2의 활성이 곧바로 억제되므로, MEK 1/2는 ERK1/2의 직접적인 상위 신호전달분자가 된다.

본 발명에서 "GSK 억제제"란 GSK (glycogen synthase kinase)의 활성을 억제하는 물질들을 의미한다. 본 발명에서 GSK는 바람직하게는 GSK3β를 의미하고, 본 발명의 조성물에 포함되는 GSKβ 억제제는 바람직하게는 CHIR99021을 의미한다. 상기 CHIR99021은 아미노피리미딘(aminopyrimidine)으로 표시된다. 그러나 상기 화합물 외에도 모든 GSK 억제제가 본 발명의 범주에 속하게 됨은 당업자에게 있어서 자명하다.

상기 저분자성 물질 FGFR 티로신 키나아제 억제제, MEK/ERK 억제제와 GSK 억제제는 시중에서 구입하여 (Stemolecule™) 사용하거나 제조하여 사용할 수 있으며, 상기 억제제 처리에 의해 pre-iPS 세포를 완전히 역분화된 세포로 유도가능하다 (PLoS One, 6, 2237-2247).

상기 FGFR 티로신 키나아제 억제제, MEK/ERK 억제제와 GSK 억제제는 배지에 처리하면 된다. 상기 배지에 유효 농도로 포함되도록 한다. 배지의 종류 및 배양방법 등 당분야에서 잘 알려진 요소에 따라 유효농도는 영향을 받을 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 PD173074 0.1μＭ, PD0325901 0.5μＭ과 CHIR99021 3μＭ의 양으로 처리하였다.

본 발명의 구체적인 양태로서, 상기 방법은 ⅳ) 배아줄기세포의 배양 조건에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 배아줄기세포 배양 조건은 당해 분야에서 배아줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 지지세포가 있는 조건에서 하이 글루코오즈 DMEM에 15% FBS (Fetal bovine serum) + 1 % nonessential amino acid +1% penicillin/streptomycin + 0.1mM β-mercaptoethanol + 1000 unit/ml mouse LIF (leukemia inhibitory factor)의 배양액에서 배양하면서 2-3일에 한 번씩 계대 배양을 하였다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 배아줄기세포 유사세포를 제공한다.

본 발명의 역분화 방법으로 제조된 배아줄기세포 유사세포는 유전자발현 (gene expression), 후성학적 특성 (epigenetics), 인 비트로/인 비보 (in vitro/in vivo)에서의 삼배엽성 분화 능력 (three germ layer differentiation), 테라토마 (teratoma) 형성 능력, 키메라 마우스 생성(chimeric mouse generation)이 마우스 배아줄기세포와 매우 유사한 것을 확인하였다.

본 발명의 배아줄기세포 유사세포는 다양한 타입의 세포를 제공하는 좋은 소스(source)이다. 예를 들면, 상기 배아줄기세포 유사세포는 세포 분화를 위한 조건의 배지에서 배양하여 조혈세포, 신경세포, 베타세포, 간세포, 연골세포, 상피세포, 요로 세포 및 이의 유사 세포로 분화 유도될 수 있다.

배아줄기세포 유사세포가 분화하기 위한 배지 조건 및 방법은 Palacios, et al., PNAS. USA, 92:7530-7537(1995), Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6;543-552(1994), 및 Bain et al., Dev. Biol, 168:342-357(1995)에 개시되어 있다. 상기 배아줄기세포 유사세포는 이식을 통해서 수많은 치료에 응용될 수 있다. 상기 배아줄기세포 유사세포는 당뇨병, 파킨스병, 알츠하이머병, 암, 척수 손상, 다발성 경화, 근위축성 측삭 경화증(루게릭병), 근이영양증, 간 질환, 고 콜레스테롤 혈증, 심장 질환, 연골 대체, 창상, 족부 궤양, 위장병, 혈관질환, 신장 질환, 요로 질환, 노화관련 질환 및 상태와 같은 수많은 질병 또는 질환 치료에 응용할 수 있다. 그 외, 본 발명의 배아줄기세포 유사세포는 약물개발 시 평가 등에도 응용될 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의하면 Shh를 처리하고 저분자성 물질 FGFR 티로신 키나아제 억제제 (PD173074), MEK/ERK 억제제 (PD0325901)와 GSK 억제제 (CHIR99021)를 처리하여 체세포를 전분화능을 가진 역분화 줄기세포로 유도할 수 있다. 본 발명에 의해 역분화된 배아줄기세포 유사세포는 예를 들어, 심근세포, 인슐린 생산세포, 또는 신경세포 등의 세포로 분화하여 심부전, 인슐린의존성 당뇨병, 파킨슨병이나 척수손상 등 다양한 질환에 대한 줄기세포 이식요법에 이용할 수 있으며, 사람배아를 이용하는 윤리적 문제나 이식 후의 거부반응을 회피할 수 있으므로 극히 유용하다. 또한, 유도 전분화성 줄기세포를 분화시켜서 생기는 각종 세포(예를 들어, 심근세포, 간세포 등)는 화합물, 약제, 독물 등의 약효나 독성을 평가하기 위한 시스템으로서 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 기존의 유도인자 유전자 도입 없이 Shh 처리 및 저분자성 화학물질 처리라는 상대적으로 간단한 방법만으로 역분화 배아줄기세포 유사세포를 제조할 수 있어, 이는 역분화된 배아줄기세포 유사세포의 가장 큰 극복 과제인 바이러스를 이용한 유전자 도입 문제를 해결할 수 있는 획기적인 발명이라고 볼 수 있고, 더 나아가 유전자 도입 없는 세포주 확립을 하는데 기반이 되는 기술을 제공하는 줄기세포분야에 매우 유용한 발명이라고 할 수 있다.

도 1a는 본 발명에 의해 Bmi1 유전자의 상위 조절인자로 알려진 Shh (Sonic hedgehog)을 처리하였을 때 하위 유전자들이 조절되는 것을 RT-PCR 방법을 통해 확인한 결과를 나타내고 있다.
도 1b는 본 발명에 의해 마우스 체세포에 Shh를 처리하고 신경줄기세포의 배양 조건에서 배양을 하여 신경구와 같은 세포의 모양이 형성되는 것을 나타내는 도면이다.
도 1c는 본 발명에 의해 형성된 신경구와 같은 모양의 세포가 신경줄기세포와 같은 특성을 지니고 있는 것을 확인한 도면이다.
도 2a는 본 발명에 의해 마우스 체세포에 Shh를 처리하고 신경줄기세포의 배양 조건에서 배양을 하여 형성된 신경구와 같은 세포에 PD173074, PD0325901과 CHIR99021을 처리하고 배아줄기세포의 배양 조건에서 배양을 한 결과 배아줄기세포와 유사한 세포가 형성된 것을 나타내고 있다 (이와 같이 형성된 세포를 SC-iPS③으로 명명함).
도 2b는 본 발명에 의해 형성된 세포에서 배아줄기세포의 특이적 발현 마커들이 발현이 되고 있는 것을 면역화학염색법을 통해 확인한 결과를 보여주고 있다. 이 때 AP stain을 했을 때 포지티브 (positive)한 결과를 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다.
도 2c는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포에서 배아줄기세포의 대표적인 유전자들이 발현되는 것을 웨스턴 블럿 (western blot) 분석 방법을 통해 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 본 발명에 의해 확립된 역분화 줄기세포에서 배아줄기세포의 자가재생 능력 유지에 중요한 Oct4와 Nanog의 프로모터 부위가 탈메틸화 (demethylation) 되어 있는 결과를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명에 의한 역분화 줄기세포가 배아줄기세포와 같이 테라토마 (teratoma)를 형성하고 있는 것을 확인한 결과를 나타내고 있다. Balb/c 누드마우스의 신장 (kidney)에 캡슐 (capsule) 형태로 세포를 주사 (injection)하고 8-10주 후에 테라토마 (teratoma)가 형성된 것을 prep하고 H&E 염색방법을 통해 염색을 하여 삼배엽에 해당하는 대표적인 세포로 분화가 된 것을 확인한 결과를 보여주고 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 마우스 체세포의 배양

배아줄기세포 유사세포를 제조하기 위해, 마우스 체세포 중 마우스 섬유아세포를 이용하였다. 마우스 섬유아세포는 CF1 스트레인 마우스(CF1 strain mouse)가 임신한지 13.5일째가 되었을 때의 배아(embryo)를 준비하고 DMEM (high glucose, w/o sodium pyruvate) + 10% FBS (Fetal bovine serum) + 0.1mM non-essential amino acid + 1% penicilin/streptomycin + 0.1mM β-mercaptoethanol) 배지의 조직배양 플라스크(tissue culture flask)에서 배양을 한 후에 3 계대 (3rd passage)가 되었을 때 2 X 10⁵의 세포를 6 웰플레이트(well plate)에 접종 (seeding)을 하였다.

실시예 2. Shh 처리에 의한 Bmi1 유도

실시예 1에서 준비된 섬유아세포에 Shh를 처리하여 Bmi1이 유도되는지를 확인하였다. 도 1a는 Bmi1 유전자의 상위 조절인자로 알려진 Shh (Sonic hedgehog, R&D systems)을 처리하였을 때 하위 유전자들이 조절되는 것을 RT-PCR 방법을 통해 확인한 결과를 나타내고 있다. Shh를 500 ng/ml로 신경줄기세포의 배양 조건 (DMEM/F12 + B27 + N2 + 1% penicillin/streptomycin + 20 ng/ml bFGF + 20 ng/ml EGF에서 처리를 하였을 때 Gli1과 Bmi1이 유도가 되며, 이 때 Bmi1 의 타겟 유전자인 p16^Ink4a와 p19^Arf의 발현이 마우스 섬유아세포에 비해 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 세포의 모양이 응집(aggregation) 되면서 신경구와 같은 형태를 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 1b). 이와 같이 유도된 신경줄기세포와 같은 세포는 Nestin, Sox2가 발현이 되는 것을 면역화학염색법을 통해 확인할 수 있었고, SSEA1과 AP 염색에도 포지티브(positive)한 결과를 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 1c). 이와 같은 결과를 통해 Bmi1을 조절할 수 있는 Shh 처리에 의해 Bmi1이 도입된 세포와 유사한 특성을 보이고 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 저분자성 물질 처리를 통한 역분화 줄기세포로의 유도 및 배아줄기세포의 특성 분석

실시예 2에서와 같이, 마우스 체세포에 Bmi1의 상위 조절인자인 Shh를 처리하고 신경줄기세포 배양 조건에서 배양을 한 후 형성된 신경구와 같은 세포에 저분자성 물질 PD173074, PD0325901과 CHIR99021을 처리하였다. 보다 구체적으로 상기 7일 동안 배양하여 형성된 세포를 single cell로 0.1% 젤라틴 코팅된 플레이트 (gelatin coated plate)에 접종 (seeding)을 하고, 마우스 배아줄기세포의 배양 조건에서 PD173074 0.1μＭ, PD0325901 0.5μＭ과 CHIR99021 3μＭ로 일주일 동안 처리하였다. 마우스 배아줄기세포의 배양 조건은 지지세포가 있는 조건에서 하이 글루코오즈 DMEM에 15% FBS (Fetal bovine serum) +1% nonessential amino acid +1% penicillin/streptomycin + β-mercaptoethanol + 1000 unit/ml mouse LIF (leukemia inhibitory factor)의 배양액에서 배양하면서 2-3일에 한 번씩 계대 배양을 하였다. 그 결과 전분화능을 갖는 역분화 줄기세포주를 확립할 수 있었다. 이와 같이 형성된 세포를 SC-iPS③로 명명하였다.

상기와 같이 저분자성 물질의 처리를 한 세포를 피더 (feeder) 위로 옮긴 후에 배양을 하면서 콜로니의 형성을 관찰하였고, 이와 같은 방법을 통해 확립된 세포가 형태 (morphology) 측면에서 배아줄기세포와 유사한 것을 도 2a의 결과를 통해 확인할 수 있었다.

이와 같은 방법을 통해 형성된 역분화 줄기세포가 AP stain을 했을 때 포지티브 (positive)한 결과를 보이며, 배아줄기세포에서 특이적으로 발현되는 마커들이 발현되고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 2b).

또한, 상기와 같이 형성된 역분화 줄기세포에서 웨스턴 블럿 (western blot) 분석 방법을 통해 배아줄기세포에서 발현되는 주요 유전자들의 발현이 배아줄기세포와 같이 발현이 되고 있는 것을 확인할 수 있었고, 배아줄기세포의 대표적인 표지인자로 알려진 SSEA1과 대표적인 마커인 Oct4도 함께 발현이 되고 있는 것을 유세포 분석 방법을 통해 확인할 수 있었다 (도 2c). 이와 같은 결과를 통해 마우스 체세포에 유전자 도입 없이 저분자성 물질의 처리를 통해 역분화 줄기세포로의 유도가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 역분화 줄기세포의 주요 유전자들의 프로모터의 메틸화 (methylation) 상태를 배아줄기세포와 비교 분석

역분화 줄기세포에서 배아줄기세포의 자가재생 능력의 유지에 중요한 유전자들의 프로모터 부위를 분석하기 위해서, 바이설파이트 시퀀싱 (bisulfite sequencing) 방법을 도입하여, Oct4와 Nanog의 프로모터 부위의 메틸화 (methylation) 유무를 분석하였다. 그 결과 역분화 줄기세포의 경우 배아줄기세포와 같이 프로모터 부위가 탈메틸화 (demethylation) 되어 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 대부분 메틸화 (methylation)되어 있는 마우스 체세포와는 상이한 결과를 나타내고 있고, 역분화 과정을 통해 확립된 세포가 배아줄기세포와 같은 특성을 지니고 있는 것을 확인한 결과를 나타내고 있다.

실시예 5. 역분화 줄기세포의 분화 능력 확인

인 비보에서 분화 능력을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위해서 테라토마 (teratoma) 형성이 가능한지를 실험하였다. 10⁶의 세포를 8000 rpm에서 5분 동안 원심분리를 하고 배아줄기세포 배양액에서 펠릿 (pellet) 배양을 24시간 동안 한 후에 6주령 Balb/c 누드마우스 (nude mouse)의 신장 (kidney)에 캡슐 (capsule) 형태로 주사 (injection)하였다. 8-10주 후에 신장 (kidney)을 분리하여 삼배엽으로 분화되었는지 여부를 파라핀 블록 (parrafin block)을 만들고 H&E 염색을 하여 확인하였다. 그 결과 삼배엽에 해당하는 세포로 분화가 된 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 이와 같은 결과를 통해 역분화 줄기세포가 배아줄기세포와 같이 테라토마 (teratoma)를 형성하는 것을 확인할 수 있었고, 배아줄기세포와 유사한 세포가 형성된 것을 위의 실험 결과를 통해 증명할 수 있었다.

Claims (4)

1. 다음을 포함하는 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포로의 역분화를 유도하는 조성물
   a) Shh (Sonic hedgehog) 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 및
   b) FGFR 티로신 키나아제 억제제 (FGFR tyrosine kinase inhibitor)인 PD173074, MEK (mitogen-activated protein kinase) 억제제인 PD0325901와 GSK (glycogen synthase kinase) 억제제인 CHIR99021.
2. ⅰ) 체세포에 Shh (Sonic hedgehog) 단백질 또는 Shh 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 처리하는 단계;
   ⅱ) 신경줄기세포 배양배지에서 배양하는 단계; 및
   ⅲ) FGFR 티로신 키나아제 억제제 (FGFR tyrosine kinase inhibitor)인 PD173074, MEK 억제제 (mitogen-activated protein kinase)인 PD0325901와 GSK 억제제 (glycogen synthase kinase inhibitor)인 CHIR99021를 처리하는 단계를 포함하는 체세포로부터 배아줄기세포 유사세포를 제조하는 방법.
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