KR20190115394A - 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법 - Google Patents

체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법에 관한 것으로서, 상기 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법은 인간 체세포의 수용체인 CXCR2를 자극함으로써 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율을 증가시키므로, 이를 효과적으로 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도에 이용할 수 있다.

Description

체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법{Composition for inducing de-differentiation from somatic cell into induced pluripotent stem cell and method for inducing de-differentiation using the same}
본 발명은 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인간 체세포의 수용체인 CXCR2를 자극하여 역분화 효율을 촉진하거나 억제할 수 있는 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법에 관한 것이다.
줄기세포 치료제 생산을 위해서는 그 공급원이 되는 줄기세포의 대량 체외 배양이 필수적으로 이루어져야 하며 안전하면서 경제적이어야 임상에서 세포치료제로 사용될 수 있다. 그러나 현재 인간 전능성줄기세포의 증식 배양을 위하여 동물유래 지지세포를 사용하거나 동물유래 산물을 포함하고 있는 특수 젤을 도포한 용기에서 배양을 하기 때문에 이종단백 오염으로 인한 안전성에 대한 우려가 발생하고 고가의 특수 젤을 사용할 경우에 경제적인 면에서 대량생산에 적합하지 않다.
역분화 줄기세포 생산 효율을 증가시키고 향후 임상에 적용하기 위해 현재 다양한 바이러스, 케미칼, 사이토카인 등을 이용하여 역분화 줄기세포를 생산 효율을 증가시키려는 연구가 시도되었다. 예를 들면, 센다이 바이러스를 이용하여 숙주 염색체에 인테그레이션되지 않도록 하거나 혹은 융합 단백질 형질도입이나 mRNA를 이용하는 연구가 있다.
한편, 종래의 재프로그램화(reprogramming)에 의한 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)의 제조방법에 따르면, 5 x 104개의 인간 피부 섬유아세포로부터 약 10여 개의 iPS 세포만이 얻어지는 낮은 효율의 문제점을 가지고 있다는 한계점이 있다.
이에 본 발명자들은 CXCR2(CXC chemokine receptor 2) 리간드를 배지에 포함하여 역분화를 수행하거나, 형질 변환을 통해 CXCR2의 발현량이 증가한 체세포에서 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화 유도 효율이 월등히 우수한 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 CXCR2의 리간드(ligand)를 포함하는 체세포에서 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CXCR2의 리간드를 포함하는 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도용 태반유래세포 조건화 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도방법을 제공하는 것이다:
CXCR2의 발현을 증가시키는 체세포 형질 변환 단계; 및
형질변환된 체세포를 배양하는 체세포 배양 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 CXCR2의 리간드를 포함하는 세포 배양 조성물의 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도 용도에 관한 것이다.
본 발명은 체세포에서 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법은 인간 체세포의 수용체인 CXCR2를 자극함으로써 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율이 증가함을 나타낸다.
본 발명자들은 CXCR2 리간드(ligand)를 포함하는 배지에서 체세포를 배양할 경우 및 형질 변환을 통해 CXCR2 발현을 증가시킨 경우에는 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율이 증가하였으나, CXCR2의 발현을 감소시킨 체세포의 경우 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율이 감소함을 확인하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 CXCR2의 리간드를 포함하는 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도용 조성물이다.
CXCR2는 세포막 단백질에 특이적으로 결합 반응하는 사이토카인의 CXC 케모카인 패밀리 중 하나이다. 그 중에서도 CXCR2는 CXC 모티프에 인접한 E-L-R 아미노산 모티프를 가지고 있는 CXC 케모카인을 인지하는 데 밀접한 관련이 있는 수용체이다. 케모카인이란 사이토카인 단백질의 일종으로, 화학 주성을 매개하는 것으로 알려져 있다.
상기 CXCR2의 리간드는 GRO-α, GRO-β, GRO-γ, GCP-2, NAP-2, ENA-78 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 예를 들어, GRO-α 또는 IL-8일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 체세포는 내피세포, 상피세포 및 태반세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 CXCR2의 리간드를 포함하는 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도용 태반유래세포 조건화 배지이다.
본 명세서상의 용어 "태반유래세포 조건화 배지"란 태반유래세포를 젤라틴-코팅된 웰 플레이트상에 접종하고, 세포배양액을 첨가하여 상기 태반유래세포를 배양한 후, 배양액만을 수거함으로써 제조된 배지를 의미한다. 인간 태반유래지지세포를 사용할 경우, 인간배아줄기세포의 미분화상태를 유지할 수 있음이 규명됨으로써 그 효용이 대두되고 있다.
상기 CXCR2의 리간드는 GRO-α, GRO-β, GRO-γ, GCP-2, NAP-2, ENA-78 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, 예를 들어, GRO-α 또는 IL-8일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 체세포는 내피세포, 상피세포 및 태반세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 태반유래세포는 인간 융모막판에서 분리되어 배양된 태반유래 섬유세포-유사세포인 것일 수 있다.
상기 태반유래세포 조건화 배지는 세포 성장 배지에 배양한 인간 태반유래세포를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음의 단계를 포함하는 체세포에서 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화 유도방법이다:
CXCR2의 발현을 증가시키는 체세포 형질 변환 단계; 및
형질변환된 체세포를 배양하는 체세포 배양 단계.
상기 체세포 형질 변환 단계는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템 또는 렌티바이러스 활성 입자(Lentiviral Activation Particles)를 사용하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 체세포 형질 변환 단계는 체세포에 CXCR2 렌티바이러스 활성 입자를 감염시킴으로써 CXCR2의 발현이 증가하도록 형질 변환되는 것일 수 있다.
상기 체세포는 내피세포, 상피세포 및 태반세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 배양은 태반유래세포 조건화 배지에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 태반유래세포는 인간 융모막판에서 분리되어 배양된 태반유래 섬유세포-유사세포인 것일 수 있다.
상기 태반유래세포 조건화 배지는 세포 성장 배지에 배양한 인간 태반유래세포를 포함하는 것일 수 있다.
상기 역분화 유도 방법은 체세포 배양 단계에서 형성된 콜로니로부터 줄기세포를 분리하는 줄기세포 분리 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법에 관한 것으로서, 상기 역분화 유도용 조성물 및 이를 이용한 역분화 유도방법은 인간 체세포의 수용체인 CXCR2를 자극함으로써 체세포에서 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율을 증가시키므로, 이를 효과적으로 유도 만능 줄기세포로의 역분화 유도에 이용할 수 있다.
도 1a는 내피세포, 상피세포 및 태반세포 배양 시 GRO-α의 발현량을 시간 경과에 따라 효소면역 정량법으로 측정한 결과이다.
도 1b는 내피세포, 상피세포 및 태반세포 배양 시 IL-8의 발현량을 시간 경과에 따라 효소면역 정량법으로 측정한 결과이다.
도 1c는 내피세포, 상피세포 및 태반세포 배양 후 GRO-α의 발현을 각각 비교한 면역형광염색 결과이다.
도 1d는 내피세포, 상피세포 및 태반세포 배양 후 IL-8의 발현을 각각 비교한 mRNA 레벨 측정 결과이다.
도 2a는 내피세포, 상피세포 및 태반세포로부터 역분화 유도 후 유도만능 줄기세포의 특성을 확인하기 위한 알칼라인 포스파테이즈 염색 결과 사진이다.
도 2b는 내피세포, 상피세포 및 태반세포로부터 역분화 유도 후 유도만능 줄기세포의 특성을 확인하기 위한 알칼라인 포스파테이즈 염색 결과 그래프이다.
도 3a는 인간 내피세포로부터 줄기세포가 역분화되는 과정에서 콜로니가 형성된 세포로부터 발현되는 면역형광법 수행 결과 사진이다.
도 3b는 인간 상피세포로부터 줄기세포가 역분화되는 과정에서 콜로니가 형성된 세포에서 발현되는 면역형광법 수행 결과 사진이다.
도 3c는 인간 태반세포로부터 줄기세포가 역분화되는 과정에서 콜로니가 형성된 세포에서 발현되는 면역형광법 수행 결과 사진이다.
도 4a는 shRNA를 이용하여 CXCR2 발현을 억제한 내피세포로부터 역분화를 유도하여 CXCR2 단백질 레벨을 측정한 웨스턴 블롯 수행 결과이다.
도 4b는 shRNA를 이용하여 CXCR2 발현을 억제한 내피세포로부터 역분화를 유도하여 CXCR2 RNA 발현량을 측정한 그래프이다.
도 5a는 shRNA를 이용하여 CXCR2 발현을 억제한 내피세포로부터 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율을 확인하기 위하여 알칼라인 포스파테이즈 염색을 수행한 결과 사진이다.
도 5b는 shRNA를 이용하여 CXCR2 발현을 억제한 내피세포로부터 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율을 확인하기 위하여 알칼라인 포스파테이즈 염색한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 shRNA를 이용하여 CXCR2 발현을 억제한 내피세포로부터 유도 만능 줄기세포로의 역분화를 유도했을 때 CXCR2, mTOR 및 β-카테닌의 발현량과 유도 만능 줄기세포의 표지 인자 발현량을 확인한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 6a는 렌티바이러스 활성 입자(lentiviral activation particles)를 이용하여 CXCR2를 과발현시킨 상피세포로부터 역분화를 유도하여 CXCR2 단백질 레벨을 측정한 웨스턴 블롯 수행 결과이다.
도 6b는 렌티바이러스 활성 입자를 이용하여 CXCR2를 과발현시킨 상피세포로부터 역분화를 유도하여 CXCR2 RNA 발현량을 측정한 그래프이다.
도 6c는 렌티바이러스 활성 입자를 이용하여 CXCR2를 과발현시킨 상피세포로부터 역분화를 유도하여 생성된 유도 만능 줄기세포를 나타낸 사진이다.
도 6d는 렌티바이러스 활성 입자를 이용하여 CXCR2를 과발현시킨 상피세포로부터 역분화를 유도하여 유도 만능 줄기세포의 콜로니 수를 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 내피세포, 상피세포 및 태반세포에서의 GRO -α 및 IL-8의 발현 확인
인간 내피세포는 ATCC에서 제정맥 내피에서 초대배양한 세포(Primary Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)를 구입하였고 2% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF)가 포함되어 있는 배양배지(Endothelial Cell Growth Medium, LONZA)를 구입하여 사용하였으며 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다.
인간 상피세포는 ATCC에서 피부의 섬유아세포를 초대배양한 세포(Primary Dermal Fibroblasts, HDF)를 구입하였고, 90% 둘베코수정이글배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)와 10% FBS가 포함되어 있는 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
인간 태반세포로는 융모막 융모조직으로부터 분리한 세포(HPC)를 사용하였고, 분리한 태반세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배양배지에 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
세 가지 세포에서 GRO-α 및 IL-8의 분비량을 측정하기 위해 내피세포, 상피세포 및 태반세포를 배양디쉬에서 각각 24시간, 48시간 및 72시간 배양한 후에 배양배지를 수거하여, 시간이 경과함에 따른 GRO-α 및 IL-8의 분비량을 효소면역 정량법으로 측정하였다.
구체적으로, 실험은 키트(Human ELISA kit, Abcam)를 이용하여 수행하였다. 실험 순서는 100 ul의 샘플을 각각 4℃에서 오버나잇 반응시키고 바이오틴 항체(biotin antibody)를 첨가 후 1시간 동안 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘 용액(Streptavidin solution)과 시약(TMB One-Step Substrate Reagent)으로 반응시킨 뒤 50 ul 정지 용액(Stop Solution)으로 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 1a에서 확인할 수 있듯이, 상피세포에 비하여 태반세포 및 내피세포에서, 특히 내피세포에서 GRO-α의 발현이 높게 나타났다.
도 1b에서 확인할 수 있듯이, 상피세포 및 내피세포에 비하여 태반세포에서 IL8의 발현이 높게 나타났다.
배양디쉬에 배양한 내피세포, 상피세포 및 태반세포를 GRO-α의 발현을 형광염색법으로 검증하였다.
구체적으로, 배양된 세포들에 4% 포르말린을 첨가하여 상온에서 10분 동안 고정하고, 10분 동안 0.1% Triton X-100/PBS를 투과시키고, 4℃에서 GRO-α 1차 항체(Abcam #ab86436)로 오버나잇 반응시켰다. 다음 날 Alexa Fluor® 488을 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 반응시키고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 처리하여 암조건에서 5분 동안 방치한 후 형광현미경으로 세포에서의 GRO-α의 발현을 측정하였다.
도 1c에서 확인할 수 있듯이, 상피세포 및 태반세포에 비하여 내피세포에서 GRO-α의 발현이 높게 나타났다.
내피세포, 상피세포 및 태반세포에서 IL-8 유전자의 발현을 실시간 연쇄중합효소반응을 통하여 비교 분석하였다. 키트(Qiagen RNeasy kit, Qiagen Hilden, Germany)를 이용하여 분화 유도된 세포로부터 RNA를 분리하고, 2 ug의 RNA, 올리고(dT) 및 역전사효소(Superscript II reverse transcriptase, Gibco)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
합성된 각각의 cDNA에 IL-8 유전자의 프라이머와 마스터믹스(iQ SYBR Green qPCR Master Mix)를 넣고 기기(Bio-Rad iCycler iQ system, Bio-Rad Laboratories, USA)를 사용하여 분석하였다. 분석 값은 GAPDH 유전자를 이용하여 정상화(normalized)하였으며, 통계적으로 유의함을 나타내기 위하여 P 값(P Value)을 사용하였다(*P =0.05). IL-8 유전자 발현 분석을 위한 프라이머는 다음과 같다.
서열번호 명칭 서열
1 IL-8 정방향 프라이머 CTGGCCGTGGCTCTCTTG
2 IL-8 역방향 프라이머 CCTTGGCAAAACTGCACCTT
도 1d에서 확인할 수 있듯이, 상피세포 및 태반세포에 비하여 내피세포에서 GRO-α의 발현이 높게 나타났다.
결과적으로, 내피세포에서 GRO-a와 IL-8이 가장 높게 발현함으로써 CXCR2가 자극되어 상피세포 및 태반세포에서보다 높은 역분화 효율을 보였음을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 내피세포, 상피세포 및 태반세포에서의 역분화 효율 비교
실시예 1의 체세포에서 유도된 역분화 줄기세포로부터 유도 만능 줄기세포의 특성인 자가재생 능력이 나타나는지의 여부를 알칼라인 포스파테이즈 염색을 통해서 확인하였다. 알칼라인 포스파테이즈(ALP) 염색은 키트(ES Cell Characterization kit, Chemicon International)를 사용하여 수행하였다.
표 2, 도 2a 및 2b에서 확인할 수 있듯이, 인간 내피세포에서 상피세포 또는 태반세포에 비해 7 내지 10배 가량 높은 역분화 효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(**P≤0.01).
세포종류 세포 접종량 콜로니/웰 효율(%)
인간내피세포(HUVEC) 1 X 105 4043 ± 0.21 4.043
태반세포(HPC) 1 X 105 380 ± 0.03 0.381
상피세포(HDF) 1 X 105 553 ± 0.03 0.553
실시예 3: 내피세포, 상피세포 및 태반세포로부터 역분화된 줄기세포에서의 CXCR2, mTOR 및 β-카테닌의 발현 검증
실시예 1에서 체세포에서 유도된 역분화 줄기세포로부터 CXCR2, mTOR 및 β-카테닌이 발현되는 부위를 면역형광법으로 검증하였다. 인간 전능성 줄기세포의 CXCR2 및 mTOR 억제가 β-카테닌의 활성도를 저하시킨다는 점이 선행연구를 통해 확인되었고, 태반 유래 조건화 배지에서 배양한 인간 역분화 줄기세포는 CXCR2/mTOR/β-카테닌 기전에 의해서 인간 전능성 줄기세포의 특징 및 증식이 조절된다.
따라서 태반 유래 조건화 배지를 이용하여 유도 만능 줄기세포를 형성하는 과정에서 CXCR2 자극에 의해서 mTOR와 β-카테닌의 기전을 통하여 역분화 줄기세포로 활성을 갖게 될 것으로 예측하고 이를 확인하였다.
인간 체세포로는 상피세포, 내피세포 및 태반세포를 사용하였으며 샌다이 바이러스 역분화 인자(OCT4, SOX2, c-Myc 및 KLF4, (Life Technologies, CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit)를 구입하여 KOS 5 MOI(multiplicity of infection; 감염다중도), c-Myc 5 MOI 그리고 Kif4 3 MOI의 바이러스를 감염시켜 형질변환시킨 후 7일 동안 성장배지를 제공하여 배양하였다.
상피세포와 태반세포의 성장배지 조성은 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 U/ml 페니실린(penicillin) 그리고 100 g/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)이며 내피세포의 성장배지로는 배지(EBM-2 배지, LONZA, CC-3162)를 구입하여 사용하였다.
형질변환된 체세포를 0.1% 젤라틴(gelatin)이 코팅된 새로운 배양용기로 이식하고 태반 유래세포 조건화 배지를 제공하여 배양하였으며 이로부터 콜로니가 형성되는 과정 중에 매일 형광염색법을 수행하였다.
구체적으로, 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정시킨 후 10분 동안 0.1% 트라이톤 X100를 세포에 침투시키고 1차 항체인 CXCR2(Abcam #ab14935), Nanog(Santacruz #sc-293121), β-카테닌(Thermo scientific #MA1-2001), p-mTOR(Cell signaling #5536)를 각각 1:1000으로 희석하여 처리하고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음 날 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 처리하고 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 처리하여 암조건에서 5분 동안 방치한 후 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 3a 내지 도 3c에서 확인할 수 있듯이, 줄기세포가 역분화되는 과정에서 콜로니가 형성된 세포에서만 CXCR2, mTOR 및 β-카테닌이 발현되었으므로, 체세포에 가해지는 CXCR2 자극에 의해서 mTOR 및 β-카테닌의 기전을 통하여 역분화 줄기세포로서의 활성을 갖게 되는 것으로 판단할 수 있다.
실시예 4: shRNA를 이용한 CXCR2 발현 억제 유도
실시예 2에서와 같이 CXCR2 발현량이 높게 나타나는 내피세포에 대하여, shRNA를 이용하여 CXCR2 발현을 억제하였을 때 역분화 줄기세포의 효율이 현저히 낮아지는 것을 확인하였다.
렌티바이러스 감염을 위해 12웰 배양 플레이트에 1X105/well의 내피세포를 배양하고, 다음 날 6 mg/mL 폴리브렌(polybrene)이 포함된 배양배지에 15분 동안 방치한 후 1 X 106 TU/mL의 shRNA가 삽입된 렌티바이러스(CXCR2 shRNA lentiviral particles, Santacruz #sc-40028-V)로 감염시켰다. 24시간 후에 배지를 폴리브렌이 첨가되지 않은 세포 성장배지로 바꾸고 다음날부터 2 ug/mL 퓨로마이신(puromycin)으로 4 내지 7일 동안 바이러스가 감염된 세포를 선별하여 수확한 다음, CXCR2의 발현 여부를 확인하였다.
렌티바이러스 감염에 이용한 CXCR2 shRNA 렌티바이러스 입자의 핵산 서열은 하기 표 3과 같다.
서열번호 명칭 서열
3 sc-40028-VA GATCCGTCTACTCATCCAATGTTATTCAAGAGATAACATTGGATGAGTAGACTTTTT
4 sc-40028-VB GATCCCCTCAAGATTCTAGCTATATTCAAGAGATATAGCTAGAATCTTGAGGTTTTT
5 sc-40028-VC GATCCGCCACTAAATTGACACTTATTCAAGAGATAAGTGTCAATTTAGTGGCTTTTT
shRNA가 삽입된 렌티바이러스를 처리하지 않은 그룹, 대조군 렌티바이러스를 처리한 그룹 및 CXCR2 렌티바이러스를 처리한 그룹을 대상으로 CXCR2의 발현량을 단백질 및 RNA 레벨 기준으로 측정하였다.
구체적으로, 단백질 레벨에서 발현량을 측정하기 위해서 세포를 차가운 PBS로 세척한 후, 용해 완충액(20 mM KCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 1 x 프로테아제 억제제, 10% 글리세롤 및 50 mM 트리스-HCl, pH 7.5)으로 15분 동안 얼음 상에서 교반하고 용해된 세포를 4℃에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다.
상층액 중의 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 분석법(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)에 의해 확인되었다. 총 단백질(30 ug)을 소듐 도데실설파이트 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분석하고 니트로셀룰로오즈(nitrocellulose) 막으로 옮겼다(GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK). CXCR2 1차 항체(Abcam #ab65968)를 1:1,000으로 희석하여 4℃에서 오버나잇 후 HRP- 접합 된 2차 항체를 1:2,000으로 희석하고, 1시간 상온에서 배양하여 ECL(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 신호를 검출하였다.
실시간 연쇄중합효소반응을 통하여 RNA 레벨을 측정하였다. GAPDH 유전자를 이용하여 정상화하였으며, 통계적으로 유의함을 나타내기 위하여 P 값을 사용하였다(*P =0.05, **P = 0.01).
CXCR2 유전자 발현 분석을 위해 사용한 프라이머는 하기 표 4과 같다.
서열번호 명칭 서열
6 CXCR2 발현 분석용 정방향 프라이머 CAATGAATGAATGAATGGCTAAG
7 CXCR2 발현 분석용 역방향 프라이머 AAAGTTTTCAAGGTTCGTCCGTGTT
도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, shRNA가 삽입된 렌티바이러스를 처리함으로써 내피세포로부터 유도된 세포에서 CXCR2의 발현이 억제되었다.
실시예 5: CXCR2 발현 억제에 의한 역분화 유도 효율 감소
실시예 4에서와 같이 CXCR2의 발현을 억제하였을 때, 체세포로부터 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율을 확인하기 위하여 알칼라인 포스파테이즈 염색을 수행하였다.
표 5, 도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이, 내피세포에서 CXCR2의 발현이 억제된 후 역분화가 유도됨에 따라 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율 또한 감소하였다(****P≤0.0001).
감염조건 세포 접종량 콜로니/웰 효율(%)
감염되지 않은 대조군 1 X 105 1974 ± 50.00 1.973
shControl 렌티바이러스 1 X 105 946 ± 89.20 0.946
shCXCR2 렌티바이러스 1 X 105 4 ± 2.70 0.004
도 5c에서 확인할 수 있듯이, 내피세포에서 CXCR2의 발현을 감소시킨 경우 이로부터 역분화 유도된 유도 만능 줄기세포에서는 CXCR2, mTOR 및 β-카테닌의 발현량 뿐만 아니라 유도 만능 줄기세포 표지 인자들의 발현량 또한 감소하였다.
실시예 6: CXCR2 과발현 유도에 의한 역분화 유도 효율 증가
상피세포에서 렌티바이러스 활성 입자(lentiviral activation particles)를 이용하여 CXCR2를 과발현시켰다.
구체적으로, 1 x 105 cells의 상피세포를 12웰 플레이트에 배양하고 24시간 뒤에 6 ug/ml 폴리브렌(polybrene)을 15분 동안 처리하고 10 MOI의 CXCR2 렌티바이러스 활성 입자(IL-8RB Lentiviral Activation Particles (h), SantaCruz, #sc-401404-LAC)로 감염시켰다. 다음날 폴리브렌이 함유되지 않은 배지로 교체하여 하루 동안 배양하였다. 이후 5 ug/ml 퓨로마이신(puromycin)을 이용하여 CXCR2 렌티바이러스 활성 입자가 감염된 세포만 선택적으로 선발하여 배양하였다.
이후 웨스턴블랏과 실시간 연쇄중합효소반응을 통해서 과발현 상태를 측정하였다. CXCR2의 발현량은 실시예 4에서와 동일한 방법을 수행하여 측정하였다.
도 6a 및 6b에서 확인할 수 있듯이, 렌티바이러스 활성 입자를 이용함으로써 상피세포로부터 유도된 세포에서 CXCR2의 발현이 증가하였다.
이에 체세포로부터 유도 만능 줄기세포로의 역분화 효율을 확인하기 위하여 상용화된 다능성줄기세포 배양 배지(TeSR)와 태반유래 조건화 배지에서 각각 CXCR2를 과발현시킨 그룹과 대조군 그룹으로 나누어 세포를 배양한 후 실시예 5에서와 같이 알칼라인 포스파테이즈 염색을 수행하였다.
표 6, 도 6c 및 6d에서 확인할 수 있듯이, 상피세포에서 CXCR2를 과발현시킨 경우 이로부터 역분화 유도된 유도 만능 줄기세포가 대조군에 비해 많았다.
감염조건 세포 접종량 콜로니/웰 효율(%)
TeSR_대조군 1 X 105 151 ± 0.09 0.151
TeSR_CXCR2 과발현 1 X 105 132 ± 0.04 0.132
태반 유래 조건화 배지_대조군 1 X 105 445 ± 0.25 0.445
태반 유래 조건화 배지 _CXCR2 과발현 1 X 105 1267 ± 1.14 1.267
TeSR에서보다 태반 유래 조건화 배지에서 역분화 줄기세포가 더 많이 만들어졌으며, CXCR2를 과발현시킨 상피세포를 태반유래 조건화 배지에 배양한 그룹에서 가장 많은 역분화 줄기세포를 유도하였음을 확인하였다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Korea University <120> Composition for inducing de-differentiation from somatic cell into induced pluripotent stem cell and method for inducing de-differentiation using the same <130> PN180057 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 1 ctggccgtgg ctctcttg 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 2 ccttggcaaa actgcacctt 20 <210> 3 <211> 57 <212> DNA <213> shRNA lentiviral particles <400> 3 gatccgtcta ctcatccaat gttattcaag agataacatt ggatgagtag acttttt 57 <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213> shRNA lentiviral particles <400> 4 gatcccctca agattctagc tatattcaag agatatagct agaatcttga ggttttt 57 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> shRNA lentiviral particles <400> 5 gatccgccac taaattgaca cttattcaag agataagtgt caatttagtg gcttttt 57 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 6 caatgaatga atgaatggct aag 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequences <400> 7 aaagttttca aggttcgtcc gtgtt 25

Claims (15)

  1. CXCR2의 리간드(ligand)를 포함하는 체세포에서 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CXCR2의 리간드는 GRO-α, GRO-β, GRO-γ, GCP-2, NAP-2, ENA-78 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 역분화유도용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 체세포는 내피세포, 상피세포 및 태반세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 역분화 유도용 조성물.
  4. CXCR2의 리간드(ligand)를 포함하는 체세포에서 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화 유도용 태반유래세포 조건화 배지.
  5. 제4항에 있어서, 상기 CXCR2의 리간드는 GRO-α, GRO-β, GRO-γ, GCP-2, NAP-2, ENA-78 및 IL-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 역분화 유도용 태반유래세포 조건화 배지.
  6. 제4항에 있어서, 상기 체세포는 내피세포, 상피세포 및 태반세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 역분화 유도용 태반유래세포 조건화 배지.
  7. 제4항에 있어서, 상기 태반유래세포는 인간 융모막판에서 분리되어 배양된 태반유래 섬유세포-유사세포인 것인, 역분화 유도용 태반유래세포 조건화 배지.
  8. 제4항에 있어서, 상기 태반유래세포 조건화 배지는 세포 성장 배지에 배양한 인간 태반유래세포를 포함하는 것인, 역분화 유도용 태반유래세포 조건화 배지.
  9. 다음의 단계를 포함하는 체세포에서 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPS)로의 역분화 유도방법:
    CXCR2의 발현을 증가시키는 체세포 형질 변환 단계; 및
    형질변환된 체세포를 배양하는 체세포 배양 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 체세포 형질 변환 단계는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템 또는 렌티바이러스 활성 입자(Lentiviral Activation Particles)를 사용하는 것인 역분화 유도방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 체세포는 내피세포, 상피세포 및 태반세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 역분화 유도방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 배양은 태반유래세포 조건화 배지에서 수행되는 것인 역분화 유도방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 태반유래세포는 인간 융모막판에서 분리되어 배양된 태반유래 섬유세포-유사세포인 것인 역분화 유도방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 태반유래세포 조건화 배지는 세포 성장 배지에 배양한 인간 태반유래세포를 포함하는 것인 역분화 유도방법.
  15. 제9항에 있어서, 상기 역분화 유도 방법은 체세포 배양 단계에서 형성된 콜로니로부터 줄기세포를 분리하는 줄기세포 분리 단계를 추가적으로 포함하는 것인 역분화 유도방법.
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