JPH06506596A - インターロイキン−８受容体及び関連分子及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

インターロイキン−８受容体及び関連分子及び方法発明の背景 本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　１ｌｅａｌｔｈによ り授与された＃ＲＯＩＡＲ３９６０２、＃ＡＧＯＯ１１５、及び＃ＫＯ４ＡＲＯ １８１０の下に、政府の援助により行われた。本発明の確固たる権利は政府が有 する。 本発明は、炎症の減少に関する。正常な環境下では、秩序正しく進行する宿主の 防御（例えば、Ｔ及びＢリンパ球、マクロファージ、及び好中球を含む）により 、有害な抗原から宿主を防御する、よく制御された免疫及び炎症性応答が起こる 。しかし、宿主防御に含まれるいずれかのシステムの調節的な機能障害により、 宿主組織は損傷を受け、臨床的に明白な疾病が引き起こされる。このような機能 障害の一つは炎症であり、これは、細胞学的及び組織学的反応の複雑な組み合わ せから成る病理学的過程である。これらの反応は、外傷または物理的、化学的ま たは生物学的因子に起因する異常な刺激に応答して、患部血管及び隣接した組織 中で起こる。炎症性疾患には、アナフィラキシ−１全身的壊死性脈管炎、全身的 狼論紅斑（ｓｙｓｔｅ＋＊ｉｃ　Ｉｕｐｕｓ　ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）　 、血清病症候群、乾廚、及びリウマチ様関節炎、及び例えば、心筋梗塞またはシ ョックにおける虚血のあとに発生する再潅流創傷（ｒｅｐｅｒｆｕｓｌｏｎ　１ ｎｊｕｒｙ）などがある。炎症は、同種移植の拒絶反応においても役割を演じる 。 好中球は、炎症の過程において役割を演じる細胞成分である。活性化されると（ 例えば、宿主が病原体に感染した後）、好中球は細胞毒性物質を生産し、炎症性 反応を増幅する。激しい炎症の間、好中球蛋白質分解酵素及び酸素遊離基の放出 により、軟骨のムコ多糖類の消化、滑膜組織の酸化、及び肺の広範囲に及ぶ損傷 が起こりうる。さらに、炎症部位における走化性因子は好中球の凝集及び内皮へ の吸着を誘発し、例えば、肺血管系における１ｅｕｋｏｓｔａｓｉｓ及び心肺機 能障害の原因となる（Ｊａｎｃｌｌ、　１１１０ｏｄ　Ｌｉｔｔｌｅ、　Ｂｒｏ ｗｎ　＆　Ｃｏ、＋　Ｂｏｓｔｏｎ、　１９８７　）　。 インターロイキン−８（ＩＬ−８）は７２アミノ酸から成るペプチドであり、イ ンターロイキン−１及び他の刺激性サイトカインによる活性化に伴い多様な細胞 型により生産される（Ｗｅｓｔｗｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　／ｚｚｕｔｙｏ１０ ｉｙ　ｆｏｄｚｙｌＯ：Ｌ４Ｂ、　１９８ｇ）。 ＩＬ−８は以前、好中球活性化ペプチド−１（ＮＡＰ−１）　、好中球活性化因 子（ＮＡＦ）　、及び単球由来好中球走化性因子（ＭＤＮＣＦ）として知られて きた。 ＩＬ−８のアミノ酸配列は決定されている（Ｌｌｎｄｌｅｙ　ａｔ　ａｔ、、／ ｆｏｒ、　／Ｖｌｌ／、　１ｃｒｔｔ／、　Ｓｔ、／、況７閃：９１９９．１９ １１９　）。ＩＬ−８は、好中球の走化性及び脱顆粒を促進する（Ｄｊｅｕ　ｅ ｔ　ａｌ、、）’、　／ｚｚｔｔｓｏ／、　１４４：２２０５．１９９０　）　 、Ｌ　Ｌ　−８は、Ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは好中球の潜在的な化学誘引剤であり、 ｉｎ　ｖｉｖｏでは強力な炎症効果を有することが示されている（Ｃｏｌｄｉｔ ｚ　ａｔ　ａｌ、、　Ｉｌ、）、　ｈ１７ａ１．１３４ニア５５．１９８９）　 ｏさらに、Ｉ　Ｌ−８は、乾岨及びリウマチ様関節炎のような自然発生的炎症性 条件において大量に存在することが見出だされている。Ｉ　Ｌ−８は、好中球に 媒介される炎症過程の中心的因子であると思われる。このため、ＩＬ〜８作用の 阻害剤またはアンタゴニストが有用な抗炎剤である事が期待される。 好中球に対するＩＬ−８の作用は特異的な受容体により媒介される（Ｃｒｏｂ　 ａｔａｌ、、）’、　１１１０／、　（’Ｉｅｚ、　２６５：８３１１．１９９ ０）　、この糖蛋白質の分子量は５８，０００ダルトンと計算され、顆粒球、特 に好中球に限定される。この受容体は、これまでに完全には同定またはクローニ ングされていないが、ＩＬ−８阻害剤及びアンタゴニストの開発において特に利 用価値が高いことが期待される。 発明の要旨 一般的に本発明は、組み換えＩＬ−８受容体ポリペプチドに関する。受容体ポリ ペプチドは、高い親和性または低い親和性でＩＬ−８に結合する。受容体は、図 １（配列番号：１）、図２（配列番号：５）、または図９（配列番号：６）に示 すアミノ酸配列と事実上同一なアミノ酸配列を有することが好ましい。本発明は 、！Ｌ−８受容体の断片またはアナログであり１．−８への結合能を有する領域 を含む、十分に単離されたポリペプチドにも関する。 種々の好適な実施例において受容体は、哺乳類、好ましくはヒトまたはウサギに 由来する。 さらに本発明は、ＩＬ−８受容体膜貫通性領域またはＩＬ−８細胞外領域の全体 またはＩＬ−８結合部分を含有するポリペプチドに関する。ポリペプチドは、図 １（配列番号＝１）に示すアミノ酸配列のアミノ酸約１〜３７またはそのＩＬ− ８結合断片、または図２（配列番号：５）に示すアミノ酸配列のアミノ酸約１〜 ５０またはその［Ｌ−８結合断片を含有することが好ましい。ポリペプチドは、 組み換えポリペプチドまたは合成ポリペプチドであることが好ましい。 “ＩＬ−８受容体ポリペプチド゛とは、ＩＬ−８に特異的に結合し、Ｉ　Ｌ−３ に媒介される適切な生物学的イベントのカスケードにシグナルを送る細胞表面蛋 白質の全体または一部を意味し、これには、ＩＬ−８に高い親和性または低い親 和性で結合する受容体が含まれる。″ポリペプチド°とは、長さや翻訳後の修飾 （例えば、糖鎖形成）に関わらずアミノ酸のいかなる鎖をも意味する。“高い親 とは、天然では混入している他の蛋白質、炭水化物及び脂肪が十分に除去された ポリペプチドを意味する。゛事実上同一な“アミノ酸配列とは、例えば、一つの アミノ酸を同じクラスの他のアミノ酸に置換する（例えば、グリシンに対してバ リン、リジンに対してアルギニンなど）などの同種アミノ酸置換、または受容体 の生物活性を破壊しない部分のアミノ酸配列における一つまたはそれ以上の非同 種アミノ酸置換、欠失、または挿入によってのみ異なるアミノ酸配列を意味する 。 このような同質の受容体は、以下に記載する、またはそれと同様の方法を用いて 、このような受容体を天然において生産するまたは生産を誘導されるいかなる動 物の組織または細胞から抽出することによっても単離することができる；または 、化学合成によって単離することができる；または、組み換えＤＮＡ技術の標準 的な技法（例えばこのような受容体をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを 単離するなど）により単離することができる。“に由来する゛とは、その生物の ゲノムにコードされ、その生物細胞のサブセットの表面に存在することを意味す る。 “合成ペプチド′とは、例えばペプチド合成のような化学合成により作製された ペプチドを意味する。 他の関連する態様において本発明は、上述の受容体（または受容体断片またはア ナログ）をコードする精製されたＤＮＡに関連する。精製されたＤＮＡは親和性 の高いＩＬ−８受容体をコードするか、または親和性の低いＩＬ−８をコードす る。好ましくは、精製されたＤＮＡはｃＤＮＡであり、ウサギＩＬ−８受容体を コードするｃＤＮＡであり、ヒトＩＬ〜８受容体をコードするｃＤＮＡであり、 プラスミドＦ３Ｒに含有されており、プラスミド５ｂｌａに含有されており、プ ラスミド４ＡＢに含有されている。 ″精製されたＤＮＡ’とは、ＩＬ−８受容体（または適切な受容体断片またはア ナログ）をコードするが、本発明のＤＮＡが由来する生物の天然に存在するゲノ ム中でＩＬ−８受容体をコードする遺伝子に隣接している遺伝子を含まないＤＮ Ａ分子を意味する。 他の関連する態様において本発明は、このような幇製されたＤＮＡを含有し、そ のベクターを有する細胞内においてそのＤＮＡによりコードされる蛋白質を発現 することのできるベクター、及びこのようなベクターを有する細胞（好ましくは 真接生物細胞、例えば、哺乳類細胞、例えば、骨髄腫細胞またはハムスター肺線 維芽細胞）に関連する。このような細胞は、このような精製されたＤＮＡにより 安定にトランスフェクトされていることが好ましい。 本発明の発現ベクターまたはベクターを含有する細胞を、組み換えＩＬ−８受容 体ポリペプチド及び上述のポリペプチドを作製する本発明の方法において使用す ることができる。この方法には、発現するよう細胞内に位置づけられたＩＬ−８ 受容体またはその断片またはアナログをコードするＤＮＡにより形質転換された 細胞の提供、ＤＮＡが発現する条件下での形質転換細胞の培養、及び組み換え！ Ｌ−８受容体蛋白質の単離が含まれる。“形質転換細胞゛とは、遺伝子工学の手 法によりＩ　Ｌ−８受容体（またはその断片またはアナログ）をコードするＤＮ Ａ分子を導入された細胞（またはその祖先にＤＮＡを導入された細胞）を意味す る。このようなりＮＡは、°発現するよう位置づけられており２、これは、ＤＮ Ａ分子が、その配列の転写および翻訳を支配する（すなわち、ＩＬ−８受容体蛋 白質、またはその断片またはアナログの生産を促進する）ＤＮＡ配列に隣接して 位置していることを意味する。 また他の態様において、本発明は、！Ｌ−８受容体（またはその断片またはアナ ログ）に優先的に結合する精製された抗体に関する。°精製された抗体”とは、 治療投与ができるよう、天然では混入している他の蛋白質、炭水化物、および脂 肪が十分に除去されている抗体を意味する。このような抗体はＩＬ−８受容体に （またはその断片またはアナログ）に″優先的に結合°シ、すなわち、他の、抗 原性上無関係な分子を事実上認識及び結合しない。 抗体は、ｉｎ　ＶＩＶＯにおいて、結合する蛋白質の生物活性を中和することが 好ましい。“生物活性゛とは、ＩＬ−８受容体の、ＩＬ−８に結合する能力及び 適切な生物学的イベントのカスケードにシグナルを送る能力を意味する。“中和 する”とは、（例えば、ＫＬ−８受容体の生物活性を）部分的または完全に阻止 することを意味する。 他の態様において、上述のポリペプチドまたは抗体は、治療的混成物の活性成分 として使用される。このような治療的混成物では、活性成分は生理学的に許容さ れる担体と共に処方されるかまたは細胞膜中に固定されることもある。これらの 治療的組成は、炎症を減少させる方法において使用される。 また他の態様において本発明は、候補化合物について、ＩＬ−８とＩＬ−８受容 体との間の相互作用を中和する能力をスクリーニングする方法に関する。この方 法には、ａ）候補アンタゴニスト化合物を、一方で、組み換えＩＬ−８受容体（ またはＩＬ−８結合断片またはアナログ）を有する第一の化合物、及びもう一方 で、！Ｌ−８を含む第二の化合物と混合する、ｂ）第−及び第二の化合物が結合 するか決定する、Ｃ）第一の化合物が第二の化合物に結合するのを阻害し、及び ／またはＩＬ−８により媒介されるＣａ”の放出を減少させる化合物を、アンタ ゴニスト化合物と同定することが含まれる。″アンタゴニスト”とは、特定の活 性、この場合、ＩＬ−８の、ＩＬ−８受容体と相互作用し、及び／またはこのよ うな相互作用に起因する生物学的イベント（例えば、細胞内Ｃａ”＋の放出）を 誘発する能力、を阻害する分子を意味する。 最後に本発明は、キメラポリペプチド、特に、図２（配列番号：５）に示す配列 のカルボキシル末端に融合された、図１（配列番号：１）に示す配列のアミノ末 端部分を含むキメラポリペプチドに関する。ポリペプチドは、図２（配列番号： ５）のアミノ酸約６３〜３６０に融合された、図１（配列番号：１）のアミノ酸 約１〜５８またはそのＩＬ−８結合断片を含み、これがＦ３Ｒ／４ＡＢにコード されていることが好ましい。本発明はまた、図１（配列番号：１）に示す配列の カルボキシル末端に融合された、図２（配列番号　５）に示す配列のアミノ末端 部分を含むポリペプチドにも関する。ポリペプチドは、図１（配列番号：１）の アミノ成約５９〜３５５に融合された、図２（配列番号＝５）のアミノ成約１〜 ６２またはその！Ｌ−８結合断片を含み、これが４ＡＢ／Ｆ３Ｒにコードされて いることが好ましい。本発明は、このようなキメラポリペプチドをコードするＤ ＮＡにも関する。 本発明の蛋白質は、好中球の活性化及び炎症応答へとつながるイベントに含まれ る。このため、このような蛋白質は、炎症の治療、またはその代わりに、炎症を 治療する治療薬の開発に有用である。乾１、リウマチ様関節炎、脈管炎、再潅流 創傷、または好中球に媒介される炎症性疾患を含む特定の疾患は、本発明の蛋白 質及び／または方法を用いて治療することができる。好適な治療薬は、例えばペ プチド断片（特に、Ｎ末端細胞外領域に由来する断片）、抗体（特に、Ｎ末端細 胞外領域を認識し結合する抗体）、またはインターロイキン：受容体相互作用を 妨害することによりＩＬ−８またはＩＬ−８受容体機能を阻止する薬物のような 、アンタゴニストが含まれる。 受容体成分は現在組み換え技術により生産することができ、また、候補アンタゴ ニストをｉｎ　ｖ＋ｔｒｏでスクリーニングすることができることから、すぐに 使用できる発明は、有用な治療薬の同定に、簡便かつ迅速なアプローチを提供す る。以下のような幾つかの理由により、これまではこのようなアプローチは困難 であった：　（１）［Ｌ−８と好中球表面にある内在性受容体との相互作用によ り、蛋白質分解酵素及び酸素遊離基の放出につながる一連のイベントカ弓１き起 こされ、その結果、受容体を有する好中球細胞の破壊が起こること、（２）好中 球表面に、関連する受容体が存在すること。Ｉ　Ｌ−８受容体遺伝子（ｃＤＮＡ として）を単離することにより、好中球とはかけ離れた細胞型（例えば、Ｊ５５ ８、ＳＰ２骨髄腫細胞、ＣｏＳ細胞、またはチャイニーズハムスター肺線維芽細 胞）中での発現を可能にし、効果的に、［Ｌ−８受容体をその正常な細胞毒性シ グナル経路から外し、細胞死を起こすことなくｒｔ、−ｓ：受容体相互作用をア ッセイするシステムを提供する。 一度単離すれば、組み換え及び分子生物学的技術を用いて、ペプチドに基づく、 または抗体に基づく治療薬を、大量かつ安価に作製することができる。 本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載する好適な実施例及び特許請求の範囲 から明白である。 ４、

【図面の簡単な説明】

図面 図１（配列番号＝１）は、ウサギ由来の、親和性の高いＩＬ−８受容体の核酸配 列及び推定アミノ酸配列を示している。 図２（配列番号：５）は、ヒト由来の、親和性の低いＩＬ−８受容体の核酸配列 及び推定アミノ酸配列を示している。 図３は、独立して単離した４Ｎの、親和性の高いＩＬ−８受容体を誘導発現する 細胞系への、（Ｌ−８の結合の程度を表す棒グラフである。 図４は、親和性の低いＩＬ〜８受容体へのＩＬ−８の結合を、ＩＬ−８ａ度の関 数として示したグラフである。 図５は、親和性の低いＩＬ−８受容体へのＭＧＳＡ／ＧＲＯαの結合を、ＭＧＳ Ａ／ＧＲＯα濃度の関数として示し、ＩＬ−８受容体へのＩＬ−８とＭＧＳＡ／ ＧＲＯαの結合の競合を示したグラフである。 図６は、親和性の低いＩＬ−８受容体への柾々のリガンドの結合の競合を示した グラフである。 図７は、親和性の高い／親和性の低い、及び親和性の低い／親和性の高いキメラ 受容体への、Ｉｎ−８の結合の程度を表す棒グラフである。 図８は、親和性の低いＩＬ−８受容体及び親和性の高い／親和性の低いキメラＩ Ｌ−８受容体への種々のリガンドの結合の競合を示したグラフである。 図９は（配列番号二６）は、ウサギ由来の、親和性の低いＩＬ−８受容体の核酸 配列及び推定アミノ酸配列を示している。 図１０は、Ｉ　Ｌ−８受容体の構造を説明する概略図である。 図１１は、親和性の高いＩＬ−８受容体への全ＩＬ−８結合のパーセンテージを 、アゴニスト濃度の関数として示した２つのグラフである。 本発明によるポリペプチド 本発明によるポリペプチドには、親和性の高い［Ｌ−８受容体全体（図１、配列 番号：１に示している）及び親和性の低い【Ｌ−８全体（図２、配列番号：５及 び図９、配列番号：６に示している）が含まれる；親和性の高い受容体は、Ｋｄ が１０ｎＭまたはそれ以下（好ましくはＫｄは０．１〜１０ｎＭの間）でＩＬ− ８に結合し、親和性の低い受容体は、１０ｎＭを上回るＫｄでｒ　Ｌ、−８に結 合する。このような受容体はいかなる供給源に由来してもよいが、例えば、ヒト またはウサギなどの哺乳類に由来することが好ましい。このようなポリペプチド は、例えば、ｒＬ−８：受容体相互作用を阻害するアンタゴニストをスクリーニ ングするのに使用する（以下を参照）。本発明のポリペプチドは、ＩＬ−８と相 互作用することのできる親和性の高い、または親和性の低いＩＬ−８受容体のア ナログまたは断片（例えば、ＩＬ−８受容体のＮ末端細胞外領域）も含む。この ようなアナログ及び断片は、Ｉ　Ｌ−８受容体アンタゴニストのスクリーニング にも使用することができる。さらに、Ｉ　Ｌ−８に結合し、好ましくは可溶性の （または不溶性であり、脂肪小胞中に処方されている）受容体断片またはアナロ グのサブセントは、炎症性疾患を減少させるアンタゴニストとして使用すること ができる（以下を参照）。受容体アナログまたは断片の有効性は、ＩＬ−８との 相互作用能に依存している；このような相互作用は、多くの標準的なｆｎ　ＶＩ ｔｒＯ結合方法及びｒＬ−８受容体機能アッセイ（例えば、以下に記載するもの ）のいずれを用いても容易にアッセイすることができる。 注目すべき特異的受容体アナログは、一つのアミノ酸を同じクラスの他のアミノ 酸に置換する（例えば、グリシンに対してバリン、リジンに対してアルギニンな ど）などの保存的なアミノ酸置換、または受容体のＩ　Ｌ−８への結合能（以下 の通りアッセイする）を破壊しない部分のアミノ酸配列における一つまたはそれ 以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、または挿入によってのみ異なるアミノ酸配 列を含む受容体蛋白質の全体または一部（以下の参照）である。 注目すべき特異的受容体断片は、ＩＬ−８と相互作用することのできるＩＬ−８ 受容体のいずれかの部分（例えば、Ｎ末端細胞外領域の全体または一部）を含む 。このような部分は、膜質通性部分１〜７、及び受容体の、細胞外に存在すると 推定される部分を含む（図１０）。このような断片はアンタゴニストとして有用 であり（上に記載する通り）　、ｉｎ　ＶＩＶＯにおいてＩＬ−８受容体の活性 を中和する抗体（例えば、受容体とＩＬ−８との間の相互作用を妨害することに より；以下を参照）を生産するためのイムノゲンとしても有用である。細胞外領 域は、類似の構造を有する関連蛋白質と比較することにより同定することができ る（例えば、Ｇ蛋白質共役受容体スーパーファミリーの他のメンバー）；有用な 領域は、そのファミリーの良（解析されているメンバーの細胞外領域と相同性を 有する領域である。 その他の方法として、アミノ酸−次配列より、蛋白質の二次構造が推定でき、こ れにより、Ｃｈｏｕ−Ｐａｓｍａｎ法（例えば、Ｃｈｏｕ　ａｎｄ　Ｐａｓｍａ ｎ、　／／７／７．　ｈｒ、　１Ｊｏｃｉｌｅｚ。 ４７：２５Ｌ、　１９７ｇ参照）などの疎水性／親水性計算を用いて半経験的に 細胞外領域を推定することができる。親水性領域、特に疎水性ストレッチ（例え ば、横貫通性領域）に囲まれた領域は、細胞外領域の強力な候補である。最後に 、細胞外領域は、標準的な酵素的消化分析（例えば、トリプシン消化解析）を用 いて実験的に同定することができる。 候補断片（例えば、膜質通性部分２〜７の全体または一部、またはいずれかの細 胞外断片）のＩＬ−８との相互作用を、本発明中に記載するアッセイにより試験 する。このような断片について、ＩＬ−８とその内在性受容体との間の相互作用 を中和する能力も試験する。有用な受容体断片（上述の通り）のアナログも作製 し、スクリーニング成分またはアンタゴニストとしての有用性を試験する（本発 明中に記載するアッセイを用いて）；本発明において、このようなアナログも有 用であると考えられる。 特に注目すべきものは、細胞外アミノ末端領域を取り囲む受容体断片（または、 そのＩＬ−８結合断片）である；この領域は、ウサギから単離した親和性の高い ！Ｌ−８受容体のおよそアミノ酸１〜３７、ウサギから単離した親和性の低いＩ Ｌ−８受容体のアミノ約酸１〜４９、及びヒトから単離した親和性の低いＩＬ− ８受容体のアミノ成約１〜５０を含む。ｒＬ−８受容体ｍ胞外ループも注目すべ きものである：これらには、ウサギから単離した親和性の高いＩＬ〜８受容体の アミノ酸約９４〜１１３．１８６〜２０２、及び２６８〜２８５；ウサギがら単 離した親和性の低いＩ　Ｌ−８受容体のアミノ酸約１０６〜１１８．１８３〜２ １０、及び２７２〜２９８：及びヒトから単離した親和性の低いＩＬ−８受容体 の７ミ／酸約１０７〜１２０．１８４〜２１３、及び２７４〜３００が含まれる 。 これらのループに由来するペプチド断片も（特に、ＩＬ−８結合を促進するよう 、ループがアミノ末端領域と協力している場合）アンタゴニストとして使用する ことができる。その他、このようなループ及び細胞外Ｎ末端領域は（ＩＬ−８受 容体生体と同様）、抗ＩＬ−８受容体抗体を作製するための免疫原を提供する。 例えば、出願人はループ２及びループ３に対するポリクローナル抗体、及びウサ ギから単離した親和性の高い受容体蛋白質のＮ末端細胞外領域に対するポリクロ ーナル抗体を作製した。 本発明において有用な２ＦＪの、ＩＬ−８受容体をコードするｃＤＮＡのクロー ニング及び同定を以下に記載する。これらの例は本発明を説明することを目的と して提供するものであり、これに限定されるものではない。 ウサギ由来の親和性の高いＩ　Ｌ−８受容体及び親和性の低いＩＬ−８受容体の クローニング及び同定 ウサギの親和性の高いＩＬ−８受容体の遺伝子は、以下に記載する通りに単離し た。 Ｚｊｇｍｏｎｄ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｑｕｌｌｌｏ（−−−−−、１９Ｊ）の方法 により、ウサギ腹膜好中球をウサギから単離し、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡの抽出源 として使用した。ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡに転写し、ｃＤＮＡ断片をλｇｔｌ ｌのＥｃｏＲ［部位に挿入して（すべてＭａｎｌａｔｉｓ　ｅｔ　ａｈ、　！ｏ ／ｅｃｔｔ／ｓｒ　１１０ｔｙｔ’ｔｙｚ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｐｒｅ唐刀A　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｌｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９１１９の方法に従った ）、ウサギ好中球ｃＤＮＡライブラリーを作製した。２５．０００個の組み換え プラークについて、以下の配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイ ブリダイズするものをスクリーニングした： ３−　ＴＴＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＧＡＣＴＣＧ　ＧＡＣＣＧＧＡＣＩ　Ｃ ＧＩ　ＣＴＧ　ＧＡＩ　ＴＡＧ　ＴＡＣ５−（配列番号：２）。 このプローブは、Ｇ蛋白質共役受容体の第二膜貫通性領域に由来する配列に基づ いて設計した（例えば、Ｈａｒｔｌｇ　ｅｔ　ａｌ、、　７／／、５’ｌＯ：６ ４．１９８９参照）。 このプローブは、［３２Ｐ］　ＡＴ　Ｐ　（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＨＡ）及びＴ４キナーゼ（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｙ、　ＨＡ　）を用いてＭａ ｎｌａｔｌｓｅｔ　ａｌ、、　５ｕｐｒａの方法により５′末端標識した。ハイ ブリダイゼーションの条件は以下の通りである：６ＸＳＳＰＥ、１％　ＳＤＳ、 ０．１％　ピロリン酸ナトリウム、１　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ ／ｍｌ　ポリ（Ａ）、及び４０μｇ／ｍｌ　変性子ウシ胸腺ＤＮＡ中で４２℃、 １２時間。フィルターは、２ｘＳＳＣ。 ０、　１％　ＳＤＳ中で５０℃で洗浄した。３回目のスクリーニングの後、６個 のプラークを単離した。これらのプラークの一つの挿入断片（Ｆ３Ｒと命名）の 大きさは、２．５ｋｄであった。Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋　ｈｏｅ、　／ ＩＩ／、　Ｉｅｍｌ、　Ｓｃ／、　ｌ’！；Ｉ７４：５４６９．１９ｇ３の方法 に従い、５ｅｑｕｅｎａｓｃ　２．０　（Ｌ］、Ｓ、　Ｂｌｏｃｈｅｍｌｃａｌ 　Ｃａｒｐ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を用いてこの挿入断片の塩基配 列を決定した。３５４アミノ酸から成る蛋白質（分子ｊ１−４０．５２８）をコ ードするオーブンリーディングフレームが認められた。塩基配列及び推定される アミノ酸配列を図１に示した。推定されるＮ結合糖鎖形成部位を、配列中に下線 で示した。 Ｆ３Ｒクローンから推定される蛋白質の幾つかの構造的特徴から、これが６蛋白 質共役受容体のファミリーに属することが示される。第一に、推定される蛋白質 配列のバイトロバシープロットは、７か所の推定される膜質通性部分が存在する ことを示している。第二に、Ｆ３Ｈの一次構造は、他のＧ蛋白質共役受容体に非 常に類似している。特に、サブスタンスＫ及びＰ受容体のようなペプチドに結合 するＧ蛋白質共役受容体（Ｍａｓｕ　ｅｔ　ａｌ、＋　ｉｌ’１ｌｔｔｒｅ３２ ９：ｇ３（Ｊ、　１９１１７＋　１ｌｅｒｓｈｅｙ　ａｎ■ Ｋｒａｕｓｅ、　、９ｃ〕ｗｅｅ　２４７：９５８．１９９０）と、最も高い相 同性を示す。第三に、Ｆ３Ｒは、幾つかの、Ｇ蛋白質共役受容体に特徴的な構造 的特徴を有する。例えば、Ｆ３Ｒは、シグナル配列を伴わずに、Ｎ末端に２つの 推定Ｎ結合糖鎖形成部位を有する。また、Ｆ３Ｒは、ポジション８０（すなわち 、膜質通性部分Ｉｆ）にアスパラギン酸を有しくこれはすべてのＧ蛋白質共役受 容体中に保存されている）、推定される膜質通性部分ＩＩＩの近傍に規範的な（ ｃａｎｏｎｉｃａｌ　）＾ｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ　トリペプチドを有する。サブ スタンスＫ及びＰ受容体と同様、推定膜貫通性部分ＩＩ中にＡｓｐ−１１３を欠 損している。このＡｓｐ−１１３は、アドレナリン作動性、ムスカリン様、ドー パミン作動性、及びセロトニン作動性受容体中の荷電アミンの結合に必須である と考えられている（Ｄｉｘｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒｏｌｄ、９ｐｒ＃ｚ＃ｒｌ ｚｏｒ　５ｙｉｐ、　ｉ；）ｗｔｙｔ、力’ｏ／、　５３：４１１７．１９８ｇ ）　；また、他のＧ蛋白質共役受容体と同様、Ｆ３Ｒは正確に位置する幾つかの セリン及びスレオニン残基を有し、これらの残基はプロティンキナーゼの潜在的 な基質である（Ｂｅｎｏｖｊｃ　ｅｔ　ａｔ、、　／／／７／７．　ｌｅｙ、　 （’ｅ／／　１７１θ／、　４：４０５．１９１ｔｌｌ）。 ＦＢＲＪ伝子の発現をさらに特徴づけるために、Ｆ３ＲｃＤＮＡをハイブリダイ ゼーシヨンプローブに用いて、ウサギ好中球ＲＮＡのノザンプロット解析を行な った。好中球及び他の組織から、塩化セシウム密度勾配遠心分離（Ｇｌ！ｓｉｎ 　ｅｔａｌ、、　ｌｊｏｃ７ｗｊｓｔｒｙ１３：２６３３．１９７４　）により ＲＮＡを単離し、１％アガロースホルムアルデヒドゲル中で電気泳動を行ない、 Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、上記の方法によりＧｅｎｃＳｃｒｅｏｎ＠（Ｄ ｕ　Ｐｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　）にプロットした０ このプロットについて、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　（Ｐｌｓｃａｔａｖａｙ、　ＮＪ ）のランダムプライミングプロトコールに従って［３２Ｐ］　ｄＣＴＰで標識し たＦ３ＲのＢｔｒｍＨＩ　／　Ａ’　ｃ　ＯＲＩ断片（６５２塩基；ウサギＩＬ −８コーディング配列の−２７〜６２５）をプローブとして、ハイブリダイゼー ションを行なった。ハイブリダイゼーション溶液は、５０％　ホルムアミド、５ 　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ、　５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０，１％　ピロリン酸 ナトリウム、１ｍｇ／ｍ１　ヘパリン、１００．ｃｚｇ／ｍｌ　ポリ　（Ａ）、 １％　ＳＤＳ、及び２００μｇ／ｍｌ　変性子ウシ胸腺ＤＮＡとした。プロット について４２℃、１６時間ハイブリダイゼーションを行ない、次いで、Ｑ、１ｘ ｓｓｃ。 ０１％　ＳＤＳ中で６５℃で洗浄した。 Ｆ３Ｒプローブは、２．６キロベースのＲＮＡ分子に特異的にハイブリダイズし た。これにより、Ｆ３Ｒが好中球中で発現することが確認され、Ｆ３Ｒクローン がほぼ全長であることが示唆された。Ｆ３Ｒクローンは、ウサギ子宮平滑筋、骨 格筋、肺、肝臓、または脳から単離したＲＮＡにはノ＼イブリッド形成をしなか った。また、線維芽、上皮、及び内皮細胞由来のポリ（Ａ）”　ＲＮＡにもハイ ブリッド形成をしなかった。前骨髄球ＨＬ−６０細胞は非常に低レベルのＦ３Ｒ ｍＲＮＡを発現し、分化した１（Ｌ−６０はこのＲＮＡを２０倍高いレベルで発 現した。 Ｆ３Ｒを、Ｐｒｏｍｓｇａ　Ｃｏｒｐ　（Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｌ、）の方法に より、ウサギ網状赤血球溶解産物中でＩｎ　ｖ［ｔｒｏ翻訳を行なった。５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定したところ、化分子マス（ｒｅｌａｔ ｉｖｅ　５ａｓｓ　）　３０．　０００〜３２．　０００ダルトンの蛋白質が合 成された（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　、標準的な技術により行なった；例えば、Ａｕ５ ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ　、　、　（’ｗｒｔｖｙｌ　ｌ’ｒｏｌｏｃｔｙ／ｓ　 １ｊｋｒ／１ａｓｔｙ〕ｊｌｔ力’ｏ１Oｚｙ、　Ｇｒｅｅ ｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１ ９８７　）　。計算上の分子量４０，５２８と見かけの分子量約３１，０００の 差は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて膜蛋白質の移動度が、可溶性蛋白質標準物と比 較して大きくなることが多いことに起因するものと思われる（Ｂｏｎｉｔｚ　ｅ ｔ　ａｌ、＋）、　１１０／、　（ｈｐ、　２５５：１１９２７．１９１１０； 　Ｒｆｚｚｏｌｏ　ｅｔａｌ、、　１１０ｃｋｚｊｓ１４１５：３４３３．１９ ７９　）。 上述の方法を使用して、ウサギの親和性の低いＩＬ−８受容体も同定し、ウサギ 好中球ライブラリーから単離した（上述）。このｃＤＮＡをｐＵｃ１９のＥｃｏ Ｒ１部位にサブクローニングして、プラスミド５ｂｌａを作製した。標準的な技 術のよりその塩基配列を決定したところ、親和性の高い受容体クローンＦ３Ｒと 類似しているが同一ではないことが判明した。 ヒト由来の親和性の低いＩＬ−８受容体のクローニングＣ１ｏｎｔｅｃｈ　（Ｐ ａｌｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ　）から入手したヒト抹消血液白血球λｇｔｌｌ　ｃ ＤＮＡライブラリー（５′ストレツチ）を、ウサギＦ３Ｒクローンの６５２塩基 ｄＣＴＰで標識した。フィルターは、５０％　ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ 変性仔ウシ胸腺ＤＮＡ、５ｘＳＳＰＥ、１％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　ｓ　５　Ｘ　Ｄｅｎ ｈａｒｄｔ溶液、及び００１％　ピロリン酸ナトリウムの溶液中で４２℃、１６ 時間ハイブリダイゼーションを行なった。次いで、フィルターを０．１ｘＳＳＣ ，０，１％　ＳＤＳ中で６５℃で洗浄した。３回目のスクリーニングの後、ウサ ギＩＬ−８プローブとハイブリッドを形成する数個のヒトクローンを単離した。 これらの一つの挿入断片（４ＡＢと命名）の大きさは、４，０キロベースであっ た；　Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。 （５ｕｐｒａ）の方法に従い、５ｅｑｕｅｎａｓｓ　２．０　（Ｕ、Ｓ、　Ｂｌ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、０）１）を用いてこ の挿入断片の両鏡の塩基配列を決定した。ヒトの親和性の低いＩＬ−８受容体の 塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を図２（配列番号・５）に示した。 その他の方法として、ヒトＩＬ−８受容体をコードする遺伝子は、全長Ｆ３Ｒプ ローブとのハイブリダイゼーシヨンにより単離することができる。標準的な技術 （例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ　、　、　ｒｔｔｒｒｅｉｌ　Ｉ’ｒｏ ｌｏｃｏ／ｓ　＃　ｌｌｏ／１ｙｃｔｔ／ｙ　１ｌｏｌｏ狽凵A５ｕｐ ｒａ参照）によりこのプローブを標識（例えば、放射標：ａ）シ、ストリンジエ ンシーの低い条件下（例えば、５０％　ホルムアミド、２００μｇ／ｍｌ　変性 仔ウシ胸腺ＤＮＡ、５ｘＳＳＰＥ、１％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　％　５　Ｘ　Ｄｅｎｈａ ｒｄｔ溶液、及び０．１％ピロリン酸ナトリウム中でインキュベーション温度４ ２℃で１６時間の／Ｘイブリダイゼーシ町ン）でこのプローブを用いてハイブリ ダイゼーションを行なう。 フィルターは、最初ストリンジエンシーの低い条件下（例えば、２ＸＳＳＣ及び ０．１％　ＳＤＳでインキュベーション温度５０℃）で洗浄し、４回の洗浄を通 してストリンジエンシーを漸次的に上昇して最終的にストリンジエンシーの高い 洗＋（例えば、Ｏ，ｌＸ５ＳＣ及び０．１％　ＳＤＳでインキュベーション温度 ６５℃）を行なう。 ヒトＩＬ−８受容体遺伝子は、クローン４ＡＢの配列に基づくプライマー配列、 例えば： ５−　ＧＡＡＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＧＣＡＧ　３”　（配列番号 ３）及び ５−　ＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＧ　３−　（配列番 号：４）： または、実質的に４ＡＢ、５ｂ　１　ａ、及びＦ３Ｒに共通する配列に基づくプ ライマー配列： ５−　ＧＧＧＡＡＡＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧ　３−　（配列番号ニ ア）及び ５−　ＧＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＴＴＧＴＡＧＧ　３−　（配列 番号：８） を用いたＰＣＲにより単離することができる。 プライマーは、例えば、＾ｐｐｌＩｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ　５ｙ ｎｔｈｅｓｉｚｅｒ　（Ｐｏｓｔｅｒ　ｃｔｔｙ。 ＣＡ）を用いてｍｌ的なシアンエチルフオスフオアミダイド化学により合成する 。 ヒト好中球は上述の通り、標準的な技術により単離し、ポリＡ”　ＲＮＡの抽出 源として使用する。ｃＤＮＡも上述の通り合成し、ｃＤＮＡ断片をいずれかの標 準的なりローニングベクター（例えば、λｇｔｌｌ）に挿入することにより好中 球ｃＤＮＡライブラリーを作製する。その他の方法として、ヒト抹消血液白血球 λｇｔｌｌ　ｃＤＮＡライブラリー（５゛ストレツチ）を、Ｃ１ｏｎｔｅｃｂ　 （Ｐａｌｏ　Ａｆｔｏ、　ＣＡ　）から購入することもできる。 約１００ｎＨのヒト好中球またはヒト末梢血液白血球ｃＤＮＡを１μｇの各合成 プライマーと混合し、製造者（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、　Ｎｏｒｖａｌｋ、 　ＣＴ　）の使用説明書に従ってポリメラーゼ連鎖反応を行なう。その結果得ら れるＰＣＲ産物を電気泳動により単離し、例えば、ベクターＳ　Ｋ十（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ、　ＬａＪｏｌｌａ　ＣＡ）中にクローニングし、大腸菌ＸＬ−Ｉ 　Ｂ　ｌ　ｕ　ｅ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中で増幅する。 ポリペプチド発現 本発明によるポリペプチドは、適切なベクター中に挿入されたＩＬ−８受容体を コードするｃＤＮＡ断片の全長または一部分（例えば、上述のｃＤＮＡ）により 適切な宿主細胞を形質転換し、受容体を発現させることにより生産することがで きる。 組み換え受容体蛋白質を提供するために多様な発現系を使用することができるこ とは、分子生物学の分野にたけた者に理解されるところである。本発明において 、使用している宿主細胞そのものは決定的なものではないが、以下の宿主細胞が 好ましい：　ＣＯ３−７，５Ｐ−２、ＮＩＨ３７３、及びチャイニーズハムスタ ー卵巣細胞、チャイニーズハムスター肺線維芽Ｄｅｄｅ細胞。このような細胞は 広範囲な取得源から入手することができる（例えば、＾麿ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｙｉｌｌｅ、　ＭＤ　） 　ｏ　）ランスフエクション法及び発現ベクターの選択は、選択した宿主系に依 存する。哺乳類細胞トランスフェクション法は例えば、Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　 ａｌ　、、Ｃｒｗｒｅｉｌ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　／／７　Ｎｏ／ｅｃｔｔ／ｖ 　１１０１０ｙ、　Ｊｏｈｎ　Ｖｌ撃■凵@＆　５ ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９　）に記載されている１発現ベクター は、例えば、ｉｎ　Ｏｏ／７ノ／７／　ｒｅｃｔｏｒｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｐ、Ｉ＋、　Ｐｏｕｗｅｌｓ　ｅｔ　ａｔ、、　１９ １１５．５浮垂吹A　１９８７　） 中に提供されているものから選択することができる。 特に好ましい発現系は、ｐＭＡＭｎｅｏ発現ベクター（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、　Ｐ ａ１ｏ、　ＣＡ）によりトランスフェクトされたマウス３Ｔ３線維芽宿主細胞で ある。ｐ　Ｍ　Ａ　Ｍ　ｎｅｏは、デキサメタシン誘導性１ｖ１ＭＴＶ−ＬＴＲ プロモータに連結したＲ３Ｖ−ＬＴＲエンハンサ−１哺乳類系中での複製を可能 にするＳＶ４０複製開始点、選択可能なネオマイシン遺伝子、及びＳＶ４０スプ ライシング及びボリアデニレーンヨン部位を提供する。ヒトまたはウサギＳ　Ｌ −８受容体または適切な受容体断片またはアナログ（上述の通り）をコードする ＤＮＡを、発現するよう設計された方向でｐＭＡＭｎｅｏベクターに挿入する。 組み換え受容体蛋白質は、以下に記載する通りに単離する。ｐＭＡＭｎｅｏ発現 ベクターと組み合わせて使用することのできる他の好ましい宿主細胞には、ＣＯ ８細胞及びＣＨＯ細胞（それぞれＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ　１６５０及びＣＣＬ 　６１）が含まれる。 その他の特に好ましい発現系は、受容体蛋白質を発現することのできる方向でＩ 　Ｌ−８受容体をコードするｃＤＮＡが挿入されたｐＳＶＬベクター（Ｐｈａｒ ｓ＋ａｃｉａ）により一時的にトランスフェクトされた（上述の通り）ＣＯ８宿 主細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ　１６５０）である。 その他の方法として、親和性の高い、または親和性の低いＩＬ−８受容体（また は受容体断片またはアナログ）は、安定にトランスフェクトされた曜乳類細胞系 により生産される。 哺乳類細胞の安定的トランスフェクションに適したベクターは、一般に入手可能 である（例えば、Ｐｏｕｖｅｌｓ　ｅｔ　ａｔ、、　（５ｕｐｒａ）参照）；こ のような細胞系の構築方法も一般に入手可能である（例えば、Ａｕ５ｕｂｅｌ　 ｅｔ　ａｔ、、（５ｕｐｒａ）参照）。 その−例においては、受容体（または受容体断片またはアナログ）をコードする ｃＤＮＡは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を有する発現ベクター中 にクローニングされている。宿主染色体へのプラスミドの挿入、及びこれによる 宿主染色体へのＩＬ−８受容体をコードする遺伝子の挿入は、０．０１〜３００ μＭのメトトレキセートを含有する細胞培地により選択する（Ａｕｓｕｂｅｌ　 ｅｔ　ａｌ、。 ５ｕｐｒａ）。この優性選択は、はとんどの細胞型において行なうことができる 。組み換え蛋白質の発現は、トランスフェクトされた遺伝子のＤＨＦＲに媒介さ れる増幅により増加する。遺伝子増幅を冑する細胞系の選択方法は、Ａｕ５ｕｂ ｅｌ　ｅＬ　ａｌ。 、（５ｕｐｒａ）により記載されているニ一般的にこのような方法には、メトト レキセートのレベルを徐々に上昇した培地中での長期間にわたる培養が含まれる 。この目的に通常使用される、ＤＨＦＲを有する発現ベクターにはｐｃＶｓＥＩ 　Ｉ−ＤＨＦＲ及びｐＡｄＤ２６ＳＶ　（Ａ）（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｔ、 、５ｕｐｒａ中に記載）が含まれる。上述のすべての宿主細胞または、好ましく はＤＨＦＲを欠損したＣＨＯ細胞系（例えば、ＣＨＯＤＨＦＲ細胞、ＡＴＣＣ登 録番号ＣＲＬ　９０９６）は、安定にトランスフェクトされた細胞系のＤＨＦＲ 選択またはＤＨＦＲに媒体された遺伝子増幅に好ましい宿主細胞である。 特に好適な安定的発現系の−５４は、ｐＳＶ２−ｇｐｔによりトランスフェクト された骨髄腫細胞系、Ｊ５５８　（ＡＴＣＣ登録番号ＴＩＢ６）または５Ｐ２（ ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ　１５８１）”？’ある。ｐＳＶ２−ｇｐｔは、ＳＶ４ ０初期プロモータ及び選択可能なｌ且エマ−カー（すなわち、大腸菌キサンチン −グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を提供する。 他の特に好適な安定的発現系は、ｐＭＡＭｎｅｏベクターにより安定にトランス フェクトされたチャイニーズハムスター肺線維芽Ｄｅｄｅ細胞系（ＡＴＣＣ登録 番号ＣＣＬ３９、Ａｓｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　）である。この細胞系は、以下の通 りウサギ！Ｌ−８受容体を誘導的に発現するのに使用されてきた。Ｆ３Ｒ受容体 ｃ　ＤＮＡ　（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ【ベクター、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｊｏ ｌｔａ、　ＣＡ中にサブクローニングされている）をＸｂａＩ及びＸｈｏｌで切 断し、約１７００ｂｐの断片を単離して、ＮｈｅＩ／Ｘｈｏｌで消化したｐＭＡ Ｍｎｅ。 発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、　Ｐａ１ｏ＾ｌｔｏ、　ＣＡ　）中に挿入し 、Ｆ３Ｒ−ｐＭＡＭｎｅＯを作製した。Ｆ３Ｒ−ｐＭＡＭｎｅｏは、グルココル チコイドにより誘導可能なマウス乳腺ガンウィルスプロモータの制御のもとに、 ウサギの親和性の高い■Ｌ−８受容体蛋白質を発現する。Ｆ３Ｒ−ｐＭＡＭｎｅ ｏは、Ｂ　ＲＬ　（Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、阿Ｄ）のりポフエクチン法を用い て、チャイニーズノ）ムスター肺線維芽Ｄｅｄｅ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ３９ 、Ａｓｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｌ　Ｉｅｃｔｆｏｎ、　 Ｒｏｃｋｖｌｌｌｅ、　ＭＤ　）をトランスフェクトするのに使用した。トラン スフェクトされた細この系は、本発明のいずれのポリペプチドを誘導的に発現す るためにも使用するＬ３９）をトランスフェクトすることにより、本発明のポリ ペプチドの構成的発１、、　５ｕｐｒａ参照）により行なうことができる。組み 換え蛋白質は単離された後、必要に応じて、例えば、高速液体クロマトグラフィ 　（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ、　１ｍｏ八Ｕへｒ）ｔ　ｈｐｃｈｙ＃ｕｔｙｓ　／ ／７１１ｊｘＡｅｚ／５ｔｒｙ　／／／７／　Ｊｏ／ｅｃｔｔ／ｙ力’ｏ１０ｇ 、　ｅｄｓ、、　Ｗｏｒ求@ａｎｄ　Ｂｕｒｄ ｏｎ、　Ｅｌｓｅｖｌｅｒ、　１９ｇ（ｌ参照）によりさらに精製することがで きる。 本発明の受容体、特に、短い受容体断片は、（例えば、６９ツノ゛７１’ｌｚｓ θｈψｒｕｅＳｙｐ１７ｅｓｊｓ、　２ｎｄ　ｅｄ、、　１９１１４　Ｔｈｅ　 Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　Ｒｏｃｋｒｏｒｄ、！Ｌに記■■■ た方法により）化学合成によっても作製することができる。 るものである。このような相互作用は、ｉｎ　ＶｌｔｒＯ結合アッセイ（以下を 参照）により検出することができる。受容体成分を、機能的にもアッセイするこ とができる、すなわち、ＩＬ−８に結合し、及び、Ｃａ　を動員する能力につい てアッセイすることができる（以下を参照）。これらのアッセイには、構成成分 として、結合が検出できるよう配置された［Ｌ−８及び組み換えＩＬ−８受容体 （または適切な断片またはアナログ）が含まれる。 Ｉ　Ｌ−８は、Ｇｅｎｚｙｓｅ　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ＾）から入手する ことができる。ＩＬ−８受容体成分は、天然には事実上受容体を持たない細胞に より生産される（例えば、適切な発現系中に受容体成分をコードする核酸を有す るよう、このような細胞を組み換えることにより生産される）ことが好ましい。 適切な細胞とは、例えば、組み換え受容体の生産に関して上記に記載した細胞（ 骨髄腫細胞、Ｊ５５８または５Ｐ２）である。 １Ｌ−８受容体へのＩＬ−８の結合度を決定するＩｎ　ｖｉｔｒｏアッセイは、 細胞全体を使用しても、膜画分を使用しても行なうことができる。細胞全体を使 用するアッセイは、Ｉ　Ｌ−８受容体成分を発現する細胞を、当業者に熟知され た方法５　目こより標識したＩＬ−８）を供給することが好ましい。受容体成分 に関連する（このため、固体基質に関連する）標識を検出することにより、結合 をアッセイすることができる。 アッセイフォーマットは、ラジオイムノアッセイフォーマット（例えば、Ａｕ５ ｕ合アッセイと比較することにより決定した。その結果を表１に示す。 （μｇ）　結合（ｃｐｍ）　結合（ｃｐｍ）１のＰＨ９中）に１２５【により標 識したＩＬ−８，２，５ｎＭを添加した。細胞をＩ　Ｌ−８と共に４℃で４５分 間インキュベートし、遠心分離により沈殿させ、冷リン酸緩衝生理食塩水により 洗浄し、細胞に結合した放射活性をガンマカウンター中で測定した。特異的結合 は、過剰な（すなわち、２５０ｎＭ）非標ｍ１Ｌ−８存在下で行なった結合アッ セイと比較することにより決定した。 その結果を表２に示す。 表２ トランスフェクトされたＤＮＡ　非特異的　特異的（８μｇ）　結合（ｃｐｍ） 　結合（ｃｐｍ）ｐｓＶＲ３８５０ Ｆ３Ｒ−ｐＳＶＲ９０４３６６３ ４ＡＢ−ｐＳＶＲ４７１２５２１ ４ＡＢ−ｐｓＶＲ７１５２３９３ その他の方法として、ＩＬ−８は固体基質を吸着させ、（例えば、ＥＬ［ＳＡア ッセイで抗原の吸着に使用するのと類似の方法によりマイクロタイタープレート に吸着させる；Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ）　［Ｌ−８受容体 を発現する１１ｉＭＡ細胞の、ＩＬ−８（例えば　３Ｈ−チミジンにより標識し たもの）への結合能は、固定化ＩＬ−８への特異的な受容体結合の検出に使用す ることができる。 特定の一例において、！Ｌ−８受容体（または受容体断片またはアナログ）は、 ＤＥＡＥデキストラン−クロロキン法（＾ｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐ ｒａ）　ニ、！：り骨髄腫細胞（例えば、Ｊ５５８またはＳＰ２細胞）中にトラ ンスフェクトされる。受容体蛋白質の発現により、検出できるよう標識されたＩ Ｌ−８が細胞に結合する。 トランスフェクトされていない宿主細胞またはもとのベクターのみを有する細胞 には、ＩＬ−８は特に結合しない；これらの細胞は、結合アッセイを行なう細胞 に対する“コントロール′として使用される。トランスフェクトシＨンの１２〜 １８時間後に、組織培養皿（例えば、１０ｃｍの皿）に、ＩＬ−８受容体を発現 する骨髄腫細胞（皿当たり約７５０，０００細胞）をまく。４８時間後、３連の 皿を、０．５％Ｍの、放射性ヨウ素で処理したＩＬ−８（２００Ｃｉ／ｍｍｏ　 １）と共にインキュベートし、受容体を有する細胞への結合をアッセイする（例 えば、細胞を回収し、細胞に結合した、検出可能な標識の量をアッセイする）。 コントロール細胞と比較して結合レベル（検出可能な標識の量）が高いものが、 標識したＩＬ−８を特異的に結合する細胞である。 その他の方法として、Ｉ　Ｌ−８受容体をコードするＲＮＡ　（以下に記載する 通りに調製する）を、標準的な方法によりアフリカッメガエルの卵母細胞に注入 する。ＲＮＡは卵母細胞中でＩｎ　ｖｌｖｏ翻訳され、ｒＬ−８受容体蛋白質は 、細胞膜中に挿入される。Ｉ　Ｌ−８結合を試験するために、ショ糖密度勾配遠 心分離により卵母細胞膜を調製しくＣｏｌｍａｎ、　ｆｒｉｔｙｓｃｒｊｐｔｊ ｏｉ　Ｊ／７／　Ｆｒｙｓ／１ｌｊｏｊ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。 ０ｘｆｏｒｄ、　１９１１６の方法による）、１２５　、により標識したＩＬ− ８を添加し、Ｖｈａｔｇａｎ　ＯＦ／Ｃフィルターを用いた真空濾過（Ｗｉｌｌ ｌａｓｓｏｎ、　１ｌｊｏｃｉｌｅｚｊｓｌｒｙ、　２７：５３７１．１９８ｇ の方法により）を行なって膜を調製する。 組み換え受容体は、カルシウムのＩＬ−８依存性動員を媒介する能力について機 能的なアッセイを行なうこともできる。ＩＬ−８を発現するベクター（上述の通 り）によりトランスフェクトされた細胞、好ましくは骨髄腫細胞、を、標準的な 技術によりＦＵＲＡ−２またはＩＮＤＯ−１でロードする。ＩＬ−８により誘導 されるカルシウムの動員は、すでに報告されている方法（Ｇｒｙｎｋｉｅｖｉｃ ｚ　ｅｔ　ａｔ。 、　）、ｌ／ｊｏ／、　（’／ｌｉｐ、　２６０：３４４０．１９８５）で蛍光 分光法により測定される。 組み換えＩＬ−８受容体へのリガンド結合特性・Ｉ　Ｌ−８受容体のＩ　Ｌ−８ リガンドへの親和性 親和性の高いＦ３Ｒ受容体のに、は、以下の通り決定した。ｐＳＶＲ−Ｆ３Ｈに よりトランスフェクトされたＣＯ５−７細胞膜（一定量）を、０〜５０％Ｍの濃 度の、１２５Ｉにより標識したＩＬ−８を含有するリン酸緩衝生理食塩水または 、０．３％Ｍの１２５１により標識したＩＬ−８及び添加量を徐々に上昇させた 非標識ＩＬ−８を含有するリン酸緩衝生理食塩水中でインキュベートした：イン キュベーションは、室温で４５分間行なった。１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡを含有する 水冷ＰＢＳを添加することにより結合反応を終結し、０．　３％のポリエチレン イミンに予め浸したＷｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｃフィルターを用いて真空ａ過を行 ない、次いで１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡを含有する１０ｍ１のＰＢＳにより洗浄した 。フィルター上に残存する放射活性の量を測定した。このような膜結合アッセイ がら、Ｆ３Ｒ受容体のＫｄは１．４％Ｍと計算された（図１１）。 親和性の低いｒＬ−８受容体（４ＡＢ）へのＩＬ−８の結合は、以下の通り測定 した。ヒトＩＬ−８を発現するクローン４ＡＢ−ｐＳＶＬ　（上記参照）８μｇ を用いて、５×１０６個のＣＯ８細胞を一時的にトランスフェクトした。３日後 、細胞を、７ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回、及び７ｍｌのＰＢ Ｓ／１ｍＭ　ＥＤＴＡで１回洗浄し、７ｍｌのＰＢＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ中で３ ７℃で５〜１０分間インキュベートした。次いで、細胞を回収し、２５ｍ１の水 冷ＰＢＳ１０．１％　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に添加し、計測し、遠心分 離ニヨり沈殿サセ、２×１０７細胞／ｍ　ｌノ濃１ｊｊテ氷冷Ｐ　Ｂ　Ｓ／　０ ．　１％　Ｂ　ＳＡに再度懸濁した。ＩＬ−８結合を試験するために、　■によ り標識したＩＬ−８（０〜２０ｎＭの６度）　を０．６〜ｌＸ１０Ｇ個の細Ｕ全 体（１００μｍのＰＢＳｌｏ、１％　Ｂ　Ｓ　Ａ中）に添加し、０℃で６０分間 インキュベートし、０゜３％のポリエチレンイミン（Ｐ　Ｅ　［：　Ｓｉｇｍａ 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｎｏ）に浸したｖｈａｔｍａｎＧＦ／Ｃフィルター を用いて濾過し、冷ＰＢＳにより洗浄し、細胞結合放射活性をガンマカウンター 中で測定した。特異的結合は、３００倍の過剰な非標識Ｉ　Ｌ−８存在下で行な った結合アッセイと比較することにより決定した。 ３回のこのような実験の平均値を図４に示す。図４の挿入図は、グラフで示した 結合データの５ｃａｔｃｈａｒｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを示している 。親和性の低い受容体のＫｄは約３１ｎＭと計算された；これは、Ｆ３Ｒ受容体 について計算されたＫａ　−１，４％Ｍと比較することができる（　５ｕｐｒａ ）。 安定的にトランスフェクトされた細胞を用いて、以下のアッセイにより４ＡＢ受 容体へのＩＬ−８結合を測定し、Ｋ、は約８．４％Ｍと計算された。４ＡＢのコ ードする領域をプラスミドＲＣ／ＣＭＶ　Ｃｌｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＨｉｎｄ ｌｌｌ／Ｘｂａｒ部位にサブクローンし、ｐＲＣ，４ＡＢを作製した。二重ＤＨ ＦＲ突然変異細胞系（Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｃｈａｉｓｅｎ、　Ｃｏｌｕｍｂｉａ 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹから供与）であるＣＨＯ ＤＧ４４細胞をｐＲＣ，４ＡＢを用いて安定的にトランスフェクトし、サブクロ ーニングされた発現系を単離した（４ＡＢＣＨＯ３３）。継代（ｐａｓｓａｇｅ 　）後２〜３日後、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄し、上述の通りに処理した。 ＩＬ−８結合を試験するために、１２５Ｉにより標識したＩＬ−８（１，０〜２ ．０％Ｍ）を２．５×１０５個の細胞及び徐々に上昇させた量の非標識ＩＬ−８ を含有する試料に添加した。インキュベージシンは０℃で６０分間行なった。 ＣＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、上述の通り、細胞結合放射活性をガンマカ ウンター中で測定した。 特異的結合は、５００倍の過剰な非標識ｆＬ−８存在下で行なった結合アッセイ と比較することにより決定した。複雑なりガント−受容体システムについて一般 化されたモデル（Ｈｏｆｆｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　Ｌｉｆｅ　Ｓ ｅｔ、、　２４：Ｌ７３９）及びＥＢＤＡ／ＬＩＧＡＮＤプログラム（ＭｃＰｈ ｅｒｓｏｎ、　１９１＋５．　Ｋｉｎｅｔｉｃ、　ＥＢＤＡ、　Ｌｉｇａｎｄ、 　Ｌｏｖｒｙ：　Ａ　ｃｏｌｌ■モ■ ｔｏｎ　ｏｆ　ｒａｄｌｏｌｌｇａｎｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　 ｐｒｏｇｒａｍｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ、に；　Ｂｉｏ唐盾■煤@） を用いて、非直線最小平方曲線（ｎｏｎ−１ｉｎｅａｒ　１ｅａｓｔ−ｓｑｕａ ｒｅｓ　ｃｕｒｖｅ　ｆｉｔｔｉｎｇ）により結合データを解析した。その結果 、［１２５１］　ＩＬ−８の飽和可能な特異的結合が示され、結合データの５ｃ ａｔｃｈａｒｄ解析から、Ｋｄが８．４％Ｍである唯一の結合部位が示される。 組み換えＩＬ−８受容体へのリガンド結合の特性：ＩＬ−８受容体の関連リガン ドへの特異性 親和性の高い及び親和性の低いＩＬ−８受容体について、関連リガンドへの結合 能も試験した。実験は上記に記載した通り行なった。１２５■により標識したＭ ００倍過剰な非標ＪＭＧＳＡ／ＧＲＯαまたは非標識ＩＬ−８を添加することに より決定した。図５に示す通り、４ＡＥにコードされた親和性の低いＩＬ−８受 容体は、リガンドＭＧＳＡ／ＧＲＯαに結合し、非標識ＭＧＳＡ／ＧＲＯαによ っても非標ｍ１Ｌ−８によっても同様に置換される。これに対して、親和性の高 いＦ３Ｒ受容体蛋白質へのＭＧＳＡ／ＧＲＯαの結合は検出されなかった（図示 せず）。 競合実験は以下の通り行なった。４ＡＢ−ｐＳＶＬを用いてＣＯ８細胞を一時的 にトランスフェクトした（上述の通り）。３日後、上述の通りに細胞を回収し、 氷冷したＰＢＳｌｏ、１％　ＢＳＡに１．３８Ｘ１０７細胞／ｍ１のｆｉ度で再 度懸濁した。リガンド結合を試験するために、１２５Ｉにより標識したＩＬ−８ （５％Ｍの濃度）を、親和性の低い受容体を発現する細胞全体６．９×１０５個 （１００μｌのＰＢＳｌｏ、１％　ＢＳＡ中）及び非標識リガンド（特異的に、 Ｏ〜５０００ｎＭの濃度の［Ｌ−８，５０〜５０００％Ｍの濃度のＰＦ４．５０ 〜５００　ｎ　Ｍの濃度のＭ　Ｇ　Ｓ　Ａ　／　Ｇ　ＲＯａ、または５０〜５０ ００％Ｍの濃度のＦＭＬＰ）の混合物に添加した。リガンド存在中で、細胞を４ ℃で一時間インキユベートし、０．３％のＰＥＩに浸したＣＰ／Ｃフィルターを 用いて濾過し、冷ＰＢＳ１０．１％　ＢＳＡにより洗浄し、細胞結合放射活性を ガンマカウンター中で測定した。 図６に示す通り、１．−８及びＭＧＳＡ／ＧＲＯαは、親和性の低い受容体への 結合においてＩＬ−８と効果的に競合した。他の２Ｆｉｉのペプチドリガンド、 ＰＦ４及びＦＭＬ　Ｐ　（Ｄｅｕｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、！’ｒｏｃ、　／Ｖｌｌ ／、　１ｃｉｄ、　ＳｔＪ、　ｌ／３１７Ｂ：４５８５．１９■ １；　Ｃｏａｔｓ　ａｎｄ　Ｎａｖａｒｒｏ、）、　ｌ／ｊｏ／、　ｎｅｔ　２ ８５＋５９６４．１９９０　）の！Ｌ−８結合への効果はほとんど無いか、また は皆無であった。このように、親和性の低い受容体はＩＬ−８に対して絶対的に 特異性を示すのではない；むしろ、ＩＬ−８フアミリーの、密接に関連したメン バーに結合する。これに対して、親和性の高い受容体は、測定したリガンドの中 で、ＩＬ−８に特異的でありだ。ＩＬ−８受容体Ｆ３Ｒ及び４ＡＢ、及びキメラ 受容体Ｆ３Ｒ／４ＡＢ及び４ＡＢ／Ｆ３Ｒの、関連リガンドへの結合能を決定す る付加的な競合実験を行なった。各受容体を発現するベクターを用いてＣＯ５細 胞を一時的にトランスフェクトした。上述の通りに細胞を回収し、水冷したＰＢ Ｓｌｏ、１％　ＢＳＡに再度懸濁した。リガンド結合を試験するために、２．５ ×１０５個の細胞を、非標識ＰＦ４、ＭＧ　Ｓ　Ａ／ＧＲＯａ、ＮＡＰ−２及び ｆＭＬＰ存在下で２％Ｍの１２”　１１　ＩＬ−８に添加した。 混合物を氷上で６０〜９０分インキュベートし、水冷ＰＢＳ１０．１％　ＢＳＡ を添加して反応を終結させ、上述の通りＣＦ／Ｃフィルターを用いて濾過した。 Ｈ。 ｆＴｍａｎ　ａｔ　ａｌ、（５ｕｐｒａ）及び１４ｃＰｈｅｒｓｏｎ、　（５ｕ ｐｒａ）を用いて、非直線最小平方面ｌｉｔ　（ｎｏｎ−１ｉｎｅａｒ　１ｅａ ｓｔ−ｓｑｕａｒｅｓ　ｃｕｒｖｅ　ｆｔｕｉｎｇ）により結合データを解析し た。 実験により、ＭＧＳＡ／ＧＲＯα及びＮＡＰ−２は、４ＡＢ受容体と競合するこ とができるが、Ｆ３Ｒ受容体とは非常に微弱な結合しか示さないことが示された 。こねは、４ＡＢ受容体がＦ３Ｒ受容体よりも選択性が低いことを示唆している 。４ＡＢの基本性格にＦ３Ｒ細胞外Ｎ末端領域が融合したキメラ受容体は、はぼ Ｆ３Ｒサブタイプのリガンド結合特性を示し、Ｆ３Ｈの基本骨格に４ＡＢ細胞外 領域が融合したキメラ受容体は、ヒト４ＡＢ受容体サブタイプに類似したリガン ド結合特性を示す。これらの結果は、ＩＬ−８受容体のＮ末端がＩＬ−８受容体 サブタイプ特異性の主要な決定基であるという理論と一致する。 親和性の高い／親和性の低いキメラＴ　Ｌ−８受容体の構築相補的な親和性の高 い／親和性の低いキメラ受容体を構築するために、発現ベクターＦ３Ｒ−ｐＳＶ Ｌ及び４ＡＢ−ｐＳＶＬ　（以下に記ｍ＞をそれぞれＸｈ。 １及びＣｅｌ［［で消化し、一方の受容体のアミン末端をコードする断片をもう 一方の受容体のアミノ末端をコードする断片と置換した。特定的には、最初の５ ８コドンを有する（すなわち図１の５ｅｒ５８までを含む）Ｆ３Ｒの２７１ｂｐ ノＸｈｏ　ｌ−Ｃｅ　Ｉ　ｆ　Ｅ断片をＦ３Ｒ−ｐＳＶＬから取り出し、末端が Ｘｈｏｌ−Ｃｅ　ｌ　Ｉ　Ｉである４ＡＢ−ｐＳＶＬ基本骨格にクローニングし た。別の構築においては、最初の６２フドンを有する（すなわち図２の５ｅｒ６ ２までを含む）４ＡＢの２８３ｂｐのＸｈｏｌ−Ｃｅｌｌｌ断片を同様に４ＡＢ −ｐＳＶＬがら取り出し、末端がＸｈｏ　ｌ−Ｃｅ　ｌ　Ｉ　ＩであるＦ３Ｒ− ｐＳＶＬ基本骨格にクローニングした。このようにして、２種のキメラＩＬ−３ 受容体遺伝子を作製したニ一つはヒト４ＡＢの２９８カルボキル末端アミノ酸に 融合したウサギＦ３Ｒのアミノ末端５８アミノ酸をコードする遺伝子（Ｆ３Ｒ／ ４ＡＢと命名）、二番目は、ウサギＦ３Ｒの２９７カルボキル末端アミノ酸に融 合したヒト４ＡＢのアミノ末端６２アミノ酸をコードする遺伝子（４ＡＢ／Ｆ３ Ｒと命名）である。 Ｉ　Ｌ−８受容体結合領域のマツピングＩＬ−８結合アッセイ（例えば、上述の もの）により、ウサギＦ３Ｒ受容体に対するＩ　Ｌ−８の親和性は、ヒト４ＡＢ 受容体に対する親和性よりも高いことが判明した（特定的には、それぞれＫａ　 ＝　１　、４　ｎ　Ｍ及びＫ　ａ　−３１ｎ　Ｍ　）。この親和性の違いを、以 下に記載する通り、ＩＬ−８結合領域の同定に使用した。 Ｆ３Ｒ，／４ＡＢ−ｐｓＶＬ４たは４ＡＢ／Ｆ３Ｒ−ｐｓＶＬ−１−メラ受容体 発現プラスミド（上述）を用いてＣＯ８細胞を一時的にトランスフェクトし、上 述の通りに細胞を回収し、洗浄した。１２５Ｉにより標識したＩＬ−８（１，５ または１０ｎＭの濃度）に、４〜５Ｘ１０Ｂ個のトランスフェクトされた細胞（ １００μｍのＰＢＳｌｏ、１％　ＢＳＡ中）を添加した。標識リガンド及び非標 識リガンド存在下で細胞を４℃で一時間インキユベートし、０．３％のＰＥＩに 浸したＯＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、冷ＰＢＳ１０．１％　ＢＳＡにより 洗浄し、細胞結合放射活性をガンマカウンター中でｊ−１定した。特異的結合は 、過剰な（すなわち０．３〜３ｎＭ）非標識ＩＬ−８存在下で行なった結合アッ セイと比較することにより決定した。 図７に示す通り、１Ｌ−８は４ＡＢ／Ｆ３ＲよりもＦ３Ｒ／４ＡＢに、より容易 に結合した。キメラ蛋白質に結合するＩＬ−８の量は、各蛋白質のアミノ末端部 分に結合するＩＬ−８の量を反映していた；このように、親和性の高い受容体の 最初の５８アミノ酸は、親和性の低い受容体に、親和性の高い結合特性を与え、 親和性の低い受容体の最初の６２アミノ酸は、親和性の高い受容体に、親和性の 低い結合特性を与えた。これらの結果から、親和性の高いＩＬ−８結合領域はＦ ３Ｒ蛋白質のアミノ末端中に含まれ、親和性の低いＩＬ−８結合領域は４ＡＢ蛋 白質のアミノ末端中に含まれることが示唆している。興味深いことに、Ｆ３Ｒ／ ４ＡＢキメラは、Ｆ３Ｒまたは４ＡＢ受容体のいずれよりもＩＬ−８に強く結合 し、これは、アミノ末端領域と、分子の他の部分の！Ｌ−８だの相互作用が起き ている可能性のあることを示している。 リガンド結合がＩＬ−８受容体のアミノ末端によることは、図８に示す実験によ っても示唆される。４ＡＢ−ｐｓＶＬまたはＦ３Ｒ／４ＡＢ−ｐＳＶＬを用いて ＣＯ５細胞を一時的にトランスフェクトし、上述の通りに細胞を回収し、洗浄し た。１．２μＮ１の　Ｉにより標識したＩＬ−８を、２×１０５個の細胞全体（ ５０μｌのＰＢＳｌｏ、１％　ＢＳＡ中）及び徐々に上昇する濃度の競合リガン ド（すなわち、００−１Ｏ００ｎの非標識ＩＬ−８または１０〜５００ｎＭのＭ ＧＳＡ／ＧＲＯα）に添加した。リガンド存在下で細胞を４℃で一時間インキユ ベートし、０．３％のＰＥＩに浸したＣＩ’／Ｃフィルターを用いて濾過し、冷 ＰＢＳ１０．１％　ＢＳＡにより洗浄し、細胞結合放射活性をガンマカウンター 中で測定した。 ｒｊｇＪＢニ示す通り、４ＡＢ受容体は、同様の親和性で１Ｌ−８及びＭＧ　Ｓ 　Ａ／ＧＲＯαを結合した。これに対して、Ｆ３Ｒ／４ＡＢ受容体（すなわち、 推定されるＦ３ＲＩＬ−８結合領域を有する受容体）については、ＩＬ−８の結 合はＭＧＳＡ／ＧＲＯαと競合することができなかった。これは、Ｆ３Ｒに媒介 されるＩＬ−８結合の特徴である。このように、親和性の高いＩＬ−８受容体の 細胞外Ｎ末端領域は、親和性の高さと特異性の両方を与える。 ＴＬ　Ｓ受容体アンタゴニストのスクリーニング上記に記載した通り、本発明の 態様の一つは、！Ｌ−８と【Ｌ−８受容体との間の相互作用を阻止し、これによ りこの相互作用に媒介されるイベントのカスケードを阻止または減少させる化合 物のスクリーニングに関する。スクリーニングの要素は、結合を検出するよう配 置されたＩＬ−８及び組み換えＩＬ−８受容体（または、上記に概説した適切な 受容体断片またはアナログ）である。上述の通り、ＩＬ〜８はＧｅｎｚｙｗｅか ら購入することができ、ウサギまたはヒトの全長（Ｌ−８受容体（またはＩＬ− ８結合断片またはアナログ）は、本発明に記載した通りに作製することができる 。 Ｉ　Ｌ−８のその受容体への結合は、上記に記載したいずれの方法によってもア ンセイすることができる。組み換えＩＬ−８受容体（または、適切なＩＬ−８受 容体断片またはアナログ）を発現する細胞を固体基質（例えば、マイクロタイタ ープレートのウェルまたはカラム）に固定化し、検出できるよう標識したＩＬ− ８（上述の通り）と反応させることが好ましい。結合は、受容体成分に結合する （そして、それにより固体基質に結合する）標識を検出することによりアッセイ する。標識ＩＬ−８の受容体を有する細胞への結合を、アンタゴニストアッセイ を２１ＦＪ定するものの“コントロール”として使用する。アンタゴニストアッ セイには、Ｉ　Ｌ−８受容体を有する細胞を、適切な量の候補アンタゴニストと ともにインキュベートすることが含まれる。この混合物に、等量の標識ＩＬ−８ を添加する。本発明に有用なアンタゴニストは、固定化された受容体発現細胞へ の標識■Ｌ−８の結合を特異的に妨害する。 次いで、アンタゴニストの、ＩＬ−８機能を妨害する能力、すなわち、通常受容 体により媒介されるシグナルトランスダクシ百ンを引き起こすことなく標ｆｉｔ Ｌ−８結合を特異的に妨害する能力を試験する。機能的アッセイを用いてこれを アッセイするために、ＩＬ−８受容体を含有する安定的にトランスフェクトされ た細胞系を、本発明に記載する通りに作製し、カルシウム結合剤、ＦＵＲＡ−２ のようなレポーター化合物を、標準的な技術により細胞質にロードすることがで きる。異種Ｉ　Ｌ−８受容体を！Ｌ−８または他のアゴニストにより刺激するこ とにより、細胞内カルシウムが放出され、それに付随してカルシウム−ＦＵＲＡ −２ｍ合体の蛍光（ｆ　Ｉ　ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）が起こる。これによりアゴ ニスト活性を測定するための簡便な方法が提供される。ｒＬ−８とともに潜在的 なアンタゴニストが含まれていることにより、蛍光を生成することなく　（すな わち、細胞内Ｃａ”＋の動員を引き起こすことなく）効果的にＩ　Ｌ−８結合を 阻止する本物の受容体アンタゴニストのスクリーニング及び同定を行なうことが できる。このようなアンタゴニストは、炎症性疾患に対する有用な治療薬である と期待される。 適切な候補アンタゴニストには、ＩＬ−８受容体断片、特に、受容体の、一つま たはそれ以上の膜貫通性部分２〜７または細胞外領域（上記に記載）を含む断片 が含まれる；このような断片には、好ましくは５個またはそれ以上のアミノ酸が 含まれる。他の候補アンタゴニストには、ＩＬ−８のアナログ及び他のペプチド 、及び非ペプチド化合物及び受容体の解析から設計または派生した抗ｒ　Ｌ−８ 受容体抗体が含まれる。 抗ＩＬ−８受容体抗体 親和性の高いＩ　Ｌ−８受容体または親和性の低いＩ　Ｌ−８受容体（または免 疫原性受容体断片またはアナログ）は、本発明にを用な抗体を作製するのに使用 することができる。上述の通り、抗体の作製に好適な受容体断片は、細胞外であ ると推定される、または実験的に示される断片である；このような断片には細胞 外Ｎ末端領域が含まれる。 ＩＬ−８受容体ペプチドに対する抗体は以下の通りに作製する。推定される細胞 外ループ（親和性の高いｒ’Ｌ−８受容体のアミノ成約９４〜１１３．１８６〜 ２０２、及び２６８〜２８５または親和性の低い！Ｌ−８受容体のアミノ成約１ ０７〜１２０．１８４〜２１３、及び２７４〜３００）の全体または一部、また は細胞外Ｎ末端領域（親和性の高いＩＬ−８受容体のアミノ成約１〜３７または 親和性の低いＩＬ−８受容体のアミノ成約１〜５０）の全体または一部に相当す るペプチドを、標準的な技術によりペプチド合成機を用いて作製する。ｍ−マレ イミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いてＫＬＨにペプチ ドをカプリングさせる。ＫＬＨ−ペプチドをフロイント完全アジュバントと混合 し、例えばモルモットまたはヤギのような動物に注入する。ペプチド抗原アフィ ニティクロマトグラフィにより抗体を精製する。このような方法を用いて、Ｎ末 端細胞外領域、及びループ２及びループ３を含有するペプチドに対するポリクロ ーナル抗血清を作製した。 免疫化に使用される付加的なペプチドは、以下の通りである：１、ヒトＩＬ−８ 受容体のアミノ酸１６〜３９　：　ＮＦＴＧＭＰＰＡＤＥＤＹＳＰＣＭＬＥＴＥ −ＴＬＮＫ　ＣＣ）（縮合のためにＣｙｓが付加されている）。 （配列は、）ｌｏｌｍｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　１９９１．５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｍｏ １．２５３：１２７ｇを参照）２　ウサギの“親和性の高い°　ＩＬ−８受容体 ；ヒトの“親和性の低い″受容体及びウサギの″親和性の低い°受容体からの３ 種のペプチド　それぞれ、アミノ酸２１〜４４．２１〜４つ、及び２１〜４６゜ 位ｆ１３５．３９及び３７（それぞれ）に位置する内部システィンをアラニンに 置換し、システィンは縮合のためにＣ○ＯＨ末端に付加した。 その他の方法として、ＩＬ−８に対する抗体は、Ｉ　Ｌ−８受容体を発現する細 胞全体またはこれら細胞の膜画分（双方とも上記に記ｗ、）を用いて作製するこ とができる。例えば、約１０７個の一時的にトランスフェクトされたＣＯ３７細 胞、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞、または５０μｇの全膜蛋白質 に相当する膜画分をマウスに注入する。２週間〜４週間後、マウスに約１０７個 の細胞または１０〜２５μｇ蛋白質に相当する膜画分を追加免疫として投与する 。２回目の追加免疫の約３週間後、マウスに再度追加免疫を行ない、標準的な技 術によりハイブリドーマを作製するためにひ臓細胞を摘出する。ＩＬ−８受容体 に結合する抗体を産生ずるハイブリドーマのスクリーニングは、ＦＡＣ９（蛍光 活性化細胞ソータ）、トランスフェクトされていない細胞対トランスフェクトさ れた細胞を用いた細胞に基づ（ＥＬＩＳＡ（免疫化に使用したのとは異なる細胞 系であることが好ましい）、または細胞膜を用いて行なう。トランスフェクトさ れた細胞に結合する抗体を産生ずるハイブリドーマをサブクローニングし、受容 体へのＩＬ−８結合を阻止する能力、またはＩＬ−８依存性シグナルトランスダ クシヨンを阻止する能力を試験する。 作製された抗体は、ウェスタンプロットまたは免疫沈降解析（Ａｕｓｕｂｅｌ　 ｅｔ　ａｌ、５ｕｐｒａの方法による）により、特異的なＩＬ−８受容体認識能 を試験する。■Ｌ−８受容体を特異的に認識する抗体は、有用なアンタゴニスト 候補であると考えられる：このような候補について、ＩＬ−８とその受容体との 間の相互作用を特異的に妨害する能力をさらに試験する（上記に２哉の通り）。 ＩＬ−８／ＩＬ＝８受容体結合またはＩＬ−８受容体機能を阻害する抗体を、本 発明において有用なアンタゴニストであると見なす。 療法 炎症性疾患の治療に特に適した治療薬は、生理食塩水のような適切な緩衝液中で 処方された、上述の可溶性アンタゴニスト受容体断片である。膜接触面において 受容体構造をＦＡ＠するのに特に適している場合、断片は十分な数の隣接膜貫通 性残基を有する。この場合、断片は適切な脂肪画分に結合している（例えば、脂 質小胞中または細胞膜を破壊することにより得られる断片に結合している）こと もある。その他の方法として、上述の通り作製した抗ＩＬ−８受容体抗体を治療 のためのものとして使用することもできる。この場合も、抗体は、薬理学的に許 容可能な緩衝液（ｆＦＩＩえば、生理食塩水）中で投与される。もし適していれ ば、抗体調製物を適切なアジュバントに結合することもできる。 治療薬：Ａ１４８！物は、治療するものの状態に応じて投与される。通常、１Ｌ −８結合に適切に競合する投与量で静脈注射により投与する。その他の方法とし て、治療薬を経口または経鼻的に、または局所的に（例えば、液体またはスプレ ーとして）投与するのも便利である。この場合も、投与量は上述の通りである。 治療は、疾患の症状の軽減に必要な回数繰り返すことができる。アンタゴニスト も炎症を予防するために（治療と同様）投与することができる；アンタゴニスト は上述の通りに投与する。 ＩＬ−８受容体は炎症に関連する好中球の活性化に含まれるため、好中球が主要 な役割を演じる炎症性疾患（例えば、乾１、リウマチ様関節炎及び他の慢性疾患 、及び再潅流創傷、敗血症ショック、外傷性ショックのような急性炎症性疾患、 成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）及び嚢胞性線維症患者における細菌感染性の炎 症性気道疾患のような肺疾患）の治療または予防にＩＬ−８受容体アンタゴニス トを使用することができる。 本発明の方法は、例えば、ヒト、愛玩動物、または家畜などのいずれの哺乳類に おける炎症反応を軽減するのにも使用することができる。ヒト以外の哺乳類を治 療する場合、使用するｒＬ−８受容体または受容体断片またはアナログまたは抗 体は、その種に特異的であることが好ましい。 他の実施例は特許請求の範囲に含まれる。 Ｓ冨ＱＵ冨ＮＣＫ　ＬＸＳτＸＮＧ （ｉｉｌ　ＴＸＴ’ＬＸ　ＯＦ　ＩＮＶ１１＋１ｒｒｌＯＮＩ　Ｉ）ｒｆｆＲ１ Ｊαエト８　ｊＬＩｌ：’ｆｆ１Ｐ？ＯＲ５Ａ）１０（Ｌｉｉｌ　ＹＵＨｌｌｔ ＲＯＦ　＄ＸＱＯ’ｌＮＣ！ｇ＋　５（Ｌｖｌ　（ＸＩＲＲＸＳＰｏＮＤＥＮＣ Ｉ　ＡＤＤＩ＋ｌＸ５ｇ＋７ＦＩ　ＺＸＰｔ　０２！１０−２８０４＋ＹＩ　Ｃ Ｏ■ワｎ１預すのＡＪｉ！Ｊ　ＰＯＲＭ＋ＩｖＬｌ　ｃｔｙＲＲ１！ＮＴ　ｕＰ ＬＸｃｋＴＸＯＮ　ＯＡ？ＡＩ（ｗｉｌｌ　ＰＲｌＯＲＡＰＰＬＸｃＡＴＸＯＮ 　ＤｈＴｋｒ（ｖｉｉｉｌ　Ａ？！’０ＲＮＩＩＹ／ＡＧ侃Ｘｎ℃〜情ＴＸＯＮ ＋（Ｌｘ）Ｔｖ＋ｘ００にｘυｘ工ＣＡＴ１ｏＨＸＷｎλにＡ丁Ｉｏ帽（２）配 列番号、１ （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：１２００ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の状態；　単鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎮状 （ｘ　ｔ）配列番号１ ＣＣＣＣＴＣ？’ＯＣＡＡＧ　Ｇｍ　ＯＧＧ　Ｔｏｎ　ｅｒ？　ＣＴＧ　ＡＡＯ ＧＡＡ　にＧＴＣＡＡＣ！　ＴＴＣＴｋＣＡＯで　４９１Ｇ＾＾　＾？ＣＣ〒ａ 　ＣＴｏ　ＣＴＣＧＣＣ↑ＧｅＡ〒Ｃ＾Ｇτ　ＣＴＧ　ａ＾ＣＣＧＣＴＡＣＣＴ 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（Ｃ）トポロジー、　直鎖状 （ｘｉ）配列番号４ ＡＸ’！’ＧＴＱＡＣＴＯＴｌｌ；入＾Ｇ＾Ｇ入＾Ｇ　ＧＧＡＧＯ２５（２）配 列番号　５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１１０６ （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）ｔＲＯ状、懸、単鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 Ｃｘ１）配列番号５ ＴＣＣＧ’ｒＣ入ＣＴ　ｌａ？　ＣＴ＋：　’ｒＡｃ　Ｃ’ｒＯＣ’ＴＯＡＡＣ ＣＴＡ　ＧＣＣＴＴＧ　ＧＣＣＧＡｅ　ＣＴＡ　ＣＴＣ３０O ＳＩＩｒ：　Ｖａｌ　ｎ＋ｒ　入ｍｐ　Ｖａｌ　’ｒｙｒ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　＾ −ｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌａｕ　ＡＬａ　Ａ１ｐＬｅｕ　Ｌdｕ Ｔ丁τ　ＧＣＣＣＴＧ　ＡＣｅ　ｍ　ｅｃｃ　入丁Ｃ’！’Ｇｏ　ＧＣＣＧＣＣ τｃｃ　＾ＡＧＧ〒Ｇ　λＡテ　ＧＣＣＴＧＧ　３４８ＡＡＣＴ’１℃τ＾Ｔ　 ＡＣＴ　ＧＧＣＡｒｃ　ｍ　Ｃ？ＡＣ？Ｇ　ＧＣＣ雪ｃ　ｋＴｃ　ＡＣＴ　Ｇπ Ｃ＾ＣＣ’Ｇ丁　４４４τＡｃｅ〒Ｇ　ＧＣＣＡＴＴ　ＯＴＣＣＡ丁　ＧＣＣｋ ｃｋ　ＣＣＣＡＣＡ　ＣＴＣＡｃｅ　ＣＡＯＡＡＣＧＣＧ　↑ｋＣ４９２ＴＴＧ 　ＣＴＣ入Ｍ　丁ＴＣＡ？Ａ　↑Ｇτ　ＣＴＣＡＧｃ　入Ｔｃ　ＴＧＯＯＴテ　 ＣＴＧ　ＴＣＣ’１７０　ＣＴＣ（”Ｔｏ　５４０ＡＴ’ｌｆｆ　Ｃ”ｌ’ｌｆ ｆ　ＴＴｋ　ＧＣｅ　ＡＴｃ　ＣＴＣＣＣＣｃＡＧ　’ｒｃｃ　’！？Ｔ　ｌｌ ＆　ＴＴＣＡ’ｒＣＯ１’Ｇ　■bＡ　ｍ　６８４ Ｃ〒Ｇ　ＡＴｃ　ｋ’Ｆ、ＣＭ　ＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＧＡ　ＴＴＣＡｃｅ　ｍ 　Ｃ１ｌ？　ＡＣｅ　ＣＴＣ↑Ｔ’ＴＡＡＧ　）３２τＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＧ ＣＣ１１０６（２）配列番号：６ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１３７３ （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の状態：　単鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｘｉ）配列番号６ ＾ＣＣＡＣＣｉ℃αＫ　Ａ？ｅ　？’ＧＧ　α℃ＧＣＣ！　１１０　ＣＴＯＣＡ ＣＧＧＣＴｏｅ　ｋＣＴ　ＴＴＣ４０６ＣＴＣ（！ＯＧ　Ａ’ｌ’Ｃｅ’ｒＧ　 ＣＣＴ　Ｃｌｌｌ０　ＡＣＴ　ｍ　＆　ＴＴＣＡ？’ＣＣＴＣＣＣＯｅ！’ＯＣ ＴＣＧ’ｌ’Ｃ７４Q ＾Ｔ’ＧＣＴＧ　τＴＴ　↑ＧＣ〒Ａ？　ＧＴＧ　ｉＴＣＡｅｅ　ＣＴり　ＣＯ ｃ　ＡｃＧ　ＣＴＯＴＴＣ！　（ＪＯ（：ＣＣＣＡＣ］９０Ａ’ｌ’Ｇ　ＯＧＧ 　ＣＡｏ　ＡＡｃ　ＣＡ（：　ＣＯＧ　ｃｃｃ　ｋｒＧ　ｃｃｃ　ｃ”ｒｃ　ａ 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Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．組み換えＩＬ−８受容体ポリペプチド。
2. ２．図１（配列番号：１）に示すアミノ酸配列と事実上同一なアミノ酸配列を有 することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
3. ３．図２（配列番号：５）に示すアミノ酸配列と事実上同一なアミノ酸配列を有 することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
4. ４．図９（配列番号：６）に示すアミノ酸配列と事実上同一なアミノ酸配列を有 することを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
5. ５．ＩＬ−８を結合することが可能な領域を有するＩＬ−８受容体の断片または アナログであることを特徴とする、事実上単離されたポリペプチド。
6. ６．図１（配列番号：１）に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜３７、またはその ＩＬ−８結合断片を含むことを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
7. ７．図２（配列番号：５）に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜５０、またはその ＩＬ−８結合断片を含むことを特徴とする請求項５に記載のポリペプチド。
8. ８．請求項１または請求項５に記載のポリペプチドをコードする精製されたＤＮ Ａ。
9. ９．前記ＤＮＡがｃＤＮＡであることを特徴とする請求項８に記載の精製された ＤＮＡ。
10. １０．請求項８に記載の精製されたＤＮＡを有する細胞。
11. １１．前記細胞中で発現するよう位置づけられた、ＩＬ−８受容体またはその断 片またはアナログをコードするＤＮＡにより形質転換された細胞の提供と、前記 ＤＮＡを発現する条件下における前記形質転換された細胞の培養と、前記ＩＬ− ８受容体ポリペプチドの単離から成る、組み換えＩＬ−８受容体ポリペプチドま たはその断片またはアナログを作製する方法。
12. １２．請求項１または５に記載のポリペプチドに優先的に結合する精製された抗 体。
13. １３．前記抗体がｉｎ　ｖｉｖｏにおいて前記ポリペプチドの生物活性を中和す ることを特徴とする請求項１２に記載の抗体。
14. １４．請求項１または５に記載のポリペプチドを活性成分として含み、前記活性 成分が薬理学的に許容可能な担体中に処方されていることを特徴とする治療薬混 成物。
15. １５．請求項１２に記載の抗体を活性成分として含み、前記活性成分が薬理学的 に許容可能な担体中に処方されていることを特徴とする治療薬混成物。
16. １６．ａ）一方に請求項１に記載の組み換えＩＬ−８受容体ポリペプチドまたは 請求項５に記載の受容体断片またはアナログを含む第一の化合物と、ＩＬ−８を 含む第二の化合物への、候補アンタゴニスト化合物の混合と、ｂ）前記第一及び 第二の化合物が結合するか否かの決定と、ｃ）第一の化合物の第二の化合物への 結合を妨害し、ＩＬ−８に媒介される細胞内Ｃａ＋＋の放出を減少させる化合物 のアンタゴニストとしての同定を含む、ＩＬ−８とＩＬ−８受容体との間の相互 作用を阻害する能力についての候補化合物のスクリーニング方法。
17. １７．図２（配列番号：５）に示す配列のカルボキシル末端部分に融合している 、図１（配列番号：１）に示す配列のアミノ末端部分を有するポリペプチド。