JPH09504030A - Ｃｎｔｆ族アンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＣＮＴＦ及びＩＬ−６アンタゴニストとしての可溶性α特異性決定サイトカインレセプター成分とβレセプター成分機能の細胞外ドメインとを含んでなるヘテロ二量体タンパク質

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＮＴＦ族アンタゴニスト 発明の背景 繊毛向神経性因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチン （ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）Ｍ（ＯＳＭ）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６） は様々な生物活性について発見されたが、（本明細書では「ＣＮＴＦ族」サイト カインと称する）新規定義のサイトカイン族を含んでいる。これらのサイトカイ ンはその遠い構造類似性［Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｎ ７：１９７−２０８ （１９９１）；Ｒｏｓｅ及びＢｒｕｃｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ８８：８６４１−８６４５（１９９１）］のために、また恐らくは より重要なことであるが、「β」シグナル変換レセプター成分を共有している［ Ｂａｕｍａｎｎ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１９８５３−１９８６２ （１９９３）；Ｄａｖｉｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８００−１８０８（ １９９３）；Ｇｅａｒｉｎｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１４３４−１４３７ （１９９２）；Ｉｐ等，Ｃｅｌｌ ６９：１１２１−１１３２（１９９２）；Ｓ ｔａｈｌ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７６２８−７６３１（１９９３ ）；Ｓ ｔａｈｌ及びＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０（１９ ９３）］ために同じグループに分類される。このサイトカイン族によるレセプタ ー活性化は上記β成分のホモ又はヘテロ二量化によって生ずる［Ｄａｖｉｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５−１８０８（１９９３），Ｍｕｒａｋａｍｉ 等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０８−１８１０（１９９３）；Ｓｔａｈｌ及 びＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４；５８７−５９０（１９９３）］。 ＩＬ−６のレセプター活性化は、最初にＩＬ−６シグナルトランスデューサーと して同定されたタンパク質［Ｈｉｂｉ等，Ｃｅｌｌ ６３：１１４９−１１５７ （１９９０）］であるｇｐ１３０のホモ二量化を必要とする［Ｍｕｒａｋａｍｉ 等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０８−１８１０（１９９３），Ｈｉｂｉ等， Ｃｅｌｌ ６３：１１４９−１１５７（１９９０）］。ＣＮＴＦ、ＬＩＦ及びＯ ＳＭのレセプター活性化は、最初にＬＩＦとの結合能力によって同定された［Ｇ ｅａｒｉｎｇ等，ＥＭＢＯＪ．１０：２８３９−２８４８（１９９１）］ＬＩＦ Ｒβとして公知の第２のｇｐ１３０関連タンパク質とｇｐ１３０との間のヘテロ 二量化によって生ずる［Ｄａｖｉｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５−１８０８（１９９３）］。 これらのサイトカインの中には、β成分の他に、β成分よりも組織分布が制限 され、従って特定のサイトカインの細胞標的を決定する特異性決定「α」成分を 更に必要とするものがある［Ｓｔａｈｌ及びＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０（１９９３）］。従って，ＬＩＦ及びＯＳＭが、対応す る細胞上にｇｐ１３０及びＬＩＦＲβの存在のみを必要とし得る広範作用因子で あるのに対して、ＣＮＴＦはＣＮＴＦＲαを必要とし［Ｓｔａｈｌ及びＹａｎｃ ｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０（１９９３）］、ＩＬ−６は ＩＬ−６Ｒαを必要とする［Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８： ５９３−５９７（１９９２）］。ＣＮＴＦＲα（ＤａｖｉＳ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７３６−１７３９（１９９３）及びＩＬ−６Ｒα［Ｈｉｂｉ等，Ｃ ｅｌｌ ６３：１１４９−１１５７，Ｍｕｒａｋａｍｉ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ６０：１８０８−１８１０（１９９０）；Ｔａｇａ等，Ｃｅｌｌ ５８：５７３ −５８１（１９８９）］は共に、細胞内シグナル化分子と相互作用せずに、その リガン ドを適切なシグナル変換βサブユニットと相互作用させるのに役立つという概念 に合致した可溶性タンパク質として機能し得る［Ｓｔａｈｌ及びＹａｎｃｏｐｏ ｕｌｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０（１９９３）］。 他のサイトカイン系からの別の証拠が更に、全てのサイトカインレセプターで のシグナル変換を開始させる共通の機構が二量化によって得られるという概念を 支持する。これに関しては成長ホルモン（ＧＨ）が恐らくは最良の例として役立 つ。結晶学的研究によって、各ＧＨ分子が２個の異なるレセプター結合部位を含 み、いずれの部位もレセプター中の同一の結合ドメインによって認識され、単一 のＧＨ分子を２個のレセプター分子に結合できることが判明した［ｄｅ Ｖｏｓ 等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２）］。二量化は順次生 起し，まずＧＨの部位１が１個のレセプター分子に結合し、次いで部位２が第２ のレセプター分子に結合する［Ｆｕｈ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１６７７− １６８０（１９９２）］。エリトロポエチン（ＥＰＯ）レセプターはシステイン 残基を導入して１個のアミノ酸を変化させることにより構造的に活性化され、ジ スルフィド結合ホモ二量体を生成し得るので、 ＥＰＯレセプターの研究も、レセプター活性化での二量化の重要性に対応してい る［Ｗａｔｏｗｉｃｈ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ ９：２１４０−２１４４（１９９２）］。 レセプター活性化の重要ステップとしてのβサブユニットのホモ又はヘテロ二 量化以外の第２の重要な特徴は、ＣＮＴＦ族サイトカインによる最終レセプター 錯体の形成が、リガンドを順番にレセプター成分にうまく結合させる機構によっ て行われることである［Ｄａｖｉｓ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５−１ ８１８（１９９３）；Ｓｔａｈｌ及びＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４ ：５８７−５９０（１９９３）］。従って、まずＣＮＴＦがＣＮＴＦＲαに結合 して錯体を形成し、次いでｇｐ１３０に結合して（本明細書ではαβ１中間体と 称する）中間体が生成する。この中間体は単一のβ成分しか持たないのでシグナ ル化能力を有さない。その後最終的にＬＩＦＲβと結合（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ）するとβ成分のヘテロ二量体が生成し、次いでシグナル変換を開始する。単一 のｇｐ１３０分子及びＩＬ−６Ｒαに結合したＩＬ−６を含む同様の中間体は直 接には単離されなかったが、遠い同族体である ＣＮＴＦとの類似性によって、また最終的に活性なＩＬ−６レセプター錯体が２ 個のｇｐ１３０モノマーと結合するという事実によって中間体が存在すると考え られた。要するに、これらの知見によって、各サイトカインが３個以下のレセプ ター結合部位、即ち任意のα特異性決定成分に結合する部位（α部位）、第１の βシグナル変換成分に結合する部位（β１部位）、及び第２のβシグナル変換成 分に結合する部位（β２部位）を有し得る一般的なサイトカインレセプター錯体 （図１）の構造が提案されることになった［Ｓｔａｈｌ及びＹａｎｃｏｐｏｕｌ ｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０（１９９３）］。これらの３部位は順次 使用され、錯体形成の最終ステップでβ成分が二量化する。これはシグナル変換 開始のために重要である［Ｄａｖｉｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５− １８１８（１９９３）］。レセプター活性化の詳細が公知であり、またＣＮＴＦ に対して非機能的なβ１中間体が存在するので、ＣＮＴＦが場合によってはＩＬ −６の高親和性アンタゴニストとなり、以下で詳述するようにＣＮＴＦ族サイト カインのリガンド又はレセプターベースのアンタゴニストの設計の戦略基盤とな ることが知見された。 サイトカインの結合によってレセプター錯体が形成されれば、β成分の二量化 が細胞内チロシンキナーゼ活性を活性化して、広範な基質がリン酸化する［Ｉｐ 等，Ｃｅｌｌ６９：１２１−１１３２（１９９２）］。チロシンのリン酸化を阻 止する阻害剤は遺伝子誘導のようなその後の事象をも妨げるので、このチロシン キナーゼの活性化は下流事象にとって重要に思える［Ｉｐ等，Ｃｅｌｌ ６９： １２１−１１３２（１９９２）；Ｎａｋａｊｉｍａ及びＷａｌｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅ ｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１４０９−１４１８（１９９１）］。Ｊａｋ１、Ｊａｋ ２及びＴｙｋ２（Ｊａｋ／Ｔｙｋキナーゼと称される）を含み［Ｆｉｒｍｂａｃ ｈ−Ｋｒａｆｔ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：１３２９−１３３６（１９９０）； Ｗｉｌｋｓ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：２０５７−２０６５（１９ ９１）］、他のサイトカインと共にシグナル変換に関与する［等，Ｃｅｌｌ ７ ４：２３７−２４４（１９９３）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎ ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（出版；１９９３）；Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ等 ，Ｃｅｌｌ ７０；３１３−３２２（１９９２）；Ｗｉｔｔｈｕｈｎ等，Ｃｅｌ ｌ ７４：２２７−２３６（１９９３）］ 新規発見の非レセプターチロシンキナーゼ族が、リガンドの不在下でβサブユニ ットのｇｐ１３０及びＬＩＦＲβの細胞質ドメインと予め会合し、リガンド付加 によってチロシンリン酸化して活性化する［Ｓｔａｈｌ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（提 出；１９９３）］ことが最近我々により実証された。従って、これらのキナーゼ は、細胞外側でリガンド結合するために、細胞内部で活性化される細胞内シグナ ル変換の最も基幹的ステップであるように思える。この系に基づく特異なアゴニ スト又はアンタゴニスト活性について小分子試料をスクリーニングするためのア ッセイ系を以下で説明する。 ＣＮＴＦ族サイトカインは広範な生理的過程で重要な役割を果たし、アンタゴ ニスト及びアゴニストの両方で治療に適用され得る。 発明の要約 本発明の一つの目的は、ＩＬ−６関連疾病又は障害の治療に有用なＩＬ−６ア ンタゴニストを生成することである。 本発明の他の目的は、本明細書に記載のＩＬ−６アンタゴニストの、骨粗鬆症 治療のための使用である。 本発明の他の目的は、本明細書に記載のＩＬ−６アンタ ゴニストの、多発性骨髄腫を含む癌の一次作用及び二次作用の両方の治療のため の使用である。 本発明の他の目的は、本明細書に記載のＩＬ−６アンタゴニストのカヘキシー 治療のための使用である。 本発明の他の目的は、ＣＮＴＦ族サイトカインのメンバーの新規アゴニスト及 びアンタゴニストの同定に有用なスクリーニング系の開発である。 本発明の他の目的は、ＣＮＴＦ族サイトカインのアゴニスト及びアンタゴニス トとして作用する小分子の同定に有用なスクリーニング系の開発である。 これらの目的や他の目的は、ＣＮＴＦ族レセプター成分を用いて、ＩＬ−６及 びＣＮＴＦアンタゴニストのような治療活性を有すると共に、ＣＮＴＦサイトカ イン族メンバーの新規アゴニスト及びアンタゴニストの同定に有用なアッセイ系 で有益性を示す非機能的な中間体を生成することにより達成される。 図面の簡単な説明 図１：一般的なサイトカインレセプターのモデルでのレセプター成分の順番によ る結合。このモデルは、サイトカインが３個以下のレセプター結合部位を含み、 まず任意のα 成分と結合し、次いでβ１、次いでβ２と結合することによってレセプター成分 と相互作用することを示している。多数のサイトカインレセプター用のβ成分は 、膜近位領域（斜線部分）を通じてＪａｋ／Ｔｙｋ族細胞質タンパク質チロシン キナーゼと相互作用する。β成分が二量化しただけで、β成分及びＪａｋ／Ｔｙ ｋキナーゼのチロシンリン酸化（Ｐ）で図示するようにシグナル変換が開始する 。 図２：ＣＮＴＦは、ＩＬＦＲβではなく、ＩＬ６Ｒα、ｇｐ１３０、ＣＮＴＦＲ αを発現するＰＣ１２細胞系（ＰＣ１２Ｄと称する）でＩＬ−６応答を阻害する 。血清の欠乏したＰＣ１２Ｄ細胞を前述したようなＣＮＴＦの存在下及び不在下 でＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。あるプレートには、 前述したような可溶性ＩＲ６Ｒα（１ｍｇ／ｍＬ）又は可溶性ＣＮＴＦＲα（１ ｍｇ／ｍＬ）を更に加えた。細胞溶解物を抗ｇｐ１３０で免疫沈殿させ、抗ホス ホチロシンでイムノブロットした。ｇｐ１３０のチロシンリン酸化はＩＬ−６レ セプター系の活性化がＩＬ−６によって誘導されることを示し、この活性化はＣ ＮＴＦを同時添加すると阻止される。 図３：ＰＣ１２Ｄ細胞上でのヨウ素化ＣＮＴＦ結合のスキ ャッチャード分析。ＰＣ１２Ｄ細胞を過剰非放射性コンペティターの存在下又は 不在下で濃度の異なるヨウ素化ＣＮＴＦと共にインキュベートして特異結合を調 べた。図面は、特異結合したヨウ素化ＣＮＴＦの量のスキャッチャードプロット を示し、９ｐＭ及び３．４ｎＭの解離定数を有する２つの結合部位に対応するデ ータを提供する。 発明の詳細な説明 本発明はＣＮＴＦ族サイトカインのようなサイトカインが共有するレセプター 成分に基づく新規アンタゴニストを提供する。 本明細書に記載する発明は、α特異性決定成分を使用して、これがサイトカイ ンと組み合わさると第１のβシグナル変換成分と結合して非機能的な中間体を生 成し、次いでこれが第２のβシグナル変換成分と結合するとβ−レセプターが二 量化して結果的にシグナルが変換される任意のサイトカインに対するアンタゴニ ストの生成法を考察する。本発明によれば、レセプターの可溶性α特異性決定成 分（ｓＲα）を、サイトカインレセプターの第１のβシグナル変換成分（β１） の細胞外ドメインと組み合わせてヘテロ二量体（ｓＲα：β１）を生成する。こ の二量体は、サイト カインと結合して非機能的な錯体を生成することによってサイトカインに対する アンタゴニストとして作用する。 実施例１に記載するように、ＣＮＴＦとＩＬ−６はβ１レセプター成分のｇｐ １３０を共有している．ＣＮＴＦがＣＮＴＦＲα及びｇｐ１３０と中間体を生成 するということはＬＩＦＲβの欠失した細胞で実証され得る（実施例１）。この 場合ＣＮＴＦとＣＮＴＦＲαとの錯体はｇｐ１３０と結合し、ＩＬ−６及びＩＬ −６Ｒαによってｇｐ１３０のホモ二量化が阻止され、シグナル変換は妨げられ る。これらの研究は、リガンド、そのαレセプター成分及びそのβ１レセプター 成分からなる非機能的な中間体錯体をリガンドの存在下で生成できれば、この錯 体がリガンドの作用を効果的に阻止することを示しているので、本明細書に記載 するＩＬ−６アンタゴニストの開発の基礎となる。他のサイトカインが、本発明 のアンタゴニストの生成にも使用できる他のβ１レセプター成分（例えばＬＩＦ Ｒβ）を使用してもよい。 従って、例えば本発明の一実施態様によれば、ＩＬ−６又はＣＮＴＦの効果的 なアンタゴニストはそのレセプター（それぞれｓＩＬ−６Ｒα及びｓＣＮＴＦＲ α）のα特異 性決定成分の細胞外ドメインと、ｇｐ１３０の細胞外ドメインとのヘテロ二量体 からなる。以下でそれぞれｓＩＬ−６Ｒα：β１及びｓＣＮＴＦＲα：β１と称 する得られたヘテロ二量体は、それぞれＩＬ−６又はＣＮＴＦに対して親和性の 高いトラップとして機能して、サイトカインが天然膜結合形態のレセプターとは シグナル変換錯体を形成できないようにする。 レセプターの細胞外部分に由来する可溶性リガンド結合ドメインはリガンド用 トラップとしては幾分効果的であり、従ってアンタゴニストとして作用する［Ｂ ａｒｇｅｔｚｉ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：４０１０−４０１３（１９９ ３）；等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８６１６− ８６２０（１９９２）；Ｍｏｈｌｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１５４ ８−１５６１（１９９３）；Ｎａｒａｚａｋｉ等，Ｂｌｏｏｄ ８２：１１２０ −１１２６（１９９３）］ことが判明したが、ＩＬ−６及びＣＮＴＦレセプター は、αレセプター成分がリガンド結合ドメインとなり、これがリガンドと協調し て可溶性形態においてレセプターアゴニストとして効果的に機能するという点で 例外的である［Ｄａｖｉｓ等、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２５９：１７３６−１７３９（１９９３）；Ｔａｇａ等，Ｃｅｌｌ ５８；５７３−５８１（１９８９）］。本発明で製造したｓＲα：β１ヘテロ二 量体は効果的なリガンド用トラップとなり、機能的な中間体を生成せずに（ＣＮ ＴＦ−ＰＣ１２Ｄ細胞の結合研究に基づく）ピコモル範囲の親和性でもってこれ らのリガンドと結合する。 当業者に公知の方法を用いてα及びβレセプター細胞外ドメインを製造するこ とができる。ＣＮＴＦＲαレセプターはクローニングされ、配列決定され、発現 されている［Ｄａｖｉｓ等（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５９−６３； この文献は参考として本明細書の一部を構成するものとする］。ＬＩＦＲβ及び ｇｐ１３０のクローニングはＧｅａｒｉｎｇ等，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８３９ −２８４８（１９９１）、Ｈｉｂｉ等，Ｃｅｌｌ ６３：１１４９−１１５７（ １９９０）、及び１９９３年５月２７日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１ 号に記載されている。前記文献は参考として本明細書の一部を構成するものとす る。 本発明を実施するのに有用なレセプター分子は、原核生物又は真核生物発現系 でのクローニング及び発現により製 造することができる。幾つかの方法を使用して組換えレセプター遺伝子を発現し 精製することができる。因子をコードする遺伝子を、非制限的ではあるが例えば ｐＣＰ１１０のような細菌性発現ベクター中にサブクローニングすることができ る。 その後安定した生物活性タンパク質を生成できる任意の技術によって組換え因 子を精製することができる。例えば非制限的ではあるが、因子を可溶性タンパク 質又は封入体として細胞から回収し、これから因子を８Ｍ塩酸グアニジニウム及 び透析によって定量的に抽出することができる。因子を更に精製するために、従 来のイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相 クロマトグラフィー又はゲル濾過が使用され得る。 βレセプターヘテロ二量体の生成を記載する「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｏ ｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ ａｎｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ」と題する１９９３年５月２７日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０ １５１号に記載のように公知の融合領域を用いてｓＲα：βヘテロ二量体レセプ ターを操作してもよいし、化学的手段により細胞外ドメインを架橋させて製造し ても よい。使用するドメインはα及びβ成分の全細胞外ドメインからなっていてもよ いし、ｓＲα：β１錯体でリガンドや他の成分との錯体形成能力を維持する突然 変異体又はその断片からなっていてもよい。 本発明の一実施態様では、細胞外ドメインはロイシンジッパーを用いて操作さ れる。ヒト転写因子ｃ−ｊｕｎ及びｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインが安 定なヘテロ二量体を１：１の化学量で生成することが判明した［Ｂｕｓｃｈ及び Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：３６−４ ０（１９９０）；Ｇｅｎｔｚ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１６９５−１６９９ （１９８９）］。ｊｕｎ−ｊｕｎホモ二量体が生成することも判明したが、これ らの二量体の安定度はｊｕｎ−ｆｏｓヘテロ二量体の約１０００分の１である。 ｆｏｓ−ｆｏｓホモ二量体は検出されなかった。 ｃ−ｊｕｎ又はｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインは、遺伝子操作キメラ 遺伝子によって前述のレセプター成分の可溶性又は細胞外ドメインのＣ末端でフ レーム融合する。融合は直接的であってもよいし、可撓性リンカードメイン、例 えばヒトＩｇＧのヒンジ領域、又は長さや組み合 わせの異なる小さなアミノ酸（例えばグリシン、セリン、トレオニン又はアラニ ン）からなるポリペプチドリンカーを使用してもよい。更には、キメラタンパク 質をＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ６）［配列番号 １］でタッグ（ｔａｇｇｅｄ）して、金属キレートクロマトグラフィーで高速精 製し及び／又は対応する抗体が利用可能であるエピトープでタッグしてウエスタ ンブロットによる検出、免疫沈殿又はバイオアッセイでの活性欠失／阻止を実施 することができる。 別の実施態様では、同様の方法を用いるが、但しヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン を用いて、ｓＲα：β１ヘテロ二量体を製造する［Ａｒｕｆｆｏ等，Ｃｅｌｌ ６７：３５−４４（１９９１）］。後者とは対照的に、Ｆｃドメインを保有する キメラ分子はジスルフィド結合ホモ二量体として発現されるので、ヘテロ二量体 の生成は生化学的に達成されねばならない。従って、ホモ二量体は、鎖間ジスル フィドの破壊を助長するが、鎖内ジスルフィドには作用しない条件下では還元し 得る。次いで、種々の細胞外部分を含むモノマーを等モル量で混合し、酸化して 、ホモ二量体とヘテロ二量体との混合物を生成する。この混合物の成分をク ロマトグラフィー技術により分離する。あるいは、この種のヘテロ二量体の生成 を、レセプター成分の可溶性又は細胞外部分、次いでｈｉｇＧのＦｃドメイン、 次いで前述のｃ−ｊｕｎ又はｃ−ｆｏｓロイシンジッパーからなる分子を遺伝子 操作して発現することによって変化（ｂｉａｓｅｄ）させてもよい［Ｋｏｓｔｅ ｌｎｙ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）］。 これらのロイシンジッパーは主にヘテロ二量体を生成するので、所望とあればこ れらのジッパーを使用してヘテロ二量体の生成を促進することができる。ロイシ ンジッパーを用いた前述のキメラタンパク質に関しては、これらを金属キレート 又はエピトープでタッグしてもよい。このタッグしたドメインを使用して金属キ レートクロマトグラフィーで高速精製し及び／又は抗体によりウエスタンブロッ トによる検出、免疫沈殿又はバイオアッセイでの活性欠失／阻止を実施すること ができる。 本発明の他の実施態様では、可撓性リンカーループを用いてキメラ分子として 発現させることによりｓＲα：β１ヘテロ二量体を製造する。キメラタンパク質 をコードするＤＮＡ構築物は、可撓性ループによって縦列に（「ヘッド ツーヘッド」）融合した２つの可溶性又は細胞外ドメインを発現するように設計 されている。このループは完全に人工（例えば一定の間隔をあけてセリン又はト レオニンによって遮断されたポリグリシンリピート）であってもよいし、天然タ ンパク質から「借用（ｂｏｒｒｏｗｅｄ）」したもの（例えばｈｉｇＧのヒンジ 領域）であってもよい。融合した可溶性又は細胞外ドメインの順序が切り換わっ た分子（例えばｓＩＬ６Ｒα／ループ／ｓｇｐ１３０又はｓｇｐ１３０／ループ ／ｓＩＬ６Ｒα）及び／又はループの長さや組成が変化した分子を操作して、所 望の特性を有する分子を選択できるようにしてもよい。 あるいは、本発明で製造したヘテロ二量体を適切なα及びβ成分でコトランス フェクトした細胞系から精製してもよい。当業者に利用可能な方法を用いてヘテ ロ二量体をホモ二量体から分離してもよい。例えば、調製用非変性ポリアクリル アミドゲルから受動溶離させて限定された量のヘテロ二量体を回収してもよい。 あるいは、高圧カチオン交換クロマトグラフィーを用いてヘテロ二量体を精製し てもよい。Ｍｏｎｏ Ｓカチオン交換カラムを用いて優れた精製が行われた。 遊離ＣＮＴＦ又はＩＬ−６と結合することによってアンタゴニストとして作用 するｓＲα：β１ヘテロ二量体の他に、本発明では更に、ＩＬ−６Ｒα及び単一 のｇｐ１３０分子とは結合できるが、第２のｇｐ１３０と結合してβ成分を完全 にホモ二量化することはできず、従って任意のＩＬ−６反応性細胞上で有効なＩ Ｌ−６アンタゴニストとして作用し得る、遺伝子操作によって新たな特性を有す る突然変異型ＩＬ−６の使用を考察する。ＩＬ−６及びＣＮＴＦレセプター錯体 の構造モデルは、これらのサイトカインがα、β１及びβ２レセプター成分との 結合のために異なる部位を有することを示している［Ｓｔａｈｌ及びＹａｎｃｏ ｐｏｕｌｏｓ，Ｃｅｌｌ ７４：５８７−５９０（１９９３）］。これらの部位 の各々を含んでいる重要なアミノ酸残基が突然変異すると、所望のアンタゴニス ト特性を有する新たな分子が生ずる。β１部位を除去すると、αレセプター成分 とは尚結合し得るが、β１成分とは結合せず、従ってナノモルレベルの親和性を 有するアンタゴニストを含む分子が得られる。ＩＬ−６のβ２部位（ＩＬ−６β ２−）を含む主要アミノ酸残基が突然変異すると、ＩＬ−６Ｒα及び第１のｇｐ １３０モノマーには結合するが、第２ のｇｐ１３０とは結合せず、従って機能的に不活性な分子が得られる。同様に、 ＣＮＴＦβ２部位の突然変異では、ＣＮＴＦＲα及びｇｐ１３０とは結合するが ，ＬＩＦＲβとは結合できず、従って非機能的なβ１中間体を生成することによ ってＣＮＴＦ作用と拮抗する分子（ＣＮＴＦβ２−）が得られる。ＣＮＴＦが高 い親和性でもつてβ１中間体を生成する前述の結合結果に基づけば、ＣＮＴＦβ ２−及びＩＬ−６β２−は共に１０ｐＭの範囲の親和性を有するアンタゴニスト となり得る。 種々の手段を使用して、所望の特性を有するＩＬ−６又はＣＮＴＦの突然変異 を生起して同定する。ＩＬ−６又はＣＮＴＦをコードするＤＮＡの標準法による ランダム突然変異生成を使用し、次いで生成物試料を分析して、後述するような 所望される新たな特性を有する突然変異サイトカインを同定してもよい。徹底的 に遺伝子工学による突然変異生成を使用して、組換えタンパク質の機能的ドメイ ンの構造機構を解明した。欠失又は置換突然変異生成の実施については文献に幾 つかの異なる方法が記載されている。最もうまくいったのは、アラニン走査突然 変異生成［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９），Ｓｃｉｅｎ ｃｅ ２４４：１０８１−１０８５］及び相同体走査突然変異生成［Ｃｕｎｎｉ ｎｇｈａｍ等，（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１３３０−１３３６］ であるように思える。 上記方法を用いたＩＬ−６又はＣＮＴＦ核酸配列の標的突然変異生成を使用し て、ＣＮＴＦβ２−又はＩＬ−６β２−候補を生成することができる。標的突然 変異生成に適した領域の選択は系統的に実施するか又は各因子に対するモノクロ ーナル抗体のパネルを使用して、サイトカインが前述のαレセプター成分だけ又 はαβ１ヘテロ二量体可溶性レセプターに結合した後に暴露され得るサイトカイ ンの領域をマッピングする研究から決定される。同様に、サイトカインのみの又 は前述のαレセプター成分もしくはαβ１ヘテロ二量体可溶性レセプターに結合 した錯体内での化学修飾又は限定タンパク質加水分解を行い、次いで保護領域及 び暴露領域を分析すると潜在的なβ２結合部位が判明し得る。 所望の特性を備えたＣＮＴＦ又はＩＬ−６突然変異体の同定アッセイは、適切 に反応性の細胞系でのＩＬ−６又はＣＮＴＦの作用を高い親和性でもって阻止す る能力を必要 とする［Ｄａｖｉｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７３６−１７３９（１９９ ３）；Ｍｕｒａｋａｍｉ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１３４９−１１３５３（１９９１）］。このようなアッセイは、ＣＮＴ Ｆ又はＩＬ−６によって駆動される細胞増殖、残存もしくはＤＮＡ合成、又は因 子の結合がＣＡＴもしくはβ−ガラクトシダーゼのようなリポーターの生成を誘 発する細胞系の構築を含んでいる［Ｓａｖｉｎｏ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４０６７−４０７１（１９９３）］。 あるいは、種々の突然変異体の特性をレセプターをベースとするアッセイで評 価してもよい。このような−アッセイは、エピトープでタッグした［Ｄａｖｉｓ 等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５９−６３（１９９１）］ｓＲα：β１試薬を用 いて、前述のｓＲα：β１レセプターヘテロ二量体との結合能力について突然変 異体をスクリーニングすることからなる。更には、エピトープでタッグした可溶 性β２試薬がα：β１ヘテロ二量体の存在下でサイトカインに結合するかどうか を評価することによってβ２部位の存在又は不在をプロービングすることができ る。例えば、ＣＮ ＴＦは、ＣＮＴＦＲα及びｇｐ１３０の両方の存在下ではＬＩＦＲβ（β２成分 ）だけに結合する［Ｄａｖｉｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１８０５−１８０ ８（１９９３）；Ｓｔａｈｌ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７６２８− ７６３１（１９９３）］。従って、可溶性ＬＩＦＲβ試薬は可溶性ｓＲα：β１ 二量体ｓＣＮＴＦＲα：β１の存在下ではＣＮＴＦだけに結合する。ＩＬ−６の 場合、ｓＲα：β１試薬はＩＬ−６Ｒα：β１であり、β２部位のプローブはエ ピトープでタッグしたｓｇｐ１３０である。従って、ＣＮＴＦのβ２突然変異体 はｓＲα：β１試薬と結合したものとして同定され、このことからサイトカイン のα及びβ１部位がインタクトであり、尚β２試薬とは結合できなかったことが 分かる。 更には、本発明は，Ｊａｋ１、Ｊａｋ２及びＴｙｋ２もしくは他の任意のシグ ナル変換成分（例えばＣＮＴＦ族サイトカインのメンバーに応答してリン酸化さ れるように決定されるＣＬＩＰ）からなる群の中から選択されたシグナル変換成 分又はβレセプター成分のリン酸化を測定することによって潜在的なβ２突然変 異体を検出又は測定する方法を提供する。 本明細書に記載するシグナル変換成分を発現する細胞は天然であっても遺伝子 操作されたものでもよい。例えば、Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ等，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ． ７０：３１３−３２２（１９９２）に記載の方法で得られたＪａｋ１及びＴｙｋ ２をコードする核酸配列を、当業者に公知の任意の方法を用いて、形質導入、ト ランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションによ り遺伝子導入動物等を介して細胞内に導入することができる。 本発明によれば、細胞を潜在的なアンタゴニストに暴露し、β成分又はシグナ ル変換成分のチロシンリン酸化を、潜在的なアンタゴニストの不在下での同一成 分のチロシンリン酸化と比較する。 本発明の他の実施態様では、前記細胞と潜在的なアンタゴニストとの接触によ り生じたチロシンリン酸化を、親ＣＮＴＦ族メンバーに暴露した同一細胞のチロ シンリン酸化と比較する。このようなアッセイでは、細胞は細胞外レセプター（ α成分）を発現しなければならないか又は細胞を可溶性レセプター成分の存在下 でテスト試薬に暴露してもよい。従って例えばＣＮＴＦのアゴニスト又はアンタ ゴニストを同定するように設計されたアッセイ系では、細胞は α成分ＣＮＴＦＲα、β成分ｇｐ１３０、ＬＩＦＲβ、及びシグナル変換成分（ 例えばＪａｋ１）を発現し得る。細胞をテスト試薬に暴露し、β成分又はシグナ ル変換成分のチロシンリン酸化をＣＮＴＦの存在下で生じたリン酸化パターンと 比較する。あるいは、テスト試薬への暴露によって生ずるチロシンリン酸化をテ スト試薬の不在下で生ずるリン酸化と比較する。あるいは、例えばＩＬ−６用ア ッセイ系は、β成分ｇｐ１３０及びシグナル変換タンパク質（例えばＪａｋ１、 Ｊａｋ２又はＴｙｋ２）を発現する細胞を可溶性ＩＬ−６レセプターと共にテス ト試薬に暴露することからなり得る。 本発明の他の実施態様では、前述の方法を使用して、リガンド結合、レセプタ ー錯体形成及びその後のシグナル変換のプロセスの種々のステップで作用する小 分子アンタゴニストのスクリーニング方法を開発する。前述したような可溶性レ セプターとリガンドとの錯体形成への干渉を評価することによって、潜在的にリ ガンド−レセプター相互作用に干渉する分子をスクリーニングする。あるいは、 ＩＬ−６又はＣＮＴＦでリポーター遺伝子の応答を誘発する細胞ベースのアッセ イを小分子又は天然生成物のライブラリ ーに対してスクリーニングして、潜在的なアンタゴニストを同定する。アンタゴ ニスト活性を示すこれらの分子を、他の因子（例えばＧＭＣＳＦ又はレセプター のチロシンキナーゼを活性するニューロトロフィン−３のような因子）に応答す る細胞ベースのアッセイで再度スクリーニングして、ＣＮＴＦ／ＩＬ−６／ＯＳ Ｍ／ＬＩＦ族因子に対する特異性を評価する。このような細胞ベースのスクリー ンを使用して、シグナル変換法で多数の標的のいずれかを阻害するアンタゴニス トを同定する。 このような一アッセイ系では、アンタゴニストに特異的な標的はＪａｋ／Ｔｙ ｋ族キナーゼ［Ｆｉｒｍｂａｃｈ−Ｋｒａｆｔ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ５：１３２ ９−１３３６（１９９０）；Ｗｉｌｋｓ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１ ：２０５７−２０６５（１９９１）］とレセプターβサブユニットとの相互作用 である。前述のように、ＬＩＦＲβ及びｇｐ１３０は、リガンドで誘導されるβ 成分の二量体化に応答して活性化したＪａｋ／Ｔｙｋ族細胞質タンパク質チロシ ンキナーゼのメンバーと予め会合する（Ｓｔａｈｌ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（提出； １９９３））。従って、細胞の細胞質内に進入してβ成分とＪａｋ／Ｔｙ ｋキナーゼとの相互作用を破壊し得る小分子は、その後の全ての細胞内シグナル 化を潜在的に阻止し得た。このような活性は、精製β成分及びＪａｋ／Ｔｙｋキ ナーゼの関連結合ドメイン間の相互作用に対する小分子の阻止能力を評価するｉ ｎｖｉｔｒｏ図式でスクリーニングできた。あるいは、２ハイブリッド相互作用 系を用いて、Ｊａｋ／Ｔｙｋキナーゼに結合するβ成分の酵母ベースアッセイを 阻害し得る分子を容易にスクリーニングすることができた［Ｃｈｉｅｎ等，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：９５７８−９５８２（１９９１）］ 。このような系では、２種のタンパク質（この例ではβ成分とＪａｋ／Ｔｙｋキ ナーゼ又はその関連ドメイン）の相互作用は、β−ガラクトシダーゼのような好 都合なマーカーの生成をもたらす。小分子試料で、２種の対照タンパク質問の相 互作用を阻害せずに所望の相互作用を破壊させる能力を試験する。このスクリー ンの利点は、β成分とＪａｋ／Ｔｙｋキナーゼとの相互作用を阻害する前に試験 化合物が細胞内に進入するという要件である。 本明細書に記載するＣＮＴＦ族アンタゴニストはサイトカインＣＮＴＦ及びＩ Ｌ−６と結合するか又はこれらと競 合する。従って、これらは、ＣＮＴＦ又はＩＬ−６によって媒介された疾病又は 障害の治療に有用である。例えばＩＬ−６アンタゴニストの治療的使用には以下 のものが含まれる： １）閉経後の女性又は卵巣摘出によりエストロゲンレベルが低下して病状が悪 化し得る骨粗鬆症では、ＩＬ−６が破骨細胞形成の重要なメディエーターとなっ て骨吸収を生じるように思える［Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：６ ２６−６２７（１９９３）；Ｊｉｌｋａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：８８−９ １（１９９２）］。重要なことであるが，ＩＬ−６は単にエストロゲン欠失状態 で重要な役割を果たすように思え、一見したところ正常な骨維持への関与は最低 限である。これに対応して、実験証拠は、機能を阻止するＩＬ−６抗体が破骨細 胞数を減少させ得ることを示している［Ｊｉｌｋａ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７ ：８８−９１（１９９２）］。エストロゲン置換治療も使用されるが、副作用が あるように思える。この副作用には子宮内膜癌や乳癌の危険性増加が含まれ得る 。従って、本明細書に記載するようなＩＬ−６アンタゴニストは、破骨細胞形成 を正常レベルまで下げるのにより特異的である。 ２）ＩＬ−６は細胞自身に作用する様式（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ｆａｓｈｉｏ ｎ）又は隣接する細胞に作用する様式（ｐａｒａｃｒ−ｉｎｅ ｆａｓｈｉｏｎ ）で作用して腫瘍形成を促進することによって多発性骨髄腫に直接関与するよう に思える［Ｖａｎ Ｏｅｒｓ等，Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．６６：２１９−２２ ３（１９９３）］。更には、Ｉｌ−６レベルが上がると、骨吸収、カルシウム過 剰血症及びカヘキシーのような望ましくない二次作用が生じる。限定された研究 では、機能を阻害するＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒα抗体がある程度効力を有する［ Ｋｌｅｉｎ等，Ｂｌｏｏｄ ７８：１１９８−１２０４（１９９１）；Ｓｕｚｕ ｋｉ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１９８９−１９９３（１９９２） ］。従って、本明細書に記載するようなＩＬ−６アンタゴニストは、二次作用及 び腫瘍増殖阻害の両方に有益であろう。 ３）ＩＬ−６は、恐らくは脂肪組織のリポタンパク質リパーゼ活性を抑制する ことによって［Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２ ：４１１３−４１１６（１９９２）］、エイズや癌に関連するカヘキシーを生ず る腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のメディエーターとな り得る［Ｓｔｒａｓｓｍａｎｎ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１６８ １−１６８４（１９９２）］。従って、本明細書に記載のアンタゴニストはこの ような患者でカヘキシーを緩和又は抑制するのに有用であろう。 これらの又は他のＣＮＴＦ族関連疾病又は障害の治療に有用な有効用量は当業 者に公知の方法を用いて決定され得る［例えばＦｉｎｇｌ等，Ｔｈｅ Ｐｈａｒ ｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏ ｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ編，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−４６（１９７５）を参照されたい］。本 発明で使用する医薬組成物は、薬理学的に許容可能な液体、固体又は半固体のキ ャリヤー中に前述のアンタゴニストを含み、該アンタゴニストがキャリヤー又は 標的分子（例えば抗体、ホルモン、成長因子等）に結合し及び／又はｉｎ ｖｉ ｖｏ投与される前にリポソーム、マイクロカプセル及び徐放製剤（アンタゴニス ト発現細胞を含む）内に取り込まれる。例えば、医薬組成物は滅菌水、食塩水、 リン酸緩衝液又はデキストロース溶液のような水溶液中に１種以上のアンタゴニ ストを含み得る。あるいは、活性剤を固体（例えばろ う）又は半固体（例えばゼラチン状）処方物中に含ませて、上記治療を必要とす る患者に移植してもよい。投与経路は静脈内、鞘内、皮下、関連組織内への注射 、動脈内、鼻腔内、経口又は移植装置利用を非制限的に含む当業界で公知の任意 の投与方法であり得る。 投与によって本発明の活性剤は全身に又は局限された部位に分散し得る。例え ば神経系の遠位領域に関連するある症状では、薬剤の静脈内又は鞘内投与が所望 され得る。状況によっては、活性剤を含むインプラントを障害区域内又はその付 近に置くことができる。適切なインプラントは非制限的ではあるが、ジェルフォ ーム、ろう又は微粒子ベースのインプラントを含む。 実施例１：ＣＮＴＦはＧＰ１３０との結合に対してＩＬ−６と競合する 材料及び方法 材料 ＩＬ−６に応答するＰＣ１２細胞のクローン（ＰＣ１２Ｄ）をＤＮＡＸ から入手した。ラットＣＮＴＦを文献に記載の方法［Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ等 ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５７：１００３−１００１２（１９９１）］ で製造した。ＩＬ−６及びｓＩＬ−６ＲはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した 。文献に記載の方法（Ｓｔａｈｌ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７６２ ８−７６３１（１９９３））によって、ｇｐ１３０のＣ末端付近の領域に由来す るペプチド（配列：ＣＧＴＥＧＱＶＥＲＦＥＴＶＧＭＥ）［配列番号２］に対す る抗血清をウサギで産生した。抗ホスホチロシンモノクローナル４Ｇ１０はＵＢ Ｉから購入し、ＥＣＬ用試薬はＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。 シグナル変換アッセイ ＰＣ１２Ｄのプレート（１０ｃｍ）を無血清培地（Ｒ ＰＭＩ １６４０＋グルタミン）中に１時間放置し、次いでラットＣＮＴＦを規 定濃度で添加するか又は添加せずにＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍＬ）＋ｓＩＬ−６Ｒ （１μｇ／ｍＬ）と共に３７℃で５分間インキュベートした。次いで、試料を前 述したような抗ｇｐ−１３０免疫沈殿、ＳＤＳ ＰＡＧＥ及び抗ホスホチロシン イムノブロッティングに付した（Ｓｔａｈｌ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６ ８：７６２８−７６３１（１９９３））。 結果 ＬＩＦＲβではなく、ＩＬ−６Ｒα，ｇｐ１３０及びＣＮＴＦＲαを発現する ＰＣ１２細胞系（ＰＣ１２Ｄと称す る）を用いて、ＣＮＴＦが有するＩＬ−６応答阻害能力を調べた。ＬＩＦＲβは ＣＮＴＦシグナル変換に必要な成分なので、予測通り、これらの細胞はＣＮＴＦ ではなく、ＩＬ−６に応答する（図２）［Ｄａｖｉｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６ ０：５９−６３（１９９３）］。他の細胞系の結果によれば［Ｉｐ等，Ｃｅｌｌ ６９：１１２１−１１３２（１９９２）］、ＰＣ１２Ｄ細胞は２ｎＭ ＩＬ− ６に応答してｇｐ１３０（及びＣＬＩＰと称する他の種々のタンパク質）のチロ シンリン酸化を生ずる（図２）。他の系でも報告されているように、組換え可溶 性ＩＬ−６Ｒα（ｓＩＬ−６Ｒα）を加えると、ｇｐ１３０チロシンリン酸化の レベルが高まる［Ｔａｇａ等，Ｃｅｌｌ ５８：５７３−５８１（１９８９）］ 。しかしながら、２ｎＭ ＣＮＴＦをＩＬ−６と同時に添加すると、ｇｐ１３０ のチロシンリン酸化が大幅に減少する。ＣＮＴＦ、ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒα の存在下では僅かなｇｐ１３０リン酸化応答が残存するが、ＣＮＴＦ濃度が４倍 に増して８ｎＭになると、この応答は除去される。従って、ＬＩＦＲβではなく ＣＮＴＦＲαを含むＩＬ−６応答性細胞では、ＣＮＴＦはＩＬ−６作用のかなり 強力なアンタゴニストである。 実施例２：ＣＮＴＦのＣＮＴＦＲα：βとの結合 材料及び方法 ＣＮＴＦ結合のスキャッチャード分析 文献に記載の方法［Ｓｔａｈｌ等，Ｊ ＢＣ ２６８：７６２８−７６３１（１９９３）］で¹²⁵Ｉ−ＣＮＴＦを製造し て精製した。２０ｐＭから１０ｎＭの範囲の¹²⁵Ｉ−ＣＮＴＦ濃度を用いて、Ｐ Ｃ１２細胞で飽和結合研究を実施した。単層細胞上で結合を直接実施した。ウェ ルから培地を除去し、細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）、０． １ｍＭのバシトラシン、１ｍＭのＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１ ｍｇ／ｍｌのＢＳＡからなるアッセイ緩衝液で１回洗浄した。¹²⁵Ｉ−ＣＮＴＦ 中で細胞を室温で２時間インキュベートし、次いでアッセイ緩衝液で２度素早く 洗浄した。細胞を、１％ＳＤＳを含むＰＢＳで溶解し、９０〜９５％の効率でＰ ａｃｋａｒｄ γカウンターでカウントした。非特異結合は１００倍過剰の非標 識ＣＮＴＦの存在によって規定された。特異結合は７０％〜９５％であった。 結果 ＰＣ１２Ｄ細胞上でのヨウ素化ＣＮＴＦ結合のスキャッ チャード分析から、ＣＮＴＦのＣＮＴＦＲα：β１との結合の平衡定数を推定し た（図３）。データは９ｐＭ及び３．４ｎＭの解離定数を有する２部位適応（ｓ ｉｔｅ ｆｉｔｏ）と一致する。低親和性部位はＣＮＴＦとＣＮＴＦＲαとの相 互作用に対応し、３ｎＭ付近にＫｄを有する［Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ等，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９０００−１９００３（１９９３）］。高親和 性錯体は、ＣＮＴＦ、ＣＮＴＦＲα及びｇｐ１３０を含む中間体として解釈され る。ＣＮＴＦＲα、ｇｐ１３０及びＬＩＦＲβを含み、従ってＣＮＴＦに応答し て活発なチロシンリン酸化を生ずるユーイング肉腫細胞系（ＥＷ−１）は、１ｎ Ｍ及び１０ｐＭの解離定数を有する非常に類似した２部位適応を示す（Ｗｏｎｇ 等、非公開データ）。従って、ＣＮＴＦは、ＣＮＴＦＲαやｇｐ１３０の他にＬ ＩＦＲβを含んでいる錯体と結合するので、ＣＮＴＦＲαやｇｐ１３０だけを含 む錯体とも同様の高い親和性でもって結合することは明白であり、かくして本明 細書に記載のｓＲα：βアンタゴニストの生成の可能性は実証される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年１１月２４日 【補正内容】 ３４条補正 請求の範囲 １．サイトカインと結合して非機能的な錯体を形成し得るサイトカインアンタゴ ニストタンパク質であって、アンタゴニストが （ａ）サイトカインレセプターの可溶性α特異性決定成分と、 （ｂ）サイトカインレセプターのβ成分の細胞外ドメイン とを含んでなる前記タンパク質。 ２．サイトカインがＣＮＴＦ族サイトカインのメンバーである請求項１に記載の タンパク質。 ３．細胞外ドメイン（ｂ）がｇｐ１３０の細胞外ドメインである請求項１又は２ に記載のタンパク質。 ４．細胞外ドメイン（ｂ）がＬＩＦＲβの細胞外ドメインである請求項１又は２ に記載のタンパク質。 ５．サイトカインがＣＮＴＦであり、α成分（ａ）がｓＣＮＴＦＲαであり、細 胞外ドメイン（ｂ）がｇｐ１３０の細胞外ドメインである請求項２又は３に記載 のタンパク質。 ６．サイトカインがＩＬ−６であり、α成分（ａ）がｓＩＬ−６Ｒαであり、細 胞外ドメイン（ｂ）がｇｐ１３０の 細胞外ドメインである請求項２又は３に記載のタンパク質。 ７．ＩＬ−６がＩＬ−６Ｒα及び第１のｇｐ１３０分子と錯体形成するときにＩ Ｌ−６を第２のｇｐ１３０分子とは結合できないようにするβ２’突然変異を含 んでいるＩＬ−６タンパク質。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＥＫ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＫ Ｃ０７Ｋ 7/06 ＡＤＴ 14/52 ＡＢＪ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ ＡＤＦ Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＷ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＢＥ，ＨＵ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 エコノミデス，アリス アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10025、 ニユー・ヨーク、ウエスト・ナインテイ・ シツクスス・ストリート・150、アパート メント・11・イー (72)発明者 ヤンコポーラス，ジヨージ・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10598、 ヨークタウン・ハイツ、バプチスト・チヤ ーチ・ロード・1519

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サイトカインレセプターの可溶性α特異性決定成分とサイトカインレセプタ ーの可溶性β１成分とを含んでなるｓＲα：β１ヘテロ二量体タンパク質。 ２．サイトカインがＣＮＴＦ族サイトカインのメンバーである請求項１に記載の タンパク質。 ３．前記β１レセプターがｇｐ１３０である請求項１に記載のタンパク質。 ４．前記β１レセプターがＬＩＦＲβである請求項１に記載のタンパク質。 ５．サイトカインがＣＮＴＦであり、前記αレセプターがｓＣＮＴＦＲαであり 、前記β１レセプターがｇｐ１３０である請求項２に記載のタンパク質。 ６．サイトカインがＩＬ−６であり、前記αレセプターがｓＩＬ−６Ｒαであり 、前記β１レセプターがｇｐ１３０である請求項２に記載のタンパク質。 ７．前記ＩＬ−６がＩＬ−６Ｒα及び第１のｇｐ１３０分子と錯体形成するとき に第２のｇｐ１３０分子とは結合できないようにするβ２突然変異を含むＩＬ− ６タンパク質。 ８．前記ＣＮＴＦがＣＮＴＦＲα及びｇｐ１３０と錯体形 成するときにＬＩＦＲβとは結合できないようにするβ２突然変異を含むＣＮＴ Ｆタンパク質。 ９．１）ＩＬ−６産生クローンを製造し； ２）ランダム又は標的突然変異生成を用いて上記クローンを突然変異させて突然 変異体ＩＬ−６を発現するサブクローンを産生し； ３）サブクローンによって産生された突然変異体ＩＬ−６分子を回収し； ４）ＩＬ−６Ｒα及び第１のｇｐ１３０分子と錯体形成したときに第２のｇｐ１ ３０とは結合し得ない突然変異ＩＬ−６分子をＩＬ−６アンタゴニストとして同 定する ことからなるＩＬ−６アンタゴニストの単離方法。 １０．前記同定が、 ｉ）突然変異ＩＬ−６分子にＩＬ−６Ｒα：β１ヘテロ二量体を加えてＩＬ−６ ／ＩＬ−６Ｒα：β１中間体を形成し； ii）前記中間体に検出可能ｇｐ１３０を加えてＩＬ−６：ＩＬ−６Ｒα：β１： β２錯体を形成し； iii）ＩＬ−６：ＩＬ−６Ｒα：β１：β２錯体中の検出可能ｇｐ１３０の量を 測定することによって前記検出可能ｇ ｐ１３０と前記ＩＬ−６／αβ１中間体との結合を調べることからなる請求項９ に記載の方法。 １１．１）ＩＬ−６産生クローンを製造し； ２）ランダム又は標的突然変異生成を用いて上記クローンを突然変異させて突然 変異体ＩＬ−６を発現するサブクローンを産生し； ３）突然変異ＩＬ−６分子を発現し； ４）前記突然変異ＩＬ−６分子をＩＬ−６Ｒαと合わせてＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ α錯体を形成し； ５）前記ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα錯体に検出可能ｇｐ１３０を加え； ６）前記ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒα錯体中に存在するときに前記検出可能ｇｐ１３ ０とは結合し得ない前記突然変異ＩＬ−６分子をＩＬ−６アンタゴニストとして 同定する ことからなるＩＬ−６アンタゴニストの単離方法。 １２．１）ＣＮＴＦ産生クローンを製造し； ２）ランダム又は標的突然変異生成を用いて上記クローンを突然変異させて突然 変異体ＣＮＴＦを発現するサブクローンを産生し； ３）サブクローンによって産生された突然変異体ＣＮＴＦ 分子を回収し； ４）ＣＮＴＦＲα及びｇｐ１３０と錯体形成したときにＬＩＦＲβとは結合し得 ない突然変異ＣＮＴＦ分子をＣＮＴＦアンタゴニストとして同定する ことからなるＣＮＴＦアンタゴニストの単離方法。 １３．前記同定が、 ｉ）突然変異ＣＮＴＦ分子にＣＮＴＦＲα：β１ヘテロ二量体を加えてＣＮＴＦ ／ＣＮＴＦＲα：β１中間体を形成し； ii）前記中間体に検出可能ＬＩＦＲβを加えてＣＮＴＦ：ＣＮＴＦＲα：β１： β２錯体を形成し； iii）ＣＮＴＦ：ＣＮＴＦＲα：β１：β２錯体中の検出可能ＬＩＦＲβの量を 測定することによって前記検出可能ＬＩＦＲβと前記ＣＮＴＦ／αβ１中間体と の結合を調べることからなる請求項１２に記載の方法。 １４．１）ＣＮＴＦ産生クローンを製造し； ２）ランダム又は標的突然変異生成を用いて上記クローンを突然変異させて突然 変異体ＣＮＴＦを発現するサブクローンを産生し； ３）突然変異ＣＮＴＦ分子を発現し； ４）前記突然変異ＣＮＴＦ分子をＣＮＴＦＲαと合わせてＣＮＴＦ／ＣＮＴＦＲ α錯体を形成し； ５）前記ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦＲα錯体に検出可能ｇｐ１３０を加え； ６）前記ＣＮＴＦ／ＣＮＴＦＲα錯体中に存在するときに前記検出可能ｇｐ１３ ０とは結合し得ないＣＮＴＦ分子をＣＮＴＦアンタゴニストとして同定する ことからなるＣＮＴＦアンタゴニストの単離方法。 １５．請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ配 列。 １６．上記で特記した請求項１、７及び８のいずれか一項に記載のタンパク質。 １７．請求項１から８及び１６のいずれか一項に記載のタンパク質と医薬的に許 容可能なキャリヤーとを含んでなる医薬組成物。 １８．請求項６又は７に記載のタンパク質と医薬的に許容可能なキャリヤーとを 含んでなるＩＬ−６関連疾病又は障害の治療用医薬組成物。 １９．エストロゲン欠失患者の骨粗鬆症の治療方法で使用するための請求項６又 は７に記載のタンパク質。 ２０．患者の多発性骨髄腫の治療方法で使用するための請求項６又は７に記載の タンパク質。 ２１．患者のカヘキシーの治療方法で使用するための請求項６又は７に記載のタ ンパク質。