ES2139759T5 - Antagonistas de citoquina. - Google Patents
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Abstract
PROTEINAS HETERODIMERICAS QUE COMPRENDEN UNA ESPECIFICIDAD {AL} SOLUBLE QUE DETERMINA UN COMPONENTE RECEPTOR DE LA CITOQUINA, Y EL DOMINIO EXTRACELULAR DE UN COMPONENTE {BE}-RECEPTOR Y QUE FUNCIONAN COMO ANTAGONISTAS DEL CNTF Y DE IL-6.
Description
Antagonistas de citoquina.
Aunque descubiertos por actividades biológicas
variables, el factor neurotrófico ciliar (CNTF; del inglés,
ciliary neurotrophic factor), el factor
inhibidor de la leucemia (LIF; del inglés, leukemia
inhibitory factor), la oncostatina M (OSM) y la
interleuquina 6 (Il-6) comprenden una familia de
citoquinas recién definida (aquí denominada "familia CNTF" de
citoquinas). Estas citoquinas están conjuntamente agrupadas a causa
de sus lejanas similitudes estructurales [Bazan, J. Neuron 7:
197-208 (1991); Rose y Bruce, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88: 8.641-8.645 (1991)] y, quizás más
importantemente, a causa de que comparten componentes \beta del
receptor, transductores de señales [Baumann et al., J. Biol.
Chem. 265: 19.853-19.862 (1993); Davis et
al., Science 260: 1.805-1.808 (1993); Gearing
et al., Science 255: 1.434-1.437 (1992); Ip
et al., Cell 69: 1.121-1.132 (1992); Stahl
et al., J. Biol. Chem. 268: 7.628-7.631
(1993); Stahl y Yancopoulos, Cell 74: 587-590
(1993)]. La activación de receptores por esta familia de citoquinas
es el resultado de la homodimerización o heterodimerización de
estos componentes \beta [Davis et al., Science 260:
1.805-1.808 (1993); Murakami et al., Science
260: 1.808-1.810 (1993); Stahl y Yancopoulos, Cell
74: 587-590 (1993)]. La activación del receptor de
IL-6 requiere la homodimerización de gp130
[Murakami et al., Science 260: 1.808-1.810
(1993); Hibi et al., Cell 63: 1.149-1.157
(1990)], una proteína inicialmente identificada como el transductor
de la señal de Il-6 [Hibi et al., Cell 63:
1.149-1.157 (1990)]. La activación de los receptores
de CNTF, LIF y OSM es el resultado de la heterodimerización entre
gp130 y una segunda proteína relacionada con gp130, conocida como
LIFR\beta [Davis et al., Science 260:
1.805-1.808 (1993)], que fue inicialmente
identificada por su capacidad para unirse a LIF [Gearing et al.,
EMBO J. 10: 2.839-2.848 (1991)].
Además de los componentes \beta, algunas de
estas citoquinas requieren también componentes "\alpha"
determinantes de la especificidad que están más limitados que los
componentes \beta en cuanto a su distribución tisular y, por lo
tanto, determinan las dianas celulares de las citoquinas
particulares [Stahl y Yancopoulos, Cell 74: 587-590
(1993)]. De este modo, LIF y OSM son factores de amplia acción que
puede que sólo requieran la presencia de gp130 y LIFR\beta en las
células sensibles, mientras que CNTF requiere CNTFR\alpha [Stahl
y Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)] e
Il-6 requiere Il-6R\alpha
[Kishimoto et al., Science 258: 593-597
(1992)]. Tanto CNTFR\alpha [Davis et al., Science 259:
1.736-1.739 (1993)] como
Il-6R\alpha [Hibi et al., Cell 63:
1.149-1.157 (1990); Murakami et al., Science
260: 1.808-1.810 (1990); Taga et al., Cell
58: 573-581 (1989)] pueden actuar como proteínas
solubles, lo que es consistente con la idea de que no interaccionan
con moléculas generadoras de señales intracelulares sino que sirven
para ayudar a sus ligandos a interaccionar con las apropiadas
subunidades \beta transductoras de señales [Stahl y Yancopoulos,
Cell 74: 587-590 (1993)].
Evidencia adicional procedente de otros sistemas
citoquínicos apoya también la idea de que la dimerización
proporciona un mecanismo común mediante el cual todos los receptores
citoquínicos inician la transducción de señales. La hormona del
crecimiento (GH; del inglés, growth hormone) quizás sirva como el
mejor ejemplo a este respecto. Estudios cristalográficos han
revelado que cada molécula de GH contiene dos diferentes sitios de
unión al receptor, siendo ambos reconocidos por el mismo dominio de
unión del receptor, lo que permite que una sola molécula de GH se
acople con dos moléculas de receptor [de Vos et al., Science
255: 306-312 (1992)]. La dimerización se produce
secuencialmente, uniéndose primero el sitio 1 de la GH a una
molécula de receptor y uniéndose luego el sitio 2 a una segunda
molécula de receptor [Fuh et al., Science 256:
1.677-1.680 (1992)]. Los estudios con el receptor
de la eritropoyetina (EPO) son también consistentes con la
importancia de la dimerización en la activación de receptores, ya
que los receptores de la EPO pueden ser constitutivamente activados
mediante el cambio de un único aminoácido que introduce un resto de
cisteína y da lugar a homodímeros enlazados por disulfuro [Watowich
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
2.140-2.144 (1992)].
Además de la homodimerización o
heterodimerización de subunidades \beta como etapa crítica para la
activación de los receptores, una segunda característica importante
es que la formación del complejo final del receptor por la familia
CNTF de citoquinas se produce a través de un mecanismo por el que el
ligando se une sucesivamente a componentes del receptor de una
manera ordenada [Davis et al., Science 260:
1.805-1.818 (1993); Stahl y Yancopoulos, Cell 74:
587-590 (1993)]. De este modo, el CNTF se une
primero a CNTFR\alpha, formando un complejo que se une luego a
gp130 para formar un compuesto intermedio (llamado aquí el compuesto
intermedio \alpha\beta1) que no es competente en cuanto a
generar señales porque sólo tiene un único componente \beta, antes
de capturar finalmente LIFR\beta para formar un heterodímero de
componentes \beta que inicia entonces la transducción de señales.
Aunque no se ha aislado directamente un compuesto intermedio similar
que contenga Il-6 unida a
Il-6R\alpha y a una sola molécula de gp130, se ha
considerado aquí el postulado de que existe por analogía con su
lejano compuesto relacionado, el CNTF, así como por el hecho de que
el complejo final activo del receptor de Il-6
captura dos monómeros de gp130. En conjunto, estos hallazgos
condujeron a la propuesta de la estructura de un complejo genérico
del receptor de citoquinas (Figura 1) en que cada citoquina puede
tener hasta 3 sitios de unión al receptor: un sitio que se une a un
componente \alpha opcional determinante de la especificidad
(sitio \alpha), un sitio que se une al primer componente \beta
transductor de señales (sitio \beta1) y un sitio que se une al
segundo componente \beta transductor de señales (sitio \beta2)
[Stahl y Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)].
Estos 3 sitios se utilizan de un modo secuencial, siendo la última
etapa de la formación del complejo, la que da lugar a la
dimerización de los componentes \beta, crítica para que se inicie
la transducción de señales [Davis et al., Science 260:
1.805-1.818 (1993)].
Una vez que la unión de la citoquina provoca la
formación del complejo del receptor, la dimerización de los
componentes \beta activa la actividad tirosina quinasa
intracelular que da lugar a la fosforilación de una gran variedad
de sustratos [Ip et al., Cell 69: 121-1.132
(1992)]. Parece que esta activación de la tirosina quinasa es
crítica para sucesos aguas abajo, ya que inhibidores que bloquean
las fosforilaciones de tirosinas también impiden sucesos
posteriores tales como inducciones génicas [Ip et al., Cell
69: 121-1.132 (1992); Nakajima y Wall, Mol. Cell.
Biol. 11: 1.409-1.418 (1991)]. Recientemente se ha
demostrado que tirosina quinasas no pertenecientes a receptores
recién descubiertas, que componen una familia que incluye Jak1, Jak2
y Tyk2 (denominadas quinasas Jak/Tyk)
[Firmbach-Kraft et al., Oncogene 5:
1.329-1.336 (1990); Wilks et al., Mol. Cell.
Biol. 11: 2.057-2.065 (1991)] y que están implicadas
en la transducción de señales con otras citoquinas [Cell 74:
237-244 (1993); Silvennoinen et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (en prensa; 1993); Velázquez et al., Cell 70:
313-322 (1992); Witthuhn et al., Cell 74:
227-236 (1993)], se preasocian con los dominios
citoplásmicos de las subunidades \beta gp130 y LIFR\beta en
ausencia del ligando y llegan a
tirosina-fosforilarse y a activarse tras la adición
del ligando [Stahl et al., Science (presentado; 1993)]. Por
lo tanto, parece que estas quinasas son la etapa más próxima a la
transducción intracelular de señales que se activa dentro de la
célula como resultado de la unión del ligando fuera de la célula.
Más adelante se describen sistemas de ensayo para analizar
colecciones de pequeñas moléculas en cuanto a sus actividades
agonistas o antagonistas específicas basadas en este sistema.
Además, Brakenhoff et al. (Cytokine,
volumen 3, nº 5, página 496, resumen 279) han identificado dos
regiones de la molécula de Il-6 que son importantes
para su bioactividad y son reconocidas por dos grupos (I y II) de
anticuerpos monoclonales (mAb; del inglés, monoclonal Antibody)
neutralizantes. Brakenhoff et al. hallaron que el sitio I
(reconocido por mAbs del grupo I) estaba implicado en la unión a la
cadena de 80 kDa del receptor de Il-6, mientras que
el grupo II está implicado en la interacción del complejo
Il-6/80 kDa con la cadena gp130 transductora de
señales. Los mAbs del grupo II se unen alrededor del resto Trp 158
de Il-6. Una mutagénesis aleatoria alrededor de Trp
158 dio lugar al aislamiento de diversos mutantes que se unían a
mAbs del grupo I pero no a mAbs del grupo II y que eran
biológicamente activos según mediciones en un ensayo con el
hibridoma B9 murino. Dos de estos mutantes fallaron a la hora de
ocasionar la producción de IgG1 cuando se ensayaron en células CESS
humanas, y uno de estos dos mutantes fue capaz de inhibir la
actividad de la Il-6 de tipo salvaje para generar
IgG1 y también de inhibir la síntesis de fibrinógeno y de inhibidor
de C1, ocasionada por Il-6, en células Hen G2
humanas.
La familia CNTF de citoquinas desempeña
funciones importantes en una gran variedad de procesos fisiológicos
que proporcionan posibles aplicaciones terapéuticas tanto para
antagonistas como para agonistas.
El invento proporciona una proteína antagonista
de citoquinas soluble capaz de unirse a una citoquina para formar
un complejo no funcional, donde la citoquina activa un receptor por
unión primero a un componente \alpha determinante de la
especificidad, seguido de unión a componentes transductores de
señales \beta1 y después \beta2, antagonista el cual es
heterodímero y comprende:
- (a)
- el componente \alpha soluble, determinante de la especificidad, del receptor de la citoquina, y
- (b)
- un dominio extracelular de un componente \beta1 del receptor de la citoquina.
Preferiblemente, la citoquina es
Il-6 o CNTF.
Preferiblemente, el dominio extracelular (b) es
el dominio extracelular de gp130.
Más preferiblemente, la citoquina es CNTF, el
componente \alpha (a) es sCNTFR\alpha, y el dominio extracelular
(b) es el dominio extracelular de gp130; o la citoquina es
Il-6, el componente \alpha (a) es
sIl-6R\alpha, y el dominio extracelular (b) es el
dominio extracelular de gp130.
El invento proporciona también composiciones
farmacéuticas que comprenden una proteína del invento junto con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
El invento proporciona también una proteína del
invento en que la citoquina es Il-6, el componente
\alpha (a) es sIl-6R\alpha, y el dominio
extracelular (b) es el dominio extracelular de gp130, para uso en un
método para tratar un trastorno relacionado con
Il-6, para uso en el tratamiento de la osteoporosis
en un paciente desprovisto de estrógenos, y para uso en el
tratamiento del mieloma múltiple y la caquexia.
Un objeto del presente invento es la producción
de antagonistas de Il-6 que sean útiles en el
tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con
Il-6.
Otro objeto del invento es el uso de los aquí
descritos antagonistas de Il-6 para el tratamiento
de la osteoporosis.
Otro objeto del invento es el uso de los aquí
descritos antagonistas de Il-6 para el tratamiento
de los efectos tanto primarios como secundarios de cánceres,
incluido el mieloma múltiple.
Aún otro objeto del invento es el uso de los
aquí descritos antagonistas de Il-6 para el
tratamiento de la caquexia.
Figura 1: unión ordenada de componentes de
receptores en un modelo de un receptor genérico de citoquinas. El
modelo indica que las citoquinas contienen hasta 3 sitios de unión
al receptor e interaccionan con los componentes de su receptor
uniéndose primero al componente \alpha opcional, luego a \beta1
y después a \beta2. Los componentes \beta de muchos receptores
de citoquinas interaccionan a través de regiones próximas a la
membrana (recuadros sombreados) con la familia Jak/Tyk de tirosina
quinasas citoplásmicas. Sólo se inicia la transducción de señales
tras la dimerización de los componentes \beta, como se esquematiza
por las tirosina-fosforilaciones (P; del inglés,
phosphorylation) de los componentes \beta y de las quinasas
Jak/Tyk.
Figura 2: El CNTF inhibe las respuestas a
Il-6 en una línea celular PC12 (llamada PC12D) que
expresa Il-6R\alpha, gp130 y CNTFR\alpha pero
no LIFR\beta. Células PC12D privadas de suero fueron incubadas +
Il-6 (50 ng/ml) en presencia o ausencia de CNTF,
según se indica. Algunas placas recibieron también
Il-6R\alpha soluble (1 mg/ml) o CNTFR\alpha
soluble (1 mg/ml), según se indica. Se sometieron productos
celulares de lisis a inmunoprecipitación con
anti-gp130 y a inmunotransferencia con
anti-fosfotirosina. La
tirosina-fosforilación de gp130 es indicativa de la
activación del sistema receptor de Il-6 provocada
por Il-6, la cual es bloqueada tras la coadición de
CNTF.
Figura 3: Análisis de Scatchard relativo a la
unión de CNTF yodado a células PC12D. Se incubaron células PC12D
con CNTF yodado, en diversas concentraciones, en presencia o
ausencia de un competidor no radiactivo en exceso para determinar
la unión específica. La Figura muestra una representación de
Scatchard relativa a la cantidad de CNTF yodado específicamente
unido y proporciona datos consistentes con dos sitios de unión con
constantes de disociación de 9 pM y 3,4 nM.
El invento aquí descrito contempla la producción
de antagonistas de cualquier citoquina que utilice un componente
\alpha determinante de la especificidad que, cuando se combina con
la citoquina, se une a un primer componente \beta transductor de
señales con objeto de formar un compuesto intermedio no funcional
que se une luego a un segundo componente \beta transductor de
señales para causar la dimerización de los receptores \beta y la
consiguiente transducción de señales. De acuerdo con el invento, el
componente \alpha soluble, determinante de la especificidad, del
receptor (sR\alpha) y el dominio extracelular del primer
componente \beta transductor de señales del receptor citoquínico
(\beta1) se combinan para formar heterodímeros
(sR\alpha:\beta1) que actúan como antagonistas de la citoquina
al unirse a la citoquina para formar un complejo no funcional.
Como se describe en el Ejemplo 1, CNTF e
Il-6 comparten el componente \beta1 gp130 del
receptor. El hecho de que CNTF forme un compuesto intermedio con
CNTFR\alpha y gp130 puede ser demostrado (Ejemplo 1) en células
que carecen de LIFR\beta, en las que el complejo de CNTF y
CNTFR\alpha se une a gp130 e impide la homodimerización de gp130
por Il-6 e Il-6R\alpha,
bloqueándose de este modo la transducción de señales. Estos estudios
proporcionan la base para el desarrollo de los antagonistas de
Il-6 aquí descritos ya que muestran que si, en
presencia de un ligando, puede formarse un complejo intermedio no
funcional que consista en el ligando, el componente \alpha de su
receptor y el componente \beta1 de su receptor, dicho complejo
bloqueará eficazmente la acción del ligando. Pueden usarse otras
citoquinas distintas de los componentes \beta1 del receptor las
cuales pueden ser también utilizadas para producir antagonistas de
acuerdo con el presente invento.
De este modo, por ejemplo, en una realización
del invento, los antagonistas eficaces de Il-6 o
CNTF consisten en heterodímeros de los dominios extracelulares de
los componentes \alpha, determinantes de la especificidad, de sus
receptores (sIl-6R\alpha y sCNTFR\alpha
respectivamente) y el dominio extracelular de gp130. Los
heterodímeros resultantes, que en adelante son denominados
sIl-6R\alpha:\beta1 y sCNTFR\alpha:\beta1
respectivamente, actúan como trampas de elevada afinidad para
IL-6 o CNTF respectivamente, haciendo por ello que
la citoquina sea inaccesible para formar un complejo transductor de
señales con las formas nativas, unidas a la membrana, de sus
receptores.
Aunque se ha demostrado que dominios solubles de
unión a ligandos, de la porción extracelular de los receptores, son
algo eficaces como trampas para sus ligandos y, por lo tanto, actúan
como antagonistas [Bargetzi et al., Cancer Res. 53:
4.010-4.013 (1993); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
8.616-8.620 (1992); Mohler et al., J.
Immunol. 151: 1.548-1.561 (1993); Narazaki et
al., Blood 82: 1.120-1.126 (1993)], los
receptores de Il-6 y CNTF son peculiares porque los
componentes \alpha del receptor constituyen dominios de unión a
ligandos que, junto con sus ligandos, actúan eficazmente en forma
soluble como agonistas de receptores [Davis et al., Science
259: 1.736-1.739 (1993); Taga et al., Cell
58: 573-581 (1989)]. Los heterodímeros
sR\alpha:\beta1 preparados de acuerdo con el presente invento
proporcionan trampas eficaces para sus ligandos, uniéndose a estos
ligandos con afinidades en el intervalo picomolar (basadas en
estudios de unión de CNTF a células PC12D) sin crear compuestos
intermedios funcionales.
Los dominios extracelulares \alpha y \beta1
del receptor pueden ser preparados usando métodos conocidos por los
expertos en la técnica. El receptor CNTFR\alpha ha sido clonado,
secuenciado y hecho expresar [Davis et al. (1991), Science
253: 59-63; documento que se incorpora aquí en su
totalidad por referencia]. Las clonaciones de LIFR\beta y gp130
son descritas por Gearing et al. en EMBO J. 10:
2.839-2.848 (1991), y por Hibi et al. en
Cell 63: 1.149-1.157 (1990), y en la solicitud PCT
publicada WO 93/10151, publicada el 27 de mayo de 1993,
incorporándose aquí todos los citados documentos en su totalidad por
referencia.
Las moléculas de receptor útiles para llevar el
presente invento a la práctica pueden prepararse por clonación y
expresión en un sistema de expresión procariótico o eucariótico. El
gen recombinante del receptor puede ser hecho expresar y ser
purificado utilizando diversos métodos. El gen que codifica el
factor puede ser subclonado en un vector de expresión bacteriano
tal como, por ejemplo, pero no a modo de limitación, pCP110.
Los factores recombinantes pueden purificarse
mediante cualquier técnica que permita la subsiguiente formación de
una proteína estable y biológicamente activa. Por ejemplo, y no a
modo de limitación, los factores pueden recuperarse de células en
forma de proteínas solubles o en forma de cuerpos de inclusión de
los que pueden ser cuantitativamente extraídos mediante una
disolución 8 M de hidrocloruro de guanidinio y diálisis. Con objeto
de purificar adicionalmente los factores, pueden utilizarse
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba, cromatografía en fase inversa o filtración en gel
convencionales.
Los receptores heterodímeros sR\alpha:\beta1
pueden construirse usando regiones de fusión conocidas, como se
describe en la solicitud PCT publicada WO 93/10151, publicada el 27
de mayo de 1993 y titulada “Receptor for Oncostatin M and Leukemia
Inhibitory Factor” (Receptor para oncostatina M y el factor
inhibidor de la leucemia), en la que se describe la producción de
heterodímeros \beta de receptor, o pueden prepararse mediante
entrecruzamiento de dominios extracelulares por medios químicos.
Los dominios utilizados pueden consistir en el dominio extracelular
completo de los componentes \alpha y \beta1, o pueden consistir
en mutantes o fragmentos de los mismos que mantengan la capacidad
para formar un complejo con su ligando y otros componentes del
complejo sR\alpha:\beta1.
En una realización del invento, los dominios
extracelulares se construyen usando cremalleras de leucina. Se ha
demostrado que los dominios de cremallera de leucina de los factores
de transcripción humanos c-jun y
c-fos forman heterodímeros estables [Busch y
Sassone-Corsi, Trends Genetics 6:
36-40 (1990); Gentz et al., Science 243:
1.695-1.699 (1989)] con una estequiometría 1:1.
Aunque también se ha demostrado que se forman homodímeros
jun-jun, estos son aproximadamente 1.000 veces menos
estables que los heterodímeros jun-fos. No se han
detectado homodímeros fos-fos.
Los dominios de cremallera de leucina de
c-jun o de c-fos se fusionan en
marco de lectura por el extremo C de los dominios solubles o
extracelulares de los susodichos componentes de receptor mediante
genes quiméricos genéticamente construidos. Las fusiones pueden ser
directas o en ellas se puede emplear un dominio conector flexible,
tal como la región bisagra de una IgG humana, o conectores
polipeptídicos que consistan en aminoácidos pequeños tales como
glicocola, serina, treonina o alanina, con diversas longitudes y en
diversas combinaciones. Además, las proteínas quiméricas pueden ser
marcadas mediante
His-His-His-His-His-His
(His6) [Identificación (ID.) de secuencia (SEQ.) nº 1] para
permitir una rápida purificación por cromatografía de
metal-quelato, y/o mediante epítopos hacia los que
estén disponibles anticuerpos, para permitir su detección en
transferencias Western, inmunoprecipitación, o reducción/bloqueo de
actividad en bioensayos.
En otra realización, el heterodímero
sR\alpha:\beta1 se prepara utilizando un método similar pero
usando el dominio Fc de una IgG1 humana [Aruffo et al., Cell
67: 35-44 (1991)]. Por contraste con lo anterior, la
formación de heterodímeros debe realizarse bioquímicamente ya que
las moléculas quiméricas que lleven el dominio Fc se expresarán
como homodímeros unidos por disulfuros. Por lo tanto, los
homodímeros pueden ser reducidos bajo condiciones que favorezcan la
ruptura de disulfuros intercatenarios pero no afecten a los
disulfuros intracatenarios. Los monómeros con diferentes porciones
extracelulares se mezclan luego en cantidades equimolares y se
oxidan para formar una mezcla de homodímeros y heterodímeros. Los
componentes de esta mezcla son separados por técnicas
cromatográficas. Alternativamente, la formación de este tipo de
heterodímeros puede ser soslayada mediante la construcción y
expresión genéticas de moléculas que consistan en la porción soluble
o extracelular de los componentes del receptor, seguida del dominio
Fc de una IgG humana, seguido de las cremalleras de leucina de
c-jun o de c-fos anteriormente
descritas [Kostelny et al., J. Immunol. 148:
1.547-1.553 (1992)]. Puesto que estas cremalleras
de leucina forman predominantemente heterodímeros, pueden ser usadas
para forzar la formación de los heterodímeros cuando se desee. En
cuanto a las proteínas quiméricas descritas al usarse cremalleras
de leucina, pueden ser también marcadas con quelatos metálicos o con
un epítopo. Este dominio marcado puede ser usado para una rápida
purificación mediante cromatografía de
metal-quelato, y/o mediante anticuerpos, para
permitir su detección en transferencias Western,
inmunoprecipitación, o reducción/bloqueo de actividad en
bioensayos.
En otra realización del invento, los
heterodímeros sR\alpha:\beta1 se preparan mediante su expresión
como moléculas quiméricas usando bucles conectores flexibles. Se
crea una construcción de DNA que codifique la proteína quimérica,
de modo que exprese dos dominios solubles o extracelulares
conjuntamente fusionados en tándem ("cabeza con cabeza")
mediante un bucle flexible. Este bucle puede ser totalmente
artificial (por ejemplo, repeticiones de poliglicocola
interrumpidas por serina o treonina con un cierto intervalo) o
"prestado" de proteínas presentes en la naturaleza (por
ejemplo, la región bisagra de una IgG humana). Pueden construirse
moléculas en que el orden de los dominios solubles o extracelulares
fusionados esté cambiado (por ejemplo,
sIl-6R\alpha/bucle/sgp130 o
sgp130/bucle/sIl-6R\alpha) y/o en que la longitud
y la composición del bucle estén variadas, para permitir la
selección de moléculas con las características deseadas.
Alternativamente, los heterodímeros preparados
de acuerdo con el presente invento pueden ser purificados a partir
de líneas celulares cotransfectadas con los componentes \alpha y
\beta1 apropiados. Los heterodímeros pueden ser separados de los
homodímeros usando métodos al alcance de los expertos en la técnica.
Por ejemplo, pueden recuperarse cantidades limitadas de
heterodímeros por elución pasiva de geles de poliacrilamida
preparativos no desnaturalizantes. Alternativamente, los
heterodímeros pueden ser purificados utilizando cromatografía de
intercambio catiónico a alta presión. Se ha obtenido una excelente
purificación usando una columna Mono S de intercambio
catiónico.
Los antagonistas de la familia CNTF aquí
descritos se unen a, o compiten con, las citoquinas CNTF e
Il-6. En consecuencia, son útiles para tratar
enfermedades o trastornos mediados por CNTF o Il-6.
Por ejemplo, los usos terapéuticos de los antagonistas de
Il-6 incluirían los siguientes:
1) En la osteoporosis, la cual puede resultar
exacerbada al reducirse los niveles de estrógenos en mujeres
posmenopáusicas o sometidas a ovariectomía, la IL-6
parece ser un mediador crítico de la osteoclastogénesis,
conduciendo a resorción ósea [Horowitz, Science 260:
626-627 (1993); Jilka et al., Science 257:
88-91 (1992)]. Es importante resaltar que parece
que la IL-6 sólo desempeña una función importante en
el estado desprovisto de estrógenos y que aparentemente está
mínimamente implicada en el mantenimiento óseo normal.
Consistentemente con esto, una evidencia experimental indica que
anticuerpos hacia Il-6, bloqueadores de su función,
pueden reducir el número de osteoclastos [Jilka et al.,
Science 257: 88-91 (1992)]. Aunque también se usa la
terapia de reposición de estrógenos, parece que hay efectos
secundarios que pueden incluir un riesgo aumentado de cánceres de
endometrio y mama. Por lo tanto, antagonistas de
Il-6 como los aquí descritos serían más específicos
para reducir la osteoclastogénesis hasta niveles normales.
2) Parece que la Il-6 está
directamente implicada en el mieloma múltiple al actuar de un modo
autocrino o paracrino para activar la formación de tumores [van
Oers et al., Ann. Hematol. 66: 219-223
(1993)]. Además, los altos niveles de Il-6 crean
efectos secundarios indeseables, tales como resorción ósea,
hipercalcemia y caquexia; en estudios limitados, anticuerpos hacia
Il-6 o Il-6R\alpha, bloqueadores
de su función, tienen cierta eficacia [Klein et al., Blood
78: 1.198-1.204 (1991); Suzuki et al., Eur.
J. Immunol. 22: 1.989-1.993 (1992)]. Por lo tanto,
antagonistas de Il-6 como los aquí descritos serían
beneficiosos tanto para los efectos secundarios como para inhibir
el crecimiento tumoral.
3) la Il-6 puede ser un mediador
del factor de necrosis tumoral (TNF; del inglés, tumor
necrosis factor) que conduce a la caquexia asociada
con el SIDA y el cáncer [Strassmann et al., J. Clin. Invest.
89: 1.681-1.684 (1992)], quizás al reducir la
actividad lipoproteína lipasa en el tejido adiposo [Greenberg et
al., Cancer Research 52: 4.113-4.116 (1992)].
En consecuencia, los antagonistas aquí descritos serían útiles para
aliviar o reducir la caquexia en dichos pacientes.
Las dosis eficaces útiles para tratar éstas u
otras enfermedades o trastornos relacionadas con la familia CNTF
pueden ser determinadas utilizando métodos conocidos por los
expertos en la técnica [véase, por ejemplo, Fingi et al.,
The Pharmacological Basis of Therapeutics (La Base Farmacológica de
la Terapéutica), compilado por Goodman y Gilman, Macmillan
Publishing Company, New York, EE.UU., páginas 1-46
(1975)]. Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con el
invento incluyen los anteriormente descritos antagonistas en un
vehículo líquido, sólido o semisólido farmacológicamente aceptable,
unidos a una molécula portadora o directora (por ejemplo, un
anticuerpo, hormona, factor de crecimiento, etc.) y/o incorporados a
liposomas, microcápsulas y preparaciones de liberación controlada
(incluyendo células que expresan antagonistas) antes de su
administración in vivo. Por ejemplo, la composición
farmacéutica puede comprender uno o más de los antagonistas en una
disolución acuosa, tal como agua, disolución salina, tampón de
fosfato o disolución de dextrosa estériles. Alternativamente, los
agentes activos pueden estar comprendidos en una formulación sólida
(por ejemplo, cérea) o semisólida (por ejemplo, gelatinosa) que
puede ser implantada en un paciente que necesite dicho tratamiento.
La vía de administración puede ser cualquier modo de administración
conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitándose a,
intravenosamente, intratecalmente, subcutáneamente, por inyección en
el tejido afectado, intraarterialmente, intranasalmente, oralmente
o por medio de un dispositivo implantado.
La administración puede dar lugar a la
distribución del agente activo del invento por todo el cuerpo o en
una zona localizada. Por ejemplo, en algunos estados en que están
afectadas regiones distantes del sistema nervioso, puede ser
deseable la administración intravenosa o intratecal del agente. En
algunas situaciones, puede colocarse una implantación que contenga
el agente activo en, o cerca de, la zona lesionada. Las
implantaciones adecuadas incluyen, pero no se limitan a, las
implantaciones basadas en gelatina esponjosa, cera o
micropartículas.
Materiales: Se obtuvo de DNAX un clon de
células PC12 que responden a IL-6 (PC12D). Se
preparó CNTF de rata del modo descrito [Masiakowski et al.,
J. Neurochem. 57: 1.003-10.012 (1991)]. La
Il-6 y el sIl-6R se obtuvieron de R
& D Systems. Se generaron antisueros en conejos frente a un
péptido procedente de una región próxima al extremo C de gp130
[secuencia: CGTEGQVERFETVGME (ID. SEQ. nº 2)] mediante el método
descrito [Stahl et al., J. Biol. Chem. 268:
7.628-7.631 (1993)]. De UBI se obtuvo el anticuerpo
monoclonal 4G10 anti-fosfotirosina, y de Amersham
los reactivos para ECL.
Ensayos de transducción de señales: Se
dejaron hambrientas células PC12D en placas (10 cm) con medio exento
de suero (RPMI 1640 + glutamina) durante 1 hora, y luego se
incubaron durante 5 minutos, a 37ºC, con Il-6 (50
ng/ml) + sIl-6R (1 \mug/ml) en presencia o
ausencia de CNTF de rata añadido en las concentraciones indicadas.
Las muestras se sometieron luego a inmunoprecipitación con
anti-gp130, electroforesis en gel de poliacrilamida
con dodecilsulfato sódico (SDS; del inglés, sodium
dodecylsulfate), e inmunotransferencia con
anti-fosfotirosina del modo descrito [Stahl et
al., J. Biol. Chem. 268: 7.628-7.631
(1993)].
La capacidad de CNTF para bloquear las
respuestas a Il-6 fue medida usando una línea
celular PC12 (llamada PC12D) que expresa
Il-6R\alpha, gp130 y CNTFR\alpha pero no
LIFR\beta. Como era de esperar, estas células responden a
Il-6 pero no a CNTF (Figura 2) puesto que
LIFR\beta es un componente necesario para la transducción de la
señal de CNTF [Davis et al., Science 260:
59-63 (1993)]. De acuerdo con los resultados en
otras líneas celulares [Ip et al., Cell 69:
121-1.132 (1992)], las células PC12D proporcionan
la tirosina-fosforilación de gp130 (así como de una
diversidad de otras proteínas llamadas CLIPs) en respuesta a
Il-6 2 nM (Figura 2). La adición de
Il-6R\alpha soluble
(sIl-6R\alpha) recombinante potencia el nivel de
la tirosina-fosforilación de gp130, como se ha
comunicado en relación con ciertos sistemas diferentes [Taga et
al., Cell 58: 573-581 (1989)]. Sin embargo, la
adición de CNTF 2 nM simultáneamente con Il-6
disminuye drásticamente la tirosina-fosforilación de
gp130. Aunque en presencia de CNTF, Il-6 y
sIl-6R\alpha queda una ligera respuesta de
fosforilación de gp130, ésta resulta eliminada si la concentración
de CNTF es aumentada cuatro veces, hasta 8 nM. Por lo tanto, en
células sensibles a Il-6 que contienen CNTFR\alpha
pero no LIFR\beta, el CNTF es un antagonista bastante potente de
la acción de Il-6.
Análisis de Scatchard relativo a la unión de
CNTF: Se preparó y purificó ^{125}I-CNTF del
modo descrito [Stahl et al., J. Biol. Chem. 268:
7.628-7.631 (1993)]. Se llevaron a cabo estudios de
unión a saturación en células PC12 usando concentraciones de
^{125}I-CNTF comprendidas en el intervalo de 20 pM
a 10 nM. La unión se llevó directamente a cabo sobre una monocapa
de células. Se separó el medio de los pocillos y se lavaron una vez
las células con tampón de ensayo que consistía en disolución salina
tamponada con fosfato [PBS (del inglés, phosphate
buffered saline); pH de 7,4], bacitracina 0,1 mM,
fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 1 \mug/ml de leupeptina, y
1 mg/ml de seroalbúmina bovina. Se incubaron las células con
^{125}I-CNTF durante 2 horas a temperatura
ambiental, lo que fue seguido de 2 rápidos lavados con tampón de
ensayo. Se sometieron las células a lisis con PBS que contenía SDS
al 1%, y se sometió el producto de lisis a cuenta en un contador
Packard de partículas gamma con una eficacia de
90-95%. La unión inespecífica resultó definida por
la presencia de CNTF no marcado en un exceso de 100 veces. La unión
específica estaba comprendida en el intervalo de 70% a 95%.
La constante de equilibrio para la unión de CNTF
a CNTFR\alpha:\beta1 fue estimada del análisis de Scatchard
relativo a la unión de CNTF yodado a células PC12D (Figura 3). Los
datos son consistentes con un ajuste de 2 sitios que tienen
constantes de disociación de 9 pM y 3,4 nM. El sitio de baja
afinidad corresponde a la interacción de CNTF con CNTFR\alpha, la
cual tiene una Kd próxima a 3 nM [Panayotatos et al., J.
Biol. Chem. 268: 19.000-19.003 (1993)]. Aquí se
interpreta que el complejo de alta afinidad es el compuesto
intermedio que contiene CNTF, CNTFR\alpha y gp130. Una línea
celular de sarcoma de Ewing (EW-1) que contiene
CNTFR\alpha, gp130 y LIFR\beta y, por lo tanto, proporciona una
intensa fosforilación de tirosinas en respuesta a CNTF, presenta un
ajuste de dos sitios muy similar con constantes de disociación de 1
nM y 10 pM (Wong et al., datos no publicados). Por lo tanto,
es evidente que el CNTF se une con una afinidad igualmente elevada a
un complejo que sólo contenga CNTFR\alpha y gp130, que a un
complejo que contenga además LIFR\beta, lo que demuestra la
viabilidad de crear los antagonistas de sR\alpha:\beta1 aquí
descritos.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: Antagonistas de la familia CNTF
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 777 Old Saw Mill River Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Tarrytown
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: New York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 10591
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con ordenador personal IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A):
- NOMBRE: Dr. Gail M. Kempler
\vskip0.500000\baselineskip
- (B):
- NÚMERO DE REGISTRO: 32,143
\vskip0.500000\baselineskip
- (C):
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: REG200
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A):
- TELÉFONO: 914-345-7400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B):
- TELEFAX: 914-345-7721
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEQ. Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEQ. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His His His His His His}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEQ. Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEQ. Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu
Thr Val Gly}
\sac{Met Glu}
Claims (11)
1. Una proteína antagonista de citoquinas
soluble capaz de unirse a una citoquina para formar un complejo no
funcional, donde la citoquina activa un receptor por unión primero a
un componente \alpha determinante de la especificidad, seguido de
unión a componentes transductores de señales \beta1 y después
\beta2, antagonista el cual es heterodímero y comprende:
- (a)
- el componente \alpha soluble, determinante de la especificidad, del receptor de la citoquina, y
- (b)
- un dominio extracelular de un componente \beta1 del receptor de la citoquina.
2. Una proteína de acuerdo con la reivindicación
1, en la que la citoquina es la interleuquina 6
(Il-6) o el factor neurotrófico ciliar (CNTF).
3. Una proteína de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en la que el dominio extracelular (b) es el dominio
extracelular de gp130.
4. Una proteína de acuerdo con la reivindicación
2 ó 3, en la que la citoquina es CNTF, el componente (a) es
sCNTFR\alpha, y el dominio extracelular (b) es el dominio
extracelular de gp130.
5. Una proteína de acuerdo con la reivindicación
2 ó 3, en la que la citoquina es Il-6, el componente
\alpha (a) es sIl-6R\alpha, y el dominio
extracelular (b) es el dominio extracelular de gp130.
6. Una secuencia de DNA que codifica una
proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5.
7. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
5 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Una proteína de acuerdo con la reivindicación
5 para uso en un método para tratar una enfermedad o un trastorno
relacionados con Il-6.
9. Una proteína de acuerdo con la reivindicación
5 para uso en un método para tratar la osteoporosis en un paciente
desprovisto de estrógenos.
10. Una proteína de acuerdo con la
reivindicación 5 para uso en un método para tratar el mieloma
múltiple en un paciente.
11. Una proteína de acuerdo con la
reivindicación 5 para uso en un método para tratar la caquexia en un
paciente.
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|---|---|---|---|
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