PT852587E - Péptidos sintéticos que inibem a actividade da il-6 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS SINTÉTICOS QUE INIBEM A ACTIVIDADE DA IL-6"

Area da Invenção A presente invenção situa-se genericamente no dominio de inibidores da actividade da Interleuquina-6 (IL-6). Mais especificamente, a presente invenção diz respeito a novos péptidos sintéticos que são capazes de inibir o crescimento dependente da IL-6 de células de mieloma/plasmacitoma.

Contexto da Invenção e Técnica Anterior 0 sistema receptor da Interleuquina-6 (IL-6) é composto por duas subunidades receptoras distintas designadas gp80 (IL-6R) e gpl30 (revisto em Hirano et al., 1994). Estas duas proteinas receptoras pertencem à superfamília de receptores de citoquinas de Bazan (1990). A estrutura 3-dimensional do Receptor da Hormona de Crescimento humano (hGHR), um membro desta família, foi revelada por cristalografia (DeVos et al., 1992), de onde se determinaram os resíduos que interagem com o ligando e aqueles que medeiam a interacção entre as duas subunidades receptoras nos seus domínios extracelulares. Apresenta-se esquematicamente na Figura 1 o alinhamento das sequências do IL-6R e hGHR com base no modelo de Bazan. A IL-6 é uma citoquina pleiotrópica que tem algumas actividades biológicas importantes (ver Revel, 1992, para uma revisão) . Além disso, a IL-6 foi implicada no crescimento e progressão de mieloma múltiplo humano (Klein et al., 1990) . 2

De facto, a IL-6 é um factor de crescimento para células leucémicas de linfócitos B de Mieloma Múltiplo. Estas células leucémicas também são denominadas células de plasmacitoma ou mieloma, pois derivam de linfócitos B ou células do plasma maduros. Quando fundidas a células B produtoras de anticorpos, estas células de mieloma ou plasmacitoma são denominadas células de hibridoma.

Considerando o facto da IL-6 ser um factor de crescimento para essas células de plasmacitoma ou mieloma, tem-se sentido desde há muito tempo necessidade de obter inibidores da IL-6 específicos que possam ser utilizados para bloquear o crescimento mediado pela IL-6 ou dependente da IL-6 dessas células de plasmacitoma/mieloma e assim proporcionar um modo de tratar Mieloma Múltiplo, uma doença que afecta um número muito grande de pessoas em todo o mundo. Com esta finalidade, Grube e Cochrane (1994) descreveram um péptido derivado do IL-6R, denominado péptido 249-264 (isto é, um péptido com os resíduos de aminoácidos desde o resíduo N° 249 até ao resíduo N° 264 da sequência de aminoácidos do IL-6R), que é capaz de inibir o crescimento de células B9 de plasmacitoma murinas. A patente US 5,210,075 revela antagonistas peptídicos da IL-6 que são modelados à imagem de sequências de aminoácidos que ocorrem na IL-6 ou IL-6R. Também é conhecido que a IL-6 desempenha um papel na inibição de outras doenças, como osteoporose e doenças autoimunes.

Até à data não foram descritos nem os péptidos específicos da presente invenção nem as suas actividades biológicas específicas e outras características, tais como, por exemplo, a sua especificidade para certos anticorpos monoclonais. 3

Em consequência, um objectivo da presente invenção consiste em proporcionar novos péptidos derivados do IL-6R que são capazes de inibir o crescimento dependente da IL-6 de células de mieloma humano ou plasmacitoma murino, osteoporose e doenças autoimunes.

Outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar esses péptidos novos que são suplementarmente caracterizados em virtude dos seus epítopos lineares definidores presentes na sequência do IL-6R, que são os sítios de ligação de anticorpos monoclonais (Mabs) que são, eles próprios, capazes de bloquear a actividade da IL-6.

Ainda outro objectivo da invenção consiste em proporcionar um processo de síntese química para a preparação dos novos péptidos.

Ainda outro objectivo da invenção consiste em proporcionar composições farmacêuticas contendo os novos péptidos.

Resumo da Invenção A presente invenção baseia-se na descoberta inesperada de que péptidos pequenos presentes na molécula gp80 do receptor da IL-6 (IL-6R) podem ser definidos em virtude da sua capacidade para se ligarem a diferentes anticorpos monoclonais (Mabs) previamente conhecidos como tendo a capacidade para inibirem fortemente a actividade da IL-6. Além disso, verificou-se surpreendentemente que estes péptidos, quando sintetizados quimicamente de acordo com a presente invenção e quando adicionados a culturas de células leucémicas, eram capazes de causar a inibição 4 completa do crescimento dessas células leucémicas (de plasmacitoma/mieloma).

Em conformidade, a presente invenção proporciona um péptido capaz de inibir a actividade da IL-β, em que o referido péptido é caracterizado por ser derivado da subunidade gp80 (IL-6R) do sistema receptor da IL-6 e por ser um epítopo linear reconhecido por um ou mais anticorpos monoclonais (Mab) específicos para o IL-6R, com a condição do referido péptido ser diferente do grupo de péptidos que consistem em: (i) o péptido de 16 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos resíduos 249-264 da molécula IL-6R; (ii) o péptido de 14 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos resíduos 255-268 da molécula IL-6R; (iii) o péptido de 6 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos resíduos 249-254 da molécula IL-6R; (iv) o péptido de 10 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos resíduos 259-268 da molécula IL-6R, e (v) o péptido de 10 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos resíduos 249-258 da molécula IL-6R. 0 péptido da invenção é um péptido em que o referido péptido define um epítopo linear reconhecido por um ou ambos os Mabs aqui designados Mab 34.4 e Mab 50.6. 0 péptido da invenção é um péptido seleccionado de qualquer um dos péptidos aqui designados: (i) 1062 com a sequência desde a posição 247 até à posição 260 da molécula IL-6R representada na Fig. 2; (ii) 1063 com a sequência desde a posição 255 até à posição 270 da molécula IL-6R representada na Fig. 2, e (iii) 1122 com a sequência desde a posição 260 até à posição 269 da molécula IL-6R representada na Fig. 2. 5

Também é descrito um péptido ou respectivos análogos biologicamente activos capazes de inibir a actividade da IL-6, em que o referido péptido é caracterizado por ser derivado da subunidade gp80 (IL-6R) do sistema receptor da IL-6 e por fazer parte de toda a região do IL-6R que está envolvida na ligação à IL-6, com a condição do referido péptido ser diferente do grupo de péptidos que consiste em: (i) o péptido de 16 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos residuos 249-264 da molécula IL-6R; (ii) o péptido de 14 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos residuos 255-268 da molécula IL-6R; (iii) o péptido de 6 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos residuos 249-254 da molécula IL-6R; (iv) o péptido de 10 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos residuos 259-268 da molécula IL-6R, e (v) o péptido de 10 aminoácidos com a sequência de aminoácidos dos residuos 249-258 da molécula IL-6R.

Esse péptido é seleccionado dos péptidos aqui designados: (a) 983 com a sequência desde a posição 277 até à posição 299 da molécula IL-6R representada na Tabela 1; (b) 1064 com a sequência desde a posição 290 até à posição 300 da molécula IL-6R representada na Tabela 1; (c) 1067 com a sequência desde a posição 125 até à posição 135 da molécula IL-6R representada na Tabela 1, e (d) um análogo de qualquer um dos (a)-(c) em que um ou mais aminoácidos foram adicionados, deletados ou substituídos por outro aminoácido. A invenção também proporciona uma composição farmacêutica que compreende, como ingrediente activo, pelo menos um dos péptidos da invenção ou misturas de quaisquer 6 desses e um transportador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Formas de realização da composição farmacêutica da invenção incluem uma composição farmacêutica para a inibição da IL-6 e uma composição farmacêutica para o tratamento de Mieloma Múltiplo, osteoporose e doenças autoimunes.

Adicionalmente, a presente invenção também proporciona a utilização dos péptidos da invenção ou misturas de quaisquer desses para a preparação de qualquer uma das composições farmacêuticas acima, ou para a inibição da IL-6, ou para o tratamento de Mieloma Múltiplo, osteoporose e doenças autoimunes.

Outros aspectos da invenção são apresentados ou surgem directamente da seguinte descrição pormenorizada da invenção.

Descrição Breve das Figuras

Fig. 1 Mostra esquematicamente uma comparação de parte da sequência de aminoácidos do dominio extracelular da molécula IL-6R com a do Receptor da Hormona de Crescimento humano (hGHR). 0 alinhamento das

sequências está de acordo com Bazan (1990) . A posição dos epitopos para os Mabs 34.4 e 50.6 está apresentada por bandeiras na figura.

Fig. 2 Mostra esquematicamente um segmento da sequência de aminoácidos do IL-6R em que os limites dos três péptidos aqui designados 1086, 1062 e 1063 estão representados pelos rectângulos (parte superior da figura). A reacção de vários decapéptidos 7 sobrepostos com Mabs está representada na parte inferior da figura, em que os decapéptidos têm sequências contidas nos péptidos 1086, 1062 e 1063. Nesta parte inferior, os números referem-se à posição de cada péptido na grelha membranar (teste de varrimento por pontos ("spot-scan")) e os simbolos "+" designam a intensidade relativa das reacções (resultados positivos), tudo como descrito nos Exemplos 1-3.

Fig. 3 Mostra graficamente os efeitos dos péptidos 1062, 1063 e péptido de controlo 903 (ver Tabela 1) no crescimento de células derivadas de plasmacitoma B9 que depende da adição de IL-6. Utilizou-se IL-6 humana produzida por CHO recombinante a 2,5 U/mL (isto é, 7,5 IU/mL) e mediu-se o crescimento passados 3 dias. Os péptidos foram adicionados à concentração indicada juntamente com IL-6. Tudo como descrito nos Exemplos 2 e 3.

Fig. 4 Mostra graficamente os efeitos dos péptidos 1062, 1063, 1067, 1086 e péptido de controlo 903 (ver

Tabela 1) no crescimento de células derivadas de plasmacitoma B9, como descrito no Exemplo 3.

Fig. 5 Mostra as sequências e os efeitos dos péptidos 1062, 1063, 1122, 1118 e péptido de controlo 903 no crescimento de células derivadas de plasmacitoma B9, como descrito no Exemplo 3.

Fig. 6 Mostra graficamente um modelo tridimensional do complexo do receptor da IL-6 que compreende IL-6R, gpl30 e o ligando IL-6. Este modelo foi calculado com base nos dados cristalográficos de DeVos et al. (1992) para a hGHR. A posição do péptido 1063 está ilustrada por círculos pretos e a direcção dos filamentos por setas brancas. Parte do péptido 1062 8 está ilustrada por quadrados brancos e do péptido 1086 por elipses brancas. Tudo também como descrito no Exemplo 3.

Descrição Pormenorizada da Invenção A presente invenção diz respeito, num aspecto, a novos péptidos que são capazes de inibir a actividade da IL-6, que se caracterizam por serem derivados da subunidade gp80 (IL-6R) do sistema receptor da IL-6 e por serem epítopos lineares reconhecidos por um ou mais anticorpos monoclonais (Mab) específicos para o IL-6R. A IL-6 é um factor de crescimento para células leucémicas de linfócitos B de Mieloma Múltiplo, isto é, células de plasmacitoma ou mieloma. De acordo com a presente invenção, os novos péptidos acima, sendo péptidos pequenos presentes na molécula IL-6R, foram definidos pela sua capacidade para se ligarem a dois Mabs previamente isolados e caracterizados (Novick et al., 1992) como sendo Mabs que inibiram fortemente a actividade da IL-6. Estes novos péptidos foram sintetizados quimicamente e adicionados a culturas dessas células leucémicas, tendo-se observado que causam a inibição completa do crescimento dessas células de plasmacitoma/mieloma.

Assim, os novos péptidos, ou misturas de dois ou mais desses péptidos da invenção, podem ser utilizados de um modo geral para a inibição da IL-6 e para a inibição de actividades celulares mediadas pela IL-6, quando essas actividades forem indesejadas. Por exemplo, quando a IL-6 é produzida de modo intracelular em quantidades anormalmente grandes ou quando a IL-6 é administrada em doses elevadas e, em ambas as situações, a IL-6 atinge níveis 9 indesejavelmente elevados no corpo, dando origem a efeitos secundários indesejáveis, os péptidos ou respectivas misturas de acordo com a invenção podem ser utilizados. Alternativamente, os novos péptidos individualmente, ou misturas de dois ou mais desses, podem ser utilizados especificamente para o tratamento de doenças, tais como, por exemplo, Mieloma Múltiplo em humanos, em que o crescimento das células cancerosas que constitui esta doença (células leucémicas de linfócitos B) depende da IL-6. Nesta candidatura, os novos péptidos da invenção antagonizam a ligação da IL-6 ao seu receptor ou interferem na função do sistema receptor que procede à transdução, de modo intracelular, de sinais moleculares conducentes ao crescimento de células de mieloma. São descritos péptidos possuindo entre cerca de 4 e cerca de 25 resíduos de aminoácidos derivados da molécula IL-6R e que definem epítopos lineares reconhecidos por qualquer um dos Mabs anti-IL-6R 34.4 e 50.6 (em que ambos os Mabs são inibidores potentes da actividade da IL-6). Destes, péptidos preferidos incluem: (a) um péptido possuindo pelo menos a sequência de 10 aminoácidos LRVHAEKSKT desde a posição 255 até à posição 264 da molécula IL-6R; (b) um péptido possuindo pelo menos a sequência de 10 aminoácidos VRAERSKTFT desde a posição 257 até à posição 266 da molécula IL-6R; (c) um péptido possuindo pelo menos a sequência de 10 aminoácidos AERSKTFTTW desde a posição 259 até à posição 268 da molécula IL-6R; (d) um péptido possuindo pelo menos a sequência de 10 aminoácidos RSKTFTTWMV desde a posição 261 até à posição 270 da molécula IL-6R; (e) um péptido possuindo pelo menos a sequência de 10 aminoácidos KTmWMVKD desde a posição 263 até à posição 2 72 da 10 molécula IL-6R; (f) um péptido possuindo pelo menos a sequência de 10 aminoácidos SFYRLRFJSLH desde a posição 247 até à posição 256 da molécula IL-6R; (g) um péptido possuindo pelo menos a sequência de 10 aminoácidos YRLRFEÍB.YE desde a posição 249 até à posição 258 da molécula IL-6R; (h) um péptido possuindo pelo menos a sequência de 10 aminoácidos .LRFELRYRAE desde a posição 251 até à posição 260 da molécula IL-6R.

Além disso, os péptidos preferidos acima também incluem qualquer um dos péptidos aqui designados: (i) 1062 com a sequência desde a posição 247 até à posição 260 da molécula IL-6R representada na Fig. 2; (i i) 1063 com a sequência desde a posição 255 até à posição 270 da molécula IL-6R representada na Fig. 2; (iii) 1086 com a sequência desde a posição 226 até à posição 245 da molécula IL-6R representada na Fig. 2; (iv) 1085 com a sequência desde a

posição 234 até à posição 245 da molécula IL-6R representada na Fig. 2, e (v) 1122 com a sequência desde a posição 260 até à posição 269 da molécula IL-6R representada na Fig. 2. Além disso, deve notar-se que , de acordo com a presente invenção, a utilização de Mabs para definir, isolar e caracterizar péptidos que representam epítopos lineares reconhecidos pelos Mabs na molécula IL-6R proporciona um novo modo para definir e isolar péptidos que estão directamente envolvidos na função da proteína IL-6R, por exemplo, péptidos, como os da invenção, que podem interferir na função desta proteína, isto é, inibir a actividade da IL-6 (que é mediada pelo IL-6R). Esta utilização de Mabs é notavelmente importante, considerando as observações anteriores segundo as quais a ligação de 11

Mabs a proteínas se deve, a maior parte das vezes, ao reconhecimento de uma configuração no interior da proteina e mais raramente a um reconhecimento de um segmento linear da sequência de aminoácidos da proteina.

Também são descritos novos péptidos que são capazes de inibir a actividade da IL-6 que se caracterizam por serem derivados da subunidade gp80 (IL-6R) do sistema receptor da IL-6 e por constituírem parte ou a totalidade da região do IL-6R que está envolvida na ligação à IL-6.

Assim, estes novos péptidos diferentes, não sendo definidos nem isolados em virtude de serem epítopos lineares reconhecidos por Mabs conhecidos, ainda assim representam péptidos que antagonizam a ligação da IL-6 ao seu receptor ou interferem na função do sistema receptor que procede à transdução, de modo intracelular, de sinais moleculares conducentes ao crescimento de células dependentes da IL-6, por exemplo, células de mieloma. Em conformidade, estes péptidos podem ser utilizados do mesmo modo notado acima, isto é, para a inibição da actividade da IL-6 em geral, quando a referida inibição for desejada, ou especificamente para a inibição de células cancerosas dependentes da IL-6, como em Mieloma Múltiplo em humanos.

Destes novos péptidos diferentes, péptidos preferidos incluem: (a) 983 com a sequência desde a posição 277 até à posição 299 da molécula IL-6R representada na Tabela 1; (b) 1064 com a sequência desde a posição 290 até à posição 300 da molécula IL-6R representada na Tabela 1; (c) 1067 com a sequência desde a posição 125 até à posição 135 da molécula IL-6R representada na Tabela 1. 12

Também são descritos análogos biologicamente activos de qualquer um dos novos péptidos descritos acima. Análogos adequados são aqueles que retêm a capacidade para inibir a actividade da IL-6 antagonizando a ligação da IL-6 ao seu receptor ou interferindo na função do sistema receptor que procede à transdução, de modo intracelular, de sinais moleculares conducentes ao crescimento de células dependentes da IL-6, tais como, por exemplo, células de mieloma. Destes, análogos adequados também incluem análogos que retêm os resíduos de aminoácidos essenciais dos epítopos lineares reconhecidos pelos Mabs 34.4 e 50.6. Estes análogos são aqueles que têm pelo menos um resíduo de aminoácido adicionado, deletado ou substituído por outro resíduo de aminoácido em comparação com a sequência de aminoácidos do péptido de onde foi gerada a sequência análoga de aminoácidos.

Em virtude das características acima dos análogos, estes análogos podem então ser utilizados do mesmo modo dos novos péptidos descritos aqui, isto é, como inibidores da actividade da IL-6 em geral ou como agentes para o tratamento de crescimentos de células cancerosas dependentes da IL-6, por exemplo, Mieloma Múltiplo.

Os péptidos e os análogos descritos aqui podem ser preparados por qualquer procedimento bem conhecido na área, em particular pelos procedimentos bem estabelecidos de síntese química, utilizando sintetizadores de péptidos automatizados, seguido de purificação cromatográfica (ver Exemplo 2).

Também são descritas composições farmacêuticas contendo, como ingrediente activo, quaisquer dos novos 13 péptidos acima, análogos ou misturas de dois ou mais péptidos ou análogos, bem como quaisquer dos bem conhecidos transportadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Estas composições farmacêuticas podem ser formuladas para qualquer forma de administração desejada, por exemplo, para administração intravenosa, intraperitoneal ou oral. Em conformidade, a escolha do diluente, transportador ou excipiente será feita de acordo com o modo de administração desejado. 0 modo real de administração e a respectiva formulação óptima serão determinados por profissionais experimentados. Da mesma forma, a dosagem para administração e, assim, a concentração do ingrediente activo em cada forma galénica de acordo com o seu modo de administração também serão decididas por profissionais experimentados. No entanto, a este respeito considera-se que uma forma galénica adequadamente eficaz, para qualquer via de administração, será aquela que dará origem a uma concentração no corpo de cerca de 50 - 100 μΜ dos péptidos, respectivos análogos ou misturas, após a administração.

As composições farmacêuticas descritas aqui podem ser utilizadas para a inibição da IL-6 quando esse tratamento for indicado, como descrito acima em casos em que os níveis da IL-6 sejam anormalmente elevados, ou podem ser utilizadas especificamente para tratar doenças em que o tecido doente depende da IL-6, por exemplo, em Mieloma Múltiplo, em que as células de mieloma que constituem o crescimento maligno dependem da IL-6. 14 A presente invenção será agora descrita mais pormenorizadamente nos seguintes Exemplos não limitativos e figuras adjuntas.

Exemplo 1: Epitopos reconhecidos pelos Mabs 34.4 e 50.6

Verificou-se que os anticorpos monoclonais 34.4 e 50.6, previamente preparados e caracterizados por um grupo que incluiu um dos presentes inventores, inibem a ligação da IL—6 à subunidade gp80 do receptor da IL-β (IL-6R) e, consequentemente, inibem a ligação da IL-6 a células humanas e a sua actividade biológica (Novick et al., 1992).

Os dois anticorpos 34.4 e 50.6 foram estudados de acordo com a presente invenção no que se refere à sua capacidade para reconhecer péptidos lineares do domínio extracelular do IL-6R. Para esta finalidade, utilizando procedimentos comuns de síntese química (ver também o Exemplo 2), sintetizou-se uma série de 96 decapéptidos que abrangem os resíduos 123-322 da sequência do IL-6R. Cada péptido consecutivo foi deslocado em 2 aminoácidos do anterior, dando origem a uma biblioteca sobreposta encaixada (ver sequência do IL-6R na Fig. 1 e alguns dos péptidos apresentados na Fig. 2). Uma membrana contendo os 96 péptidos reagiu com o Mab 34.4 (18 μg/mL) e foi corada com um anticorpo secundário conjugado à β-galactosidase (anticorpo imunoglobulina anti-ratinho). Observaram-se na membrana duas séries de manchas positivas para a β-galactosidase, uma correspondente aos resíduos 223-240 e a outra aos resíduos 241-272. Realizou-se uma experiência semelhante utilizando um anticorpo secundário conjugado a peroxidase de rábano bravo e detecção por quimioluminescência melhorada (estojo ECL, Amersham 15

Radiochemicals, R.U.)· Este método de detecção é mais quantitativo e permitiu comparar a intensidade da reacção entre o anticorpo e os diversos péptidos. Observou-se uma reacção forte com manchas de 4 péptidos (67, 68, 69 e 70) correspondentes aos aminoácidos 255-264, 257-266, 259-268 e 261-270. Estes resultados estão representados na Fig. 2, que mostra esquematicamente um segmento da sequência de aminoácidos do IL-6R em que os limites dos três péptidos aqui designados 1086, 1062 e 1063 estão representados por rectângulos (parte superior da figura) e que também mostra os resultados da reacção dos vários decapéptidos sobrepostos contidos nos péptidos 1086, 1062 e 1063 com Mabs (parte inferior da figura). Nestes resultados da reacção, os números referem-se à posição de cada péptido na grelha membranar (teste de varrimento por pontos ("spot-scan")) e os simbolos "+" designam a extensão da reacção (+++ = reacção muito forte; ++ = reacção forte, e + = reacção relativamente forte) . Assim, destes resultados é aparente que o núcleo do epítopo do Mab 34.4 é RSÍCT (261-264), mas provavelmente estende-se a mais resíduos em redor deste núcleo.

De um modo semelhante, também se testou a biblioteca de 96 péptidos do IL-6R com o Mab 50.6 com o método de detecção de ECL. As manchas 64 e 65 foram as que reagiram mais fortemente, indicando a sequência 251-258 como sendo o epítopo de núcleo para este segundo anticorpo neutralizador (Fig. 2). 16

Exemplo 2: Péptidos sintéticos correspondentes a epítopos definidos pelos Mabs 34.4 e 50.6 inibem a actividade biológica da IL-6 no crescimento de células de hibridoma

Determinou-se a região da sequência do IL-6R à qual se ligam os Mabs neutralizadores 34.4 e 50.6, como descrito acima (Fig. 2). Os péptidos indicados 1062 (residuos 257-260 do IL-6R) , 1063 (255-270) e 1086 (226 e 245) foram obtidos por sintese em fase sólida com um sintetizador de péptidos da Applied Biosystems (Foster City, CA) . Verificou-se a pureza dos péptidos por Cromatografia Liquida de Alto Desempenho de Fase Reversa (RP-HPLC) numa coluna Aquapore C8 (Brownlee).

Em seguida, estes péptidos purificados foram testados quanto à sua capacidade para interferir na acção da IL-6 em células. A fundamentação foi a seguinte: uma vez que os anticorpos que bloqueiam a actividade da IL-6 se ligam a sequências de epítopos presentes nestes péptidos, é provável que estas sequências sejam importantes para algumas interacções proteína-proteína no complexo do receptor. Assim, estes péptidos podem, eles próprios, imitar essas interacções e interferir nos contactos normais proteína-proteína necessários para a função do sistema receptor.

Para avaliar a actividade biológica dos péptidos como inibidores da acção da IL-6 contra o crescimento de células de plasmacitoma utilizou-se uma linha de células de hibridoma B9 cujo crescimento depende da IL-6 (Helle et al., 1988) . As células B9 foram cultivadas em suspensão em meio de crescimento RPMI 1640 (Biolabs Ltd., Israel) com soro fetal de vitelo inactivado pelo calor 10% e 4 U/mL de IL-6. A IL-6 humana recombinante de células de Ovário de 17

Hamster Chinês (CHO) era uma preparação pura, como descrito (Novick et ai., 1989), que titulou em células de plasmacitoma T1165 5 x 106 unidades/mg (correspondente a 1,5 x 107 Unidades internacionais/mg). As unidades usadas aqui são unidades T1165 (1 unidade = 3 Unidades internacionais).

Antes do ensaio, as células B9 foram lavadas e incubadas durante 5 horas em meio de crescimento mas sem IL-6. As células foram centrifugadas, novamente suspensas em meio de crescimento com 2,5 unidades/mL (isto é, 7,5 IU/mL) de IL-6 e foram semeadas numa microplaca de 96 cavidades (Nunc, Dinamarca) a 50 000 células num volume final de 0,2 mL por cavidade. O volume de 25 μι de uma solução aquosa com uma concentração de péptido apropriada foi incluído no volume final de cada cavidade, isto é, os péptidos a concentrações que variaram desde 62,5 μρ/ηΛ até 250 μρ/ηύΐ (bem como um controlo de 0 μρ/ιτΛ) foram adicionados juntamente com a IL-6. Passados 3 dias de cultura a 37°C adicionou-se uma solução de Azul de Alamar (Biosource, Camarillo, CA) a 20 μρ/ιτΛ por cavidade e, após mistura, continuou-se a incubação durante 3 horas. Mediu-se a absorvância óptica de cada cavidade ao comprimento de onda de 530 nm, como especificado pelo fabricante. A absorvância é directamente proporcional ao número de células vivas presentes na cavidade, como verificado em experiências de calibração desde 50 000 até 106 células B9 (0,25 OD530 correspondente a 5 x 105 células B9 nas presentes condições experimentais). Os resultados foram expressos pela diferença entre a densidade final de células com IL-6 e sem IL-6. A diferença dependente da IL-6 na ausência de péptido foi definida como 100% de crescimento. 18

Os resultados das experiências acima estão apresentados na Fig. 4, que mostra graficamente os efeitos dos péptidos 1062, 1063 e péptido de controlo (ver abaixo e Tabela 1) no crescimento dependente da IL-6 das células derivadas de plasmacitoma B9. Como é claro destes resultados, a adição de concentrações crescentes do péptido 1063 (255-270) originou inibição dependente da dose do crescimento das células B9. À dose mais elevada, a inibição do crescimento foi 99%. Também se obteve inibição completa com o péptido 1062 (257-260) mas com uma curva de doses diferente. Em contraste, um péptido de controlo, 903 (com uma sequência não relacionada, como mostrado na Tabela 1 abaixo), não inibiu o crescimento dependente da IL-6 das células B9. Em consequência, os dois péptidos 1062 e 1063, correspondentes aos epítopos do núcleo dos Mabs neutralizadores 34.4 e 50.6, são inibidores específicos potentes do crescimento dependente da IL-6 de células derivadas de plasmacitoma. TABELA 1 Péptidos testados quanto à inibição da actividade da IL-6 e

suas coordenadas no IL-6R Péptido Sequência ............. 1 Coordenadas Observações 1062 SFYRLRFELRYRAE 247-260 epítopo Mal) 50.6 1063 LRYRAERSKTFTnVMV 255-270 epitopo Mal) 34.4 983 CVtHDAWSGLRHWQLRAQEEFG 277-299 1064 VQLRAQEEFGQ 290-300 ligação IL-6 1067 SPLSNWCEWG 125-1.35 início domínio H 1085 LSVTWQDPHSWN 234-245 1ÔS6 AVARNPRWLSVTWQDPHSWN 226-245 interacção gpl30? 903 PGHRYRDQQTQTSFSEEPQSSQLLPC outra proteína péptido controlo 19

Testou-se a actividade do péptido 1063 (255-270, epítopo do Mab 34.4) em 5 experiências separadas, e a inibição às três doses foi altamente significativa do ponto de vista estatístico (Tabela 2 abaixo). A comparação directa do péptido 1063 com o péptido de controlo 903 revelou uma inibição altamente significativa do crescimento dependente da IL-6 das células B9 derivadas de plasmacitoma mesmo quando se utilizou o péptido 1063 a uma concentração que era metade da concentração do péptido de controlo (ver legenda da Tabela 2 abaixo). TABELA 2

Actividade antagonista para a IL-6 do péptido dos epitopos dos Mabs 34.4 e 50.6 CRESCIMENTO DE CÉLULAS B9 DE HIBRIDOMA DEPENDENTE DA IL-S PÉPTIDO 62,5 jig/mL 125 \xgfmli | 250 pg/mL Percentatrem do crescimento de células dependente da IL-6 i DP 1063 (255*2703 ?l±9(p-0,OOÍ) 45*16 (p<Q,G01) 3*1 (p<0,0001) 1062 (257-260) 100*0 {a.s.} 15*9 (p<0,Q00l) 903 (controlo) 97*4 (n.s,) 95*9 (n.s.) 89*15 (n.s.)

Análise estatística de 5 experiências utilizando o teste t de Student de duas caudas em comparação com ausência de péptido. A comparação do crescimento de células B9 com o péptido 1063 e 125 μρ/ηϋ, relativamente ao péptido de controlo 903 a 250 μg/mL foi altamente significativa a p = 0,004.

Exemplo 3: Comparação entre péptidos de epitopos dos Mabs 34.4 e 50.6 e péptidos de outras regiões da sequência do IL-6R quanto à inibição do crescimento de células B9 de hibridoma. 20

Prepararam-se cinco péptidos como descrito acima (Exemplo 2) correspondentes a diferentes regiões da sequência do IL-6R (ver Tabela 1 acima). Os péptidos 983 e 1064 correspondem a uma região homóloga àquela que, na hGHR, está envolvida na ligação de ligandos (Fig. 1; DeVos et al., 1992) e que contém o motivo EAQEEF que se verificou ligar-se à IL-6 (Martin et al., 1994). O péptido 1067 também corresponde a uma região que, na molécula hGHR, está envolvida na ligação de ligandos (Fig. 1) . O péptido 1086 corresponde a uma região que se verificou interagir com a gpl30 (Savino et al., 1994) e que está próxima do epítopo dos Mabs 34.4 e 50.6 (Fig. 2). Testaram-se estes péptidos quanto ao seu efeito no crescimento dependente da IL-6 das células B9 derivadas de plasmacitoma, tal como no Exemplo 2 .

Uma comparação do crescimento residual dependente da IL-6 (ver Tabela 3 abaixo) mostra que os péptidos sobrepostos 983 e 1064 não foram activos em comparação com o péptido 1063 (255-270). O péptido 1067 exibiu alguma actividade, mas inferior à do péptido 1063. Numa série de quatro experiências, o crescimento residual na presença do péptido 1067 foi 62% ± 43 e não teve significado estatístico. No entanto, o péptido 1086 (226-245) exibiu actividade, apesar de inferior à dos péptidos 1062 e 1063. A Fig. 4 mostra graficamente os efeitos dos péptidos 1062, 1063, 1067 e 1086, em comparação entre si e com o péptido de controlo 903, no crescimento de células derivadas de plasmacitoma B9. os resultados apresentados são os resultados médios de 4 experiências. A Fig. 5 mostra novamente as sequências dos péptidos acima mencionados 1062 e 1063 e o seu efeito no crescimento 21 de células derivadas de plasmacitoma B9, bem como dos péptidos 1118 e 1122, com um efeito baixo e forte, respectivamente, e de dois péptidos relacionados que se verificou serem inactivos. TABELA 3

Comparação de diferentes péptidos CRESCIMENTO DE CÉLULAS B9 DE HIBRIDOMA COM 0 PÉPTIDO 1063 1064 983 1067 903 Percentagem do crescimento de células dependente da IL-6 IL-6: 1 U/mL 3% 74% 100% 48% 100%

Péptidos testados a 250 μg/mL

Produziu-se um modelo tridimensional da molécula IL-6R com base nas coordenadas cristalográficas da hGHR. Este está apresentado esquematicamente na Fig. 5, que é um modelo tridimensional do complexo do IL-6R compreendendo IL-6R, gpl30 e o ligando IL-6. Este modelo foi calculado com base nos dados cristalográficos de DeVos (1992) para a hGHR. Está indicada a posição dos diferentes péptidos testados. O péptido 1063 (255-270, marcado por círculos pretos) não parece interagir com o ligando IL-6. O péptido 1062 (247-260, marcado por quadrados brancos na região que precede a sua sobreposição com o péptido 1063) contém resíduos em redor da posição 247 que podem interagir com a IL-6. O péptido 1086 (226-245, marcado por elipses brancas) contém uma alça que interage com a gpl30. É conhecido que a gpl30 sofre dimerização em resultado da ligação da IL-6 e IL-6R (Hirano et al.r 1994) e o IL-6R pode sofrer dimerização de um modo semelhante para formar um complexo hexamérico. A construção de um modelo computacional deste complexo hexamérico por uma reunião simétrica de dois dos complexos triméricos mostrados na Fig. 5 revelou que o 22 péptido 1063 e parte do 1062 estão envolvidos numa segunda interacção do IL-6R e gpl30. Em consequência, as regiões comuns aos péptidos activos, em particular o péptido 1063 que é o inibidor mais activo da IL-6, parecem interferir nas interacções entre o IL-6R e gpl30 para formar o complexo hexamérico e, assim, inibir a função do complexo receptor da IL-6.

Exemplo 4: Péptidos definidos pelos epitopos dos Mabs 34.4 e 50.6 inibem o crescimento dependente da IL-6 de células de mieloma humano O mieloma múltiplo é uma leucemia de células do plasma em que a IL-6 é considerada um factor promotor do crescimento (Klein et al., 1990). Em consequência, teve interesse determinar se os péptidos derivados dos epitopos dos Mabs 34.4 e 50.6, ou outros péptidos, inibem o crescimento dessas células tumorais. A linha de células XG-1 foi estabelecida a partir de um paciente com mieloma múltiplo (Klein et al., 1990) e o crescimento destas células depende da adição de IL-6. Estabeleceram-se culturas de células XG-1 em placas Costar de 6 cavidades num volume final de 1 mL. As células foram cultivadas com ou sem IL-6 (0,2 U/mL, isto é, 0,6 IU/mL) durante 3 dias e depois foram submetidas a impulsos com timidina etiquetada com tritio durante 2 horas. Utilizou-se a incorporação de timidina radioactiva como medida do crescimento e replicação de DNA. Como indicado na Tabela 4 abaixo, o crescimento dependente da IL-6 foi fortemente reduzido (em 85%) pela adição de 100 μρ/ηύΐ. do péptido 1062, e foi reduzido em mais de 55% com o péptido 1063. Em contraste, o péptido 1064 exerceu apenas um pequeno efeito inibidor. Verificou-se que o péptido 1067 também é activo na inibição 23 do crescimento destas células de mieloma humano (ver Tabela 4 abaixo).

Em consequência, os péptidos do IL-6R são capazes de inibir a função do complexo do receptor da IL-6 humano em células tumorais humanas. TABELA 4

Efeito em células XG-1 de mieloma humano CRESCIMENTO DE XG-1 DE MIELOMA HUMANO COM 0 PÉPTIDO nenhum 1062 1063 1064 1067 Incorporação de 3H-timidina, cpm x 10 3 Sem IL-6 6,4 ± 1,6 8,3 ± 0,3 8,7 ± 2,5 10,1 ± 0,3 6,5 ± 1,9 IL-6, 0,2 U/mL 43,6 ± 0,9 15,1 ± 3,3 25,2 ± 0,2 39,1 ± 1,5 10,7 ± 0,3 dependente de IL-6 (%) 37,2 (100) 6,8 (18,2) 16,5 (44,3) 29,0 (78) 4,2 (11,3)

Considerando os resultados aqui apresentados acima (Exemplos 1-4), fez-se uma comparação entre estes resultados ("Presente Invenção") e os resultados previamente relatados respeitantes a péptidos descritos por Cochrane (Grube e Cochrane, 1994, "Técnica Anterior"). Esta análise comparativa está apresentada na Tabela 5 abaixo. Deve notar-se que Cochrane mostrou que apenas o péptido 249-264 (Y249-T264) era activo nas células derivadas de linfocitoma B9, ao passo que os outros péptidos descritos por Cochrane foram testados em células HepG2 para efeitos de secreção de fibrinogénio. Em contraste, verificou-se que os péptidos da presente invenção 1062 (247-260), 1063 (255-270), 1086 (226-245) e 1122 (260-269), todos os quais diferem (apesar de com alguma sobreposição no que se refere a 1062 e 1063) dos de Cochrane, são activos em células B9. Além disso, os péptidos 1062 e 1063 inibem células XG-1 de mieloma humano. Suplementarmente, a actividade dos péptidos 24 mais semelhantes (apesar de ainda serem diferentes) da presente invenção e de Cochrane, nomeadamente 1063 (255- 270) e 255-268, respectivamente, também é diferente.

Verificou-se, de acordo com a invenção, que o péptido da presente invenção 1063 (L255-V270) é activo em células B9, ao passo que o de Cochrane (255-268) testado em células HepG2 foi inactivo.

Por fim, os péptidos preparados e caracterizados de acordo com a presente invenção foram isolados pelo procedimento inicial de mapeamento de epítopos utilizando os Mabs 34.4 e 50.6 previamente preparados. Em contraste, Cochrane preparou os péptidos por síntese aleatória de diferentes péptidos. TABELA 5

Comparação entre a actividade dos péptidos da presente invenção e os da técnica anterior (Grube e Cochrane, 1994)

Presente Invenção Técnica Anterior PÉPTIDO RESULTADO PÉPTIDO RESULTADO células B9 XG-1 células B9 HepG2 247-260 (1062) activo activo 249-264 activo activo 255-270 (1063) activo um pouco 255-268 não realizado inactivo 249-254 não realizado inactivo 259-268 não realizado inactivo 249-258 não realizado activo 226-245 (1086) activo não realizado

Referências

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DeVos A.M., Ultsch M. e Kossiakoff A. A. (1992) "Human Growth Hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex". Science 255: 306-312.

Grube B.J. e Cochrane C.G. (1994), "Identification of a regulatory domain of the Interleukin-β receptor". J. Biol. Chem. 269: 20791-20797.

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Martin F., Toniatti C., Salvati A.L., Venturini S., Ciliberto G., Cortese R. e Sollazzo M. (1994) "The affinity selection of a minibody polypeptide inhibitor of human IL-6". EMBO J. 13: 5303-5309.

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Lisboa, 26 de Fevereiro de 2009

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido capaz de inibir a actividade da IL-6, em que o referido péptido é seleccionado de um grupo que consiste em: (a) SFVRfRf£LRVRA£, com a sequência desde a posição 247 até 260 da molécula IL-6R da Fig. 2; (b) LRYRÂÈRSKTFTÍW&fV, com a sequência desde a posição 255 até 270 da molécula IL-6R da Fig. 2, e (c) ERSKTFTTWM, com a sequência desde a posição 260 até 269 da molécula IL-6R da Fig. 2.

2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 que é SFYRLRFELRYHAE com a sequência desde a posição 2 47 até 260 da molécula IL-6R da Fig. 2.

3. Péptido de acordo com a reivindicação 1 que é fRYRAEBSKYFTtWMV com a sequência desde a posição 2 55 até 270 da molécula IL-6R da Fig. 2.

4. Péptido de acordo com a reivindicação 1 que é ÊRSKTFTTWSS com a sequência desde a posição 260 até 269 da molécula IL-6R da Fig. 2.

5. Composição farmacêutica que compreende, como ingrediente activo, um péptido ou uma mistura de dois ou mais péptidos de acordo com a reivindicação 1 e um transportador, diluente ou receptor farmaceuticamente aceitável.

6. Utilização de um péptido ou de uma mistura de dois ou mais péptidos da reivindicação 1 para a preparação de 2 uma composição farmacêutica destinada ao tratamento de mieloma múltiplo, osteoporose e doenças autoimunes.

7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a composição farmacêutica é preparada para o tratamento de mieloma múltiplo.

8. Utilização de um péptido ou de uma mistura de dois ou mais péptidos da reivindicação 1 para a preparação de uma composição farmacêutica destinada à inibição da actividade da IL-6. Lisboa, 26 de Fevereiro de 2009