PT726954E

PT726954E - Antagonistas de citoquinas

Info

Publication number: PT726954E
Application number: PT94930818T
Authority: PT
Inventors: George D Yancopoulos; Neil Stahl; Aris Economides
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 1993-10-20
Filing date: 1994-10-19
Publication date: 2000-04-28
Also published as: AU7982794A; HK1008346A1; DK0726954T4; US5470952A; CA2173846C; ATE187982T1; ES2139759T3; EP0726954B2; WO1995011303A1; DK0726954T3; ZA948242B; CN1138350A; ES2139759T5; AU679579B2; EP0726954B1; GR3032777T3; DE69422304T3; US5844099A; JP3961562B2; DE69422304T2

Description

83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ DESCRICÃO “Antagonistas de citóquinas”

ANTECEDENTES DO INVENTO

Embora identificados para actividades biológicas variáveis, o factor neurotrófico ciliar (CNTF), o factor inibidor de leucemia (LIF), a oncostatina M (OSM) e a interleucina-6 (IL-6) fazem parte de uma família recentemente definida de citóquinas (aqui referida como a “família CNTF” de citóquinas). Estas citóquinas estão agrupadas devido às suas semelhanças estruturais distantes [Bazan, J. Neuron 7: 197-208 (1991); Rose e Bruce, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 8641-8645 (1991)], e talvez mais importante, porque elas partilham componentes “β” do receptor de transdução de sinal [Baumann, et al, J. Biol. Chem. 265: 19853-19862 (1993); Davis, et al, Science 260: 1805-1808 (1993); Gearing et al, Science 255: 1434-1437 (1992); Ip et al., Cell 69: 1121-1132 (1992); Stahl, et al, J. Biol. Chem. 268: 7628-7631 (1993); Stahl e Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)]. A activação do receptor por esta família de citóquinas resulta da homo ou heterodimerização destes componentes β [Davis, et al., Science 260: 1805-1808 (1993), Murakami, et al, Science 260:1808-1810 (1993); Stahl e Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)]. A activação do receptor de IL-6 requer homodimerização de gpl30 [Murakami, et al., Science 260:1808-1810 (1993), Hibi, et al., Cell 63: 1149-1157 (1990)], uma proteína inicialmente identificada como o transdutor de sinal de IL-6 [Hibi, et al., Cell 63: 1149-1157 (1990)]. A activação do receptor de CNTF, LIF e OSM resulta da heterodimerização entre o gpl30 e uma segunda proteína relacionada com gpl30 conhecida como Lm^ [Davis, et al., Science 260: 1805-1808 (1993)], que foi inicialmente identificada pela sua capacidade de se ligar a LIF (Gearing et al, EMBO J. 10: 2839-2848 (1991)].

Adicionalmente aos componentes β, algumas destas citóquinas também necessitam de componentes “a” determinantes de especificidade que são mais limitados na sua distribuição nos tecidos do que os componentes β e que por isso determinam os alvos celulares de cada citóquina [Stahl e Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)]. Assim, LIF e OSM são factores de ampla acção que podem apenas necessitar da presença de gpl30 e LIFRβ nas células que produzem a resposta, enquanto que CNTF necessita de CNTFRa [Stahl e Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)] e IL-6 necessita de IL-6Ra [Kishimoto, et al, Science 258: 593-597 (1992)]. Tanto CNTRFa [Davis, et al, Science 259:1736-1739 (1993)] como IL-6Ra [Hibi, et al, Cell 63: 1149-1157, Murakami, et al., Science 260:1808-1810 (1990); Taga, et al., Cell 58: 573-581 (1989)] podem funcionar como proteínas solúveis, de acordo com a noção de que não interagem com moléculas de sinalização

83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ 2 intracelular mas que servem para ajudar os seus ligandos a interagir com as subunidades β transdutoras de sinal apropriadas [Stahl e Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)].

Outas evidências de outros sistemas de citóquinas também suportam a noção de que a dimerização proporciona um mecanismo comum pelo qual todos os receptores de citóquinas iniciam a transdução de sinal. A hormona de crescimento (GH) serve talvez como o melhor exemplo a este respeito. Estudos cristalográfícos revelaram que cada molécula de GH contém dois locais distintos de ligação ao receptor, ambos são reconhecidos pelo mesmo domínio de ligação no receptor, permitindo que uma única molécula de GH se envolva com duas moléculas receptoras [de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)]. A dimerização ocorre sequencialmente, com o local 1 da GH ligando-se primeiro a uma molécula receptora, seguida da ligação do local 2 a uma segunda molécula receptora (Fuh, et al., Science 256: 1677-1680 (1992)]. Estudos com o receptor da eritropoietina (EPO) são também consistentes com a importância da dimerização na activação do receptor, porque os receptores EPO podem ser constitutivamente activados pela mudança de um único aminoácido que introduz um resíduo de cisteína e que resulta em homodímeros com ligações dissulfureto [Watowich, et al., Proc. Acad. Sei. USA 89: 2140-2144 (1992)].

Adicionalmente à homo ou heterodimerização das subunidades β como passo crítico para a activação do receptor, uma segunda característica importante é que a formação do complexo receptor final pela família CNTF de citóquinas ocorre através de um mecanismo pelo qual o ligando se liga sucessivamente a componentes do receptor de uma maneira ordenada [Davis, et al., Science 260: 1805-1818 (1993); Stahl e Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)]. Assim, o CNTF liga-se primeiro a CNTFRa, formando um complexo que então se liga ao gpl30 para formar um intermediário (denominado aqui por intermediário αβί) que não é competente na sinalização porque apenas tem um único componente β, antes de finalmente recrutar LIFR^ para formar um heterodímero de componentes β que então inicia a transdução de sinal. Embora um intermediário semelhante contendo IL-6 ligada a IL-6Ra e uma única molécula de gpl30 não tenha sido directamente isolado, postulámos que este existe por analogia com o seu parente distante, CNTF, assim como pelo facto de que o complexo receptor final activo de IL-6 recruta dois monómeros de gpl30. Todas juntas, estas verificações conduziram a uma proposta para a estrutura de um complexo receptor de citóquinas genérico (Figura 1) em que cada citóquina pode ter até 3 locais de ligação ao receptor: um local que se liga a um componente α determinante de especificidade opcional (local a), um local que se liga ao primeiro componente β transdutor de sinal (local β 1) e um local que se liga ao segundo componente β transdutor de sinal (local β2) [Stahl e Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)]. Estes três locais são utilizados de modo sequencial, com o ultimo passo na formação do complexo - que resulta na dimerização do componente 3 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ β-crítico para ο início da transdução de sinal [Davis, et al, Science 260: 1805-1818 (1993)]. O conhecimento dos detalhes da activação do receptor e da existência do intermediário βΐ não funcional para CNTF conduziu à descoberta de que CNTF é um antagonista de alta afinidade para IL-6 em certas circunstâncias e proporciona a base estratégica para desenhar antagonistas baseados no ligando ou no receptor para a família CNTF de citóquinas tal como detalhado em baixo.

Uma vez que a ligação da citóquina induza a formação do complexo receptor, a dimerização dos componentes β activa a actividade intracelular da tirosina-quinase que resulta na fosforilação de uma grande variedade de substratos [Ip, et al, Cell 69: 1121-1132 (1992)]. Esta activação da tirosina-quinase parece ser crítica para os acontecimentos a jusante uma vez que os inibidores que bloqueiam as fosforilações da tirosina também evitam acontecimentos posteriores tais como induções de genes [Ip, et al., Cell 69: 1121-1132 (1992); Nakajima e Wall, Mol. Cell. Biol. 11: 1409-1418 (1991)]. Recentemente, demonstrámos que uma família recentemente determinada de tirosina-quinases não receptoras que inclui Jakl, Jak2 e Tyk2 (referidas como quinases Jak/Tyk) [Firmbach-Kraft, et al, Oncogene 5: 1329-1336 (1990); Wilkis, et al, Mol. Cell. Biol. 11: 2057-2065 (1991)] e que estão envolvidas na transdução de sinal com outras citóquinas [(,et al., Cell 74: 237-244 (1993); Silvennoinen, et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (no prelo; 1993); Velazquez, et al, Cell 70: 313-322 (1992); Witthuhn, et al, Cell 74: 227-236 (1993)], associam-se previamente aos domínios citoplasmáticos das subunidades β de gpl30 e LIF^ na ausência do ligando e tomam-se tirosinas fosforiladas e activadas após adição do ligando [Stahl et al, Science (submetido: 1993)]. Por isso estas quinases parecem ser o primeiro passo da transdução de sinal intracelular activada dentro da célula como resultado da ligação do ligando fora da célula. Sistemas de ensaios para pesquisa de colecções de pequenas moléculas para actividades agonistas ou antagonistas específicas baseados neste sistema são descritos em baixo.

Adicionalmente, Brakenhorff et al. (Cytokine, vol. 3, n° 5, pagina 496, resumo 279) identificaram duas regiões da molécula de IL-6 importantes para a bioactividade, reconhecidas por dois grupos (I e II) de anticorpos monoclonais neutralizantes (mAb). Brakenhoff et al. verificaram que o local I (reconhecido por mAb do grupo I) estava envolvido na ligação à cadeia de 80 kDa do receptor de IL-6 enquanto que o grupo II está envolvido na interaeção do complexo IL-6/80 kDa com a cadeia de transdução de sinal gpl30. Os mAb do grupo II ligam-se em tomo do resíduo Trpl58 de IL-6. Mutagénese aleatória em tomo de Trp 158 resultou no isolamento de vários mutantes, que se ligam aos mAb do grupo I, mas não aos do grupo II, que eram biologicamente activos tal como medido num ensaio do hibridoma B9 de murídeo. Dois destes mutantes não induziram

83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ 4 produção de IgGl quando testados em células CESS humanas e um desses dois mutantes foi capaz de inibir a actividade indutora de IgGl de IL-6 de tipo selvagem e também de inibir o fibrogénio induzido por IL-6 e a síntese do inibidor Cl em células humanas Hen G2. A família CNTF de citóquinas tem papéis importantes numa grande variedade de processos fisiológicos que proporcionam potenciais aplicações terapêuticas tanto para os antagonistas como para os agonistas.

SUMÁRIO DO INVENTO O invento proporciona uma proteína antagonista de uma citóquina capaz de se ligar a uma citóquina para formar um complexo não funcional, antagonista que compreende: (a) um componente solúvel α determinante de especificidade, do receptor da citóquina; e (b) um domínio extracelular de um componente β do receptor da citóquina.

De preferência, a citóquina é IL-6 ou CNTF.

De preferência, o domínio extracelular (b) é o domínio extracelular de gpl30 ou LIFRp.

De maior preferência a citóquina é CNTF, o componente α (a) é sCNTFRa e o domínio extracelular (b) é o domínio extracelular de gpl30; ou a citóquina é IL-6, o componente α (a) é sIL-6Ra e o domínio extracelular (b) é o domínio extracelular de gpl30. O invento também proporciona composições farmacêuticas compreendendo uma proteína do invento juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável. O invento também proporciona uma proteína de acordo com o invento em que a citóquina é IL-6, o componente α (a) é sIL-6Roc e o domínio extracelular (b) é o domínio extracelular de gpl30 para utilização num método de tratamento de uma desordem relacionada com IL-6, para utilização no tratamento da osteoporose num doente com falta de estrogénio, e para utilização no tratamento de mieloma múltiplo e caquexia.

Um objectivo do presente invento é a produção de antagonistas de IL-6 que sejam úteis no tratamento de doenças ou desordens relacionadas com IL-6.

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Outro objectivo do invento é a utilização de antagonistas de IL-6 aqui descritos para o tratamento de osteoporose.

Outro objectivo do invento é a utilização de antagonistas de IL-6 aqui descritos para o tratamento dos efeitos primários e secundários do cancro, incluindo do mieloma múltiplo.

Ainda outro objectivo do invento é a utilização de antagonistas de IL-6 aqui descritos para o tratamento da caquexia.

Outro objectivo do invento é o desenvolvimento de sistemas de pesquisa úteis para a identificação de novos agonistas e antagonistas de membros da família CNTF de citóquinas.

Outro objectivo do invento é o desenvolvimento de sistemas de pesquisa úteis para a identificação de pequenas moléculas que actuem como agonistas ou antagonistas da família CNTF de citóquinas.

Estes e outros objectivos são alcançados através da utilização de componentes do receptor da família CNTF para produzir intermediários não funcionais os quais têm actividade terapêutica como antagonistas de IL-6 e de CNTF, assim como utilidade em sistemas de ensaio úteis para identificar novos agonistas e antagonistas dos membros da família CNTF de citóquinas.

BREVE DESCRICÃO DAS FIGURAS FIGURA 1: Ligação ordenada dos componentes do receptor num modelo de um receptor de citóquinas genérico. O modelo indica que as citóquinas contêm até 3 locais de ligação ao receptor e que interagem com os componentes do seu receptor ligando-se primeiro ao componente α opcional, seguindo-se a ligação a βΐ e depois a β2. Os componentes β para muitos receptores de citóquinas interagem através de regiões próximas da membrana (caixas sombreadas) com a família Jak/Tyk de proteínas citoplasmáticas tirosina-quinases. Apenas após dimerização dos componentes β a transdução de sinal é iniciada, tal como esquematizado pelas fosforilações da tirosina (P) dos componentes β e das quinases Jak/Tyk. FIGURA 2: CNTF inibe respostas a IL-6 numa linha celular PC 12 (chamada PC12D) que expressa IL-6Ra, gpl30, CNTFRa, mas não υΠΠβ. Células PC12D privadas de soro foram incubadas + IL-6 (50 ng/ml) na presença ou ausência de CNTF tal como indicado. Algumas placas também receberam IL-6Ra solúvel (1 mg/ml) ou CNTFRa solúvel (1

83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ 6 mg/ml) tal como indicado. Lisados celulares foram sujeitos a imunoprecipitação com anti-gpl30 e imunomarcados com anti-fosfotirosina. A fosforilação da tirosina de gpl30 é indicativa da activação induzida por IL-6 do sistema receptor de IL-6, que é bloqueado por co-adição de CNTF. FIGURA 3: Análise “Scatchard” de ligação de CNTF iodado em células PC12D. As células PC12D foram incubadas com várias concentrações de CNTF iodado na presença ou ausência dum excesso de competidor não radioactivo para determinar a ligação especifica. A figura mostra um gráfico “Scatchard” da quantidade de CNTF iodado especificamente ligado e dá dados consistentes com dois locais de ligação com constantes de dissociação de 9 pM e 3,4 nM.

DESCRICÂO DETALHADA DO INVENTO O presente invento proporciona novos antagonistas que são baseados nos componentes do receptor que são partilhados por citóquinas tais como a família CNTF de citóquinas. O invento aqui descrito contempla a produção de antagonistas para qualquer citóquina que utilize um componente α determinante de especificidade que, quando combinado com a citóquina, se liga a um primeiro componente β transdutor de sinal para formar um intermediário não funcional que então se liga a um segundo componente β transdutor de sinal causando dimerização do receptor β e consequente transdução de sinal. De acordo com o invento, o componente solúvel α determinante de especificidade do receptor (sRa) e o domínio extracelular do primeiro componente β transdutor de sinal do receptor de citóquina (βΐ) são combinados para formar heterodímeros (sRa^l) que actuam como antagonistas para a citóquina através da ligação à citóquina para formar um complexo não funcional.

Tal como descrito no Exemplo 1, CNTF e IL-6 partilham o componente βΐ de receptor de gpl30. O facto de que CNTF forma um intermediário com CNTFRa e gpl30 pode ser demonstrado (Exemplo 1) em células não possuindo ίΙΡΕβ, onde o complexo de CNTF e CNTFRa se liga a gpl30 e evita a homodimerização de gpl30 por IL-6 e IL-6Ra, bloqueando deste modo a transdução de sinal. Estes estudos proporcionam a base para o desenvolvimento dos antagonistas de IL-6 aqui descritos, uma vez que mostram que se, na presença de um ligando, pode ser formado um complexo intermediário não funcional, que consista no ligando, no seu componente α receptor e no seu componente receptor βΐ, ele bloqueará eficazmente a acção do ligando. Outras citóquinas podem utilizar outros 7 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ componentes receptores βΐ, tais como LIFR-β, que podem ser também utilizados para produzir antagonistas de acordo com o presente invento.

Assim por exemplo, numa concretização do invento, os antagonistas eficazes de IL-6 ou CNTF consistem em heterodímeros dos domínios extracelulares dos componentes a determinantes de especificidade dos seus receptores (sIL-6Ra e sCNTFRa respectivamente) e no domínio extracelular de gpl30. Os heterodímeros resultantes, que são referidos de aqui em diante como sIL-6Ra^l e sCNTFRa:βΐ respectivamente, funcionam como armadilhas de alta afinidade para IL-6 ou CNTF, respectivamente, deixando deste modo a citóquina inacessível para formar um complexo de transdução de sinal com as formas nativas ligadas à membrana dos seus receptores.

Embora se tenha provado que os domínios solúveis de ligação ao ligando da porção extracelular dos receptores são de certa maneira eficazes como armadilhas para os seus ligandos e assim actuam como antagonistas [Bargetzi, et al., Câncer Res. 53: 4010-4013 (1993);, et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 89: 8616-8620 (1992); Mohler, et al., J. Immunol. 151 : 1548-1561 (1993); Narazaki, et ai, Blood 82: 1120-1126 (1993)], os receptores de IL-6 e CNTF são invulgares na medida em que os componentes α dos receptores constituiem domínios de ligação aos ligandos que, de acordo com os seus ligandos, funcionam eficazmente na forma solúvel como agonistas dos receptores. [Davis, et al., Science 259: 1736-1739 (1993); Taga, et al., Cell 58: 573-581 (1989)]. Os heterodímeros sRa-.βΙ preparados de acordo com o presente invento proporcionam armadilhas eficazes para os seus ligandos, ligando estes ligandos com afinidades na ordem de picomolar (com base em estudos de ligação de CNTF a células PC12D) sem criarem intermediários funcionais.

Os domínios extracelulares dos receptores α e β podem ser preparados utilizando métodos conhecidos pelos peritos na arte. O receptor CNTFRa foi clonado, sequenciado e expresso [Davis, et al., (1991) Science 253: 59-63 que é aqui incorporado por referência na sua totalidade]. As clonagens de e de gpl30 são descritas em Gearing et al. em EMBO J. 10: 2839-2848 (1991), Hibi, et al. Cell 63: 1149-1157 (1990) e no pedido PCT WO 93/10151 publicado em 27 de Maio de 1993, todos aqui incorporados por referência na sua totalidade.

As moléculas receptoras úteis para a prática do presente invento podem ser preparadas através de clonagem e expressão num sistema de expressão eucariota ou procariota. O gene do receptor recombinante pode ser expresso e purificado utilizando vários métodos. O gene que codifica o factor pode ser subclonado num vector de expressão bacteriano, tal como por exemplo, mas não limitado a, pCPl 10. 8 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ

Os factores recombinantes podem ser purificados através de qualquer técnica que permita a subsequente formação de uma proteína activa biologicamente estável. Por exemplo, mas sem limitação, os factores podem ser recuperados de células tanto na forma de proteínas solúveis como de corpos de inclusão, a partir dos quais podem ser extraídos quantitativamente através de cloridrato de guanidínio 8M e diálise. Para continuar a purificar os factores, podem ser utilizadas cromatografia de permuta iónica, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de fase inversa ou filtração em gel, convencionais.

Os receptores heterodiméricos sRa:p podem ser construídos utilizando regiões de fusão conhecidas, tal como descrito no pedido de PCT WO 93/10151 publicado em 27 de Maio de 1993 intitulado “Receptor for Oncostatin M and Leukemia Inhibitory Factor” que descreve a produção de heterodímeros receptores β, ou podem ser preparados através de ligação cruzada dos domínios extracelulares por meios químicos. Os domínios utilizados podem consistir no domínio extracelular inteiro dos componentes α e β, ou podem consistir em mutantes ou fragmentos destes que mantenham a capacidade de formar um complexo com o seu ligando e outros componentes no complexo sRa^l.

Numa concretização do invento, os domínios extracelulares são construídos utilizando “fechos” de leucina. Foi demonstrado que os domínios do fecho de leucina dos factores de transcrição humanos c-jun e c-fos formam heterodímeros estáveis [Busch e Sassone-Corsi, Trends Genetics 6: 36-40 (1990); Gentz, et ai, Science 243: 1695-1699 (1989)] com uma estequeometria de 1:1. Embora também se tenha demonstrado que se formam homodímeros jun-jun, estes são cerca de 1000 vezes menos estáveis do que os heterodímeros jun-fos. Não foram detectados homodímeros fos-fos. O domínio do “fecho” de leucina tanto de c-jun como de c-fos estão fundidos numa estrutura do terminal-C dos domínios solúveis ou extracelulares dos componentes dos receptores acima mencionados através de genes quiméricos construídos geneticamente. As fusões podem ser directas ou podem empregar um domínio ligante flexível, tal como a região charneira do IgG humano, ou polipéptidos de ligação que consistem em pequenos aminoácidos tais como glicina, serina, treonina ou alanina, com vários comprimentos e combinações. Adicionalmente, as proteínas quiméricas podem ser sinalizadas por His-His-His-His-His-His (His6), [SEQ ID NO: 1] para permitir uma rápida purificação através de cromatografia com quelato de metais e/ou através de epitopos para os quais estão disponíveis anticorpos, para permitir a detecção em análises de Western, imunoprecipitação, ou depleção/bloqueio de actividade em bioensaios.

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Noutra concretização ο heterodímero sRa:pl é preparado utilizando um método semelhante, mas utilizando o domínio Fc de IgGl humana [Aruffo, et al., Cell 67:35-44 (1991)]. Em contraste com o anterior, a formação de heterodímeros tem que ser alcançada bioquimicamente, uma vez que moléculas quiméricas portadoras do domínio Fc serão expressas como homodímeros ligados por ligações dissulfureto. Assim, os homodímeros podem ser reduzidos sob condições que favorecem a destruição das ligações dissulfureto inter-cadeias que não afectam as ligações dissulfureto intra-cadeias. Depois os monómeros com porções extracelulares diferentes são misturados em quantidades equimolares e oxidados para formar uma mistura de homo e heterodímeros. Os componentes desta mistura são separados através de técnicas cromatográficas. Altemativamente, a formação deste tipo de heterodímeros pode ser dirigida por engenharia genética e expressão de moléculas que consistem na porção solúvel ou extracelular dos componentes do receptor seguidos pelo domino Fc da hlgG, seguido quer pelos “fechos” de leucina c-jun ou c-fos descritos acima [Kostelny, et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)]. Uma vez que estes “fechos” de leucina formam predominantemente heterodímeros, eles podem ser utilizados para conduzir a formação de heterodímeros onde desejados. Assim como para as proteínas quiméricas descritas utilizando fechos de leucina, estes também podem ser sinalizados com quelatos metálicos ou um epitopo. Este domínio sinalizado pode ser utilizado para purificação rápida através de cromatografia com quelato de metais, e/ou através de anticorpos, para permitir a detecção em análise de Western, imunoprecipitação ou depleção/bloqueio de actividade em bioensaios.

Noutra concretização do invento os heterodímeros sRa:pi são preparados através da expressão de moléculas quiméricas utilizando dobras de ligação flexíveis. Uma construção de ADN codificando a proteína quimérica é desenhada de tal maneira que expresse dois domínios solúveis ou extracelulares fundidos em série (“cabeça com cabeça”) através de uma dobra flexível. Esta dobra pode ser inteiramente artificial (p. ex. repetições de poliglicina interrompidas por serina ou treonina com um certo intervalo) ou “emprestada” por proteínas de ocorrência natural (p. ex., a região charneira de hlgG). Podem ser construídas moléculas nas quais a ordem dos domínios solúveis ou extracelulares fundidos é trocada (p. ex. sIL6Ra/dobra/sgpl30 ou sgpl30/dobra/sIL6Ra) e/ou nas quais o comprimento e a composição da dobra é variado, para permitir a selecção de moléculas com as características desejadas.

Altemativamente, os heterodímeros feitos de acordo com o presente invento podem ser purificados a partir de linhas celulares co-transfectadas com os apropriados componentes α e β. Os heterodímeros podem ser separados dos homodímeros utilizando métodos disponíveis a peritos na arte. Por exemplo, quantidades limitadas de heterodímeros podem 10 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ ser recuperadas através de eluição passiva de géis de poliacrilamida preparativos, não desnaturantes. Altemativamente, os heterodímeros podem ser purificados utilizando cromatografia de permuta catiónica de alta pressão. Uma excelente purificação foi obtida utilizando uma coluna de permuta catiónica Mono S.

Adicionalmente aos heterodímeros sRa:pi que actuam como antagonistas ligando-se a CNTF ou IL-6 livres, o presente invento contempla também a utilização de versões mutadas e construídas de IL-6 com propriedades novas que lhes permitem ligar-se a IL-6Ra e a uma única molécula de gpl30, mas que não se ligam ao segundo gpl30 para completar a homodimerização do componente β, e que assim actuam como um antagonista eficaz de IL-6 em qualquer célula que responda a IL-6. O nosso modelo para a estrutura dos complexos dos receptores de IL-6 e CNTF indica que estas citóquinas têm locais distintos para a ligação aos componentes receptores α, βΐ e β2 [Stahl e Yancopoulos, Cell 74: 587-590 (1993)]. Mutações de resíduos dos aminoácido críticos que constituem cada um destes locais origina moléculas novas que têm as propriedades antagonistas desejadas. A ablação do local βΐ daria uma molécula que ainda se poderia ligar ao componente receptor α mas não ao componente βΐ, e portanto constituiria um antagonista com afinidade nanomolar. Mutações de resíduos de aminoácido· críticos compreendendo o local β2 de IL-6 (Π_,-6β2-) dariam uma molécula que se ligaria a IL-6Ra e ao primeiro monómero de gpl30, mas que não se ligaria ao segundo gpl30 e assim seria funcionalmente inactiva. De forma semelhante, mutações do local β2 de CNTF dariam uma molécula ^ΝΤΡβ2-) que se ligaria a CNTFRa e a gpl30, mas que não se ligaria a ίΠ^β, antagonizando portanto a acção de CNTF ao formar o intermediário não funcional βΐ. Com base nos resultados de ligação descritos acima onde CNTF forma o intermediário βΐ com alta afinidade, tanto CNTFβ2- como ΙΤ-6β2- iriam constituir antagonistas com afinidade na ordem dos 10 pM. São utilizados vários meios para criar e identificar mutações de IL-6 ou CNTF que tenham as propriedades desejadas. Podem ser utilizada mutagénese aleatória através de métodos padrão do ADN que codifica IL-6 ou CNTF, seguida de análise da colecção de produtos para identificar citóquinas mutadas possuindo as propriedades novas desejadas tal como delineado abaixo. A mutagénese por engenharia genética tem sido utilizada extensivamente para elucidar a organização estrutural de domínios funcionais de proteínas recombinantes. Várias abordagens diferentes têm sido descritas na literatura para realizar mutagénese por deleção ou substituição. A de maior sucesso parece ser a mutagénese por pesquisa de alanina [Cunningham e Wells (1989), Science 244: 1081-1085] e mutagénese por pesquisa de homólogos [Cunningham, et al., (1989), Science 243:1330-1336].

83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ 11 A mutagénese dirigida das sequências de ácidos nucleicos de IL-6 ou CNTF utilizando tais métodos pode ser utilizada para criar candidatos a CNTFp2 ou IL-6P2. A escolha das regiões apropriadas para a mutagénese dirigida é feita sistematicamente ou determinada a partir de estudos pelos quais são utilizados painéis de anticorpos monoclonais contra cada um dos factores para mapear regiões das citóquinas que possam ser expostas após ligação da citóquina ao componente receptor α sozinho, ou aos receptores solúveis heterodiméricos αβί descritos acima. De forma semelhante, a modificação química ou a proteólise limitada da citóquina sozinha ou num complexo ligada ao componente receptor a ou aos receptores solúveis heterodiméricos αβί acima descritos, seguidas da análise das regiões protegidas e expostas podia revelar potenciais locais de ligação β2.

Os ensaios para identificar CNTF ou IL-6 mutantes com as propriedades desejadas envolvem a capacidade de bloquear com alta afinidade a acção de IL-6 ou CNTF em linhas celulares apropriadamente responsivas [Davis, et al., Science 259: 1736-1739 (1993); Murakami et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 11349-11353 (1991)]. Tais ensaios incluem proliferação celular, sobrevivência ou síntese de ADN conduzidos por CNTF ou IL-6 ou a construção de linhas celulares onde a ligação do factor induz a produção de repórteres tais como CAT ou β-galactosidase [Savino, et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 4067-4071 (1993)].

Altemativamente, as propriedades de vários mutantes pode ser avaliada com um ensaio baseado no receptor. Um tal ensaio consiste na pesquisa de mutantes quanto à sua capacidade para se ligarem aos heterodímeros receptores sRa^l acima descritos utilizando reagentes sRa^l sinalizados com epitopos [Davis et al, Science 253: 59-63 (1991)]. Para além disso, pode-se sondar a presença ou ausência do local β2 avaliando se quer a um reagente β2 solúvel sinalizado com o epitopo se irá ligar à citóquina na presença do heterodímero α:β1. Por exemplo, CNTF apenas se liga ao ίΠΤΙβ (o componente β2) na presença de ambos o CNTFRa e o gpl30 [Davis, et al., Science 260: 1805-1808 (1993); Stahl, et al., J. Biol. Chem. 268: 7628-7631 (1993)]. Assim um reagente LETiji solúvel apenas se ligaria a CNTF na presença do dímero do sRa: βΐ solúvel sCNTFRa^l. Para IL-6, o reagente sRa^l seria IL-6Ra^l e a sonda para o local β2 seria sgpl30 marcado com epitopo. Assim os mutantes β2 de CNTF seriam identificados como aqueles que se ligam ao reagente sRa^l, demonstrando que o local α e βΐ da citóquina estavam intactos, não se ligando no entanto ao reagente β2.

Adicionalmente, o presente invento proporciona métodos de detecção ou medição da actividade de potenciais mutantes de β2 através da medição da fosforilação de um

83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ 12 componente β do receptor ou de um componente de transdução de sinal seleccionado do grupo que consiste em Jakl, Jak2 e TYk2 ou qualquer outro componente de transdução de sinal, tal como os CLIP, que estão determinados como sendo fosforilados em resposta a um membro da família de citóquinas CNTF.

Uma célula que expressa o(s) componente(s) de transdução de sinal aqui descritos pode fazê-lo naturalmente ou ser geneticamente modificada para o fazer. Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos que codificam Jakl e Ttyk-2 obtidas tal como descrito por Velazquez, et ai, Cell, Vol. 70: 313-322 (1992), podem ser introduzidas numa célula por transdução, transfecção, microinjecção, electroporação, através de um animal transgénico, etc., utilizando qualquer método conhecido na arte.

De acordo com o invento, as células são expostas a um potencial antagonista e a fosforilação da tirosina tanto do(s) componente(s) β como do(s) componente(s) de transdução de sinal é comparada com a fosforilação da tirosina do(s) mesmo(s) componente(s) na ausência do potencial antagonista.

Noutra concretização do invento, a fosforilação da tirosina que resulta do contacto das células acima com o potencial antagonista é comparada com a fosforilação da tirosina nas mesmas células expostas ao parente membro da família CNTF. Em tais ensaios, a célula tem que expressar o receptor extracelular (componente a) ou as células podem ser expostas ao agente de teste na presença do componente receptor solúvel. Assim, por exemplo, num sistema de ensaio desenhado para identificar agonistas ou antagonistas de CNTF, a célula pode expressar o componente α CNTFRa, os componentes β gpl30 e LIFR£ e um componente de transdução de sinal tal como o Jakl. A célula é exposta a agentes de teste, e a fosforilação da tirosina dos componentes β ou do componente de transdução de sinal é comparada com o padrão de fosforilação produzido na presença de CNTF. Altemativamente, a fosforilação da tirosina que resulta da exposição a um agente de teste é comparada com a fosforilação que ocorre na ausência do agente de teste. Altemativamente, um sistema de ensaio, por exemplo, para IL-6 pode envolver a exposição de uma célula que expressa o componente β gpl30 e uma proteína transdutora de sinal tal como a Jakl, Jak2 ou Tyk2 a um agente de teste em conjunção com o receptor de IL-6 solúvel.

Numa outra concretização do invento as abordagens de cima são utilizadas para desenvolver um método para pesquisar pequenas moléculas antagonistas que actuam em vários passos no processo de ligação do ligando, formação do complexo receptor e subsequente transdução de sinal. As moléculas que potencialmente interferem com as interacções ligando-receptor são pesquisadas através da avaliação da interferência da 13 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ formação do complexo entre os receptores solúveis e o ligando tal como acima descrito. Altemativamente, ensaios baseados em células nas quais IL-6 ou CNTF induzem respostas de um gene repórter são pesquisadas em bibliotecas de pequenas moléculas ou produtos naturais para identificar potenciais antagonistas. As moléculas que mostram actividade antagonista são novamente pesquisadas em ensaios baseados em células que respondem a outros factores (tais como GMCSF ou factores como Neurotrofina-3 que activam receptores de tirosina-quinase) para avaliar a sua especificidade contra a família de factores CNTF/IL-6/OSM/LIF. Tais pesquisas baseadas em células são utilizadas para identificar antagonistas que inibem qualquer um de vários alvos no processo de transdução de sinal.

Num tal sistema de ensaio, o alvo especifico para antagonistas é a interacção da família Jak/Tyk de quinases [Firmbach-Kraft, Oncogene 5: 1329-1336 (1990); Wilks, et al., Mol. Cell. Biol. 11: 2057-2065 (1991)] com as subunidades β do receptor. Tal como acima descrito, LIFRp e gpl30 associam-se previamente a membros da família Jak/Tyk de proteínas tirosina-quinase citoplasmáticas, que se tomam activadas em resposta à dimerização do componente β induzida pelo ligando (Stahl, et al., Science (submetido em 1993). Assim, pequenas moléculas que podiam entrar no citoplasma da célula e interromper a interacção entre o componente β e a quinase Jak/Tyk podiam potencialmente bloquear toda a sinalização intracelular subsequente. Tal actividade podia ser pesquisada com um esquema in vitro que avaliasse a capacidade de pequenas moléculas para bloquearem a interacção entre domínios de ligação relevantes do componente β purificado e a quinase Jak/Tyk. Altemativamente, podia-se facilmente pesquisar moléculas que podessem inibir um ensaio baseado em leveduras da ligação do componente β às quinases Jak/Tyk utilizando o sistema de interacção de dois híbridos [Chien, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 9578-9582 (1991)]. Num tal sistema, a interacção entre duas proteínas (componente β e quinase Jak/Tyk ou domínios relevantes destes neste exemplo) induz a produção de um marcador conveniente tal como a β-galactosidase. Colecções de pequenas moléculas são testadas quanto à sua capacidade para interromper a interacção desejada sem inibir a interacção entre as duas proteínas de controlo. A vantagem desta pesquisa seria a necessidade dos compostos de teste entrarem na célula antes de inibirem a interacção entre o componente β e a quinase Jak/Tyk.

Os antagonistas da família CNTF aqui descritos ligam-se a, ou competem com as citóquinas CNTF e IL-6. De acordo com isto, são úteis para tratar doenças ou desordens mediadas por CNTF ou IL-6. Por exemplo, as utilizações terapêuticas dos antagonistas de IL-6 incluiriam o seguinte: 1) Na osteoporose, que pode ser exacerbada pela diminuição dos níveis de estrogénio em mulheres pós-menopausa ou através de ovariectomia, a IL-6 parece ser um mediador

83 915

EP 0 726 954/PT 14 crítico da osteoclastogénese, conduzindo a reabsorção óssea [Horowitz, Science 260: 626-627 (1993); Jilka, et al, Science 257: 88-91 (1992)]. De grande importância, a IL-6 apenas parece desempenhar um papel principal no estado de falta de estrogénio e aparentemente está minimamente envolvido na normal manutenção do osso. Consistentes com isto, evidências experimentais indicam que anticorpos bloqueadores de função para IL-6 podem reduzir o número de osteoclastos [Jilka, et al., Science 257: 88-91 (1992)]. Enquanto que a terapia de substituição do estrogénio é também utilizada, parecem existir efeitos secundários que podem incluir o aumento do risco de cancro do endométrio e cancro da mama. Assim, os antagonistas de IL-6 como aqui descritos seriam mais específicos para reduzir a osteoclastogénese para níveis normais. 2) A IL-6 parece estar directamente envolvida em mielomas múltiplos actuando de forma autócrina ou parácrina para promover a formação de tumor [van Oers, et al, Ann. Hematol. 66: 219-223 (1993)]. Para além disso, os níveis elevados de IL-6 criam efeitos secundários indesejáveis tais como reabsorção óssea, hipercalcemia e caquexia; em estudos limitados, anticorpos bloqueadores de função para IL-6 ou IL-6Rct têm alguma eficácia [Klein, et al., Blood 78: 1198-1204 (1991); Suzuki, et al, Eur. J. Immunol. 22: 1989-1993 (1992)]. Por este motivo, os antagonistas de IL-6 tal como aqui descritos seriam benéficos tanto para os efeitos secundários como para inibir o crescimento do tumor. 3) IL-6 pode ser um mediador do factor de necrose tumoral (TNF) que leva a caquexia associada a SIDA e cancro [Strassmann, et al., J. Clin. Invest. 89: 1681-1684 (1992)], talvez através da redução da actividade da lipoproteína-lipase no tecido adiposo [Greenberg, et ai, Câncer Research 52: 4133-4116 (1992)]. De acordo com isto, os antagonistas aqui descritos seriam úteis para aliviar ou reduzir a caquexia em tais doentes.

Doses eficazes, úteis para o tratamento destas ou de outras doenças ou desordens relacionadas com a família CNTF podem ser determinadas utilizando métodos conhecidos por peritos na arte [ver, por exemplo, Fingi, et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co., New York, págs. 1-46 (1975)]. As composições farmacêuticas para utilização de acordo com o invento incluem os antagonistas acima descritos num transportador líquido, sólido ou semi-sólido farmaceuticamente aceitável, ligado a um transportador ou molécula direccionante (p. ex., anticorpo, hormona, factor de crescimento, etc.) e/ou incorporado em lipossomas, microcápsulas e numa preparação de libertação controlada (incluindo células que expressem os antagonistas) antes da administração in vivo. Por exemplo, a composição farmacêutica pode compreender um ou mais dos antagonistas numa solução aquosa, tal como água estéril, solução salina, tampão fosfato ou solução de dextrose. Altemativamente, os agentes activos

83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ 15 podem estar compreendidos numa formulação sólida (p. ex. cera) ou semi-sólida (p. ex. gelatinosa) que pode ser implantada num doente que necessite de tal tratamento. A via de administração pode ser qualquer modo de administração conhecido na arte, incluindo mas não se limitando a intravenosa, intra-tecal, subcutânea, por injecção no tecido envolvido, intra-arterial, intranasal, oral ou através de um dispositivo implantado. A administração pode resultar na distribuição do agente activo do invento em todo o corpo ou numa área localizada. Por exemplo, em algumas condições que envolvem regiões distantes do sistema nervoso, pode ser desejável a administração intravenosa ou intra-tecal do agente. Nalgumas situações, um implante contendo agente activo pode ser colocado na ou perto da área lesionada. Os implantes adequados incluem, mas não estão limitadas a, implantes à base de espuma gelatinosa, cera ou micropartículas. EXEMPLO 1: CNTF COMPETE COM IL-6 PELA LIGAÇÃO A GP130

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais. Foi obtido um clone de células PC 12 que respondem a IL-6 (PC12D) em DNAX. CNTF de rato foi preparado tal como descrito [Masiakowski, et al., J. Neurochem. 57: 1003-10012 (1991)]. IL-6 e sIL6R foram comprados a R & D Systems. Os anti-soros foram criados em coelhos contra um péptido derivado de uma região próxima do terminal-C de gpl30 (sequência: CGTEGQVERFETVGME) [SEQ ID NO: 2] através do método descrito [Stahl, et al., J. Biol. Chem. 268:7628-7631 (1993)]. O anti-corpo anti-fosfotirosina monoclonal 4G10 foi comprado a UBI e os reagentes de ECL a Amersham.

Ensaios de Transducão de Sinal. Foram condicionadas placas (10 cm) de PC12D em meio isento de soro (RPMI 1640 + glutamina) durante 1 hora, e depois incubaram-se com IL-6 (50 ng/ml) + sIL-6R (1 μg/ml) na presença ou ausência de CNTF de rato nas concentrações indicadas durante 5 minutos a 37°C. As amostras foram então sujeitas a imunoprecipitação com anti-gpl30, SDS PAGE e imunomarcação com anti-fosfotirosina tal como descrito [Stahl, et al, J. Biol. Chem. 268: 7628-7631 (1993)].

RESULTADOS A capacidade de CNTF para bloquear respostas de IL-6 foi medida utilizando uma linha celular PC12 (chamada PC12D) que expressa IL-6Ra, gpl30 e CNTFRa, mas não LIFRp. Tal como se podia prever, estas células respondem a IL-6, mas não a CNTF (FIG. 2) 16 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ uma vez que LIFR-β é um componente necessário para a transdução do sinal de CNTF [Davis, et al, Science 260: 59-63 (1993)]. De acordo com os resultados em outras linhas celulares [Ip, et al., Cell 69: 1121-1132 (1992)], as células PC12D dão fosforilação da tirosina de gpl30 (assim como de uma variedade de outras proteínas chamadas CLIP) em resposta a IL-6 2 nM (Fig. 2). A adição de IL-6Ra solúvel recombinante (sIL-6Rct) aumenta o nível de fosforilação da tirosina de gpl30, tal como foi relatado em alguns outros sistemas [Taga, et al., Cell 58: 573-581 (1989)]. No entanto, a adição de CNTF 2 nM simultaneamente com IL-6 diminui severamente a fosforilação da tirosina de gpl30. Embora permaneça uma pequena resposta de fosforilação de gpl30 na presença de CNTF, IL-6 e sIL-6Ra, esta é eliminada se a concentração de CNTF for aumentada quatro vezes para 8 nM. Deste modo, em células que respondem a IL-6 que contêm CNTFRa mas não LEFRp, o CNTF é um antagonista bastante potente da acção de IL-6.

EXEMPLO 2. LIGAÇÃO DE CNTF AO CNTFRa :B

MATERIAIS E MÉTODOS

Análise “Scatchard” da Ligação de CNTF. Foi preparado e purificado l25I-CNTF tal como descrito [Stahl et al. JBC 268: 7628-7631 (1993)]. Foram realizados estudos de saturação de ligação em células PC12, utilizando concentrações de I-CNTF variando de 20 pM a 10 nM. A ligação foi realizada directamente numa monocamada de células. O meio foi removido dos poços e as células foram lavadas uma vez com tampão de ensaio que consiste em solução salina de tampão fosfato (PBS; pH 7,4), bacitracina 0,1 mM, PMSF 1 mM, 1 pg/ml de leupeptina e 1 mg/ml de BSA. As células foram incubadas em I-CNTF durante 2 horas à temperatura ambiente, seguida de 2 lavagens rápidas com tampão do ensaio. As células foram lisadas com PBS contendo 1% de SDS e contadas num Contador Packard Gamma a 90-95% de eficiência. A ligação não específica foi definida pela presença de um excesso de 100 vezes de CNTF não marcado. A ligação específica variou de 70 a 95%.

RESULTADOS A constante de equilíbrio para a ligação de CNTF a CNTFRa:βΐ foi estimada a partir da análise “Scatchard” de ligação de CNTF iodado em células PC12D (Figura 3). Os dados são consistentes com um ajuste a 2 locais tendo constantes de dissociação de 9 pM e 3,4 nM. O local de baixa afinidade corresponde à interacção de CNTF com CNTFRa, que tem uma Kd próxima de 3 nM [Panayotatos, et al, J. Biol. Chem. 268: 19000-19003 (1993)]. Interpretamos o complexo de alta afinidade como o intermediário que contém CNTF, CNTFRa e gpl30. Uma linha celular de sarcoma de Evving (EW-1) que contém CNTFRa, 17 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ gpl30 e LIFRp e que por esse motivo dá uma robusta fosforilação de tirosina em resposta a CNTF, mostra um ajuste a dois locais muito semelhante às constantes de dissociação de 1 nM e 10 pM (Wong, et al., dados não publicados). Assim, é aparente que CNTF se liga com igual alta afinidade a um complexo contendo apenas CNTFRa e gpl30, tal como o faz a um complexo que contém adicionalmente LIFRp, demonstrando deste modo a viabilidade da criação dos antagonistas sRa:P aqui descritos. (Segue Listagem de Sequências) 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

(ii) TÍTULO DO INVENTO: Antagonistas da Família CNTF (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Regeneron Pharmaceuticals, Inc. (B) RUA: 777 Old Saw Mill River Road (C) CIDADE: Tarrytown (D) ESTADO: New York (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 10591 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO CORRENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR/AGENTE: (A) NOME: Kempler PhD., Gail M. (B) NÚMERO DE REGISTO: 32143 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/CERTIFICADO: REG 200 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 914-345-7400 (B) TELEFAX: 914-345-7721 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida 19 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

His His His His His His 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: desconhecido (D) TOPOLOGIA: desconhecida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Cys Gly Thr Glu Gly Gin Vai Glu Arg Phe Glu Thr Vai Gly Met Glu 1 5 10 15

Lisboa, 25. JAfi. 2000

Por REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. - O AGENTE OFICIAL - Λ

O ADJUNTO

ENG.® ANTÓNIO JOÁO DA CUNHA FERREIRA

Ag. Of. Pr. Ind.

Rua dos Flores, 74 - 4.* 1BOO LISBOA

Claims

83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína antagonista de citóquinas capaz de se ligar a uma citóquina para formar um complexo não funcional, antagonista este que compreende: (a) o componente α solúvel que determina a especificidade do receptor de citóquina; e (b) um domínio extracelular de um componente β do receptor de citóquina.
2. Proteína de acordo com a reivindicação 1 em que a citóquina é Interleucina-6 (IL-6) ou o factor neurotrófico ciliar (CNTF).
3. Proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o domínio extracelular (b) é o domínio extracelular de gpl30.
4. Proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que o domínio extracelular (b) é o domínio extracelular de LIFRp.
5. Proteína de acordo com a reivindicação 2 ou 3 em que a citóquina é CNTF, o componente α (a) é sCNTFRa e o domínio extracelular (b) é o domínio extracelular de gpl30.
6. Proteína de acordo com a reivindicação 2 ou 3 em que a citóquina é IL-6, o componente α (a) é sIL-6Ra e o domínio extracelular (b) é o domínio extracelular de gpl30.
7. Sequência de ADN que codifica uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Composição farmacêutica compreendendo uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável.
9. Proteína de acordo com a reivindicação 6 para utilização num método de tratamento de uma doença ou desordem relacionada com IL-6.
10. Proteína de acordo com a reivindicação 6 para utilização num método de tratamento de osteoporose num doente com depleção de estrogénios.
11. Proteína de acordo com a reivindicação 6 para utilização num método de tratamento de mieloma múltiplo num doente. 83 915 ΕΡ Ο 726 954/ΡΤ 2/2
12. Proteína de acordo com a reivindicação 6 para utilização num método de tratamento de caquexia num doente. Lisboa, 25. “AM. 2000 Por REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. - O AGENTE OFICIAL -