PT1097173E - Utilização de péptidos de il-2 e dos seus derivados como agentes terapêuticos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÃO DE PÉPTIDOS DE IL-2 Ξ DOS SEUS DERIVADOS COMO AGENTES TERAPÊUTICOS A presente invenção tem por objecto novos péptidos de IL-2 e os seus derivados e a sua utilização como agentes terapêuticos. A interleucina-2 (IL-2) é o principal factor de crescimento dos linfócitos T (THEZE et al. 1998, Immunol. Today 17: 481-486). Ao regular a actividade auxiliar dos linfócitos T, a IL-2 aumenta as repostas imunitárias humorais e celulares. Estimulando as células T de CD8 (cúmulo de diferenciação 8) e as células NK (natural killer) cito- tóxicas, esta citocina participa nos mecanismos de defesa contra tumores e infecções virais. Utiliza-se a IL-2 na terapia contra o melanoma mestastásico e no adenocarcinoma renal. IL-2 utiliza-se em ensaios clínicos em muitas formas de cancro (LOTZE e ROSENBERG 1988, Interleukin 2 as a Pharmacologic Reagent, em Interleuckin 2, K. A. Smith,

Academic Press: p. 237-89). Também se utiliza em pacientes infectados com VIH e leva a um aumento significativo das contagens de CD4 (KOVACS et al. ' 1996, New Engl. J. of Medicine 1350-6). A IL-2 humana é uma proteína com 133 aminoácidos (aa) composta por quatro hélices a ligadas por anéis de vários comprimentos; já se estabeleceu a sua estrutura tridimensional. O R-IL-2 (receptor de IL-2) é composto por três cadeias α, β e γ. O R-IL-2a controla a afinidade do receptor. Os R-IL-2B e R-IL-2Y são responsáveis pela transdução do sinal de IL-2. As diferentes áreas moleculares de IL-2 que interagem com as três cadeias de R-IL-2 2 já foram definidas. Mais especificamente determinou-se que uma hélice A de a, assim como a área do terminal NH2 de IL-2 (resíduos 1 a 30) controla as inferacções IL-2/R-IL-26 (ECKENBERG et al. 1997, Cytokine 9: 488-98): à cadeia de R-IL-25 é a mais importante na sinalização de IL-2 (THÈZE et al. 1990).

Os efeitos da interleucina-2 (IL-2) humana nas res-pectivas células alvo são mediados através de receptores específicos da superfície das células (R-IL-2) (TANIGUCHI et al. (1983) Nature 302: 305-310; ROBB et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:.' 6486-6490; SMITH KA. ,1988a. Interleukin-2; SMITH KA (1988b) Science 240: 1169-1176). R-IL-2 compreende pelo menos três sub-unidades codificadas por genes diferentes (MINAMI et al. (1993) Annu. Rev. Immunol. 11: 245-267; TANIGUCHI et al. (1993) Cell 73: 5-8). O primeiro componente a ser identificado, R-IL-2a, é uma proteína de 55 kDa que se liga a IL-2 com um Kd de ~ 10 nM (UCHIYAMA et al. (1981) J. Immunol . 126: 1293-1297; LEONARD et al. (1984) Nature 311: 626-631). 0 papel do R-IL-2oi (KUMAR et al. (1987) J. Iiranunol. 139: 3680-3684) e a influência de IL-2 na expressão do gene do R-IL-2a já foram estudados (BISMUTH et al. (1985) Eur. J. Immunol. 15: 723-727; FROUSSARD et al. (1991) Mol. Immunol. 28: 87-93). O segundo componente de R-IL-2, R-IL-2S é uma proteína de 75 kDa com um grande domínio intracitoplásmico (286 aa) (TESHIGAWARA et al. (1987) J. Exp'. Med. . 165: 223-238; HATAKEYAMA et al. (1989) Science 244: 551-556; TSUDO et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 1982-1986). O último componente a ser identificado, 1L-2Ry, é uma proteína de 64 kDa (TAKESHITA et al. (1992) Science 257: 379-382; ISHII et al. (1994) Int. Immunol. 6: 1273-1277). R-IL-25 e R-IL-2y pertencem à família dos receptores de hematopoietina em que R-IL-2a pertence a outra família de moléculas (THÈZE J 3 (1994) Eur. Cytokine Netw. 5.: 353-368). No sistema do rato são necessárias as três para formar um receptor funcional (MOREAU et al. ; (1995a) J. Immunol. 155: 3401-3408; CHASTAGNER et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26: 201-206). No sistema humano,, dois receptores são funcionais. Quando associados, R-IL-2B humano mais R-IL-2y formam um receptor com uma afinidade intermédia com uma Kd of 1 nM, enquanto a expressão das três cadeias leva à formação de um R-IL-2 de elevada afinidade (Kd ~ 10 pM)* A estrutura de IL-2 (MACKAY D (1992) Science 257: 410-413) é composta por um núcleo compacto envolvido por quatro hélices α anti-paralelas ligadas por três anéis (Figura 1). Algumas das interacções entre IL-2 e as sub-unidades de R-IL-2a (SAUV et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 4636-4640; WANG et al. (1995) Fur. J. Immunol. 25: 1212-1-216) e R-IL-2y (Voss et al.· (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2428-2432; Buchli et al.. (1993) Arch. .Biochm. Biophys. 307: 411-415) já foram explicadas, mas sabe-se menos no que respeita à interaeção de IL-2/R-IL-2B, apesar do facto de a cadeia de R-IL-2P desempenhar um papel muito crítico na transduçâo do sinal (TANIGUCHI' T (1995.) Science 268: 251-255).· Já foi demonstrado que uma substituição de, Asp20 por Lis (mutante-D20K) evita a ligação a R-IL-2B (COLLINS et al. . (1988) Proc.. Natl. Acad. Sei. USA 85: 7709-7713). Num relatório recente analisou-se o papel da sequência (Leu 17, Leul8, Leul9, Asp20, Leu21.) da hélice A de IL-2a, nas interacções de IL-2/R-IL-2ÍÍ por meio da mutagénese de cassetes (BERNDT et al. (1994) Biochemistry 33: 6571-6577). Contudo os dados foram difíceis de interpretar dado que a maior parte das proteínas produzidas tinham' várias mutações dentro e fora da sequência que interessava. Só se estudou 4 um análogo com urna única mutação (L21V). Mais surpreendentemente foi referido nesse estudo que a eliminação dos resíduos 17-31 (Dell) que atravessam o segmento, origina uma proteína com uma actividade total de agonista.

Os péptidos da IL-2 e os seus derivados foram descritos em Cytokine (1997} 7: 488-498, mas não foram testados num sistema in vitro quanto á actividade bioquímica tal como a actividade de citocina e, em particular, a actividade semelhante à da IL-2. 0 pedido dê patente internacional PCT WO 9.1/02000 descreve a utilização de uma proteína mutante de IL-2 (IL-2m) resistente a proteólise, para o tratamento de doenças em que o receptor de IL-2 desempenha um papel. A IL-2m deste pedido de patente internacional PCT compreende a eliminação de 1 a 5 aminoácidos na sequência de IL-2 que corresponde aos resíduos 74, 74-78, 75-77, 76-78,' 76-79, 75, 78 e 79 da hélice C. O pedido de patente internacional. PCT WO 90/00565 descreve análogos de IL-2 com uma ou duas substituições de aminoácidos' nas hélices A, B, B', E ou F, que alteram o domínio de ligação do receptor e/ou que estabiliza a estrutura de, IL-2 de modo a' modificar a especificidade destes mutantes em relação às células que .comportam os receptores de IL-2 p55 ou p75 e, por sua vez, induzem a desejada actividade de IL-2. O pedido de patente internacional PCT WO 90/00565 descreve também análogos em que um resíduo de cisteína foi substituído por um resíduo na terminação N, na terminação C ou entre as hélices C e D de IL-2, para permitir a ligação de um ligando (toxina, anticorpo, fármaco, marcador). 5

Este pedido de patente internacional PCT utiliza os análogos descritos antes para o tratamento de doenças neoplásicas e de imunodeficiência.

Tendo em vista as deficiências mencionadas antes, concomitantemente com as análises dos agonistas e dos antagonistas de IL-2 de acordo com a técnica anterior, assim como os processos de modulação da actividade de IL-2 é claro que há uma necessidade na' técnica para este tema.

De acordo com isto, um dos objectos da presente invenção consiste em providenciar composições com uma actividade semelhante à ÍL-2 e processos para a sua utilização como agentes terapêuticos.· As aplicações desses péptidos recombinantes, sintéticos ou híbridos são assim um dos objectos da presente invenção. Estas composições definem-se como tendo as seguintes caracteristicas: a) contêm um ou mais péptidos com um comprimento de pelo menos cinco aminoácidos; e b) inibem ou simulam a ligação da hélice A da interleucina-2 (IL-2) com uma sub-unidade de um receptor de.IL-2 (1L-2R).

Um outro objecto da presente invenção consiste na utilização de um péptido purificado com as seguintes caracteristicas: a) o péptido tem pelo menos cinco aminoácidos de comprimento; b) o péptido liga-se a uma sub-unidade de um receptor de IL-2 (R-IL-2); e c) o péptido induz a fosforilação de uma sub-unidade do R-IL-2..

Um outro objecto da presente invenção consiste na preparação dos anticorpos que reconhecem os péptidos da presente invenção, e a utilização terapêutica destes anticorpos. 6

Um outro objecto da presente invenção consiste na utilização de sequências de ADN que codificam os péptidos da presente invenção e os seus derivados. Esses fragmentos de ADN são úteis para a terapia de genes, entre outras aplicações. A utilização de um ADN da sequência que se segue ATG· GCT CCG ACG AGC AGC TCC- ACC AAG AAA ACC CAG CTC CAG CTC GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC {SEQ ID NO.: 1) ou da. referida SEQ ID NO..: 1 sem o primeiro codão ATG (SEQ ID NO. : 3) consiste num dos objeçtos· particulares da presente invenção.

Ainda outro objecto da presente invenção consiste em providenciar um processo para a detecção da actividade de um péptido semelhantea IL-2, em que se mede a actividade de IL-2 por meio da ligação do R-IL-2 ao péptido que tem a actividade agonista· ou antagonista de IL-2. Ainda um outro objecto da presente invenção é a utilização de compostos que inibem a actividade de um R-IL-2 por meio do contacto do R-IL-2 com uma quantidade do péptido antagonista seleccionado, suficiente para inibir a ligação de IL-2 ao R-IL-2 em condições que permitem que ocorra a ligação do péptido ao R-IL-2.'

Um outro objecto da presente invenção consiste em providenciar um processo para a selecção de anticorpos, específico para o péptido purificado com uma actividade semelhante a IL-2 tal como se definiu aqui. Estes anticorpos monoclonais ou policlonais podem inibir a ligação de IL-2 ao R-IL-2 em condições que permite que ocorra a ligação ' do péptido ao R-IL-2. A utilização terapêutica destes anticorpos faz também parte da presente invenção. Em particular, estes anticorpos específicos para os péptidos purificados são úteis para o tratamento ou a prevenção de reacções imunitárias indesejáveis tal como rejeição de 7 enxertos ou distúrbios auto-imunes, por exemplo, artrite reumatcide.

Ainda um outro objecto da presente invenção consiste em providenciar um processo para a indução num paciente de efeitos biológicos de IL-2 por meio da administração ao paciente de uma quantidade do péptido agonista da-presente invenção, suficiente para induzir esses- efeitos biológicos, ou por meio da administração de uma combinação de várias citocinas e do péptido purificado. Pelas várias citocinas entende-se, por exemplo, IL-4, IL^9, IL-15 ou.IL-2,.

Um outro objecto da presente invenção consiste nas sequências de ácidos nucleicos correspondendo à sequência de aminoácidos do péptido purificado e dos seus derivados de acordo com a presente invenção. Um enquadramento preferido é a sequência de nucleótidos què codifica o péptido purificado IP130 com a seguinte sequência (SEQ ID NO.: 2): Met Ala Pro Tre Ser Ser Ser Tre Lis Lis Tre Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile'.Leu Asn Gli Ile Asn Asn ou uma sequência que não contém o primeiro Met {SEQ ID NO. : 4).

Esta sequência ou uma sequência dela derivada pode ser inserida num vector apropriado capaz de expressar o produto in vivo, numa bactéria ou numa célula eucariótica, particularmente numa levedura ou numa célula de mamífero. Estas estruturas são úteis para a terapia de genes entre outras utilizações.

Com os. objectos anteriores e outros, as vantagens e características da presente invenção tornar-se-ão a partir daqui evidentes, podendo a natureza da presente invenção tornar-se claramente compreensível com referência à 8 descrição detalhada dos enquadramentos preferidos da pré-sente invenção que se seguem e as reivindicações em anexo.

Uma apreciação mais completa da presente invenção e muitas das suas vantagens serão facilmente obtidas à medida que sejam melhor compreendidas com referência à descrição detalhada que se segue, em conjunto com os desenhos que os acompanham em que.: A figura 1 mostra uma" representação esquemática da estrutura da IL-2 humana. A proteína contém 133 resíduos de aminoácidos (peso molecular: 15-18 kDa, consoante · o .grau .de glicosilaçâo) . Quatro hélices a, assinaladas .com A.' (posições 6-29 dos . resíduos), B-B' (posições 53-72), C (posições 81-97), e D . (posições .113-133) rodeando um núcleo central hidrofóbico. OS. resíduos Leu 17 e Asp20 (ver texto) ocorrem na hélice A do te.rminal N. A estrutura do anel entre a hélice C e a hélice D era indeterminada. Obtiveram-se as coordenadas atómicas a partir da ligação de entrada do Banco de Dados de Proteínas de Brookhaven (BERNSTEIN .et at. (1977) J. Mol. Biol. 112: 535-542), depositado por D.B. MCKAY (MACKAY D (1992) Science 257: 410-413). A figura foi desenhada com o programa Molscript . (KRAULIS (1991) J. Appl. Cristallògr24: .946-950) .. A figura 2 mostra a ligação , e a inibição da ligação de Acm H2-8. Experiências da ligação: revestiram-se as placas com IL-2,· péptido 1-22 ou péptido 1-30.. O Controlo é representado por placas não revestidas. As ligações de Acm foram reveladas com um conjugado de fosfatase alcalina e Ig polivalente de cabra anti-rato. Experiências da Inibição: utilizaram-se concentrações dos Acms H2-8 ou 19B11 que dão uma ligação ½ 9 máxima às placas revestidas com IL-2. Misturaram-se estas diluições durante 1 hr a 37, °C com a concentração dos inibidores indicada antes de se adicionarem as cavidades revestidas com IL-2. A figura 3 mostra a ligação do Acm H2-8 no péptido de 1-30. Revestiram-se as placas com Acm H2-8 e inc.ubaram-se com péptido de 1-30 conforme descrito.. A figura 4 mostra os efeitos biológicos do Acm H2-8 na IL-2 Pro125. Fizeram-se ensaios, com diferentes concentrações de IL-2 Pro125 no que respeita à proliferação de TS1 (3 células (R-IL-2a-, R-IL-2(Í+ humano, 1L-2Ry+ de rato). Mediu-se a proliferação por incorporação de [3HTdR] conforme indicado.

Fez-se o ensaio de várias concentrações (indicadas entre párêntesis - pg/ml) do Acm H2-8. Como controlo, verificou-se a ausência ·. de efeitos, dò Acm H2-8' na proliferação das· células de TSip dependente de IL-2. A figura 5 mostra o· modelo das 'interseções de. IL-2/R-IL-2. Figura 5 (A) Posição dos resíduos Leul7 e ' Asp20 na estrutura de IL-2 no que respeita às hélices A, C e D, numa vista perpendicular ao eixo da hélice A. Figura 5 (B) Posição dos resíduos Leul7 no que respeita às hélices A e B-B'. A. cadeia lateral de Leul7 está localizada num núcleo hidr.ofóbico da molécula rico em leucina. A cadeia lateral carregada de Asp20 está parcialmente exposta ao dissolvente. As duas orientações da molécula que aqui se mostram são mais Ou menos perpendiculares à mostrada na Figura 1.

Figura 5 (C) - O modelo do complexo de IL-2/R-IL-2 (BAMBOROUGH et al. (1994) Structure 2: 839-851) tem por base a estrutura da hormona do crescimento humano 10 e o seu receptor {DE VOS et al. (1992) Science 255: 306-312) . Para maior clareza, apenas se mostram as hélices α A e D de IL-2 e as cadeias β e γ do receptor. As posições de IL-2 estudadas, Leul7, Asp20 e os resíduos Argl5 e Tirl34 do R-IL-2fi estão, marcados. Também se mostram as posições Cisl25e Serl27. Os' elementos estruturais secundários tal como definido pelo programa DSSP (KABSCH et al. (1983) Biopolymers 22: 2577-2637). As coordenadas atómicas do complexo foram obtidas do Brookhaven Protein Data Bank, filme do código de entrada. Ά figura 6 é uma representação esquemática das interacções de IL-2 /R-IL-2 e da sequência ΓΡ130 (SEQ ID NO.: 4). O receptor de IL-2 é composto por três sub-unidades (cí, A, y)i (Ver Imm. Today,' 1996). A figura 7 demonstra que IP130 induz a proliferação, e actua em sinergia com IL-2. Fez-se o ensaio da actividade pròliferativa em ΤΞΐβ2 (que cresceu em IL-2) . Retirou-se um fundo de 1,4 x 103 cpm. Também se observa a sinergia com IL-2. As células alvo de TSl β derivam das células TSl de murino (que expressa apenas R-IL-2Y de murino), depois da transfecção com o gene de R-IL-2B humano.

A figura 8 mostra que a proliferação induzida por IP130 não é devida à sinergia com um factor residual de crescimento resultante do meio de cultura. As células de ΤΞΙβ, utilizadas neste estudo, são postas em cultura em IL-4. TS1B prolifera com IP130 e esta proliferação não é inibida pelo Acm 11B11, que neutraliza a proliferação induzida por IL-4. A figura 8A mostra a actividade pròliferativa de IP130. A figura 8B mostra a actividade proliferativa de IL-4. A figura 8C mostra IP130 ' + Acm 11B11 (anti-IL-4). A figura 8D mostra IL-4 + .Acm 11B11 (D) e IL-4 + Acm 145 (controlo Acm) (▼) . Arialisou-se a actividade proliferativa em TSlp4 {que cresceu em IL-4). A figura 9 demonstra que o R-IL-2B humano é essencial para' a' proliferação induzida por IP130. A figura 9A mostra a actividade de IP130 nas células TS1 trans-fectadas com R-IL-2B humano. A figura 9B mostra o efeito do anticorpo (A41) de neutralização'do R-IL-2B anti-humano. na actividade de ΪΡ 130. As células TS1 proliferam apenas após a transf ecção; por meio do gene humano.de R-IL-2p. Tal como para IL-2, a cadeia de R-· IL-2B de murino não permite a: proliferação na presença de IP 130., A proliferação dé TS1B induzida por IP 130 é. neutralizada especificamente pelo .Acm A41 (R-IL-2B. anti-humano). A figura 10 é um. resumo de IP 130 (SEQ ID NO. : 4) e dos estudos em função da estrutura das moléculas derivadas. Es.tudou-se uma família dé péptidos quanto à forma das suas hélices, oligomerização e actividade biológica (ver também a apresentação geral dos dados). A figura 11 representa um modelo das interacções de IP130/lL-2Rp. IP13Q é tetrâmieo e 1L-2R β forma um dímero em solução. Proposto a partir dos resultados obtidos com a estrutura tridimensional de IL-2 e o crescimento do complexo de hormona/receptor. A figura 12 mostra o modelo de fosforilação induzida por IP130 e o envolvimento de SHC. IP130 induz a fosforilação da proteína SHC. As duas bandas que 12 correspondem às isoformas de SHC são fosforiladas após uma estimulação de dez minutos por meio de IP130. À esquerda mostra-se a cinética da fosforilação de Shc. À direita mostra-se uma .análise 'de "Western blot" da proteína Shc. A figura .13 é um ensaio .electroforético do deslocamento da mobilidade que mostra que IP130 não induz a actividade de STAT. Analisa-se a actividade de STAT em extractos nucleares de células KIT225 depois da estimulação por IL-2, IP130 ou. IL-2 + IP130. Apenas as células estimuladas ' por IL-2 ou IL-2 + IP130 mostram uma activação de STAT. Utilizou-se' no estudo sondas de β-caseína. Gbtiveram-se os mesmos resultados com duas outras sondas (GAS e GIRE). A figura 14 descreve um modelo de transdução do sinal e IP130. A IL-2 utiliza três vias principais: 1 °/JAK/STAT consoante o complexo de R-IL-2 βγ; 2°/SHC/MAPK iniciado na cadeia de IL-2 RB fosforilada e 3°/Pl3K. De. acordo com o modelo de (IP130)4/(R-IL-2 β) 2 (Figura 14), IP130 não induz a via de JAK/STAT mas induz a via de SHC/ MAPK.· (JAK: Janus cinase [família de proteínas de tirosina cinase não' receptoras associadas com receptores de citocina] activada; P13K: fosfatidil-inositol, 3-fosfato-cinase; STAT: transdutores de sinal e activadores de transcrição; MAPKK: proteína-cinase activada por ;: mitogénio; MAPK:. proteí-na-cinase activada por ' mitogénio; 71.) : . indução da transcrição). A figura 15 mostra1 a entrada do ciclo· da célula (S+G2/M) das células NK estimuladas por IP130. PBMC são estimuladas por IL-2, IP130 ou IL-2 . + IP130. 13

Subtraem-se as respostas não especificas (J+l no .meio) . As células NK que entram, nas fases S+G2/M medem-se por meio de iodeto.de propidio e são analisadas com o software ModFit 2.0 (Becton Dickinson). A.figura 16 mostra que IP130 estimula a actividade de LAK. Nesta experiência, estudou-se a. cinética da estimulação da actividade de LAK. ,0s histogramas mostram os resultados com uma relação de efector/alvo de dez'. Δ% lise = lise induzida por IL-2 e/ou IP130 -: lise espontânea. A presente invenção tem por objectd a utilização de péptidos de IL-2 derivados de interleucina-2 (IL-2), para serem utilizados na terapêutica em' mamíferos e em particular em seres humanos.. Seleccioham-se os péptidos a partir de fragmentos de IL-2 e de derivados de IL-2. Os derivados definem-^se como contendo uma sequência de aminoácidos capaz de se ligar à cadeia . de R-IL-2 β nas condições aqui descritas, ou capazes de se ligarem aos anticorpos monoclonais produzidos pelo hibridoma H2-8. A presente', invenção também tem por objecto anticorpos dirigidos contra os péptidos de acordo com a presente invenção que, do mesmo modo simulam ; e/ou regulam a actividade de IL-2. As abordagens terapêuticas e de diagnóstico envolvem a utilização dos péptidos purificados e os anticorpos para a detecção e/ou a regulação da ligação de IL-2 ao R-IL-2 in. vitro e in vivo. De acordo com a presente invenção, podem utilizar-se técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, e ADN recombinante dentro do que é comum nesta técnica. Essas técnicas estão completamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, SAMBROOK et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I- 14 I.II [Ausubel, R. M., ed. (1994)];. "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volumes I-III . [J. E.. Celis, ed. (1994)]; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III [Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gaited. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)] ; "Transcriptiono and Translation" [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshnei, ed. (1986)];. "Immobilized Cells and Enzime.s" [IRL Press, (1986).]; B.. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984). .

Por isso,, quando aqui aparecerem, os termos que se seguem terão as definições indicadas a seguir.

As expressões "péptido de IL-2", "agonista/antagónista de IL-2", "derivados de IP130/IP130 ", e qualquer variante não listada aqui especificamente,. podem ser utilizados aqui de uma forma intermutável, e tal como são.·, utilizados ao longo ;do presente· pedido .de patente de invenção. Estes .termos referem-sê' a material proteináçeo incluindo proteínas simples ou múltiplas ou produtos, recombinantés ou péptidos· obtidos por síntese, química e. estendem-se às proteínas . que têm as sequências de aminoácidos aqui descritas e que se apresentam na Figura 10.. (SEQ ID NO. : 3) . O perfil das actívídades biológicas que se·estabelecem aqui a seguir,. constitui um dos aspectos do presente pedido de patente.. De acordo com isto, as proteínas que exibem uma actividade praticamente equivalente ou uma actividade alterada estão contemplados do mesmo modo. Estas modificações podem ser deliberadas, por exemplo, tal como as modificações .obtidas através de mutagénese dirigida ao sítio ou podem ser acidentais, tal como as obtidas através de mutações em hospedeiros que' são produtores do complexo ou das suas designadas sub-unidades. Do mesmo modo, as 15 expressões . "péptido de IL-2", "agonista/antagonista de IL-2", ."derivados de IP130/IP130 ou péptidos.' purificados", pretendem estar incluídos dentro do âmbito das proteínas especificamente citadas aqui, assim como todos os análogos praticamente homólogos e as variações alélicas. . É preferível que os resíduos, de aminoácídos aqui descritos estejam na forma isomérica. "L". Contudo, os resíduos na forma isomérica' "D." podem ser substituídos por qualquer resíduo de amínoácido L, desde' que a. , propriedade funcional desejada ou a ligação da imunoglobulina sejam retidas .pelo polipéptido. NH2 refere-se ao grupo amino livre presente na terminação amino de um polipéptido.· ÇOOH refere-se ao grupo' carboxi livre, presente na terminação carboxi de um polipéptido. Mantendo a nomenclatura normalizada para os polipéptidos,: J. Biol. Chem., 243: 552-59 (1969), na tabela de correspondência que se segue mostram-se as abreviaturas dos resíduos de aminoácidos:

QUADRO DE CORRESPONDÊNCIA

SÍMBOLO AMÍNOÁCIDO 1-Letra 3-Letras Y Tir tirosina G . Gli glicina F Fen fenilalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser serina I Ile isoleucina L Leu . leucina T Tre treonina V Vai valina P Pro prolina K Lis lisina 16 H . His histidina Q Gin glutamina E Glu ác. glutâmico w Trp triptofano R Arg arginina D ' Asp ác. aspártico N Asn asparagina c Cis cisteina

Deve notar-se que todas as sequências dos residuos de aminoácidos estão aqui representadas por fórmulas cuja orientação para a esquerda e para a direita está na di-reeção convencional, da terminação amino parà á terminação carboxi. Além disso, deve notar-se ainda que um traço no principio ou no fim de uma sequência de residuos de aminoácidos. indica uma . ligação de péptido a uma outra sequência de um ou mais residuos de aminoácidos. 0 quadro apresenta-se para correlacionar as notações com. uma letra e-com três letras que pòdem aparecer aqui alternadamente.

Um "replicão" é qualquer elemento genético (por exemplo, plasmido, cromossoma, virus). que funciona como uma unidade autónoma de replicação de ADN in vivo; isto é, capaz de replicação sob o seu próprio controlo.

Um "vector" é um replicão, tal corno um plasmido, um fago ou um cosmido, ao qual se podé ligar um outro segmento de ADN de modo a produzir a replicação.do segmento ligado.

Uma "molécula de ADN . " refere-se à forma polimérica de desoxiribonucleótidos (adenina, guanina, timina, ou citosi-na) na sua forma quer de hélice de estrutura simples ou de estrutura dupla. Este termo refere-se apenas à estrutura primária e secundária da molécula, e não limita quaisquer 17 formas terciárias particulares. Assim, este termo inclui ADN de estrutura helicoidal dupla encontrada, inter alia, nas moléculas lineares de ADN (por exemplo, fragmentos de restrição), virus, plasmidos, e. cromossomas. Quando se discute a estrutura de moléculas particulares de ASN de estrutura dupla, as sequências podem ser descritas aqui de acordo com a convenção normal de dar a sequência apenas na direcção de 5' para 31 ao longo da estrutura helicoidal de ADN não escrita (isto é, a estrutura helicoidal com uma sequência homóloga à do ARNm). . . Uma "origem de replicação" refere-se às sequências de ADN que participam na síntese do ADN.

Uma "sequência de codificação" do ADN é uma sequência: de ADN de estrutura helicoidal dupla que está transcrita è traduzida, num polipéptido in vivo quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. As fronteiras da sequência de codificação são determinadas por um codão de iniciação na terminação 5V. (amino) e um codão de paragem da tradução no terminal 3' (carboxilo). Uma sequência de codificação pode ' incluir, mas não se limita a sequências procarióticas, ADNc do ARNm eucariótico, sequências de ADN genómico a partir de ADN eucariótico (por exemplo, mamíferos), e ainda sequências de ADN sintéticas. Um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição estarão normalmente localizados em 3' relativamente à sequência de codificação.

As sequências de controlo de transcrição e de tradução são sequências reguladoras do ADN, tal como promotores, melhoradores, sinais de poliadenilação, terminadores, e similares, que providenciam .para a expressão de uma sequência de codificação numa célula hospedeira. 18

Uma "sequência promotora " é uma região reguladora do ADN capaz de ligar a polimerase de ARN numa célula e iniciar a ' transcrição, de uma sequência de codificação a jusante (direcção 3T).· Com a finalidade de dar definições da presente invenção, a sequência do promotor está ligada à sua terminação 3' por meio do sítio de iniciação da transcrição e prolonga-se para montante (direcção 5') para incluir o número ' mínimo de bases ou de elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis'detectáveis acima do valor básico. Dentro da sequência do promotor poder-se-á encontrar um sítio de iniciação.. da transcrição (convenientemente definida pelo mapeamento com nuclease Slj,. assim como os domínios de. ligação da proteína (sequêricias . de consenso) responsáveis pela. ligação de ARN polimerase. Os. promotores, eucarióticos poderão conter muitas vezes, mas não sempre, caixas."TÁTA" e caixas "CAT". Os- promotores procarióticos contêm sequências de Shine-Dalgar.no· para além das sequências· de consenso -10. e -35.

Uma "sequência ' de controlo, de expressão" é uma sequência de ADN que controla e , regula a' transcrição " e a tradução de outra sequência de ADN. Uma sequência de .codificação está "sob o controlo" das sequência de controlo da transcrição e da' tradução numa célula quartdo o RNA polimerase transcreve a sequência de codificação no ARNm, que é então traduzida na proteína codificada pela sequência de codificação.

Uma· "sequência de sinal" pode ser incluída antes da sequência de codificação. Esta sequência codifica um pépti-do de sinal, no terminal N em relação ao polipéptido, que comunica com a célula hospedeira para dirigir o polipéptido p.ara a superfície da célula ou segregam o polipéptido no meio, e o seu péptidõ de sinal é cortado pela célula 19 hospedeira antes da proteína sair da célula. As sequências de sinal podem ser encontradas associadas com uma variedade de proteínas naturais com procariptos e eucariotos. 0 termo "oligonucleótido" define-se como uma molécula que contém dois ou unais ribonucleótidos, preferencialmente mais de três. A sua dimensão exacta dependerá de muitos factores que, por sua vez, depende da função e utilização finais do oligonucleótido. A célula foi "transformada" por meio de ADN exógeno ou heterólogo quando esse ADN tinha sido introduzido dentro da célula. 0 ADN resultante dâ transformação pode ser ou não integrado, (pòr.uma ligação covalente) no ADN cromossómico constituindo o genoma da célula. Nos procariotos,' nas leveduras, è nas células de mamífero, por exemplo, pode-se manter o ADN resultante da transformação no elemento epis.sómico tal como um plasmido. No que respeita às células eucarióticas, uma célula transformada de forma estável é aquela em que o ADN resultante da transformação se integrou no cromossoma de tal modo que é herdado pelas células filhas através da. replicação do cromossoma. Esta estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula eucariótica para estabelecer linhas de células ou clones constituídos por uma população de células-filhas contendo o ADN da transformação. Um "clone" é uma população de células derivada de uma única célula ou um ancestral comum por meio de mitose. Uma "linha de células" é um clone de uma célula primária que é capaz de crescer estavelmente in vitro durante muitas gerações.

Duas sequências de ADN são "praticamente homólogas" quando pelo menos cerca de 75 % (preferencialmente pelo menos cerca de’'80'·%, e mais preferencialmente pelo menos 20 cerca de 90 ou 95 %). de nucleótidos se emparelham ao longo de um comprimento definido das sequências de ADN. As sequências que sâo praticamente homólogas, podem ser identificadas comparando as sequências utilizando um software padrão dispo.nivel em bancos de. dados de sequências, ou numa experiência de hibridação de Southern, por exemplo, em condições severas tal como as definidas para um sistema particular. Definir condições de hibridação apropriadas está dentro das competências da técnica. Ver, por exemplo, MANIATIS et al., supra;' ADN Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid.Hibridação, supra.

Deve entende.r-se que também está dentro do âmbito da presente invenção as utilizações biológicas das sequências de ADN que codificam os péptidos de IL-2 com a mesma sequência de aminoácidos que as IP130 (SEQ ID NO.: 2 ou SEQ ID NO. :4)> mas que estão degeneradas em relação ao ADN que codifica SEQ ID NO.: 2 ou SEQ.ID NO.: 4. Por "degenerada em relação a" . significa que se utiliza um codão com três. letras diferentes para . especificar um aminoácido particular. É bem sabido da técnica que os codões que se seguem podem ser utilizados de forma intermutável para codificar' para cada aminoácido especifico:

Fenilalanina (Fen ou F) UUU ou UUC . Leucina (Leu ou L) UUA ou UUG ou CUO ou CUCou

CUA ou CUG

Isoleucina (He ou I) . . AUU ou AUC ou AUA·.

Metionina (Met ou H) : AUG

Valina (Vai ou V) GUU ou GUC ou GUA: OU GUG

Serina . (Ser ou S) UCU ou UCC ou UCA ou UCG ou

. AGU ou AGC

Prolina (Pro ou.P) . CCU ou, CC'C ou CCA ou CCG

Treonina (Tre ou T) ACU ou ACC ou ACA ou ACG 21

Alanina {Ala ou A) GCU ou GCG ou GCA ou GCG

Tirosina (Tir ou T) UAU ou UAC .

Hlstidina' (His ou H) CAU ou CAC

Glutamina (Gin ou Q) CAA ou CAG

Asparagina (Asn ou N) AAU ou AAC

Lisina {Lis ou K) AAA ou AAG

Ácido aspártico (Asp ou D) GAU ou GAC

Ácido glutâxnico (Glu ou E) GAA ou GAG

Cisteína (Cis ou C) . UGU ou UGC

Arginina (Arg ou R) CGU ou CGC ou CGA ou CGG ou

AGA ou AGG

Glicina (Gli ou G) GGU ou GGC or GGA or GGG

Triptofano (Trp ou W) UGG

Codão cie terminação UAA (ocre) ou UAG (âmbar) ou UGA (opala)

Deve entender-se que os codões anteriores são específicos para as sequências' deARN. Os' codões correspondentes ; para ADN têm um T substituído per U.

Podem fazer-se modificações dos péptidos no ADN que codifica a SEQ ID NO. 2 ou a SEQ ID NO.: 4' tal cômo um codão particular, se transforma num codão que codifica para um 'aminoácido diferente. Tal mutação é .geralmente conseguida fazendo o mínimo de alterações possíveis nos nucleótidos. Uma . mutação de substituição deste tipo pode ser.feita para mudar um aminoácido na proteína resultante de uma forma não conservadora (isto é., alterando o codão a partir de um aminoácido que pertence a um grupo de aminoácidos. com. uma dimensão particular ou característiço de um aminoácido que pertence a outro, grupo) ou de uma forma conservadora (isto é, alterando o codão a partir ' de um aminoácido que: pertence a um grupo de aminoácidos com uma dimensão particular ou característico de um aminoácido' 22 que pertence ao mesmo grupo). Tal alteração conservadora leva geralmente a- uma menor mudança na estrutura e na função da proteina resultante. É mais provável que uma alteração não conservadora .possa alterar a estrutura, a actividade ou a .função da proteina resultante. Deve considerar-se que a presente invenção inclui sequências contendo . alterações conservadoras que não alterám significativamente, a actividade ou as carácteristicas de ligação da proteina resultante. A seguir dá-se um exemplo de vários grupos de aminoácidos:

Aminoácidos com grupos ,R não polares

Alanina ' .

Valina .' Leucina

Isoleucina .

Prolina

Fe.nilalanina ,

Triptof.ano .

Metionina

Aminoácidos .com grupos R polares não carregados

Glicina

Serína

Treonina

Cisteina

Tirosina

Asparagina

Glutamina 23

Aminoácidos com grupos R polares carregados (carregados negativamente a pH 6,0) Ácido aspártico Ácido glutâmico

Aminoácidos básicos (carregadds positivamente a pH .6,0)

Lisina Arginina

Histidina (a pH 6,0)

Um outro grupo pode ser o dos aminoácidos com grupos fenilo:

Fenilalanina Triptcfano Tirosina

Um outro grupo pode ser de acordo com o peso molecular (isto·é, dimensão dos grupos R):

Glicinà. 75 Alanina ' 89 Seriná 105 Prolina 115 Valin 117 Treonina 119 Gisteina 121 Leucina 131 Isoleucina 131 Asparagina 132 Ácido aspártico 133 Glutamina . 146 24

Lisina 146 Ácido glutâmico 147 Metionina 149 . Histidina (a pH! 6,0) 155 Fenilalanina 165 Arginina - 174 Tirosina 181 Triptofano 204

As substituições conservadoras particularmente preferidas são: - Lis para Arg e vice-versa de tal modo que sé possa manter uma carga positiva;

Glu para Asp' e vice-versa. de tal modo que se possa manter uma carga negativa; - Ser para' Tre de . tal modo que se possa manter um -OH livre; e - Gin para Asn de tal modo .que sé possa manter um NH2 livre.

As. substituições de. aminoácidos podem, também ser introduzidas nos na. IL-2 ou nos seus péptidos para substituir um· aminoácido com uma propriedade particularmente preferida. Por exemplo, um Cis pode introduzir um sitio potencial para pontes de di-sulfureto com outro Cis. Um. His po.dé ser introduzido como um sitio "catalítico" particular (isto é, His pode actuar como um ácido ou' uma base e é o aminoácido mais comum na catálise bioquímica). Pode introduzir-se Pro por causa da sua estrutura particularmente plana, que introduz uma conformação com ligações entre folhas β na estrutura das proteínas. . 25

Os péptidos activos sob o ponto de vista biológico da presente invenção englobam preferencialmente uma região da sequência de IL-2 que inclui os aminoácidos 17-20, embora um ou mais destes resíduos de aminoácidos possa ser substituído por outro aminoácido, ou por um aminoácido modificado. A utilização do péptido preferido que contenha pelo menos 5 aminoácidos de comprimento, mais preferencialmente 8-12 aminoácidos, e o mais preferencial pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, constituem um dos aspectos da presente invenção, assim como a utilização do péptido da presente invenção com base nos aminoácidos 1-30 de 11-2.

Pode-se considerar que a . actividade biológica ou fisiológica de IL-2 inclui a estimulação de CD4, CD8 e das células NK células, e pode incluir actividades anti-virais. e anti-tumor. A actividade biológica ou fisiológica de IP 130 e de outros péptidos da presente invenção podem incluir as actividades anteriores de IL-2, assim como a indução da fosforilação de SHC e da indução da via de SHC/MAPK.

Uma região "heteróloga" da estrutura de ADN é um segmento identificável de ADN dentro de uma molécula maior de ADN que não se encontra associada com a molécula maior na natureza. Assim, quando uma região heteróloga codifica um gene de mamífero, o gene será normalmente flanqueado por ADN que não flanqueia o ADN genómico de mamíferos no genoma ! I do organismo fonte. Um outro exemplo de uma sequência de i codificação heteróloga é uma estrutura em que a própria | i sequência de codificação não se encontra na natureza (por exemplo, um ADNc em que a sequência de codificação genómica contém intrões, ou sequências sintéticas com codões diferentes dos do gene natural). As variações alélicas ou 26 os eventos de mutação de ocorrência natural não dão origem a uma região heteróloga de ADN tal como definido aqui.

Um "anticorpo" é qualquer imunoglobulina, incluindo anticorpos e os seus fragmentos, que se ligam a um epítopo específico. 0 termo engloba anticorpos policlonais, mono-clonais, e quiméricos, estes últimos descritos com mais detalhe nas patentes norte-americanas U.S. Nos. 4.816.397 e 4.816.567.

Um "sítio de combinação de anticorpos" é uma porção estrutural de uma molécula de anticorpo constituída por regiões variáveis e hipervariáveis de cadeias pesadas e leves que se ligam especificamente ao antigénio. A frase "molécula de anticorpo" nas suas várias formas gramaticais, tal como se utiliza aqui, contempla tanto uma molécula intacta de imunoglobulina como uma porção activa sob 1 o ponto de vista imunológico de uma molécula de imunoglobulina.

Exemplos de moléculas de anticorpos são moléculas intactas de imunoglobulina, moléculas praticamente intactas de imunoglobulina e porções de uma molécula de imunoglobulina que contêm o paratope, incluindo as porções conhecidas na técnica como Fab, Fab', F(ab')2 e F(v), porções essas que são preferíveis para serem utilizadas nos processos terapêuticos aqui descritos.

Preparam-se porções de Fab e F(ab')2 de moléculas de anticorpo por reacção proteolítica de papaína e de pepsina, respectivamente, em moléculas de anticorpo praticamente intactas, por processos que são bem conhecidos. Ver, por exemplo, a patente norte-americana U.S. No. 4.342.566 para 27

Teofilopolous et al. As porções de moléculas de anticorpo Fab' são bem conhecidas e são produzidas a partir de porções de F(ab')2 seguida da redução das ligações de di-sulfureto que ligam as duas porções de cadeias pesadas tal como com o mercaptoetanol, e seguido de alquilação do mercaptano da proteína resultante com um reagente tal cokO iodoacetamida. Aqui prefere-se um anticorpo que contém moléculas intactas de anticorpo. A frase "anticorpo monoclonal" nas suas várias formas gramaticais refere-se a um anticorpo com apenas uma espécie de sítio de combinação do anticorpo capaz de uma imuno-reacção com um antigénio particular. Um anticorpo· monoclonal exibe assim uma única afinidade de ligação para qualquer antigénio com o qual imuno-reage. Um anticorpo monoclonal pode por isso conter uma molécula de anticorpo com uma pluralidade de sítios de combinação do anticorpo, sendo cada um deles imuno-específico para um antigénio diferente; por exemplo, um anticorpo monoclonal bi-específico (quimérico) .

Os anticorpos da presente invenção preferidos ligam-se aos péptidos da presente invenção, descritos antes. Os anticorpos que se ligam aos péptidos da presente invenção podem ser utilizados como agentes de diagnóstico para analisar a ligação de IL-2 ao seu receptor, e podem também ser utilizados como agentes terapêuticos, para aumentar ou inibir a ligação de IL-2 ao seu receptor. Num enquadramento preferido, o anticorpo da presente invenção inibe a ligação de IL-2 e/ou IP130 ao R-IL-2. A frase "aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" refere-se às entidades moleculares e às composições que são toleráveis sob o ponto de vista fisiológico e normalmente 28 não produzem uma reacção alérgica ou desagradável semelhante, tal como um mal-estar gástrico, tonturas e similares, quando administradas a um ser humano. A frase "quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico" utiliza-se aqui para significar uma quantidade suficiente para prevenir e preferencialmente reduzir de pelo menos cerca de 30. por cento, mais preferencialmente de pelo menos 50 por cento, mais preferencialmente de pelo menos 90 por cento, uma alteração significativa sob o ponto de vista clinico numa característica da patologia tal como, por exemplo, pressão sanguinea elevada, febre ou contagem dos glóbulos brancos para avaliar a sua presença e actividade. A sequência de ADN está "ligada operacionalmente" a uma sequência de controlo de expressão quando a sequência de controlo de expressão controla e regula a transcrição e a tradução dessa sequência de ADN sequência. A expressão "ligada operacionalmente" inclui o facto de comportar um sinal inicial apropriado (por exemplo, ATG) na frente da sequência de ADN e ser expressa e mantendo o quadro de leitura correcto para permitir a expressão da sequência de ADN sob o controlo da sequência de controlo de expressão e produção do produto' desejado codificado pela sequência de ADN. Se um gene que se pretende inserir numa molécula de ADN recombinante não contém uma sinal de iniciação apropriado, esse sinal de iniciação pode ser inserido à frente do gene. A expressão "condições padrão de hibridação" refere-se a condições de sal e de temperatura praticamente equivalentes a 5 x SSC e 65 °C tanto para a hibridação como para a lavagem. Contudo, um especialista na material 29 aperceber-se-á que essas " condições padrão de hibridação" dependem de condições particulares incluindo a concentração de sódio e de magnésio no tampão, comprimento e concentração da sequência de nucleótidos, percentagem de correspondência, percentagem de formamida, e similares. Também é importante na determinação das "condições padrão de hibridação" saber se as duas sequências de hibridação são RNA-RNA, ADN-ADN ou RNA-ADN. Essas condições padrão de hibridação são facilmente determinadas por um especialista na matéria, de acordo com fórmulas bem conhecidas, em que a hibridação é normalmente 10-20 °C abaixo da Tm prevista ou determinada com lavagens mais severas, se necessário.

Num dos seus aspectos principais, a presente invenção tem por objecto a utilização de péptidos de IL-2 que regulam a actividade de IL-2 actividade. Por "regular" entende-se quer a actividade agonista quer a antagonista que ora aumentam ora suprimem os efeitos fisiológicos de IL-2, tal como a proliferação de células, tal comò se descreve a seguir.

Tal como . se estabelece antes, a presente invenção também tem por objecto uma molécula de ADN recombinante ou um gene clonado, ou uma sua variante degenerada, que codifica um péptido de IL-2 péptido, ou um seu fragmento que possui um peso molecular preferencialmente de cerca de 2-5 kD e uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na Figura 10 (SEQ [D NO.: 4) ou uma sequência em que a SEQ ID NO. : 4 está modificada por inserção, eliminação e/ou substituição; preferencialmente uma molécula de ácido nueleico, em particular uma molécula de ADN recombinante ou um gene clonado, que codifica o péptido com uma sequência de nucleótidos, é complementar ou híbrida, em condições 30 padrão de hibridação, com uma sequência de ADN que codifica a SEQ ID NO:2 ou a SEQ ID NO.: 4.

As possibilidades tanto de diagnóstico como terapêuticas que são trazidas pela existência de péptidos de IL-2, derivam do facto de os péptidos parecerem participar directa e causalmente na interacção proteína-proteína entre o péptido de IL-2 e o receptor de IL-2 receptor, especificamente Ε-ΙΙι-2β, e os factores ' que depois medeiam os eventos celulares. Em particular o péptido de IP130 tem mostrado que induzem a fosforilação de R-IL-2L, para induzir c-mic; e para induzir as células assassinas naturais (NK) a entrarem no ciclo da célula. Tal como foi sugerido antes e elaborado aqui depois, a presente invenção contempla a intervenção farmacêutica na cascata de reacções em que o R-IL-2 está implicado, para regular a actividade iniciada,por IL-2 e os segs péptidos.

Assim, em exemplos em que se deseja reduzir ou inibir a actividade induzida por IL-2, pode-se introduzir um inibidor do péptido de IL-2 para bloquear a interacção de IL-2 com o R-IL-2. De uma forma correspondente, exemplos em quetem lugar uma actividade insuficiente induzida por IL-2, ela pode ser remediada pela introdução de quantidades adicionais do agonista apropriado do péptido de IL-2, tal como de IP130, ou dos seus cognatos, análogos, fragmentos químicos ou farmacêuticos e similares. .

Tal como discutido antes, os péptidos de IL-2 ou os seus parceiros de ligação ou outros ligandos ou agentes que exibem quer mimetismo ou antagonismo em relação a IL-2 ou o controlo sobre a sua produção, podem ser preparados em composições farmacêuticas, com um veículo apropriado e uma força efectiva para administração por vários meios a um 31 paciente que experimente uma situação clinica adversa associada a niveis indesejáveis de IL-2 para o seu tratamento. Pode-se utilizar uma variedade de técnicas administrativas, entre elas as técnicas parentéricas tal como injecções sub-cutâneas, intravenosas e intraperit-neais, cateterizações e similares. As quantidades medias dos péptidos de IL-2 ou as suas sub-unidades podem variar e em particular devem basear-se nas recomendações e na prescrição de um médico ou um veterinário qualificados.

Também os anticorpos incluindo tanto anticorpos poli-clonais como monoclonaís e fármacos que regulam a produção ou a actividade de IL-2 e/ou os seus péptidos podem possuir certas aplicações de diagnóstico e podem ser utilizados, por exemplo, . para fins de detecção e/ou de medição da actividade do receptor de IL-2 ou similares. Por exemplo, IL-2 ou os seus péptidos podem ser utilizados para produzir tantos anticorpos policlonais como monoclonaís a eles. próprios numa variedade de. meios celulares, por meio de técnicas conhecidas tal como técnicas de hibridação utilizando, por exemplo, linfócitos de baço de rato fundido e células de mieloma. Do mesmo modo, podem-se descobrir ou sintetizar pequenas moléculas que simulam ou antagonizam a actividade(s) dos péptidos de IL-2 da presente invenção e podem ser utilizados em diagnóstico e/o protocolos terapêuticos. A metodologia geral para a produção de anticorpos monoclonaís por hibridomas é bem conhecida. Também se podem criar linhas de células que produzem anticorpos imortais por meio de técnicas diferentes da fusão, tal como transformação directa de linfócitos B com ADN oncogénico, ou transfecção com vírus de Epstein-Barr. Ver, por exemplo, M. SCHREIER et al., "Hibridoma Techniques" (1980); 32 HAMMERLING et al., "Monoclonal Anticorpos And T-célula Hibridomas" (1981); KENNETT et al., "Monoclonal Anticorpos" (1980); ver também asa patentes norte-americanas U.S. Nos. 4.341.761; 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.451.570; 4.466.917; 4.472.500; 4.491.632; 4.493.890.

Os painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra os péptidos de IL-2 podem ser rastreados quanto a várias propriedades; isto é, isotipo, epitopo, afinidade, etc. De particular . interesse são os anticorpos monoclonais que regulam a actividade de IL-2 ou dos seus péptidos. Esses anticorpos monoclonais podem ser facilmente identificáveis em ensaios de proliferação celular. Os anticorpos de elevada afinidade são também úteis quando é possível a purificação por imuno-afinidade da IL-2 natural ou recom-binante ou os péptidos de IL-2.

Preferencialmente, o anticorpo anti-IL-2 utilizado nos processos de diagnóstico da presente invenção, é um anticorpo policlonal purificado por afinidade. Mais preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal (Acm). Além disso, é preferível que as moléculas· de anticorpo anti-IL-2 aqui utilizadas estejam sob a forma de porções Fab, 'Fab', F(ab')2 ou F(v) das moléculas inteiras de anticorpo.

Um processo de diagnóstico da presente invenção compreende o exame de uma amostra ou um meio celular por meio de um ensaio que inclui uma quantidade efectiva de um péptido de IL-2 marcado ou um seu antagonista, tal como um anticorpo anti-IP130, preferencialmente um anticorpo policlonal purificado por afinidade, e mais preferencialmente um Acm. Além disso, é preferível que as moléculas de anticorpo anti-IL-2 utilizadas aqui estejam sob a forma de 33 porções de Fab, Fáb1, F{ab')2 ou F(v) ou moléculas inteiras de anticorpo. Tal como se discutiu previamente, os doentes que poderão beneficiar deste processo incluem os que sofrem de cancro, de uma lesão pré-cancerosa, uma infecção virai ou outros distúrbios patológicos semelhantes.· Os processos para isolar o péptido de IL-2 e induzir os anticorpos anti-IL-2 e para a determinar e optimizar a capacidade dos anticorpos anti-IL-2 para auxiliar o exame das células alvo são bèm conhecidos na técnica.

Os processos para a produção de anticorpos policlonais anti-polipéptido são bem conhecidos na· técnica. . Ver a patente norte-americana U.S, No. 4.493.795 para Nestor et al. Um anticorpo monoclonal, normalmente contendo porções de Fab e/ou F{ab')2 de moléculas úteis de anticorpos, podem ser v preparados utilizando as tecnologias de hibridoma descritas èm Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)., Em pesumo, para formar o hibridoma a partir do qual se produz a composição do anticorpo monoclonal, funde-se um mieloma ou outra linha de células que se auto-perpetuam com linfócitos obtidos a partir do baço de um mamífero hiperimunizado còm um péptido de IL-2 ou uma sua porção de ligação de IL-2 R.

Normalmente fundem-se os esplenócitos com células de mieloma utilizando polietileno-glicol (PEG) 6000. Seleccio-nam-se os híbridos fundidos pela sensibilidade a. HAT. Os hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal útil na prática da presente invenção são identificados pela sua capacidade para imuno-reagir com o presente mutante ou péptido de IL-2 e a sua capacidade para inibir a actividade específica de IL-2 em células alvo. 34

Um anticorpo monoclonal útil na prática da presente invenção pode ser produzido iniciando uma cultura de hibridomas monoclonais compreendendo um meio nutriente contendo um hibridoma que segrega moléculas de anticorpo com a especificidade apropriada do antigénio. Mantém-se a cultura nas condições e durante um período de tempo suficiente para que o hibridoma segregue as moléculas de no meio. Recolhe-se então o meio contendo o anticorpo. As moléculas de anticorpo podem então ser isoladas por técnicas bem conhecidas. 0 meio útil para a preparação destas composições tanto são bem conhecidos na técnica como estão comercialmente disponíveis e incluem meios sintéticos de cultura, ratos consanguíneos e similares. Um exemplo de meio sintético é o meio essencial mínimo de Dulbecco (DMEM; DULBECCO et al., Virol. 8: 396 (1959)) complementado com 4,5. gm/1 de glicose, 20 mm de glutamina, e soro bovino fetal a 20 %. Um exemplo de uma estirpe de rato consanguíneo é a do Balb/c.

Os processos para a produção de anticorpos monoclonais anti-IL-2 são bem conhecidos na técnica. Ver NIMAN et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 80: 4949-4953 (1983). Normalmente, utiliza-se o presente péptido de IL-2 ou um péptido análogo quer sozinho, ou conjugado com um veículo imunogénico, tal como o imunogénio no processo descrito antes para a produção de anticorpos monoclonais anti-IL-2. Rastreia-se os hibridomas quanto à sua capacidade para produzir um anticorpo que imuno-reâge com o mutante ou o análogo do péptido de IL-2. A presente invenção ainda contempla a utilização de composições terapêuticas que são úteis na prática dos processos terapêuticos da presente invenção. Num 35 enquadramento, a composição terapêutica inclui, numa mistura, um excipiente (veículo) aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e um ou mais péptidos de IL-2, um péptido purificado ou um.seu derivado ou um análogo do seu polipéptido ou um seu fragmento, tal como aqui descrito/ como um ingrediente activo. Num enquadramento preferido,' k composição terapêutica compreende um composto activo contendo um péptido purificado capaz de regular a ligação específica da presente IL-2 com o R-ÍL-2. A preparação de composições terapêuticas que contêm polipéptidos, análogos ou fragmentos activo. como ingredientes activos é bem compreendida na técnica. Normalmente, essas composições são preparadas como produtos inj ectá.veis, que como soluções líquidas ou como. suspensões, contudo, também se podem preparar formas sólidas apropriadas para solução ou suspensão em líquidos, antes da injecção. -A preparação pode também ser emulsionada. 0 ingrediente terapêutico activo é muitas vezes misturado com excipientes que são aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico e compatíveis com o ingrediente activo. Os excipientes apropriados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou 'similares e as suas combinações. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tal como agentes de molhagem ou emulsionantes, agentes de tamponamento do pH que melhoram a eficácia do ingrediente activo. A utilização das composições pode ser por administração de uma forma compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico. A quantidade a ser administrada depende a pessoa a ser tratada, da capacidade do sistema imunitário 36 do indivíduo para utilizar o ingrediente activo e o grau de modulação da capacidade de ligação de IL-2 desejada. As quantidades precisas do ingrediente activo· necessárias para serem administradas, dependem da decisão do médico e são peculiares para cada indivíduo. Contudo, as doses apropriadas podem variar entre cerca de 0,1 . e 20, preferencialmente cerca de 0,5 até cerca de 10, e mais preferencialmente um a vários, miligramas de ingrediente activo por quilograma de peso de corpo de cada indivíduo por dia e depende da via de administração. Os regimes para a administração inicial e as injecções de reforço são também variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial seguida de doses repetidas a intervalos de uma ou mais horas por meio de. uma injecção subsequente ou outra administração. Alternativamente, considera-se uma infusão intravenosa suficiente para manter concentrações no sangue de dez nanomolar a dez micromolar. , . j A utilização das composições terapêuticas pode ser

Sr· feita por administração numa composição que. ainda inclui uma quantidade efectíva do agonista/antagonista de IL-2 ou de um seu análogo, e.um ou mais dos seguintes ingredientes activos: um antibiótico, um esteroide.

Tal como se utiliza aqui, "pg" refere-se a picograma, "ng" refere-se a nanograma, "pg" ou "ug" refere-se a micrograma, "mg" refere-se a miligrama, "ul" ou "μΐ" significa microlitro, "ml" refere-se a mililitro, "1" refere-se a litro.

Uma outra característica da presente invenção é a expressão das sequências de ADN aqui descritas. Tal como é bem sabido na arte, as sequências de ADN podem ser expressas ligando-as operacionalmente a uma sequência de 37 controlo de. expressão num vector de expressão apropriado e utilizando esse vector de expressão para transformar um hospedeiro unicelular apropriado.

Essa ligação operacional de uma sequência de ADN da' presente invenção a uma sequência de controlo.de expressa inclui, obviamente, se já não fizer parte da sequência de ADN,' o fornecimento de um codão de iniciação, ATG, no quadro de leitura correcta a montante da sequência de ADN.

Pode-se utilizar uma ampla variedade de combinações de hospedeiro/vector de expressão na expressão das sequências de ADN da presente invenção. Os .vectores de expressão, úteis, for exemplo, podem. consistir em segmentos de sequências de ADN cromossómica-s, não cromossómicas e sintéticas. Os vectores apropriados incluem derivados de SV40 e plasmidos· bacterianos conhecidos,, por exemplo plasmidos de E. coli col El, pCRl, pBR322, pMB9 e os seus derivados, plasmidos tais como RP4; ADNS de fagos, por exemplo, os numerosos derivados dò fago λ, por exemplo', NM989, e outro ADN de fagos, por exemplo, M13 è ADN de fago de hélice simples e filamentoso; plasmidos de levedura tal como o plasmido de 2μ ou os seus derivados; vectores úteis nas células eucarióticas, tal como vectores úteis nas células de insectos e de mamíferos; vectores derivados de combinações de plasmidos e ADNs de fagos, tal como plasmidos que tenham sido modificados para utilizar o ADN de fago ou outras sequências'de controlo de; e similares.

Pode-se utilizar qualquer uma de uma grande variedade de sequências de controlo de expressão - - sequências que controlam a expressão de uma sequência de ADN ligada ope-racionalmente a ela - - nestes vectores para.expressar as sequências de ADN da presente invenção. Essas sequências de. 38 controlo de expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores precoces ou tardios· de SV40, CMV, vaccinia, polioma ou adenovírus, o sistema lac, o sistema trp, õ sistema TAC, o sistema TRC, o sistema LTR, o operador principal e as regiões do promotor do fago À, as regiões de controlo da proteína revestida fd, o promotor para 3-fosfoglicerato-cinase ou outras enzimas glicoliticas,. os promotores de fosfatase ácida (por exemplo, . Pho5), os promotores.dos factores que emparelham com a levedura a, e outras sequências conhecidas para o controlo da expressão de genes das células proçarióticas ou eucarióticas ou os seus vírus,, e as suas várias combinações. Há uma ampla .variedade de células hospedeiras unicelulares que. são úteis na expressão das sequências de ÁDN da presente invenção. Estes hospedeiros podem incluir hospedeiros, eucariót-icos e procarióticos bem. conhecidos, tal como as estirpes de E. ,colír. Pseudomonas, .Bacillus, Strepiomices, fungos tal como leveduras e células de animais tais. como células' de OHC (ovário', de hamster chinês}, Rl.l, B-W e L-M, .células de rim de macaco verde africano (por exemplo, COS 1, COS '7, BSC1, BSC40, e, BMT.1Ó), células de insectos (por exemplo, Sf9), e células humanas e células de plantas em cultura' de tecidos.

Deve entender-se que nem todos os vectores, sequências de controlo de expressão e hospedeiros funcionarão da mesma forma para expressar as. sequências de ADN da presente invenção. Nem todos hospedeiros funcionam igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. Contudo, um especialista na matéria será capaz de seleccionar os vectores apropriados, as sequências de controlo de expressão, e os hospedeiros sem experimentação desnecessária para conseguir a expressão desejada sem sair do âmbito da presente 39 invenção. Por . exemplo, ao seleccionar um vector, o hospedeiro, deve ser considerado , porque o vector deve funcionar nele. 0 número de cópias do vector, a capacidade para controlar que o número de cópias e a expressão de qualquer uma das proteínas - codificadas., pelo vector, tal como os marcadores de :antibióticos, também terão de ser considerados.

Para seleccionar uma- sequência de controlo de expressão, considera-se normalmente uma variedade de facto-res. Incluem, por exémplo, à força relativa do sistema, a sua possibilidade de controlo, e a sua compatibilidade com a sequência particular de ADN ou com o gene a ser expresso, particularmente no que respeita às estruturas secundárias potenciais. Os hospedeiros, unicelulares apropriados serão seleccionados tendo em consideração, por exemplo, a sua compatibilidade com o vector escolhido, as suas caracte-rísticas de secreção, a sua capacidade de dobrar correcta-mente as proteínas, e os seus requisitos de fermentação, assim como a toxicidade para com o hospedeiro do produto codificado pelas sequências de ADN a ser expressas, e a facilidade de purificação dos produtos de expressão.

Considerando estes e outros factores., um especialista na matéria será capaz de construir uma· ·. variedade de vectores/sequência de controlo de expressão/combinações de hospedeiros que irão expressar as sequências de ADN da presente invenção na fermentação numa cultura animal em larga escala.

Pretende-se ainda que a utilização terapêutica dos péptidos de acordo com a presente invenção, dos análogos do péptído de IL-2 que podem ser preparados a partir, de sequências de nucleótidos do complexo de proteínas/sub- 40 unidades- derivadas estão dentro do âmbito da' presente invenção. Os análogos, tal como os fragmentos, podem ser produzidos, por exemplo,: por digestão da pepsina do material· de IL-2. Outros análogos, tal como muteinas, podem ser produzidos por mutagénese padrão dirigida ao sítio das sequências de codificação de IL-2. Os análogos que exibem "actividade de IL-2" tal como moléculas pequenas, quer. funcionando como promotores ou inibidores, podem ser identificados por meio. de ensaios conhecidos in-· vivo e./ou in vitro.

Tal' como se mencionou antes, uma, sequência de ADN que· codifica . os . péptidos de ' IL-2 pode ser ; preparada,

sinteticamente em. vez .de ser clonâda. A sequência de ADN pode ser; desenhada' com os codões ' apropriados, para a sequência de aminoácidos ' do péptido de . IL-2. Em. geral, quando se seleccionam os codões- preferidos . para' o hospedeiro pretendido se a sequência for utilizada para expressão. A sequência completa é combinada a partir dos oligonucleótidos sobrepostos preparados por processos normalizados numa sequência de codificação completa. Ver, por exemplo,:EDGE, Nature, 292: 756 (1981); NAMBAIR et al., Science, 223: 1299 (1984); JAY et al., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984)

As sequências de ADN sintéticas permitem uma construção conveniente de genes que irão expressar os análogos dos péptidos de IL-2 ou "muteinas". Alternativamente, o ADN que codifica as muteinas podem ser produzidos por mutagénese dirigida ao sitio de genes originais de IL-2 ou ADNcs, e as muteinas podem ser produzidas directamente utilizando a síntese convencional de péptidos. 41

Um processo geral para a incorporação especifica do sitio de aminoácidos não naturais em proteínas, está descrito em Christo.fer J.. Noren, Spencer J. Antoni-Cahill, Michael C. Griffit, Peter G. Schultz, Science, 244: 182-188 (Abril 1989). Este processo pode ser utilizado para criar análogos com aminoácidos não naturais.

De acordo com as aplicações da· terapia de. genes da presente invenção, a· preparação de oligonueleótidos anti-paralelos e de ribozimas pode ser utilizada para regular a expressão de IL-2 ao nível da tradução. Esta abordagem utiliza ácidos nucleicos anti-paralelos ,e ribozimas para bloquear a tradução de um.ARNm específico, quer mascarando esse ARNm com um. ácido nucleico anti-p.ara.lelo ou clivando-o com uma ribozima. Ácidos nucleicos anti-paralelos são moléculas de ADN ou de ARN que são complementares de pelo .menos uma porção de uma molécula específica de ARNm. (Ver WEINTRAUB, 1990; MARCUS-SEKURA, 1988.) Na célula, hibridam com ARNm, formando uma molécula com hélice dupla. A célula não traduz um ARNm nesta forma de hélice dupla. Por isso, os ácidos nucleicos anti-paralelos interferem com a expressão do ARNm na proteína. Os' oligómeros de cerca de quinze nucleótidos e as moléculas que hibridam com o codão de iniciação AUG serão particularmente eficientes, dado que' são fáceis de sintetizar e provavelmente irão dar menos problemas do que as moléculas maiores quando se introduzem nas células. Os processos anti-paralelos têm' sido utilizados para inibir a expressão de muitos genes in vitro (MARCUS-SEKURA,: 1988; HAMBOR et al., 1988).

As sequências de ADN aqui descritas podem assim ser utilizadas para preparar as moléculas anti-paralelas contra 42 e as ribozimas que clivam os ARNms para IL-2 ou as moléculas que estimulam.ou reduzem a secreção de IL-2 e òs seus ligandos. A presente invenção também tem por objecto . uma variedade de aplicações em diagnóstico, incluindo processos para a detecção dá presença e da actividade de IL-2, com referência à sua capacidade para provocar as actividades que são mediadas pelos péptidos da presente IL-2. Tal como .se mencionou antes, ô péptido de IL-2 pode ser utilizado para produzir anticorpos para si próprio por meio de uma variedade de técnicas conhecidas e esses anticorpos podem então ser isolados e utilizados tal como nos ensaios para avaliar a presença e/ou a ·. actividade de gma IL-2 e/ou IL^2 R particular nas células alvo suspeitas..

Tal como descrito em detalhe antes, os anticorpo(s) contra os péptidos de IL-2 podem ser produzidos e isolados por processos . normalizados', incluindo, as técnicas- de' hibridoma bem conhecidas. Pór conveniência, os anti.corpo(s) dos péptidos de' IL-2; serão aqui referidos 'como- Aci e os anticorpos que aparecem nas'outras espécies como Ac2- A presença dos péptidos de IL-2 ê"IL-2 nas células pode ser acertada por processos imunológicos usuais aplicáveis a essas determinações. Conhece-se um certo número de processos úteis. Três desses processos, que são especialmente úteis, utilizam quer o péptido marcado de IL-2 com um marcador detectável, o anticorpo Abi marcado com um marcador detectável, ou o anticorpo Ab2 marcado com um marcador detectável. Os processos podem ser resumidos pelas equações que se seguem em que o asterisco indica que a partícula está marcada e "PIL" significa o péptido de IL-2: 43 A. PIL * + ACi = PIL* Aci B. PIL + Ac* = PIL ACi* C.' PIL + Aci + Ac2 * = PIL Aci Ac2*

Os processos e as suas aplicações são todos familiares para os especialistas na matéria e, de acordo com isto, podem ser utilizados dentro do âmbito da presente invenção. 0 processo "concorrente", processo A, está descrito nas patentes norte-americanas U.S. Nos. 3.654.090 e 3,850,752. O processo C, o processo "sanduíche", está descrito nas patentes norte-americanas. U.S.: Nos. RE 31.006 e 4.016.043. São conhecidos ainda outros processos tal como o processo do "anticorpo duplo" ou. "DASP". " , Em cada exemplo, o PIL forma complexos com um ou mais anticorpo(s) ou parceiros de e um dos elementos do complexo é marcado com um marcador .detéctável. Pelo facto de se formar, um complexo, se desejado,, pode-se determinar a sua quantidade.por processos conhecidos aplicáveis à detecção de marcadores.

Será evidente do que ficou dito que a propriedade característica de AC2 é que reage com Aci. Isto acontece porque Acj que se desenvolve em espécies de mamíferos tem sido utilizado noutras espécies como um antigénio para desenvolver o anticorpo Ac2.’ Por exemplo,. Ac2 pode desenvolver-se em cabras utilizando anticorpos de coelhos como antigénios. Por isso AC2 será um anticorpo anti-coelho desenvolvido em cabras. Para fins da descrição e das reivindicações, Aci será referido como um anticorpo primário ou anti-PIL, e Ac2 será referido como um anticorpo secundário ou anti-Ac. 44

Os marcadores que são mais vulgarmente utilizados nestes estudos são elementos radioactivos, enzimas, produtos químicos que fluorescem quando . expostos a luz ultravioleta e a outras.

Conhece-se um certo número de materiais fluorescentes e podem ser utilizados como marcadores. Estes, incluem, por exemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, vermelho do Texas, azul de AMÇA e amarelo de Lucifer. Um material de detecção particular é o anticorpo anti-coelho preparado em cabras e conjpgado com fluoresceína através de um iso-ticçianato. O. péptido de IL-2 ou os seus parceiros de ligação também podem ser marcados com elementos radioactivos õu com uma. enzima. 0 marcador radioactivo pode ser deteçtado por qualquer um dos processos de contagem ; correntemente disponíveis'.' 0 isótopo preferido pode ser seleccioriado entre 3H, : 14Cr 32P, 35S, .35C1, 51Cr, 57Co, 56Co, ' 59Fe. 90Y 125! 131I e 186Re

Os marcadores' de enzimas também são úteis .e podem· ser detectados por'qualquer uma das técnicas presentemente utilizadas como colorimetria, espectro-fotometria, fluoroes-pectrofotometria, amperometria cu gasometria. Conjuga-se a enzima ' com a partícula seleccionada por reacção com moléculas. ligadas por pontes tal como Carbodi^imidas, di-isocianatos, glutaraldeído e similares. Muitas enzimas que podem ser utilizadas nestes processos são conhecidas e podem ser utilizadas. As preferidas são peroxidase, B-glucuronidase, B-D-glicosidase, B-D-gaíabtosidase, ureiase, glicose-oxidase mais peroxidase e fosfatase alcalina. As patentes norte-americanas U.S. t Nos, 3.654.Q90; .3.850.752;. e 4.016.043 são aqui referidas a título de exemplo por 45 causa da descrição de material de marcação e processos alternativos.

Um sistema de ensaio particular que pode ser utilizado de. acordo com a presente invenção é conhecido como um ensaio do receptor. Num ensaio do receptor, o material a ser ensaiado é marcado de forma apropriada e depois inoculam-se certas colónias celulares de ensaio com uma quantidade tanto do material marcado como do material não marcado depois do que se realizam estudos de ligação para determinar em que medida o material marcado se liga aos receptores da célula. Deste modo, podem confirmar-se diferenças de afinidade entre os materiais.

Um outro enquadramento da presente invenção é uma aplicação de diagnóstico dos kits de ensaio comerciais apropriados para serem utilizados por um especialista em medicina. 0 kit pode ser preparado para: determinar a presença ou a ausência da actividade pré-determinada de R-IL-2 ou a capacidade da actividade pré-determinada de IL-2 nas células-alvo suspeitas. De. acordo com as. técnicas de ensaio . discutidas antes, uma das classes' desses kits conterá pelo menos o péptido de IL-2 marcado ou o seu parceiro de ligação, por exemplo um anticorpo específico, e instruções, obviamente, consoante o processo seleccionado, por exemplo, "concorrente," "sanduíche" "DASP" e similares. Õs kits.podem também conter reagentes periféricos tal como tampões, estabilizantes, etc.

De acordo com isto, pode-se preparar um kit de ensaio, para a demonstração da presença ou da capacidade das células para a actividade pré-determinada de IL-2 R, compreendendo: 46 (a) uma quantidade pré-determinada de pelo menos um componente marcado,, reactivo sob . o ponto dé' vista, imuno-químico obtido por ligação directa ou indirecta do presente factor do péptido de· IL-2 ou um seu parceiro de ligação especifico, com um marcador detectável; (b) outros reagentes; e (c) instruções para utilização do referido kit.

Mais especificamente, o kit do ensaio de diagnóstico pode compreender: (a) uma quantidade conhecida do péptido IL-2 tal como se descreveu antes (ou um parceiro de ligação)·ligado geralmente a uma fase- sólida para formar.· um imuno-absorvente ou, em alternativo, ligado a um marcador apropriado ou vários tal como produtos' acabados, etc. (ou os seus parceiros .de ligação) um de cada; .. (b) se necessário', outro reagentes; e ' (c) . instruções para utilização do referido kit.

Numa outra variante, o kit. de ensaio pode ser preparado , e utilizado para os fins estabelecidos · antes, operando de acordo com um protocolo pré-determinado (por exemplo, "concorrente", "sanduíche", "anticorpo . duplo", ) etc.), e compreende: (a) um componente marcado que tenha sido obtido, por acoplamento do péptido de IL-2 com um marcador, detectável; (b) um ou mais reagentes imuno-quimicos adicionais, dos quais pelo menos um reagente é um ligando ou um ligando imobilizado, ligando esse que se selecciona no grupo que consiste em: 47 (i) um ligando capaz de se ligar ao componente marcado (a); (ii) um ligando capaz de se ligar ao parceiro de ligação do componente marcado (a); (iii) um ligando capaz de se ligar a pelo menos’um dos componente(s) a ser determinado; e (iv) um ligando capaz de se ligar a. pelo menos um dos parceiros de. ligação de pelo menos um dos componente (s). a ser determinado; e (c)· instruções para a realização de um protocolo para a detecção e/ou determinação de um ou mais componentes de uma reacção , imurío-química entre o péptido de Ii-2 e um seu.-parceiro de ligação específico.

Tendo- descrito a. presente invenção de. uma forma genérica, pode-se compreendê-la melhor com a referência a certos .exemplos específicos que são aqui dados apenas com fins ilustrativos.e não pretendem ser limitativos, a menos què isso seja especificado expressamente·.

EXEMPLOS

Exemplo 1:. Caracterização do anticorpo monoclonal de rato H2.8

Imunizaram-se repetidamente ratos fêmeas BALB/c com 25 a 50 pg de péptido 1-30 pôr injecção. Acoplou-se o péptido a um veículo de KLH e injectou-se com adjuvante completo de Freund (primeira injecção) ou adjuvante, incompleto de Freund' (injecções subsequentes). Avaliou-se o titulo da actividade anti-IL-2 num. grupo de cinco animais. As células do baço do animal que davam ã melhor resposta foram utilizadas para a fusão com a linha de células SP2-0. 48

Clonaram-se quatrò hibridomas com actividade específica anti-IL-2. Purificaram-se os anticorpos a partir do respectivo fluido ascítico por meio de uma precipitação em sulfato de amónio. Verificou-se a pureza dos reagentes (> 80%) por meio de géis de poliacrilamida. Caracterizaram-se as propriedades dos Acms. Os resultados estão relatados apenas para o Acm H2-8. Determinou-se o isotipo (IgGl) e o Kd (1 ,4 x 10_9M) do Acm H2-8.

Utilizaram-se como controlos os Acms 19ΒΓ1 (IgGl) e 2C4 . (IgGl) previamente caracterizados (MOREAU· et al (.1995b) Mel. Immunol. 32: 1047-1056; REBOLLO et a.1 (1992) Mal. Immunol. 29: 119-130). Os Acms 19811 e ; 2C4 inibiram a ligação de IL-2 a R-IL-2B e reconheceram os péptidos 1-10 (ver a seguir), 1-22 e 1-30. 11B11 (IgG, k) monoclonal de rato específico para o IL-4 de murino foi fornecido pelo Dr. W. PAUL (National. Institute .of Healt, Betesda MD, USA)-e'utilizou-se como foi descrito previamente (MOREAU et al. (1995b) Mel. Immunol. 32: 1047-1056). . O efeito inibidor do Acm H2-8 purificado foi ensaiado primeiro na ligação de IL-2 marcada com 125T. Mediram-se os seus efeitos em dois transfectantes derivados de uma linha de células de rato expressando apenas IL-2mRY. Obtiveram-se os transfectantes TS15 e TSla depois da transfecção com R·^ IL-2B humana e ADNc de R-IL-2a, respectivamente. Ambas as linhas, de células ligam-se a IL-2. O Acm H2-8 inibe a ligação de IL-2 to Τ81β sem afectar significativamènte a ligação de IL-2 a TSla (dados não mostrados).

Estudaram-se as propriedades de ligação do Acm H2-8 por ELISA. Revestiram-se as placas quer com IL-2 ou os péptidos 1-22 ou 1-30. O Acm H2-8 liga-se a IL-2 e aos péptidos 1-30, mas não reconhece os . péptidos- 1-22.. Como 49 controlo o Acm 19B11 (previamente caracterizado). reconhece ambos os péptidos (Figura 2) .

Realizaram-se experiências de inibição de ligação para caracterizar melhor a especificidade do Acm H2-8Revestiram-se- as placas com IL-2 ê utilizou-se uma concentração dé Acm H2-8 dando aproximadamente 50% de ligação máxima. Pré-incubou-se H2-8 com diferentes péptidos incluindo cinco decapéptid.os (1-10, 5-15, 10-20, 15-25, 20-30). Apenas.IL-2' e os péptidos^ 1-30 foram capazes de. inibir a ligação do Acm Η2-8 à IL-2.· Os péptidos 1-30 fo.ram os' inibidores mais; eficientes nestas experiências (Figura- 2)'. Este resultado é compatível com o facto de qué os péptidos- 1-30 isolados se, dobram numa .configuração, helicoidal, α (teor de hélice a de. 50% ± 7%) enquanto nos péptidos 1-:22 não acontece (13% ± 5%) como se mediu por dicroísmo circular. Por isso, os péptidos 1-30 podem adoptar algumas, conformações estruturais únicas muito próximas das da IL-2 natural. Como controlo a ligação do Acm 19B11 é inibida pela IL-2 mas também pelos péptidos 1-10, 1-22 e 1-30. Isto confirma que o epítopo do Acm 19B11 está próximo, da posição terminal NH2 de IL-2 como já foi sugerido antes (MOREAU et al. (1995b) Mal. Immunol. 32: 1047-1056).

Exemplo 2: Sintese de péptidos

Sintetizaram-se os péptidos num conjunto de etapas em fase sólida utilizando o processo de Boc/ácido trifluoro-acético (MERRIFIELD (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149- 2145), numa - resina de p-metil-benzidrilamina (Applied Biosystems) com um sintetizador de péptidos 430 A da

Applied Biosystems. 50

Exemplo 3: Envolvimento dos aa nas posigoes 17 e 20 no reconhecimento do Acm H2-8

Avaliou-se a reactividade do Açm H2-8 a vários mutantes de IL-2 incluindo um mutante na posição 17 {Leu -> Asp) , quatro mutantes na - posição 20 (Asp Asn; Asp -► Lis; Asp -* Arg e Asp Leu) e um duplo mutante 17-20 (Leul7 -*·. Asp e Asp20 -► Leu) por análise de Western blot (Figura 3) - O Acm H2-8 não reconhece mutações na posição 20 ou o duplo mutante (THÈZE J (1994). Eur. Çytokine Netw. 5: 353-368; MOREAU et al. (1995a) J. Immunol. 155: 3401-3408; CHASTAGNER et al. (1996) Eur. J,' Immunol. . 26: 201-206; MACKAY D (1992) Science 257: 410-413) . O reconhecimento da mutação na posição 17 é também afectado. Como controlo positivo mostram-se os resultados obtidos com o Acm 2C4 que reconhece um epítopo próximo, da posição' terminal NH2. de IL-2. Dado que este Acm (tal como 19Β1Γ), reconhece os péptidos 1-10 que não comportam mutação, a sua ligação a IL-2 não é afectada. Do mesmo modo, as mutações na- posição. 125 e/ou 127 não afectam a ligação com os Acms H28 e 2C4,. e servem como controlos adicionais. As experiências por meio de ELISA realizadas com todos os mutantes suportam os dados obtidos com as análises por Western blots (dados não mostrados)·. 0 Acm H2-8, conforme caracterizado' no Exemplo' 1 e .0 19B11 (descrito em Molec. Immunol. (1995) 32:c!047-1056) têm propriedades semelhantes: ambos se ligam à extremidade do terminal NH2 de IL-2 e inibem especificamente a ligação de IL-2 à cadeia R-IL-2h. Dado que ambos os anticorpos reconhecem as sequências localizadas nos péptidos 1-30 têm interesse compara a relação' entre os epítopos correspon- 51 dentes. Utilizaram-se placas revestidas com o Acm H2-8 para ligar os : péptidos 1-30. A ligação do Acm 19B11 a estas placas foi positiva, indicando assim que os epitopos dos Acms H2-8 e 19B11 não se sobrepõem significativamente. Vários controlos realizados para verificar estes resultados estãò .ilustrados (Figura 3) . A' ligação de 19B11. está estritamente dependente da presença dos péptidos 1-30 e, do revestimento por meio do Acm H2-8. Os resultados obtidos· com o Acm 3H9, reconhecendo, os péptidos 30-54, demonstram, ainda mais a especificidade dos dados apresentados na Figura '3.

Exemplo 4: Linhas de células, meios decultura e ensaio de proliferação .

As células TSl expressam apenas R-IL-2y de. rato.' As células TS12 obtiveram-se após transfecção das células TSl com ADNc de. R-IL-2p humano clonado' no vector de expressão. pdKCR. gehtilmente cedido pelo Dr. T. TANIGUCHI (Institute for.Molecular and Cellular Biology, Universidade de Tóquio, Japão). Obtiveram-se as célulasTSla após· transfecção de células TSl com ADNc de R-IL-2oc humano clonado no vector de expressão de pCMV4 fornecido pelos Drs W.A. KUZIEL e W.C. GREENE (Gladstone Institute Virol./ Immunol., San Francisco CA, USA) . TSip e TSla foram caracterizados previamente (PITTON et' ., al. (1993) Cytokine 5: 362-371) . Também se utilizou CTLL2 e YT para os estudos de ligação de IL-2.

Todas as culturas foram realizadas em meio completo composto por RPMI 1640 (BioProducts, Walkerville, MD), 10% de SBF inactivado pelo calor (Serovial, Vogelgsun, França) , glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 2-B-mercaptoetanol 50 mM (2βΜΕ), As linhas de células TS15 e TSla· cresceram como células ΤΞ 1 num meio 52 completo complementado com sobrenadante das proteínas de IL-9 de murino que expressam baculovírus recombinante (DIB 349) (UITTENHOVE et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 6934-6938) . Fez-se, uma cultura das células TSlft (104 célu-las/cavidade) em 96 cavidades em placas microtituladorás de fundo plano com um volume final de 0,2 ml. Fizeram-se ensaios com várias concentrações de rIL-2 humana, muteinas de IL-2 ou IL-9r de rato. Para ensaiar o efeito inibidor dos Acms, misturaram-se nas cavidades da cultura diferentes concentrações destes reagentes com as respectivas linfocinas durante 30 min a baixa temperatura antes de adicionar- as células. Os efeitos inibidor.es de mutèina 20 Leu (descritos em Cytokine (1997) 9: 488-498, qúe está aqui incluída integr.almente como referência) foram estudados por pré-incubação das células (30 min a 4 °C) com a concen tração de inibidor indicada antes de se adicionar IL-2'ou IL-9 às cavidades... As culturas, foram submetidas a pulsação· com 0,5 pCi/cavidade de (3H) TdR passadas . 36 ' h de incubação· e colheram-se 15 h rnais tarde..

Exemplo 5: Propriedades biológicas do Acm H2-8

Avaliaram-se.- as. propriedades biológicas do Acm H2-8 na proliferação da linha de células TS1|3 dependente de IL-2-ou de I.L-9 (Figura 4):. Nestas experiências utilizou-se IL-2 Pro125 mutante de IL-2 (Cis Pro) . Esta mutação reduz ligeiramente a afinidade de IL-2 para R-IL-2 sem afectar a proliferação máxima obtida quando se utilizam concentrações mais elevadas do mutante. A Figura 4 mostra que diferentes concentrações, do Acm H2-8 reduzem a proliferação de IL-2 de Τ31β. Observa-se uma 53 deslocação progressiva da curva de titulação de IL-2 com o aumento das concentrações de Acm H2-8. Os efeitos inibidores de Acm H2-8 são comparáveis aos obtidos com o Acm 19B11, que também se verificou que inibe a proliferação de células que comportam R-IL-2 de elevada afinidade (MOREAU et al. . (1995b) Mol. Immunol. 32': 1047-1056) . A adição tanto de Acm H2-8 como de 19B11 elimina completamente a proliferação de IL-2 mesmo numa dose. de IL-2 muito elevada·.·.

Como controlos, . a Figura 4 mostra que o Acm 11B11 (especifico para' o ÍL-4 de rato) não. afecta· â proliferação de TS1(3. dependente de IL-2. ,A proliferação de TSlp dependente de IL-9 também· não é afectada nem, por H2-8 nem por 19B 11.

Exemplo 6: 'Ensaio de ligação e de inibição de. IL-2

Realizou-se o ensaio de ligação como já foi descrito (MOREAU et al. (1995bj Mal. .Immunol.' 32: 1047-1056). Estu-dou-se primeiro a ligação de IL-2 marcada- com 125i às diferentes linhas de células. As experiências de inibição foram realizadas a uma concentração de IL-2 marcada com 125 Γ originando uma ligação máxima entre 50. e:70 .%. Analisaram-se os efeitos das diferentes muteinas após pré-incubação de 1 hr a 4 °C seguida de incubação com IL-2 marcada com 12 51 (3 h a 4 °C).. Em cada uma das experiências determinou-se á ligação não especifica. Os dados estão expressos ;como % da capacidade inibidora das diferentes muteinas versus proteína de tipo selvagem.

Exemplo 7: Propriedades flsico-químicas do péptido IP130 .(Cytokine, 1997) 0 péptido, de terminal amino de IL-2 incluindo os aa (aminoácidos): 1 a. 30 tem um peso molecular de 3422. 54

Os estudos de dicroismo circular realizados com IP130 indicam que a 20 °C, em. tampão de fosfato (20mM, pH 1,2), 50 % dos residuos estão numa configuração em hélice. A estrutura quaternária do péptido IP130 foi também estudada pelo equilíbrio da sedimentação - difusão. A uma concentração superior a 5 x 10-6M, a maior parte das moléculas estão numa forma tetramérica (em equilíbrio com um complexo octomérico). A sequência dos amínoácidos 1 a 30 mostra 7 leucinas e 2 isoleucinas entre os primeiros -20 resíduos. A periodicidade destes aa assim como os resultados anteriores sugerem um-modelo estrutural para IP 130 que' deverá conter 4 péptidos organizados em 4 hélices a. Neste modelo as. cadeias laterais das leucinas e das isoleucinas aparecem na mesma face. Esta face é hidrofóbica e quarto destas faces irão constituir .um núcleo hidrofóbico inacessível à. água. A concentrações elevadas os péptidos 1-1Ò tendem a dimerizar e isto explicará a formação dos péptidos octoméricos.

Estudou-se a ligação de IP 130 à cadeia solúvel de 1L-2RB. Tem-se verificado que R-IL-2B solúvel é dimérica em solução. A partir destes resultados, propôs-se um modelo estrutural: o complexo deverá incluir quatro péptidos de IP130 e duas cadeias de R-IL-2B ((IP130)4/(R-IL-2B)2).

Exemplo 8: Propriedades biológicas de IP130

Realizaram-se estudos quer com uma linha de células de murino transfectada quer por gene de R-IL-2B humana (TSlfi) quer com uma linha de células dé leucémicas humanas dependente de IL-2 (Kit 225 do Dr. T. HORI). 55 IP 130 estimula a proliferação de TS1 5 na ausência de IL-2. Na presença deIL-2 observa-se uma forte sinergia com o. péptido. Ambas as actividades são obtidas a concentrações, comparáveis (CI-50 ~ pM)· IP130 actua apenas nas linhas de células que expressam R-IL-25 humana. Isto está de acordo com os estudos prévios que mostraram que o R-IL-25 de murino não se liga a IL-2 (CHASTAGNER et al. 1996, Eur. J. Immunol. 26: 201-6). Consequentemente, as linhas clássicas de murino (C30-1, CTLL, HT-2,....) utilizadas normalmente para . avaliar a actividade dé IL-2 permanecem insensíveis aos efeitos de ΓΡ130. Além disso o R-IL-25 anti-human que bloqueia Acm neutraliza os efeitos de IP130.

Apenas o péptido induz a fosforilaçâo de proteínas na linha de células do Kit 225. No modelo das proteínas fosforiladas, a cinase Shc é facilmente reconhecida. Depois da imuno-precipitação específica e da análise de mancha com Acm-4G10 (anti-Ptir), identifica-se R-IL-25 fosforilado nos lisados da linha de células do kit 225 estimulada por indução de IP130.c-mic que depende da fosforilaçâo de R-IL-25 também se observa após a estimulação de IP130. STAT-3 e STAT-5 não são activados depois da estimulação de IP130 dado que R-IL-2y não está envolvido na interacção de IP130 com o Kit 225.

Exemplo 9: Propriedades imunológicas de 1P130 e utilização como agente terapêutico A cadeia de R-IL-25 és consitutivamente expressa pelas células NK humanas dos dadores estudados (DAVID et al., Blood .91: 165-172, 1998) . Os monócitos aperias expressam a 56 cadeia de R-IL-2y. Outros linfócitos não expressam nem R-IL-2fi nem R-lL-2a nem R-IL-2y- (DAVID et al. 1998). IP130 induz as células NK a entrarem no cico da célula. IP130 também tem sido experimentado na geração de, LAK ín vitro. IP130 induz a actividade de LAK tal como se ensaiou nos alvos de K562.

Isolou-se Acm H2-8 após imunização com.os péptidos IL-2 1-30. Reconhece tanto IL-2 como os péptidos 1-30, mas não os péptidos mais pequenos que cobrem a mesma região (Figura 2). Este resultado sugere que Acm H2-8.reconhece um epitopo conformacional na região do N-terminal de IL-2, e que es.te epitopo é simulado pelo péptido 1-30. Na verdade', as medidas do dicroísmo circular revelam uma frácção significativa de uma estrutura de hélice α para o péptido 1-30 péptido. Além disso, H2-8 pode ligar-se ao péptido 1-30 mesmo na presença do Acm 19B 11 (que reconhece um epitopo linear na parte não helicoidal do péptido 1-30), mas não reconhece os mutantes de IL-2 na posição 20 (no centro da α-hélice A) como determinado por análise de "Western blot" ou ELISA (Figura 3 e outros dados não mostrados). O anticorpo também inibe a bioactividade de IL-2 nas células TSlft (Figura 4), . cuja proliferação é estritamente dependente da expressão da .cadeia de R-IL-2L humana.

Considerados em conjunto, estes resultados demonstram que o Acm H2-8 reconhece um epitopo à volta de Asp20 de IL 2,, uma região que: influencia directamente a interacção da citocina com R-IL-2L.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS 57 <11Q> INSTITUT PASTEUR THEZE, Jacques ECKENBERG, Ralph MOREAU, Jean-Louis GOT.DBERG, Michel ROSE, Thierry ALZARI, Pedro MAZIE, Jean-Claude <120> NOVOS PÉPTIDOS DE IL-2 E. OS SEUS DERIVADOS E A SUA UTILIZAÇÃO COMO AGENTES TERAPÊUTICOS, <130> BLOcb22 6/79PCT < 14 0 > 25 <141> <150> 09/116.594 < 151> 1999-07-16 <160> 4 <170> Patentln Ver. <210> 1 <211> 93 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 . atggctccga cgagcagctc caccaagaaa acccagctcc agctcgaaca cctgctçctg 60 gacctgcaga tgatcctgaa cggtatcaac aac 93 <210> 2 <211> 31 58

<212> PRT <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 2

Met Ala Pro Tre Ser Ser Ser Tre Lis Lis Tre Gin Leu Gin.Leu Glu 1 5 10 15

His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gli Ile Asn Asn. 20 25 30

<210> 3 <21i> 90 <212> ADN <213> Ilomo sapiens <4C0> 3

gctccgacga gcagctccac caagaaaacc cágctccagc tcgaacacct gctgctggac 6Q-ctgcagatga tcctgaacgg tatcaacaac - ' 90 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <40C> 4

Ala Pro Tre Ser Ser Ser Tre Lis Lis Tre Gin Leu Gin Leu Glu His 1 ' ; 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gli Ile Asn Asn 20 . 25 30

Lisboa, 14 de Agosto de 2008 59

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção in vitro da presença de R-IL-2 caracterizado pelo facto de se medir R-l.L-2 por meio de: a) fazer contactar (1) uma amostra biológica de um mamífero na qual se suspeita da presença ou da acti-vidade do referido R-IL-2, com (2) um péptido que consiste na SEQ ' ID NO: 2 ou na SEQ ID NO: 4, em condições que permitam que ocorra à ligação do referido R-IL-2 ao referido péptido; e b) detectar se a ligação de facto ocorreu entre o R-IL-2 da referida amostra e o péptido que consiste na SEQ ID NO: 2 ou na SEQ ID NO: 4.
2. 2. Processo para inibir a activldade de um R-IL-2 caracte rizado pelo facto de compreender o contacto do referido R-IL-2 com uma quantidade, do péptido que' consiste na SEQ ID NO: 2 ou na SEQ ID NO: 4, suficiente para inibir a ligação de IL-2 ao referido R-IL-2 em condições que permitam que ocorra a ligação do referido péptido ao' referido R-IL-2.
3. 3. Utilização de um péptido que consiste nas SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4, útil pàra induzir num doente as acti-vidades úteis de IL-2, seleccionadas do grupo que consiste na estimulação de células CD4, estimulação de células CD8+, estimulação de células NK, contra a indução da actividade virai ou de tumor de fosforilação de SHC e indução da via de SHC/MAPK, para a preparação de um medicamento. 1
4. 4. Utilização de um vector contendo uma sequência de ADN que codifica um péptido que consiste na SEQ ID NO: 2 ou , na SEQ ID NO: 4 caracterizada por se destinar à pré-paração de um medicamento útil para tratar um doente que tem falta de actividade de IL-2.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 3, caracteriza da pelo facto de o referido péptido que consiste nas SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 estar incluído numa mistura que compreende uma citocina.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5 caracterizada pelo facto de a citocina ser IL-2, IL-4, IL-9, IL-7 ou ; IL-15.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de a quantidade de IL-2, administrada por injecção, ser de 1 x 106 unidades internacionais.
8. 8. Utilização de um péptido que consiste na sequência homóloga da SEQ ID NO.:. 2 ou da SEQ ID NO: 4., .caracterizada pelo facto de o, referido péptido .estar codificado por uma sequência de nucleótidos com pelo menos cerca de 75% dos nucleótidos da sequência que codifica para a SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NO: 4,. diferindo o referido péptido da SEQ ID NO: 2 ou da SÉQ ID.NO: 4 por uma ou mais alterações conservadoras,.em que'a referida-sequência homóloga exibe pratícamente a mesma actividade ou.caracteristicas.de ligação ou ambas que a SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NÓ: 4, útil para induzir num paciente as actividades úteis seleccionadas de IL-2, seleccionadas no grupo que consiste na estimulação das células -CD4,. estimulação de células CD8+, estimulação -de células NK, indução da fosforilação de SHC e indução 2 da via SHC/MAPK, para a preparação de um medicamento contra uma actividade virai ou tumoral.
9. 9. Utilização de um péptido tal como definido na reivindicação 8, caracterizada pelo facto de a referida, alteração conservadora ser a substituição de grupos R não polares nos seus aminoácidos por outros grupo.s R não polares, para a preparação de um medicamento útil para induzir . num doente actividades úteis selecciona-das de IL-2, actividades seleccionadas no grupo que consiste na estimulação das células CD4, estimulação de células CD8 + , estimulação' de células NK, uma actividade anti-viral, uma actividade anti-tumoral, indução da fosforilação, de SHC e indução da via de SHC/MAPK.
10. 10. Utilização de um péptido tal como definido na reivindicação 8, caracterizada pelo'facto de a referida alteração conservadora ser a substituição de grupos R polares não carregados-, por outros grupos . R polares não carregados nos seus aminoácidos, para a preparação de . um medicamento útil para induzir num paciente actividades úteis seleccionadas de IL-2, seleccionadas no: grupo que consiste na estimulação das células CD4, estimulação de células CD8 + , estimulação de células NK, uma actividade anti-viral, uma actividade anti-tumoral, indução da fosforilação de SHC fosforilação e indução da via SHC/MAPK.
11. 11. Utilização de um péptido tal como definido na reivindicação 8, caracterizada pelo facto de a referida alteração conservadora ser a substituição de grupos R polares carregados por outros grupos R polares carregados nos. seus aminoácidos, para a preparação" de um medicamento útil para induzir num doente actividades úteis se- 3 leccionadas de IL-2, seleccionadas no grupo que consiste em estimulação das células CD4, estimulação de células CD8+, estimulação de células NK, actividade anti-viral, actividade anti-tumoral, indução da fosfo-rilação de SHC fosforilação e indução da via SHC/MAPK.
12. 12. Utilização de um péptido tal como definido na reivindicação 8, caracterizada pelo facto de a referida alteração conservadora corresponder a um Lis substituído por Arg, ou vice-versa de modo a que se mantenha a carga positiva, para a preparação de um medicamento útil para induzir num doente actividades úteis seleccionadas de IL-2, seleccionadas no grupo que consis- • te na estimulação das células CD4, estimulação de células CD8 + , estimulação de células NK, actividade anti-viral, actividade anti-tumoral, indução da fosfò-rilação de SHC fosforilação e indução da via SHC/MAPK.
13. 13. ·Utilização de um péptido tal como definido· na reivindi-. cação 8, caracterizada pelo facto de·a referida altera-.. çãò conservadora corresponder a um Glu. substituído por Asp,' ou vice-versa de modo' a .que se mantenha a carga negativa, para a preparação de um medicamento útil para induzir num doente as actividades úteis seleccionadas de IL-2, seleccionadas no grupo que consiste na estimulação das células CD4, estimulação de células CD8+, estimulação de células NK, actividade anti-viral, actividade anti-tumoral, indução da fosforilação de SHC, fosforilação e indução da via SHC/MAPK.
14. 14. Utilização de um péptido tal como .definido na reivindicação 8,' caracterizada pelo facto de a referida alteração conservadora corresponder a uma Ser substituída por Tre, de tal modo que se mantém o grupo OH livre, para a 4 preparação de um medicamento útil para induzir num doente as actividades úteis seleccionadas de IL-2, seleccionadas no grupo que consiste na estimulação das células CD4, estimulação de células CD8 + , estimulação de células NK, actividade anti-viral, actividade anti-tumoral, indução da fosforilação de SHC, fosforilação e indução da via SHC/MAPK.
15. 15. Utilização de um péptido tal como definido na reivindicação 8, caracterizada pelo facto de a referida alteração conservadora corresponder a um Gin substituído por Asn de tal modo que se mantenha o grupo NH2 livre,· para a preparação de um medicamento útil para induzir num doente actividades úteis seleccionadas -de IL-2, seleccionadas no grupo que consiste na estimulação das células CD4, estimulação de células CD8 + , estimulação de células NK, actividade anti-viral, actividade anti-tumoral, indução da fosforilação de SHC, fosforilação e indução da via SHC/MAPK. '
16. 16. Utilização de um péptido que consiste na sequência homóloga da SEQ ID NO: 2 ou dá SEQ ID NQ: 4, estando o referido péptido codificado por uma sequência de nucleótidos com pelo menos cerca de 75 % dos nucleóti-dos da .sequência que codifica para a SEQ ID NO: 2 ou a SEQ ID NO: 4 e com uma actividade que compreende a indução da fosforilação de SHC; ou a indução da via de SHC/MAPK, para a preparação de um medicamento útil para induzir num doente actividades úteis escolhidas de IL-2 contra uma actividade virai ou tumoral.
17. 17. Utilização de acordo com as reivindicações 8 a 16, caracterizada pelo facto de o referido péptido estar incluído numa mistura que compreende uma citocina. 5
18. 18. Utilização de acordo com as reivindicações 8 a 16, ca-racterizada pelo facto de o referido péptido estar presente numa quantidade capaz de induzir as. referidas actividades úteis, selecc.ionadas no grupo que consiste na estimulação de células CD4,. estimulação de células CD8 + , estimulação de células NK,' actividade anti-viral, actividade anti-tumoral, indução da fosforilação de SHC fosforilação e indução da. via de SHÇ/MAPK.'.
19. 19. Utilização de acordo com. .a reivindicação 17, caracte- rizáda pelo facto de a citocina ser IL-2, IL-4, IL-9, 11-7 .ou IL-15.
20. 20. Utilização de acordocom a reivindicação; 19, caracte-rizada pelo facto· de a quantidade de :IL-2, administrada por injecção, ser.de 1 x 106 unidades internacionais. Lisboa,: 14 de Agosto de 2008. 6