JP2657221B2 - ヒトＦｃγレセプター▲ＩＩＩ▼ - Google Patents
ヒトＦｃγレセプター▲ＩＩＩ▼Info
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- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般に治療用化合物に関し、より詳細には
ヒト免疫グロブリンＧに対する可溶性および膜結合型の
低親和性レセプター、それをコードする核酸、およびこ
の種のレセプターの診断・治療用途に関する。
ヒト免疫グロブリンＧに対する可溶性および膜結合型の
低親和性レセプター、それをコードする核酸、およびこ
の種のレセプターの診断・治療用途に関する。
背景 免疫グロブリン（IgG）のFc部分に対するレセプター
は細胞性免疫防御において中心的な役割を演ずる。３種
類の前記レセプターが確認されている：単量体IgGに対
して高い親和性をもつ72キロダルト（kD）レセプターは
単球と一部のマクロファージに存在し、単量体IgGに対
して低い親和性をもつ40kDレセプターは単球、好中球、
好酸球、血小板およびある種のヒト腫瘍細胞系列に存在
し、そして単量体IgGに対して低い親和性をもつ50〜70k
Dレセプターは好中球、好酸球、ナチュラルキラー細胞
およびマクロファージに存在する。これらの３種類のFc
γレセプターはそれぞれFcγR I、FcγR IIおよびFcγR
IIIと呼ばれている:Unkeless et al.,Ann.Rev.Immuno
l.,Vol.6,p.251−281（1988）。
は細胞性免疫防御において中心的な役割を演ずる。３種
類の前記レセプターが確認されている：単量体IgGに対
して高い親和性をもつ72キロダルト（kD）レセプターは
単球と一部のマクロファージに存在し、単量体IgGに対
して低い親和性をもつ40kDレセプターは単球、好中球、
好酸球、血小板およびある種のヒト腫瘍細胞系列に存在
し、そして単量体IgGに対して低い親和性をもつ50〜70k
Dレセプターは好中球、好酸球、ナチュラルキラー細胞
およびマクロファージに存在する。これらの３種類のFc
γレセプターはそれぞれFcγR I、FcγR IIおよびFcγR
IIIと呼ばれている:Unkeless et al.,Ann.Rev.Immuno
l.,Vol.6,p.251−281（1988）。
IgG被覆血小板のFcγR III媒介除去は、過度の出血に
よって特徴づけられる血小板欠乏症、免疫血小板減少性
紫斑病（immune thrombocytopenic purpura;ITP）の発
生において重要な役割を演ずると考えられる:von dem B
orne,p.222−256,Immunohaematology,Engelfriet et a
l.,eds.（Elsevier,Amsterdam,1984）。Clarkson et a
l.,New England J.Med., Vol.314,p.1236−1239（198
6）は、難治性ITP患者へのリガンド阻止抗FcγR III抗
体の注入が血小板数の一時的増加をもたらしたと報じて
いる。この観察は、ITPの大方の有害症状が、IgG被覆血
小板上の結合部位を遮断するか又はその結合部位につい
てFcγR IIIと競合する作用物質の投与により、一時的
に改善されうることを示唆している。
よって特徴づけられる血小板欠乏症、免疫血小板減少性
紫斑病（immune thrombocytopenic purpura;ITP）の発
生において重要な役割を演ずると考えられる:von dem B
orne,p.222−256,Immunohaematology,Engelfriet et a
l.,eds.（Elsevier,Amsterdam,1984）。Clarkson et a
l.,New England J.Med., Vol.314,p.1236−1239（198
6）は、難治性ITP患者へのリガンド阻止抗FcγR III抗
体の注入が血小板数の一時的増加をもたらしたと報じて
いる。この観察は、ITPの大方の有害症状が、IgG被覆血
小板上の結合部位を遮断するか又はその結合部位につい
てFcγR IIIと競合する作用物質の投与により、一時的
に改善されうることを示唆している。
臨床免疫学の別の分野において、免疫グロブリンと抗
原から成る集合体（いわゆる“免疫複合体”）の血清レ
ベルの上昇は多種多様の疾患、特に全身性エリテマトー
デス（SLE）や慢性関節リウマチのような自己免疫病と
関係している。このような複合体の血清レブルは自己免
疫疾患の存在について診断する上で非常に役立ってい
る：例えば、Theofilopoulos et al.,Am.J.Pathol.,Co
l.100,p.531−591（1980）。
原から成る集合体（いわゆる“免疫複合体”）の血清レ
ベルの上昇は多種多様の疾患、特に全身性エリテマトー
デス（SLE）や慢性関節リウマチのような自己免疫病と
関係している。このような複合体の血清レブルは自己免
疫疾患の存在について診断する上で非常に役立ってい
る：例えば、Theofilopoulos et al.,Am.J.Pathol.,Co
l.100,p.531−591（1980）。
現在、免疫複合体の血清レベルの検定法には、ある種
の補体またはリマウトイド因子蛋白に対する複合体の親
和性を利用する固相検定と、免疫複合体を優先的に結合
するRaji細胞の性質を利用する細胞検定が含まれる:Ros
e et al.,eds.Manual of Clinical Immunology,3rd Ed.
（American Society for Microbiology,Washington,D.
C.,1986）中のTheofilopoulos et al.,chapter28および
Toth et al.,chapter29。あいにく、哺乳類細胞を土台
とした多くの検定法と同様に、Raji細胞検定法は実施す
るのが難しく、免疫複合体へのRaji細胞結合がもともと
可変的であるために精密なコントロールと基準を必要と
する。
の補体またはリマウトイド因子蛋白に対する複合体の親
和性を利用する固相検定と、免疫複合体を優先的に結合
するRaji細胞の性質を利用する細胞検定が含まれる:Ros
e et al.,eds.Manual of Clinical Immunology,3rd Ed.
（American Society for Microbiology,Washington,D.
C.,1986）中のTheofilopoulos et al.,chapter28および
Toth et al.,chapter29。あいにく、哺乳類細胞を土台
とした多くの検定法と同様に、Raji細胞検定法は実施す
るのが難しく、免疫複合体へのRaji細胞結合がもともと
可変的であるために精密なコントロールと基準を必要と
する。
前述のことを考慮すると、医学社会にとっては、十分
に特性決定がなされて、広く入手可能で、容易に培養し
うる細胞系列を利用した別の免疫複合体検定法を提供す
ることが有益であるだろう。さらに、もしも可溶性Fcγ
Ｒが難治性ITPの実際的な緊急治療を可能にするに足る
量で生産されるならば、それもまた有益であるだろう。
に特性決定がなされて、広く入手可能で、容易に培養し
うる細胞系列を利用した別の免疫複合体検定法を提供す
ることが有益であるだろう。さらに、もしも可溶性Fcγ
Ｒが難治性ITPの実際的な緊急治療を可能にするに足る
量で生産されるならば、それもまた有益であるだろう。
発明の要約 本発明は、可溶性および膜結合ヒトFcγR IIIポリペ
プチド、それらの変異蛋白、それをコードしうる核酸、
並びに前記ポリペプチドおよび変異蛋白の診断・治療用
途に関する。
プチド、それらの変異蛋白、それをコードしうる核酸、
並びに前記ポリペプチドおよび変異蛋白の診断・治療用
途に関する。
本発明はヒトFcγR IIIをコードするcDNAの発見に基
づいている。FcγR IIIコード化挿入物（第１図に示
す）を含むcDNAクローン、pcD（SRa）は米国メリーラン
ド州ロックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ATCC）に受託番号67707として大腸菌K12株
MC1061により寄託された。
づいている。FcγR IIIコード化挿入物（第１図に示
す）を含むcDNAクローン、pcD（SRa）は米国メリーラン
ド州ロックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ATCC）に受託番号67707として大腸菌K12株
MC1061により寄託された。
従って、本発明は、可溶性または膜結合ヒトFcγR II
Iから成る次のアミノ酸配列： または を有する蛋白、並びに１個のアミノ酸残基が欠失され
て、そしてCys、Phe、TrpおよびTyr以外の０〜２個のア
ミノ酸残基が以下の置換表に従って置換されている変異
蛋白を提供する：アミノ酸 置換可能なアミノ酸 Ala Ser、ThrまたはGlr Arg Lysr Asn AspまたはSer Asp GluまたはAsn Gln Glu Glu AspまたはGlu Gly AlaまたはSer His Asn Ile ValまたはLeu Leu ValまたはIle Lys ArgまたはAsn Met Leu Pro Ala Ser Ala、Thr、GlyまたはAsn Thr Ser、AlaまたはLys Val Ile、AlaまたはLeu 変異蛋白に関して、この置換表は置換されるアミノ酸
と同義である追加のＬ−アミノ酸群を表す。ある群に含
まれる同義アミノ酸は、その群の構成員間の置換がその
分子の生物学的機能を保持するように、十分に類似した
物理化学的性質を有する:Grantham,Science,Vol.185,p.
862−864（1974）およびDayhoff et al.,Atlas of Prot
ein Sequence and Structure1972,Vol.5,p.89−99。
Iから成る次のアミノ酸配列： または を有する蛋白、並びに１個のアミノ酸残基が欠失され
て、そしてCys、Phe、TrpおよびTyr以外の０〜２個のア
ミノ酸残基が以下の置換表に従って置換されている変異
蛋白を提供する：アミノ酸 置換可能なアミノ酸 Ala Ser、ThrまたはGlr Arg Lysr Asn AspまたはSer Asp GluまたはAsn Gln Glu Glu AspまたはGlu Gly AlaまたはSer His Asn Ile ValまたはLeu Leu ValまたはIle Lys ArgまたはAsn Met Leu Pro Ala Ser Ala、Thr、GlyまたはAsn Thr Ser、AlaまたはLys Val Ile、AlaまたはLeu 変異蛋白に関して、この置換表は置換されるアミノ酸
と同義である追加のＬ−アミノ酸群を表す。ある群に含
まれる同義アミノ酸は、その群の構成員間の置換がその
分子の生物学的機能を保持するように、十分に類似した
物理化学的性質を有する:Grantham,Science,Vol.185,p.
862−864（1974）およびDayhoff et al.,Atlas of Prot
ein Sequence and Structure1972,Vol.5,p.89−99。
さらに、先に示した配列において、アミノ酸の欠失
は、とりわけアミノ酸が１個だけ欠失されて、しかも機
能的コンホメーションにとって重要なアミノ酸（例え
ば、いくつかのシステイン残基）が除去または置換され
ないならば、生物学的機能を変えることなく可能である
ことが明らかである:Anfisen,“蛋白鎖の折りたたみを
支配する原理",Science,Vol.181,p.223−230（1973）。
欠失により得られた蛋白および変異蛋白は本発明の範囲
内である。本明細書中で式ＩまたはIIの蛋白のアミノ酸
残基が番号で表される場合、その番号は蛋白のＮ末端と
関連している。
は、とりわけアミノ酸が１個だけ欠失されて、しかも機
能的コンホメーションにとって重要なアミノ酸（例え
ば、いくつかのシステイン残基）が除去または置換され
ないならば、生物学的機能を変えることなく可能である
ことが明らかである:Anfisen,“蛋白鎖の折りたたみを
支配する原理",Science,Vol.181,p.223−230（1973）。
欠失により得られた蛋白および変異蛋白は本発明の範囲
内である。本明細書中で式ＩまたはIIの蛋白のアミノ酸
残基が番号で表される場合、その番号は蛋白のＮ末端と
関連している。
特に、Arg、Gln、His、MetおよびPro以外のアミノ酸
１〜２個（とりわけ１個）が以下の置換表に従って置換
される：アミノ酸 置換可能なアミノ酸 Ala Ser Asn Asp Asp Glu Gln Asp Gly Ala Ile Val Leu Val Lys Arg Ser AlaまたはThr Thr SerまたはAla Val Ile 式ＩまたはIIに関連して本発明明細書中で用いる“Ｎ
重置換”とは、ゼロ−Ｎ個の置換によって、その天然ア
ミノ酸配列と異なるアミノ酸配列の群を表し、その際置
換用アミノ酸はその置換位置のアミノ酸と同義であるア
ミノ酸群から選ばれる。すなわち、アミノ酸残基Alaが
置換位置にあるとすると、そのAlaはSer、ThrまたはGly
で置換することができる。
１〜２個（とりわけ１個）が以下の置換表に従って置換
される：アミノ酸 置換可能なアミノ酸 Ala Ser Asn Asp Asp Glu Gln Asp Gly Ala Ile Val Leu Val Lys Arg Ser AlaまたはThr Thr SerまたはAla Val Ile 式ＩまたはIIに関連して本発明明細書中で用いる“Ｎ
重置換”とは、ゼロ−Ｎ個の置換によって、その天然ア
ミノ酸配列と異なるアミノ酸配列の群を表し、その際置
換用アミノ酸はその置換位置のアミノ酸と同義であるア
ミノ酸群から選ばれる。すなわち、アミノ酸残基Alaが
置換位置にあるとすると、そのAlaはSer、ThrまたはGly
で置換することができる。
同様に、式ＩまたはIIに関連して本明細書中で用いる
“Ｎ重欠失”なる用語は、アミノ酸のゼロ−Ｎ個の欠失
によって、その天然アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列
の群を表す。
“Ｎ重欠失”なる用語は、アミノ酸のゼロ−Ｎ個の欠失
によって、その天然アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列
の群を表す。
全体を通して、アミノ酸、ヌクレオチド、制限エンド
ヌクレアーゼなどを明示するために標準略号が採用され
る：例えば、Cohn,“ａ−アミノ酸の命名法および略号
表示",Methods in Enzymology,vol.106,p.3−17（198
4）;Wood et al.,Biochemistry:A Problems Approach,2
nd ed.（Benjamin,Menlo Park,1981）；およびRoberts,
“制限エンドヌクレアーゼ名簿",Methods in Enzymolog
y,Vol.68,p.27−40（1979）。
ヌクレアーゼなどを明示するために標準略号が採用され
る：例えば、Cohn,“ａ−アミノ酸の命名法および略号
表示",Methods in Enzymology,vol.106,p.3−17（198
4）;Wood et al.,Biochemistry:A Problems Approach,2
nd ed.（Benjamin,Menlo Park,1981）；およびRoberts,
“制限エンドヌクレアーゼ名簿",Methods in Enzymolog
y,Vol.68,p.27−40（1979）。
本発明の特に好適な特徴は、蛋白の部分がヒトFcγR
IIIの細胞外ドメインから成るということである。
IIIの細胞外ドメインから成るということである。
図面の簡単な説明 第１図パートＡおよびＢ（２枚のシートを並べて解読
するようになっている）は、pcD（SRa）−GP5のcDNA挿
入物のヌクレオチド配列を示す； 第２図は、FcγR III変異体として分泌される、可溶
性ヒトFcγR IIIを生産するために挿入された停止コド
ンの相対位置を示す； 第３図パートＡおよびＢ（２枚のシートを並べて解読
するようになっている）は、pcD（SRa）−NL10のcDNA挿
入物のヌクレオチド配列を示す。
するようになっている）は、pcD（SRa）−GP5のcDNA挿
入物のヌクレオチド配列を示す； 第２図は、FcγR III変異体として分泌される、可溶
性ヒトFcγR IIIを生産するために挿入された停止コド
ンの相対位置を示す； 第３図パートＡおよびＢ（２枚のシートを並べて解読
するようになっている）は、pcD（SRa）−NL10のcDNA挿
入物のヌクレオチド配列を示す。
発明の詳細な説明 本発明は、ヒトIgGのFc部分に結合しうるポリペプチ
ドをコードする核酸を含む。これらのポリペプチドはヒ
トFcγR IIIから誘導される。本発明は、ヒトFcγR III
の可溶性および膜結合ポリペプチドを含む。これらのポ
リペプチドおよび他の修飾型は標準蛋白工学技法を使っ
て容易に製造される。
ドをコードする核酸を含む。これらのポリペプチドはヒ
トFcγR IIIから誘導される。本発明は、ヒトFcγR III
の可溶性および膜結合ポリペプチドを含む。これらのポ
リペプチドおよび他の修飾型は標準蛋白工学技法を使っ
て容易に製造される。
ひとたび天然蛋白の核酸配列および／またはアミノ酸
配列が得られると、その天然配列に突然変異を実際上生
じさせるためにいろいろな技法が利用可能となる。Scie
nce,Vol.229,p.1193−1201（1985）中でShortleは、本
発明に適用できる核酸の突然変異誘発法を説明してい
る。好ましくは、本発明の蛋白変異体は、オリゴヌクレ
オチドによって誘導される特定部位の突然変異誘発［例
えば、Zoller and Smith,Methods in Enzymology,vol.1
00,p.468−500（1983）および“ヒト組換えインターロ
イキン−２変異蛋白”と題するMarkらの米国特第451858
4号；これらの文献は参照によりここに引用するものと
する］、またいわゆる“カセット”突然変異誘発［Well
s et al.,Gene,Vol.34,p315−323（1985）およびEstell
et al.,Science,Vol.233,p.659−663（1986）に記載さ
れ、さらに本質的にはMullenbach etal.,J.Biol.Chem.,
Vol.261,p.719−722（1985）およびFeretti et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.,Vol.83,p.597−603（1986）に記載さ
れる］によりつくられる。なお、特許請求の範囲におい
て、「１またはそれ以上のアミノ酸が置換または欠失さ
れているアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、出
願前周知技術である部位特定変更誘発法、カセット突然
変異誘発法等により修飾できる程度の数のアミノ酸が置
換または欠失されているものであって、かつ元のポリペ
プチドの生物学的活性が保たれる範囲で置換または欠失
されているものを意味する。
配列が得られると、その天然配列に突然変異を実際上生
じさせるためにいろいろな技法が利用可能となる。Scie
nce,Vol.229,p.1193−1201（1985）中でShortleは、本
発明に適用できる核酸の突然変異誘発法を説明してい
る。好ましくは、本発明の蛋白変異体は、オリゴヌクレ
オチドによって誘導される特定部位の突然変異誘発［例
えば、Zoller and Smith,Methods in Enzymology,vol.1
00,p.468−500（1983）および“ヒト組換えインターロ
イキン−２変異蛋白”と題するMarkらの米国特第451858
4号；これらの文献は参照によりここに引用するものと
する］、またいわゆる“カセット”突然変異誘発［Well
s et al.,Gene,Vol.34,p315−323（1985）およびEstell
et al.,Science,Vol.233,p.659−663（1986）に記載さ
れ、さらに本質的にはMullenbach etal.,J.Biol.Chem.,
Vol.261,p.719−722（1985）およびFeretti et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.,Vol.83,p.597−603（1986）に記載さ
れる］によりつくられる。なお、特許請求の範囲におい
て、「１またはそれ以上のアミノ酸が置換または欠失さ
れているアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、出
願前周知技術である部位特定変更誘発法、カセット突然
変異誘発法等により修飾できる程度の数のアミノ酸が置
換または欠失されているものであって、かつ元のポリペ
プチドの生物学的活性が保たれる範囲で置換または欠失
されているものを意味する。
アミノ酸修飾をもつポリペプチド（すなわち、変異蛋
白）はいろいろな状況において望ましいだろう。例え
ば、好ましくない副作用はある種の変異蛋白によって軽
減されるかもしれず、特にその副作用が目的の活性部分
と異なるポリペプチド部分に関係している場合はそうで
ある。いくつかの発現系では、天然ポリペプチドはプロ
テアーゼによる分解を受けやすい。このような場合に、
その感受性配列を変更する所定のアミノ酸の置換および
／または欠失は収量を相当に高めることができる：例え
ば、英国特許出願第2173−804−Ａ号（ここでは、ヒト
組織プラスミノーゲン活性化因子の275位のArgがGlyま
たはGluで置換される）。また、変異蛋白は精製法にお
いてその収量を高め、かつ／また酸化、アシル化、アル
キル化、または他の化学修飾を受けやすいアミノ酸を排
除することによって蛋白の貯蔵寿命をのばすことができ
る。例えば、メチオニンは容易に酸化されてスルホキシ
ドを形成するが、これは多くの蛋白では生物学的活性の
減少につながる：例えば、Brot and Weissbach,Arch.Bi
ophys.,Vol.223,p.271（1983）。メチオニンはしばしば
生物学的特性をほとんど又は全く減少させない、より不
活性のアミノ酸で置換される：例えば、オーストラリア
特許出願第AU−Ａ−52451/86号。細菌の発現系では、コ
ンホメーション的に必ずしも必要でないシステイン残基
を排除または置換することによって、収量増加が時には
期待できる：例えば、Markらの米国特許第4518584号。
白）はいろいろな状況において望ましいだろう。例え
ば、好ましくない副作用はある種の変異蛋白によって軽
減されるかもしれず、特にその副作用が目的の活性部分
と異なるポリペプチド部分に関係している場合はそうで
ある。いくつかの発現系では、天然ポリペプチドはプロ
テアーゼによる分解を受けやすい。このような場合に、
その感受性配列を変更する所定のアミノ酸の置換および
／または欠失は収量を相当に高めることができる：例え
ば、英国特許出願第2173−804−Ａ号（ここでは、ヒト
組織プラスミノーゲン活性化因子の275位のArgがGlyま
たはGluで置換される）。また、変異蛋白は精製法にお
いてその収量を高め、かつ／また酸化、アシル化、アル
キル化、または他の化学修飾を受けやすいアミノ酸を排
除することによって蛋白の貯蔵寿命をのばすことができ
る。例えば、メチオニンは容易に酸化されてスルホキシ
ドを形成するが、これは多くの蛋白では生物学的活性の
減少につながる：例えば、Brot and Weissbach,Arch.Bi
ophys.,Vol.223,p.271（1983）。メチオニンはしばしば
生物学的特性をほとんど又は全く減少させない、より不
活性のアミノ酸で置換される：例えば、オーストラリア
特許出願第AU−Ａ−52451/86号。細菌の発現系では、コ
ンホメーション的に必ずしも必要でないシステイン残基
を排除または置換することによって、収量増加が時には
期待できる：例えば、Markらの米国特許第4518584号。
好ましくは、本発明の可溶性形態のFcγR IIIは、Fc
γR IIIcDNAのトランスメンブラン部分と細胞部分のコ
ード領域に先立って（すなわち、そのコード領域の５′
方向または“上流”方向に）停止コドンを導入すること
によって得られる。これは特定部位の突然変異誘発を使
って有利に行われる。トランスメンブラン領域は高い平
均疎水度をもつ約20〜25個の残基を含むアミノ酸セグメ
ントの存在によって簡単に同定することができる：例え
ば、Wickner,Science,Vol.210,p.861−868（1980）およ
びGreene et al.,Ann.Rev.Immunol.,Vol.4,p.69−95（1
986）。
γR IIIcDNAのトランスメンブラン部分と細胞部分のコ
ード領域に先立って（すなわち、そのコード領域の５′
方向または“上流”方向に）停止コドンを導入すること
によって得られる。これは特定部位の突然変異誘発を使
って有利に行われる。トランスメンブラン領域は高い平
均疎水度をもつ約20〜25個の残基を含むアミノ酸セグメ
ントの存在によって簡単に同定することができる：例え
ば、Wickner,Science,Vol.210,p.861−868（1980）およ
びGreene et al.,Ann.Rev.Immunol.,Vol.4,p.69−95（1
986）。
プラスミドpcD（SRa）−GP5は、Okayama and Berg,Mo
l.Cell.Biol.,Vol.2,p.161−170（1983）およびVol.3,
p.280−289（1983）に記載されるpcDシャトルベクター
と類似しているが、発現を高めるために、Takebe et a
l.,Mol.Cell.Biol.,Vo8,p.466−472（1988）に記載され
るHTLV（Ｉ）レトロウイルス由来のロング・ターミナル
・リピート（LTR）の部分の下流挿入によって、SV40プ
ロモーターが修飾されている。好都合なことに、このプ
ラスミドは大腸菌K12株MC1061または同様の宿主内で増
殖できる。
l.Cell.Biol.,Vol.2,p.161−170（1983）およびVol.3,
p.280−289（1983）に記載されるpcDシャトルベクター
と類似しているが、発現を高めるために、Takebe et a
l.,Mol.Cell.Biol.,Vo8,p.466−472（1988）に記載され
るHTLV（Ｉ）レトロウイルス由来のロング・ターミナル
・リピート（LTR）の部分の下流挿入によって、SV40プ
ロモーターが修飾されている。好都合なことに、このプ
ラスミドは大腸菌K12株MC1061または同様の宿主内で増
殖できる。
本発明のFcγR IIIの免疫グロブリンＧ結合特性は標
準技術によって測定される；例えば、（１）膜結合Fcγ
R IIIの場合には:IgG被覆赤血球（RBC）の存在下でロゼ
ットを形成するか、または熱処理により集合されたヒト
IgGを優先的に結合する、FcγR III cDNAでトランスフ
ェクトされた細胞の能力；または（２）可溶性FcγR II
Iの場合には：ヒトIgGを含む免疫吸着カラムにより溶液
からFcγR IIIを優先的に分離する能力、またはIgG被覆
RBCとFcγR IIIをもつことが知られている細胞とのロゼ
ット形成を阻止する能力。前者の測定は蛍光標識を付け
たヒトIgG分子を用いて行うことができる：例えば、Hau
gland,Handbook of Fluorescent Probes（Molecular Pr
obes ,Inc.,Junction City,OR,1985）。後者の測定は分
離したヒトIgGと、例えばBio−Rad研究所（Richmond,C
A）から市販されている活性化セファロースカラムと、
からIgGカラムを作製することにより実施できる。
準技術によって測定される；例えば、（１）膜結合Fcγ
R IIIの場合には:IgG被覆赤血球（RBC）の存在下でロゼ
ットを形成するか、または熱処理により集合されたヒト
IgGを優先的に結合する、FcγR III cDNAでトランスフ
ェクトされた細胞の能力；または（２）可溶性FcγR II
Iの場合には：ヒトIgGを含む免疫吸着カラムにより溶液
からFcγR IIIを優先的に分離する能力、またはIgG被覆
RBCとFcγR IIIをもつことが知られている細胞とのロゼ
ット形成を阻止する能力。前者の測定は蛍光標識を付け
たヒトIgG分子を用いて行うことができる：例えば、Hau
gland,Handbook of Fluorescent Probes（Molecular Pr
obes ,Inc.,Junction City,OR,1985）。後者の測定は分
離したヒトIgGと、例えばBio−Rad研究所（Richmond,C
A）から市販されている活性化セファロースカラムと、
からIgGカラムを作製することにより実施できる。
ロゼット検定は当分野で標準的である：例えば、Rose
et al.,eds.,Manual of Clinical Laboratory Immunol
ogy,3rd Ed.（American Society for Microbiology,Was
hington,D.C.,1986）中のWinchester et al.,chapter 3
1。
et al.,eds.,Manual of Clinical Laboratory Immunol
ogy,3rd Ed.（American Society for Microbiology,Was
hington,D.C.,1986）中のWinchester et al.,chapter 3
1。
ひとたび本発明のcDNAがクローン化されると、広い範
囲の発現系（すなわち、宿主と発現ベクターの組み合わ
せ）を使って本発明蛋白を生産することができる。使用
可能な宿主細胞の種類には細菌、酵母、昆虫、哺乳類な
どが含まれるが、これらに限定されない。発現系を選択
して、それによる蛋白生産を最適化するには、以下に挙
げる多くの要因を考察して釣合いを取ることが必要であ
る：すなわち（１）発現しようとする蛋白の性質、例え
ばその蛋白は一部の宿主生物に有毒であったり、宿主プ
ロテアーゼによる分解を受けやすかったり、あるいは不
活性なコンホメーションでまたは宿主内において不溶性
の形態で発現されたりする；（２）対象の蛋白に対応す
るメッセンジャーRNA（mRNA）の性質、例えばそのmRNA
はmRNAの機能的寿命を急激に短くする宿主エンドヌクレ
アーゼに特に感じやすい配列をもっていたり、あるいは
出発コドンやリボソーム結合部位を遮蔽して宿主内での
翻訳開始を阻止する二次構造を形成したりする；（３）
コード領域に隣接する３′−および５′−領域における
宿主適合世の発現調節配列の選択、利用可能性、並びに
配置−これらにはプロモーター、５′−および３′−プ
ロテクター配列、リボソーム結合部位、転写ターミネー
ター、エンハンサー、ポリアデニレート付加部位、キャ
ップ部位、イントロン−スプライス部位などが含まれ
る；（４）蛋白が宿主によりプロセッシングされうる分
泌ジグナル配列をもつかどうか、または宿主に内在する
シグナル配列をコードする発現調節配列が成熟蛋白をコ
ードする領域へ移行すべくスプライシングされねばなら
ないかどうか；（５）宿主のトランスフェクションまた
はトランスフォーメーションの利用可能な方式および効
率、並びに一時的な発現が望まれるのかあるいは安定し
た発現が望まれるのか；（６）蛋白発現用の希望する宿
主培養系の規模およびコスト；（７）翻訳後修飾が望ま
れるか、またはどのような種類の翻訳後修飾が望まれる
か、例えば希望するグルコシル化の程度および種類は宿
主の選択に影響する；（８）発現された蛋白を宿主細胞
および／または培地の蛋白や他の物質から容易に分離で
きるか、例えばいくつかの場合には後続の精製工程を助
けるために特殊なシグナル配列をもつ融合蛋白を発現さ
せることが望ましい、例えばSassenfeld et al.,Biotec
hnology,January 1984;（９）所定の宿主内の特定ベク
ターの安定性およびコピー数、例えばHofschneider et
al.,eds.Gene Cloning in Organisms Other than E.col
i（Springer Verlag,Berlin,1982）；および（10）当分
野で習熟した者に知られた同様な要因。
囲の発現系（すなわち、宿主と発現ベクターの組み合わ
せ）を使って本発明蛋白を生産することができる。使用
可能な宿主細胞の種類には細菌、酵母、昆虫、哺乳類な
どが含まれるが、これらに限定されない。発現系を選択
して、それによる蛋白生産を最適化するには、以下に挙
げる多くの要因を考察して釣合いを取ることが必要であ
る：すなわち（１）発現しようとする蛋白の性質、例え
ばその蛋白は一部の宿主生物に有毒であったり、宿主プ
ロテアーゼによる分解を受けやすかったり、あるいは不
活性なコンホメーションでまたは宿主内において不溶性
の形態で発現されたりする；（２）対象の蛋白に対応す
るメッセンジャーRNA（mRNA）の性質、例えばそのmRNA
はmRNAの機能的寿命を急激に短くする宿主エンドヌクレ
アーゼに特に感じやすい配列をもっていたり、あるいは
出発コドンやリボソーム結合部位を遮蔽して宿主内での
翻訳開始を阻止する二次構造を形成したりする；（３）
コード領域に隣接する３′−および５′−領域における
宿主適合世の発現調節配列の選択、利用可能性、並びに
配置−これらにはプロモーター、５′−および３′−プ
ロテクター配列、リボソーム結合部位、転写ターミネー
ター、エンハンサー、ポリアデニレート付加部位、キャ
ップ部位、イントロン−スプライス部位などが含まれ
る；（４）蛋白が宿主によりプロセッシングされうる分
泌ジグナル配列をもつかどうか、または宿主に内在する
シグナル配列をコードする発現調節配列が成熟蛋白をコ
ードする領域へ移行すべくスプライシングされねばなら
ないかどうか；（５）宿主のトランスフェクションまた
はトランスフォーメーションの利用可能な方式および効
率、並びに一時的な発現が望まれるのかあるいは安定し
た発現が望まれるのか；（６）蛋白発現用の希望する宿
主培養系の規模およびコスト；（７）翻訳後修飾が望ま
れるか、またはどのような種類の翻訳後修飾が望まれる
か、例えば希望するグルコシル化の程度および種類は宿
主の選択に影響する；（８）発現された蛋白を宿主細胞
および／または培地の蛋白や他の物質から容易に分離で
きるか、例えばいくつかの場合には後続の精製工程を助
けるために特殊なシグナル配列をもつ融合蛋白を発現さ
せることが望ましい、例えばSassenfeld et al.,Biotec
hnology,January 1984;（９）所定の宿主内の特定ベク
ターの安定性およびコピー数、例えばHofschneider et
al.,eds.Gene Cloning in Organisms Other than E.col
i（Springer Verlag,Berlin,1982）；および（10）当分
野で習熟した者に知られた同様な要因。
上記の諸要因を考慮して特定の発現系の選択および／
または修飾を行うための指針を提供する文献が多数利用
できる：例えば、de Boer and Shepard,“大腸菌による
外来遺伝子発現を最適化するための戦略",p.205−247,K
roon,ed.Genes:Structure and Expression（John Wiley
＆Sons,New York,1983）は、数種の大腸菌発現系につい
て説明している;Kucherlapati et al.,Chitical Review
s in Biochemistry,Vol.16,Issue 4,p.349−379（198
4）およびBanerji et al.,Genetic Engineering,Vol.5,
p.19−31（1983）は、哺乳類細胞にトランスフェクショ
ンおよびトランスフォーメーションを起こす方法につい
て述べている;Reznikoff and Gold,eds.,Maximizing Ge
ne Expression（Butterworths,Boston,1986）は、大腸
菌、酵母、および哺乳類細胞による遺伝子発現の所定の
論題についで述べている；そしてThilly,Mammalian Cel
l Technology（Butterworths,Boston,1986）は哺乳類発
現系について説明している。
または修飾を行うための指針を提供する文献が多数利用
できる：例えば、de Boer and Shepard,“大腸菌による
外来遺伝子発現を最適化するための戦略",p.205−247,K
roon,ed.Genes:Structure and Expression（John Wiley
＆Sons,New York,1983）は、数種の大腸菌発現系につい
て説明している;Kucherlapati et al.,Chitical Review
s in Biochemistry,Vol.16,Issue 4,p.349−379（198
4）およびBanerji et al.,Genetic Engineering,Vol.5,
p.19−31（1983）は、哺乳類細胞にトランスフェクショ
ンおよびトランスフォーメーションを起こす方法につい
て述べている;Reznikoff and Gold,eds.,Maximizing Ge
ne Expression（Butterworths,Boston,1986）は、大腸
菌、酵母、および哺乳類細胞による遺伝子発現の所定の
論題についで述べている；そしてThilly,Mammalian Cel
l Technology（Butterworths,Boston,1986）は哺乳類発
現系について説明している。
同様に、特定cDNAと発現調節配列を連結および／また
は操作した、本発明で使用するのに適した発現ベクター
を作製および／または修飾するための技術および条件に
ついて記載している多くの文献が利用可能である：例え
ば、Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual（Cold Spring Harbor 研究所,N.Y.,1982）;Glo
ver,DNA Cloning:A Practical Approach,Vol.I and II
（IRL Press,Oxford,1985）；およびPerbal,A Practica
l Guide to Molecular Cloning（John Wiley＆Sons,N.
Y.,1984）。
は操作した、本発明で使用するのに適した発現ベクター
を作製および／または修飾するための技術および条件に
ついて記載している多くの文献が利用可能である：例え
ば、Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual（Cold Spring Harbor 研究所,N.Y.,1982）;Glo
ver,DNA Cloning:A Practical Approach,Vol.I and II
（IRL Press,Oxford,1985）；およびPerbal,A Practica
l Guide to Molecular Cloning（John Wiley＆Sons,N.
Y.,1984）。
本発明で使用するのに適した発現系には、Itakura an
d Riggsの米国特許第4704362号（細菌発現）、Clarkら
の米国特許題4675285号およひHamerの米国特許第459930
8号（哺乳類発現）、並びにKurjanらの米国特許第45460
82号（酵母発現）に記載されるものが含まれる。従っ
て、上記特許は参照によりここに引用するものとする。
d Riggsの米国特許第4704362号（細菌発現）、Clarkら
の米国特許題4675285号およひHamerの米国特許第459930
8号（哺乳類発現）、並びにKurjanらの米国特許第45460
82号（酵母発現）に記載されるものが含まれる。従っ
て、上記特許は参照によりここに引用するものとする。
SV40を土台としたベクター（例えば、pcDベクター）
を使用するとき、好適な宿主はCOS7細胞系列である。こ
れはGluzman,Cell,Vol.23,p.175−182（1981）に記載さ
れており、ATCCから寄託番号CRL1651として入手でき
る。
を使用するとき、好適な宿主はCOS7細胞系列である。こ
れはGluzman,Cell,Vol.23,p.175−182（1981）に記載さ
れており、ATCCから寄託番号CRL1651として入手でき
る。
本発明の可溶性FcγR IIIはITP治療用の薬剤組成物と
して投与される。この種の組成物は薬学的担体中に有効
量のFcγR IIIを含有する。薬学的担体は本発明組成物
を患者に与えるのに都合のよい、適合性の、無毒性物質
でありうる。一般に、前記薬物の非経口投与に適した組
成物はよく知られている：例えば、Remington′s Pharm
aceutical Science,15th Ed.（Mack Publishing Compan
y,Easton,PA 1980）。また、本発明組成物は植え込み可
能な薬剤デリバリーシステムを使って患者の体内に導入
することもできる：例えば、Urquhart et al.,Ann.Rev.
Pharmacol.Toxicol.,Vol.24,p.199−236（1984）。
して投与される。この種の組成物は薬学的担体中に有効
量のFcγR IIIを含有する。薬学的担体は本発明組成物
を患者に与えるのに都合のよい、適合性の、無毒性物質
でありうる。一般に、前記薬物の非経口投与に適した組
成物はよく知られている：例えば、Remington′s Pharm
aceutical Science,15th Ed.（Mack Publishing Compan
y,Easton,PA 1980）。また、本発明組成物は植え込み可
能な薬剤デリバリーシステムを使って患者の体内に導入
することもできる：例えば、Urquhart et al.,Ann.Rev.
Pharmacol.Toxicol.,Vol.24,p.199−236（1984）。
非経口的に投与される場合、可溶性FcγR IIIは薬学
的担体と共に注入可能な単位用量形態（溶液、懸濁液、
エマルジョン）に薬剤化されるであろう。このような担
体は本来無毒性であって、非治療的である。担体の例は
生理食塩水、リンガー液、デキストロース液、およびハ
ンクス液である。不揮発性油やオレイン酸エチルのよう
な非水性担体も使用できる。好適な担体は５％デキスト
ロース／食塩水である。担体は少量の添加剤、例えば等
張性および化学的安定性を高める物質（例．緩衝剤、防
腐剤）を含んでいてもよい。可溶性FcγR IIIは好まし
くは集合体や他の蛋白を実質的に含まない精製形態で、
約５〜30mg/mlの濃度範囲、好ましくは約10〜20mg/mlの
濃度範囲に製剤化される。
的担体と共に注入可能な単位用量形態（溶液、懸濁液、
エマルジョン）に薬剤化されるであろう。このような担
体は本来無毒性であって、非治療的である。担体の例は
生理食塩水、リンガー液、デキストロース液、およびハ
ンクス液である。不揮発性油やオレイン酸エチルのよう
な非水性担体も使用できる。好適な担体は５％デキスト
ロース／食塩水である。担体は少量の添加剤、例えば等
張性および化学的安定性を高める物質（例．緩衝剤、防
腐剤）を含んでいてもよい。可溶性FcγR IIIは好まし
くは集合体や他の蛋白を実質的に含まない精製形態で、
約５〜30mg/mlの濃度範囲、好ましくは約10〜20mg/mlの
濃度範囲に製剤化される。
ITPと関連した血小板減少症を改善するのに有効な量
の可溶性FcγR IIIを患者に与える投薬方式を選択する
ことは、可溶性FcγR IIIの血清回転率、免疫障害と関
連した内因性の競合FcγR IIIの血清レベル、可溶性Fc
γR IIIの免疫原性などを含めて、いくつかの要因に左
右される。好ましくは、投薬方式は患者に与える可溶性
FcγR IIIの量を、許容できるレベルの副作用と調和さ
せて、最大限にするようにする。従って、患者に与える
可溶性FcγR IIIの量は、使用する個々の可溶性FcγR I
IIおよび治療すべき病気の重症度に幾分か左右される。
適切な用量を選択する指針は、可溶性FcγR IIIとほぼ
同じ大きさのポリペプチドである抗体および抗体断片の
治療用途に関する文献に見いだせる：例えば、Ferrone
et al.,eds.,Handbook of Monoclonal Antibodies（Nog
es Publications Park Ridge,NJ,1985）中のBach et a
l.,chapter 22;およびHaber et al.,eds.,Antibodies i
n Human Diagnosis and Therapy（Raven Press,New Yor
k,1977）中のRussell,p.303−357およびSmith et al.,
p.365−389。好ましくは、用量は約１〜20mg/kg/日、よ
り好ましくは約１〜10mg/kg/日の範囲である。
の可溶性FcγR IIIを患者に与える投薬方式を選択する
ことは、可溶性FcγR IIIの血清回転率、免疫障害と関
連した内因性の競合FcγR IIIの血清レベル、可溶性Fc
γR IIIの免疫原性などを含めて、いくつかの要因に左
右される。好ましくは、投薬方式は患者に与える可溶性
FcγR IIIの量を、許容できるレベルの副作用と調和さ
せて、最大限にするようにする。従って、患者に与える
可溶性FcγR IIIの量は、使用する個々の可溶性FcγR I
IIおよび治療すべき病気の重症度に幾分か左右される。
適切な用量を選択する指針は、可溶性FcγR IIIとほぼ
同じ大きさのポリペプチドである抗体および抗体断片の
治療用途に関する文献に見いだせる：例えば、Ferrone
et al.,eds.,Handbook of Monoclonal Antibodies（Nog
es Publications Park Ridge,NJ,1985）中のBach et a
l.,chapter 22;およびHaber et al.,eds.,Antibodies i
n Human Diagnosis and Therapy（Raven Press,New Yor
k,1977）中のRussell,p.303−357およびSmith et al.,
p.365−389。好ましくは、用量は約１〜20mg/kg/日、よ
り好ましくは約１〜10mg/kg/日の範囲である。
実施例 以下の実施例は本発明の例示に役立つ。ベクターおよ
び宿主の選択、並びに試薬の濃度、温度、他の変数の値
は、本発明の適用を例示するためのものであり、それを
制限するものとして解釈されるべきでない。
び宿主の選択、並びに試薬の濃度、温度、他の変数の値
は、本発明の適用を例示するためのものであり、それを
制限するものとして解釈されるべきでない。
実施例I.ヒトFcγR IIIを発現する安定した哺乳類形質
転換細胞の構築 好ましくは、安定したFcγR III発現を可能にする哺
乳類細胞系列は、選択マーカーを保有するベクターと宿
主適合性プロモーターおよびFcγR III cDNA挿入物を保
有するベクターとを使って宿主哺乳類細胞を同時にトラ
ンスフェクトすることにより作られる。pcD（SRa）−GP
5の場合、適当な宿主にはチャイニーズハムスター卵巣
細胞、COSサル細胞、およびマウスＬ細胞、例えばアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションから寄託番
号CCL1.3として入手できるチミジンキナーゼ欠損変異株
（tk-）Ｌ細胞が含まれる。選択マーカーは宿主ゲノム
に完全に組み込まれたFcγR III遺伝子を含む確率が高
い宿主細胞を選ぶことを可能にする。一般に、トランス
フェクション溶液中のpcD（SRa）−GP5対マーカー含有
ベクターの比は約10:1である。従って、マーカー遺伝子
が宿主ゲノムに組み込まれるならば、pcD（SRa）−GP5
も一層高い濃度で組み込まれることになるであろう。ま
た、選択マーカーは復帰変異体細胞が異常増殖しないよ
うに目的の形質転換細胞の培養物を守る手段を提供す
る。
転換細胞の構築 好ましくは、安定したFcγR III発現を可能にする哺
乳類細胞系列は、選択マーカーを保有するベクターと宿
主適合性プロモーターおよびFcγR III cDNA挿入物を保
有するベクターとを使って宿主哺乳類細胞を同時にトラ
ンスフェクトすることにより作られる。pcD（SRa）−GP
5の場合、適当な宿主にはチャイニーズハムスター卵巣
細胞、COSサル細胞、およびマウスＬ細胞、例えばアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクションから寄託番
号CCL1.3として入手できるチミジンキナーゼ欠損変異株
（tk-）Ｌ細胞が含まれる。選択マーカーは宿主ゲノム
に完全に組み込まれたFcγR III遺伝子を含む確率が高
い宿主細胞を選ぶことを可能にする。一般に、トランス
フェクション溶液中のpcD（SRa）−GP5対マーカー含有
ベクターの比は約10:1である。従って、マーカー遺伝子
が宿主ゲノムに組み込まれるならば、pcD（SRa）−GP5
も一層高い濃度で組み込まれることになるであろう。ま
た、選択マーカーは復帰変異体細胞が異常増殖しないよ
うに目的の形質転換細胞の培養物を守る手段を提供す
る。
tk-マウスＬ細胞に、pcD（SRa）−GP5とpSV2tk（SV40
初期プロモーターの支配下にあるチミジンキナーゼ遺伝
子を保有するpSV2プラスミド）とを使って同時にトラン
スフェクションを起こさせる。pSV2プラスミドはMullig
an et al.,Science,Vol.209,p.1422−1427（1980）、お
よびSubramani et al.,Mol.Cell.Biol.,Vol.1,p.854−8
64（1981）に記載されており、アメリカ・タイプ・カル
チャー・コレクションから寄託番号37146として入手で
きる。両方のプラスミドは大腸菌、例えばATCCから寄託
番号33694として入手できるHB101株中で増幅させ、塩化
セシウム平衡遠心により精製する。10％ウシ胎児血清を
含むダルベッコ修飾イーグル培地（DME）10ml中の約１
×105のtk-L細胞の浮遊液をファルコン3003培養皿に入
れ、５％炭酸ガス定温器を使って37℃で20時間培養す
る。その後、培地を新しい10％ウシ胎児血清含有DME 10
mlと取り替え、この培養物をさらに４時間インキュベー
トする。インキュベート後、0.5mlの溶液Ａ（50mMヘペ
ス、280mM NaCl、1.5mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2
2）と0.5mlの溶液Ｂ（2M CaCl2、10μg pcD（SRa）−GP
5、１μg pSV2tk）を培地に加え、この培養物を５％CO2
雰囲気中37℃で24時間インキュベートする。その後、細
胞はHATを含む選択培地（例えば、Sigma Chemical Co.,
St.Louis,MO）におく。２週間後、生存しているコロニ
ーを限界希釈によりサブクローニングし、クローンはFc
γR IIIの発現について検定する。
初期プロモーターの支配下にあるチミジンキナーゼ遺伝
子を保有するpSV2プラスミド）とを使って同時にトラン
スフェクションを起こさせる。pSV2プラスミドはMullig
an et al.,Science,Vol.209,p.1422−1427（1980）、お
よびSubramani et al.,Mol.Cell.Biol.,Vol.1,p.854−8
64（1981）に記載されており、アメリカ・タイプ・カル
チャー・コレクションから寄託番号37146として入手で
きる。両方のプラスミドは大腸菌、例えばATCCから寄託
番号33694として入手できるHB101株中で増幅させ、塩化
セシウム平衡遠心により精製する。10％ウシ胎児血清を
含むダルベッコ修飾イーグル培地（DME）10ml中の約１
×105のtk-L細胞の浮遊液をファルコン3003培養皿に入
れ、５％炭酸ガス定温器を使って37℃で20時間培養す
る。その後、培地を新しい10％ウシ胎児血清含有DME 10
mlと取り替え、この培養物をさらに４時間インキュベー
トする。インキュベート後、0.5mlの溶液Ａ（50mMヘペ
ス、280mM NaCl、1.5mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.2
2）と0.5mlの溶液Ｂ（2M CaCl2、10μg pcD（SRa）−GP
5、１μg pSV2tk）を培地に加え、この培養物を５％CO2
雰囲気中37℃で24時間インキュベートする。その後、細
胞はHATを含む選択培地（例えば、Sigma Chemical Co.,
St.Louis,MO）におく。２週間後、生存しているコロニ
ーを限界希釈によりサブクローニングし、クローンはFc
γR IIIの発現について検定する。
実施例II.免疫複合体の血清レベルを測定するための膜
結合FcγR IIIを発現する安定したＬ細胞形質転換体の
使用 本発明のFcγR IIIを発現する安定した哺乳類形質転
換細胞は、免疫複合体の検定においてRaji細胞系列と置
き換えることができる：例えば、Theofilopoulos et a
l.,chapter 28,Manual of Clinical Laboratory Immuno
logy,3rd Ed.（American Society for Microbiology,Wa
shington,D.C.1986）。
結合FcγR IIIを発現する安定したＬ細胞形質転換体の
使用 本発明のFcγR IIIを発現する安定した哺乳類形質転
換細胞は、免疫複合体の検定においてRaji細胞系列と置
き換えることができる：例えば、Theofilopoulos et a
l.,chapter 28,Manual of Clinical Laboratory Immuno
logy,3rd Ed.（American Society for Microbiology,Wa
shington,D.C.1986）。
ヒトIgGに対する抗血清はウサギを使って調製し、硫
酸アンモニウム沈澱とその後のアニオン交換クロマトグ
ラフィーカラム（DEAE−セルロース52;Whatman Chemica
l Separation Ltd.,Maidstone,England）での分画化に
よりIgG画分を単離する。市販の抗血清も使用できる。
抗血清のIgG画分は5mg/mlとなし、1mlを125Iで標識す
る。ヨウ素化および透析後、約３×105cpm/μｇの比活
性とするために、抗血清はリン酸緩衝液（PBS）で1mg/m
lに希釈する。FcγR III cDNAにより形質転換された細
胞は72時間培養後収穫し、培地200μ中の２×106細胞
の部分を1.5mlプラスチック製エッペンドルフ円錐チュ
ーブ（Brinkmann Instruments,Inc,Westbury,N.Y.;カタ
ログ番号22−36−411−１）に入れる。各チューブにス
ピナー培地（Ca2+とMg2+を含まないイーグル最少培地）
1mlを加え、細胞を800×ｇで８分遠心する。上清を吸引
し、細胞ペレットをスピナー培地50μ中に再度浮遊さ
せる。試験すべき血清は0.15M NaCl（生理食塩水）で４
倍に希釈し、25μを形質転換細胞に加える。５〜10分
ごとに手で穩やかに撹拌しながら37℃で45分間インキュ
ベートした後、細胞はスピナー培地で３回洗う。最終洗
浄後、５〜10分ごとに穏やかに撹拌した細胞は、10g/
のヒト血清アルブミン（NSA）を含むスピナー培地で希
釈した125I−標識ウサギ抗ヒトIgGと４℃で30分反応さ
せる。インキュベーション後、細胞を３回洗い、上清を
完全に吸引して除き、そして細胞ペレットの放射能をガ
ンマカウンターで計測する。検定はすべて２通り行う。
絶対カウント数、インプットの百分率、または抗体のマ
イクログラム数として表される取込み量は、いろいろな
量の集合ヒトIgG（aggregated human IgG:AHG）を含む
正常ヒト血清（補体源）とインキュベートした細胞によ
る放射性抗体取込みの標準曲線を参照する。血清中の免
疫複合体の量は希釈係数について補正した後のAHGの量
に等しいと考えられ、血清１ミリリットル当たりのAHG
同等物のマイクログラム数として表される。可溶性AHG
は生理食塩水1ml当たり6.5mgのコーンフラクション（Co
hn fraction）IIまたは単離したヒトIgGの溶液から形成
され、63℃で30分加熱し、遠心して不溶性の大きい集合
体を除く。その後、上清は緩衝液で希釈して最終濃度を
約1.6mg/mlとする。この調製物のアリコート（0.5ml）
は−70℃で保存され、１カ月程度も使用することができ
る。
酸アンモニウム沈澱とその後のアニオン交換クロマトグ
ラフィーカラム（DEAE−セルロース52;Whatman Chemica
l Separation Ltd.,Maidstone,England）での分画化に
よりIgG画分を単離する。市販の抗血清も使用できる。
抗血清のIgG画分は5mg/mlとなし、1mlを125Iで標識す
る。ヨウ素化および透析後、約３×105cpm/μｇの比活
性とするために、抗血清はリン酸緩衝液（PBS）で1mg/m
lに希釈する。FcγR III cDNAにより形質転換された細
胞は72時間培養後収穫し、培地200μ中の２×106細胞
の部分を1.5mlプラスチック製エッペンドルフ円錐チュ
ーブ（Brinkmann Instruments,Inc,Westbury,N.Y.;カタ
ログ番号22−36−411−１）に入れる。各チューブにス
ピナー培地（Ca2+とMg2+を含まないイーグル最少培地）
1mlを加え、細胞を800×ｇで８分遠心する。上清を吸引
し、細胞ペレットをスピナー培地50μ中に再度浮遊さ
せる。試験すべき血清は0.15M NaCl（生理食塩水）で４
倍に希釈し、25μを形質転換細胞に加える。５〜10分
ごとに手で穩やかに撹拌しながら37℃で45分間インキュ
ベートした後、細胞はスピナー培地で３回洗う。最終洗
浄後、５〜10分ごとに穏やかに撹拌した細胞は、10g/
のヒト血清アルブミン（NSA）を含むスピナー培地で希
釈した125I−標識ウサギ抗ヒトIgGと４℃で30分反応さ
せる。インキュベーション後、細胞を３回洗い、上清を
完全に吸引して除き、そして細胞ペレットの放射能をガ
ンマカウンターで計測する。検定はすべて２通り行う。
絶対カウント数、インプットの百分率、または抗体のマ
イクログラム数として表される取込み量は、いろいろな
量の集合ヒトIgG（aggregated human IgG:AHG）を含む
正常ヒト血清（補体源）とインキュベートした細胞によ
る放射性抗体取込みの標準曲線を参照する。血清中の免
疫複合体の量は希釈係数について補正した後のAHGの量
に等しいと考えられ、血清１ミリリットル当たりのAHG
同等物のマイクログラム数として表される。可溶性AHG
は生理食塩水1ml当たり6.5mgのコーンフラクション（Co
hn fraction）IIまたは単離したヒトIgGの溶液から形成
され、63℃で30分加熱し、遠心して不溶性の大きい集合
体を除く。その後、上清は緩衝液で希釈して最終濃度を
約1.6mg/mlとする。この調製物のアリコート（0.5ml）
は−70℃で保存され、１カ月程度も使用することができ
る。
放射性抗体取込みの標準曲線は次のように作成され
る。AHGの50μ部分（蛋白80μｇ）を食塩水で連続的
に希釈する（11の２倍希釈物）。次に、新たに得られ
た、または−70℃で保存した、正常ヒト血清（補体源）
の２倍希釈物50μを各AHG希釈物に加え、慎重に混合
し、37℃で30分インキュベートする。その後、各混合物
25μを２通りずつ２×106細胞に加える（20μｇから
約20ngまでのAHGを含む血清の４倍最終希釈物）；この
混合物をインキュベートし、洗浄し、放射性標識抗体と
反応させる。その後、テスト血清と同様に放射能を計測
する。正常ヒト血清の４倍希釈物（基準曲線における補
体源として使用）25μとインキュベートした細胞によ
る放射性抗体取込みの基底線（バックグラウンド）も作
成される。
る。AHGの50μ部分（蛋白80μｇ）を食塩水で連続的
に希釈する（11の２倍希釈物）。次に、新たに得られ
た、または−70℃で保存した、正常ヒト血清（補体源）
の２倍希釈物50μを各AHG希釈物に加え、慎重に混合
し、37℃で30分インキュベートする。その後、各混合物
25μを２通りずつ２×106細胞に加える（20μｇから
約20ngまでのAHGを含む血清の４倍最終希釈物）；この
混合物をインキュベートし、洗浄し、放射性標識抗体と
反応させる。その後、テスト血清と同様に放射能を計測
する。正常ヒト血清の４倍希釈物（基準曲線における補
体源として使用）25μとインキュベートした細胞によ
る放射性抗体取込みの基底線（バックグラウンド）も作
成される。
最近、IgG集合体の標準調製物と破傷風トキソイド−
ヒト抗破傷風トキソイド免疫複合体の標準調製物が国際
免疫学者協会の援助の下に開発され、スイス赤十字社輸
血サービスから入手できる：例えば、Nydegger et al.,
Clin.Exp.Immunol.,Vol.58,p.502−509（1984）。
ヒト抗破傷風トキソイド免疫複合体の標準調製物が国際
免疫学者協会の援助の下に開発され、スイス赤十字社輸
血サービスから入手できる：例えば、Nydegger et al.,
Clin.Exp.Immunol.,Vol.58,p.502−509（1984）。
実施例III.可溶性ヒトFcγR IIIの構築 可溶性FcγR IIIは、pcD（SRa）−GP5のFcγR III cD
NA挿入物のオリゴヌクレオチドにより誘導される特定部
位の突然変異誘発を使って構築した。pcD（SRa）−GP5
の全cDNA挿入物は、2.4キロベースのBamHI断片としてブ
ルースクリプト（Bluescript）KSプラスミド（Stratage
ne,San Diego,CA）にサブクローニングし、その後一本
鎖DNAを調製した。
NA挿入物のオリゴヌクレオチドにより誘導される特定部
位の突然変異誘発を使って構築した。pcD（SRa）−GP5
の全cDNA挿入物は、2.4キロベースのBamHI断片としてブ
ルースクリプト（Bluescript）KSプラスミド（Stratage
ne,San Diego,CA）にサブクローニングし、その後一本
鎖DNAを調製した。
TAA停止コドンとBamHI部位をコードする合成オリゴヌ
クレオチド（最小寸法約18ヌクレオチド）（第２図に太
字体で示す突然変異を含む）は、DNAポリメラーゼＩ大
型断片（Amersham,Arlington Heights,IL）を使う相補
鎖合成のためのプライマーとして使用した。第２図に
は、FcγR III cDNAによりコードされる主要ドメインに
対する停止コドンとBamHI部位の位置が示してある:Sは
シグナルペプチドをコードする領域を表し、ECはFcγR
IIIの細胞外ドメインをコードする領域を示し、ＨはFc
γR IIIの疎水性、すなわちトランスメンブラン、ドメ
インをコードする領域を表し、そしてＣは細胞質ドメイ
ンをコードする領域を表す。第２図に示すように停止コ
ドンを導入すると、細胞質ドメインとトランスメンブラ
ンドメインの両方を欠失した変異体FcγR IIIが生成さ
れる；これは修飾DNA配列のそばに略称“sFcγR III"で
示されるように可溶性である。この変異体の本性をDNA
配列解析により確認した後、それをpcD（SRa）ベクター
のBamHI部位にサブクローニングし、大腸菌内で増幅さ
せ、そしてエレクトロポレーションによりCOS7細胞にト
ランスフェクションを起こさせた。トランスフェクショ
ンの１日前に、100mm培養皿当たり（1.5〜2.0）×106個
程度のCOS7サル細胞を、６％ウシ胎児血清と2mMグルタ
ミンを含むダルベッコ修飾イーグル培地（DME）にまい
た。トランスフェクションを実施するために、トリプシ
ン処理により細胞を収穫し、計数し、無血清DMEで２回
洗い、無血清DME中に（１〜７）×106/mlの細胞を浮遊
させた。DNAを加えて25μg/mlとなし、この混合物を室
温で10分放置し、その後0.8mlに0.4cm減菌キュベット中
でBio Rad（Richmond,CA）ジーンパルサーを使って250
V,960マイクロファラッドのパルスをかけた。パルス電
圧をかけた後、細胞は10分放置し、（1.5〜2.0）×106/
100mm培養皿で６％ウシ胎児血清含有DMEにまいた。72時
間後、上清を回収して可溶性FcγR IIIについて検定し
た。
クレオチド（最小寸法約18ヌクレオチド）（第２図に太
字体で示す突然変異を含む）は、DNAポリメラーゼＩ大
型断片（Amersham,Arlington Heights,IL）を使う相補
鎖合成のためのプライマーとして使用した。第２図に
は、FcγR III cDNAによりコードされる主要ドメインに
対する停止コドンとBamHI部位の位置が示してある:Sは
シグナルペプチドをコードする領域を表し、ECはFcγR
IIIの細胞外ドメインをコードする領域を示し、ＨはFc
γR IIIの疎水性、すなわちトランスメンブラン、ドメ
インをコードする領域を表し、そしてＣは細胞質ドメイ
ンをコードする領域を表す。第２図に示すように停止コ
ドンを導入すると、細胞質ドメインとトランスメンブラ
ンドメインの両方を欠失した変異体FcγR IIIが生成さ
れる；これは修飾DNA配列のそばに略称“sFcγR III"で
示されるように可溶性である。この変異体の本性をDNA
配列解析により確認した後、それをpcD（SRa）ベクター
のBamHI部位にサブクローニングし、大腸菌内で増幅さ
せ、そしてエレクトロポレーションによりCOS7細胞にト
ランスフェクションを起こさせた。トランスフェクショ
ンの１日前に、100mm培養皿当たり（1.5〜2.0）×106個
程度のCOS7サル細胞を、６％ウシ胎児血清と2mMグルタ
ミンを含むダルベッコ修飾イーグル培地（DME）にまい
た。トランスフェクションを実施するために、トリプシ
ン処理により細胞を収穫し、計数し、無血清DMEで２回
洗い、無血清DME中に（１〜７）×106/mlの細胞を浮遊
させた。DNAを加えて25μg/mlとなし、この混合物を室
温で10分放置し、その後0.8mlに0.4cm減菌キュベット中
でBio Rad（Richmond,CA）ジーンパルサーを使って250
V,960マイクロファラッドのパルスをかけた。パルス電
圧をかけた後、細胞は10分放置し、（1.5〜2.0）×106/
100mm培養皿で６％ウシ胎児血清含有DMEにまいた。72時
間後、上清を回収して可溶性FcγR IIIについて検定し
た。
COS7培養上清中の可溶性FcγR IIIはゲル電気泳動に
よりさらに分析し、免疫沈降させた。この結果は第３図
に示してある。対照（コントロール）、実験１および６
つの実際の実験即ち実験２〜７を行った。実験１、３お
よび６はそれぞれ、可溶性FcγR III cDNAを保有するpc
DでトランスフェクトしたCOS7細胞の培養上清からの蛋
白を含んだ。実験１の蛋白は非特異的マウスIgG2抗体に
より免疫沈降された；実験３の蛋白は、おそらく抗体の
Fc部分と可溶性FcγR IIIとの結合によりヒトIgGにより
免疫沈降された；そして実験６の蛋白はFcγR IIIの細
胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体3G8により
免疫沈降された。可溶性FcγR IIIは約40キロダルトン
の幅広バンドに一致した。実験４および７は、可溶性Fc
γR III cDNAを保有するpcDでトランスフェクトしかつ
ツニカマイシンの存在下で培養したCOS7細胞の培養上清
からの蛋白を含んだ。ツニカマイシンは蛋白へのＮ結合
炭水化物の翻訳後結合を阻害する。これは40キロダルト
ンバンドの見掛け上の不均一性の正体を調べる目的で使
用された。ツニカマイシンはより低分子量の２つのバン
ドを出現させ、これは可溶性FcγR IIIの脱グリコシル
化と一致する。ツニカマイシンはMartens et al.,PNAS8
4:809−813（1987）に記載の通りに培養物に加えた。実
験２および５はそれぞれ、実験３と４および実験６と７
のCOS7細胞と同じ遺伝子操作（ただし、プラスミドDNA
はトランスフェクションの手順に含まれなかった）を受
けたCOS7細胞の培養上清からの蛋白を含んだ。
よりさらに分析し、免疫沈降させた。この結果は第３図
に示してある。対照（コントロール）、実験１および６
つの実際の実験即ち実験２〜７を行った。実験１、３お
よび６はそれぞれ、可溶性FcγR III cDNAを保有するpc
DでトランスフェクトしたCOS7細胞の培養上清からの蛋
白を含んだ。実験１の蛋白は非特異的マウスIgG2抗体に
より免疫沈降された；実験３の蛋白は、おそらく抗体の
Fc部分と可溶性FcγR IIIとの結合によりヒトIgGにより
免疫沈降された；そして実験６の蛋白はFcγR IIIの細
胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体3G8により
免疫沈降された。可溶性FcγR IIIは約40キロダルトン
の幅広バンドに一致した。実験４および７は、可溶性Fc
γR III cDNAを保有するpcDでトランスフェクトしかつ
ツニカマイシンの存在下で培養したCOS7細胞の培養上清
からの蛋白を含んだ。ツニカマイシンは蛋白へのＮ結合
炭水化物の翻訳後結合を阻害する。これは40キロダルト
ンバンドの見掛け上の不均一性の正体を調べる目的で使
用された。ツニカマイシンはより低分子量の２つのバン
ドを出現させ、これは可溶性FcγR IIIの脱グリコシル
化と一致する。ツニカマイシンはMartens et al.,PNAS8
4:809−813（1987）に記載の通りに培養物に加えた。実
験２および５はそれぞれ、実験３と４および実験６と７
のCOS7細胞と同じ遺伝子操作（ただし、プラスミドDNA
はトランスフェクションの手順に含まれなかった）を受
けたCOS7細胞の培養上清からの蛋白を含んだ。
実施例IV.ナチュラルキラー細胞からの変異体ヒトFcγR
IIIの単離 cDNAライブラリーは、ヒト・ナチュラルキラー（NK）
細胞系列より抽出したmRNAから、pcD（SRa）発現ベクタ
ーを使って作製された。このライブラリーは、ランダム
プライムDNAラベリング（Boehringer Mannheim,Indiana
polis,IN）により31Pで放射性標識した、pcD（SRa）−G
P5のcDNA挿入物由来のプローブを使ってスクリーニング
した。ヒトIgG結合活性を示すクローンpcD（SRa）−NL1
0が得られた。pcD（SRa）−NL10のcDNA挿入物の配列は
第３図に示してある。このFcγR IIIのアミノ酸配列とp
cD（SRa）−GP5によりコードされるアミノ酸配列とは、
細胞外ドメインにおいてたった６個のアミノ酸が相違す
るだけで、非常に類似していることが分かる。
IIIの単離 cDNAライブラリーは、ヒト・ナチュラルキラー（NK）
細胞系列より抽出したmRNAから、pcD（SRa）発現ベクタ
ーを使って作製された。このライブラリーは、ランダム
プライムDNAラベリング（Boehringer Mannheim,Indiana
polis,IN）により31Pで放射性標識した、pcD（SRa）−G
P5のcDNA挿入物由来のプローブを使ってスクリーニング
した。ヒトIgG結合活性を示すクローンpcD（SRa）−NL1
0が得られた。pcD（SRa）−NL10のcDNA挿入物の配列は
第３図に示してある。このFcγR IIIのアミノ酸配列とp
cD（SRa）−GP5によりコードされるアミノ酸配列とは、
細胞外ドメインにおいてたった６個のアミノ酸が相違す
るだけで、非常に類似していることが分かる。
本発明実施態様の前記記載は例示および説明のために
提供された。それらは本発明を網羅するものではなく、
また本発明を開示された細部に限定するものでもない。
明らかに、前記の教示を考慮して多くの修正および変更
が可能である。実施態様は本発明の原理およびその実際
的使用も最もよく説明するために選択して記載してあ
り、これにより当分野で習熟した者は様々な実施態様に
おいて、意図する特性用途に合うような修正を施して、
本発明を最大限に利用することができる。本発明の範囲
はここに添付の請求の範囲によって定められるものとす
る。
提供された。それらは本発明を網羅するものではなく、
また本発明を開示された細部に限定するものでもない。
明らかに、前記の教示を考慮して多くの修正および変更
が可能である。実施態様は本発明の原理およびその実際
的使用も最もよく説明するために選択して記載してあ
り、これにより当分野で習熟した者は様々な実施態様に
おいて、意図する特性用途に合うような修正を施して、
本発明を最大限に利用することができる。本発明の範囲
はここに添付の請求の範囲によって定められるものとす
る。
出願人はpcD（SRa）−GP5を米国メリーランド州ロッ
クビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ATCC）に受託番号67707として寄託した。この寄託
は微生物の寄託に関するプダペスト条約の下に；さらに
特許のための培養物寄託に関するATCC協定により提示さ
れた条件の下に行われ、これは寄託物が35U.S.C.122お
よび37C.F.R.1.14に従って米国特許商標局長管に利用可
能となり、そして米国特許の発布の際には一般の人々に
利用可能となることを保証し、また寄託物を維持するこ
とを命じている。寄託された菌株が利用可能となること
は、特許法に従って担当行政機関により許可された権利
に違反して本発明を実施するための許可として解決され
るべきではない。
クビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ATCC）に受託番号67707として寄託した。この寄託
は微生物の寄託に関するプダペスト条約の下に；さらに
特許のための培養物寄託に関するATCC協定により提示さ
れた条件の下に行われ、これは寄託物が35U.S.C.122お
よび37C.F.R.1.14に従って米国特許商標局長管に利用可
能となり、そして米国特許の発布の際には一般の人々に
利用可能となることを保証し、また寄託物を維持するこ
とを命じている。寄託された菌株が利用可能となること
は、特許法に従って担当行政機関により許可された権利
に違反して本発明を実施するための許可として解決され
るべきではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 モーア，ケヴィン・ダブリュー アメリカ合衆国カリフォルニア州94306, パロ・アルト，パーク・ブールヴァード 4144 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．333（1988. Ｊｕｎ．９）ｐ．568−570
Claims (5)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列： を有するFcγR IIIポリペプチドまたはヒトIgGのFc部分
に結合しうる活性を有し、上記アミノ酸配列において１
またはそれ以上のアミノ酸が置換または欠失されている
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列を有する核酸。 - 【請求項２】下記のヌクレオチド配列： を有する請求項１記載の核酸。
- 【請求項３】ヒトFerR IIIポリペプチドの生成に用いら
れる、請求項１または２記載の核酸。 - 【請求項４】宿主適合性プロモーターおよび請求項１ま
たは２記載の核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換
することを特徴とするヒトFcγR IIIポリペプチドの生
成方法。 - 【請求項５】下記のアミノ酸配列： を有するFcγR IIIポリペプチドまたはヒトIgGのFc部分
に結合しうる活性を有し、上記アミノ酸配列において１
またはそれ以上のアミノ酸が置換または欠失されている
アミノ酸配列を有するポリペプチド。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US19951388A | 1988-05-27 | 1988-05-27 | |
| US199,153 | 1988-05-27 | ||
| US30003989A | 1989-01-19 | 1989-01-19 | |
| US300,039 | 1989-01-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03501484A JPH03501484A (ja) | 1991-04-04 |
| JP2657221B2 true JP2657221B2 (ja) | 1997-09-24 |
Family
ID=26894851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1506363A Expired - Lifetime JP2657221B2 (ja) | 1988-05-27 | 1989-05-24 | ヒトＦｃγレセプター▲ＩＩＩ▼ |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5976831A (ja) |
| EP (3) | EP0449828A1 (ja) |
| JP (1) | JP2657221B2 (ja) |
| KR (1) | KR0149012B1 (ja) |
| AT (2) | ATE197053T1 (ja) |
| AU (1) | AU3740089A (ja) |
| DE (3) | DE68929256T2 (ja) |
| ES (2) | ES2150898T3 (ja) |
| GR (1) | GR3034698T3 (ja) |
| HK (1) | HK1001403A1 (ja) |
| WO (1) | WO1989011490A1 (ja) |
Families Citing this family (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989011490A1 (en) * | 1988-05-27 | 1989-11-30 | Schering Biotech Corporation | HUMAN Fcgamma RECEPTOR III |
| US5767077A (en) * | 1988-05-27 | 1998-06-16 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Human Fc-γ receptor III |
| US7038031B1 (en) * | 1989-07-28 | 2006-05-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | DNA encoding FcγR receptor protein on NK cells |
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