KR0149012B1 - 사람 f크롬 수용체 iii - Google Patents

사람 f크롬 수용체 iii

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KR0149012B1
KR0149012B1 KR1019900700147A KR900700147A KR0149012B1 KR 0149012 B1 KR0149012 B1 KR 0149012B1 KR 1019900700147 A KR1019900700147 A KR 1019900700147A KR 900700147 A KR900700147 A KR 900700147A KR 0149012 B1 KR0149012 B1 KR 0149012B1
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에이. 펠쯔 개리
더블유. 무어 케빈
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쇼트보르그 레기날드 데
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안토니우스-쉐드훼 에스
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Abstract

내용없음

Description

[발명의 명칭]
사람 Fcγ 수용체Ⅲ
[발명의 분야]
본 발명은 일반적으로 치료 화합물, 특히 사람 면역 글로불린 G에 대한 가용성 및 막 결합된 형태의 저-친화성 수용체, 이를 암호화하는 핵산, 및 이러한 수용체의 진단 및 치료용 용도에 관한 것이다.
[발명의 배경]
면역글로불린 G(IgG)의 Fc 부위에 대한 수용체는 세포성 면역방어에 있어서 중심적인 역할을 한다. 세가지 유형의 이러한 수용체가 동정되었다 : 단량체성 IgG에 대한 친화성이 높은 72kD 수용체가 단핵구와 일부 대식구에서 발견되고, 단량체성 IgG에 대한 친화성이 낮은 40kD 수용체가 단핵구, 호중구, 호산구, 혈소판 및 특정인의 종양 세포주에서 발견되며, 단량체성 IgG에 대한 친화성이 낮은 50 내지 70kd 수용체가 호중구, 호산구, 천연 킬러(killer) 세포, 및 대식구에서 발견된다. 이들 세가지 유형의 Fcγ수용체는 각각 FcγRⅠ, FcγRⅡ, 및 FcγRⅢ로 언급한다[참조문헌: Ulnkeless et al., Ann. Rev. Immunol., Vol. 6, pgs. 251-281(1988)].
IgG-피복된 혈소판의 FcγRⅢ-중개된 제거는 과다출혈을 특징으로 하는 혈소판-결핍증인 면역 혈소판 감소성 자반병(ITP)의 발병에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다[참조문헌: Von dem Borne, pgs. 222-256 in Immunohaematology, Engelfriet et al., eds. (Elsevier, Amtserdam, 1984]. 리간드-차단 안티-FcγRⅢ 항체를 치료 난치성 ITP 환자에 주입함으로써 혈소판 수가 일시적으로 증가한다는 사실이 보고되었다[참조문헌: Clarkson et al., New England F. Med., Vol. 314, pgs. 1236-1239(1986)]. 이러한 관찰 결과는 ITP의 대부분의 유해한 증상의 발현이 IgG-피복된 혈소판상의 결합부위에 대한 FcγRⅢ를 차단하거나 이와 경쟁하는 제제를 투여함으로써 일시적으로 경감될 수 있다는 것을 암시한다.
임상 면역학의 독립된 분야에 있어서, 면역글로불린과 항원으로 이루어진 응집물(면역복합체)의 상승된 혈청 수준은 광범위한 종류의 장애, 특히 전신성 홍반성 낭창(SLE), 및 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환과 관련되어 있다. 이러한 복합체의 수준은 자기면역 장애의 존재 유무에 대해 중요한 진단 수단이 되어왔다[참조문헌: Theofilopoulos et al., Am. J. Pathol., Col. 100, pgs. 531-591(1980)].
현재 사용되고 있는 면역복합체의 혈청 수준 검정법에는 특정 보체 또는 류마티스 인자 단백질에 대한 복합체의 친화성을 이용하고자 하는 고체-상-검정법, 및 면역 복합체에 우선적으로 결합하는 래지(Raji) 세포의 특성을 이용하는 세포성 검정이 있다[참조문헌: Theofilopoulos et al., chapter 28, and Toth et al., chapter 29, in Rose et al., eds. Manual of Clinical Immunology, 3rd Ed. (American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1986)]. 유감스럽게도, 다수의 포유류-세포 기본 검정법과 같이, 래지-세포 검정법도 수행하기가 어려우며, 면역 복합체에 대한 래지-세포의 결합이 본래 다양하기 때문에 정교한 조절과 표준물이 요구된다.
전술한 사실로 미루어 보아, 의학계에서는 성상이 잘 확인되고, 광범위하게 입수용이하며, 편리하게 배양된 세포주를 이용하는, 면역복합체에 대한 대체 검정법을 개발하는 것이 유리할 것이다. 가용성 FcγR가 충분한 양으로 생성되어 난치성 ITP 증상에 대한 실질적인 응급 치료를 할 수 있다면 또한 유리할 것이다.
[발명의 요약]
본 발명은 가용성 및 막-결합된 사람 FcγRⅢ 폴리펩타이드, 이들의 뮤테인, 이들을 암호화할 수 있는 핵산, 및 이러한 폴리펩타이드 및 뮤테인의 진단 및 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 사람 FcγRⅢ를 암호화하는 cDNA의 발견에 기초한다. 이.콜라이 K12 균주 MC1061 중의 FcγRⅢ-암호화 삽입물(제1도)을 함유하는 cDNA 클론 pcD(SRα)가 ATCC에 가탁되어 있다(American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA, 기탁번호 제67707호).
본 발명의 바람직한 양태에는 하기 서열식(Ⅰ) 및 (Ⅱ)로 정의된 2회 치환되고 1회 결실된 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질이 포함된다.
및
상기 서열식에서, X(Xaa)는 아미노산 Xaa에 대한 유사 L-아미노산의 그룹을 나타낸다.
그룹내의 유사 아미노산은 분자의 생물학적 기능을 보존하기 위해 그룹원간의 치환에 대해 충분히 유사한 생리화학적 특성을 지닌다[참조문헌: Gratham, Science, Vol. 185, pgs. 862-864 (1974) : and Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 1972, Vol. 5, pgs. 89-99]. 특히 극소수의 아미노산만이 결실되고 기능적인 형태에 중요한 아미노산, 예를 들어 일부 시스테인 잔기가 제거되거나 대체되지 않는다면, 생물학적 기능을 변형시키지 않으면서 상기 동정된 서열 중에서 아미노산이 결실될 수도 있음이 명백하다[참조문헌: Anfisen, Principles That Govern The Folding of Protein Chains, Science, Vol. 181, pgs. 223-230 (1973)]. 결실에 의해 생성된 단백질 및 뮤테인도 본 발명의 범위에 속한다. 서열식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 단백질의 아미노산 잔기가 본 명세서에서 번호로 언급되는 경우, 이러한 번호는 단백질의 N-말단을 참조로 한 번호를 언급한다.
각각의 아미노에 대해 바람직한 및 보다 바람직한 유사 아미노산 그룹을 표Ⅰ에 나타내었다. 각 아미노산에 대한 각 그룹을 빗금선(/)으로 나타냈다. 빗금선 좌측의 아미노산이 가장 바람직한 그룹이다. 동일선상의 모든 아미노산이 보다 바람직한 그룹이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 서열식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)에 언급된 N-회 치환된이란 각각 치환되지 않은 천연 아미노산 서열과 달리 0내지 N개의 아미노산이 치환된 아미노산 서열 그룹을 나타내며, 이러한 대체 아미노산은 치환 위치에 있는 아미노산에 대한 유사 아미노산의 적절한 그룹중에서 선택된다. 즉, X(Ala)가 치환위치에 있으면, 그 위치의 Ala는 Ser, Ser 또는 Gly로 대체될 수 있다.
이와 마찬가지로, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 서열식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)와 관련하여 N-회 결실된 이란 각각 아미노산이 결실되지 않은 천연 아미노산 서열과 달리 0 내지 N개의 아미노산이 결실된 아미노산 서열의 그룹을 나타낸다.
명세서 전반에 걸쳐서, 표준 약어는 아미노산, 뉴클레오티드, 제한 엔도뉴클레아제 등을 나타내는데 사용된다[참조문헌: Cohn, Nomenclature and Symbolism of α-Amino Acids, Methods in Enzymology, Vol. 106, pgs. 3-17 (1984); Wood et al. Biochemistry: A Problems Approach, 2nd ed. (Benjamin, Menlo Park, 1981); and Roberts, Directory of Restriction Endonucleases, Methods in Enzymology, Vol. 68, pgs. 27-40 (1979)].
[도면의 간단한 설명]
제1a도 및 1b도는 pcD(SRα)-GP5의 cDNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열도이다.
제2도는 Fcγ RⅢ 돌연변이체로서 분비되는, 가용성 사람 Fcγ RⅢ을 생성시키기 위해 삽입된 정치 코돈의 상대적인 위치 선성도이다.
제3a도 및 3b도는 pcD(SRα)-NL10의 cDNA 삽입물의 뉴클레오티드 서열도이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명에서는 사람 IgG의 Fc 부위와 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 포함된다. 이들 폴리펩타이드는 사람 FcRⅢ에서 유도된다. 본 발명에는 사람 FcRⅢ에 대한 가용성 및 막-결합된 폴리펩타이드가 포함된다. 이들 폴리펩타이드 및 다른 변형체는 표준 단백질 공학 기술을 사용하여 용이하게 생성된다.
일단 핵산 서열 및/또는 아미노산 서열 정보가 천연 단백질에 대해 이용 가능하면, 각종 기술이 천연 서열내에서 실질적으로 돌연변이를 생성시키는 데에 이용될 수 있게 된다. 본 발명에 적용될 수 있는 핵산 돌연변이 기술이 쇼틀[참조문헌: Shortle, in Science, Vol. 229, pgs. 1193-1201 (1985)]에 의해 고착되었다. 바람직하게는, 본 발명의 단백질 돌연변이체는 부위-특이성 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발[참조문헌: Zoller and Smith, Methods in Enzymology, Vol. 100, pgs. 468-500 (1983), and Mark et al., 미합중국 특허 제 4,518,584호, Human Recombinant Interleukin-2Muteins, 본 명세서에 참조로 인용]; 또는 카셋트(cassette) 돌연변이 유발[참조문헌: Wells et al. in Gene, Vol. 34, pgs. 315-323 (1985); Estell et al. in Science, Vol 233, pgs 659-663 (1986), and Mullenbach et al. in J. Biol. Chem. Vol. 261, pgs. 719-722 (1986), and Feretti et al. in Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 83, pgs. 597-603 (1986)]에 의해 생성된다.
아미노산이 변형된 폴리펩타이드(즉, 뮤테인)가 각종 상황하에서 바람직할 수 있다. 예를 들어, 특히 부작용이 목적 활성을 갖는 폴리펩타이드와 상이한 부분과 관련된 경우, 특정 뮤테인에 의해 바람직하지 않은 부작용이 경감될 수 있다. 일부 발현 시스템의 경우, 천연 폴리펩타이드는 프로타아제에 의한 분해에 민감할 수 있다. 이러한 경우, 민간한 서열을 변화시키는 아미노산의 선별된 치환 및/또는 결실은 수율을 상당히 증진시킬 수 있다(예: 사람 조직 플라스미노겐 활성인자의 위치 275에 있는 Arg를 Gly 또는 Glu로 대체시킨 영국 특허원 제2173-804-A호). 또한 뮤테인은 정제 과정시에 수율을 증가시킬 수 있고/있거나 산화, 아실화, 알킬화, 또는 기타 화학적 변형에 민감한 아미노산을 제거시킴으로써 단백질의 저장수명을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 메티오닌은 신속히 산화과정을 거쳐 설폭사이드를 형성하는데, 이러한 과정은 다수의 단백질이 생물학적 활성을 상실하는 것과 관련된다[참조문헌: Brot and Weissbach, Arch. Biophys., Vol 223, pg. 271 (1983)]. 메티오닌은 종종 생물학적 활성을 거의 또는 전혀 상실시키지 않는 보다 불활성인 아미노산으로 대체될 수 있다(예: 오스트레일리아 특허원 제AU-A-52451/86호). 세균성 발현 시스템에서, 수율은 종종 형태적으로 비필수적인 시스테인 잔기를 제거시키거나 교체시킴으로써 증가시킬 수 있다(예: Mark et al., 미합중국 특허 제4,518,584호).
바람직하게는, 본 발명의 가용성 형태인 FcRⅢ는 FcRⅢ cDNA의 트랜스막 및 세포내(intracellular) 부위를 암호화하는 영역의 앞에 (5'-또는 상부방향) 정지 코돈을 도입시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 과정은 부위-특위적 돌연변이 유발에 의해 편리하게 수행된다. 트랜스막 영역은 평균적으로 높은 소수성을 띠는 약 20 내지 25개의 잔기를 함유하는 아미노산 단편의 존재로 쉽게 동정된다[참조문헌: Wickner, Science, Vol. 210, pgs. 861-868 (1980), and Greene et al., Ann, Rev. Immunol., Vol. 4, pgs. 69-95 (1986)].
플라스미드 pcD(SRα)-GP5는, HTLV(Ⅰ) 레트로바이러스의 긴 말단 반복 부위(LTR)를 하부에 삽입시켜 발현이 향상되도록 SV40 프로모터를 변형[참조문헌: Takebe et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 8, pgs. 466-472 (1988)]시킨 것을 제외하고는 pcD tu틀 벡터와 유사하다[참조문헌: Okayama and Berg, Mol. Cell. Biol., Vol. 2, pgs. 161-170 (1983), and Vol. 3, pgs. 280-289 (1983)]. 이 플라스미드는 이.콜라이 K12균주 MC1061 또는 유사한 숙주내에서 편리하게 증식된다.
본 발명의 FcRⅢ의 면역글로불린 G 결합특성은 표준기술, 예를 들어(1) 막-결합된 FcRⅢ의 경우, FcRⅢ cDNA로 형질 감염된 세포가 IgG-피복된 적혈구(RBC)의 존재하에 로젯(rosette)을 형성하는 능력 또는 열처리에 의해 응집된 사람 IgG와 우선적으로 결합하는 능력; 또는 (2) 가용성 FcRⅢ의 경우, 사람 IgG를 포함하는 면역흡착 컬럼에 의해 용액으로부터 FcRⅢ를 우선적으로 제거시키는 능령, 또는 IgG-피복된 RBC와 FcRⅢ를 함유하고 있는 것으로 알려진 세포간의 로젯 형성을 억제하는 능력에 의해 측정된다. 전자의 측정법은 형광 표지된 사람 IgG 분자로 수행될 수 있다[참조문헌: Haugland, Handbook of Fluorescent Probes(Molecular Probes, Inc., Junction City, OR, 1985)]. 후자의 측정법은 분리된 사람 IgG 및 시판되고 있는 활성화된 세파로스 컬럼(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)으로부터 IgG 컬럼을 작제함으로써 수행될 수 있다.
로젯 검정법은 본 분야의 표준기술이다[참조문헌: Winchester et al., chapter 31, in Rose et al., eds., Manual of Clinical Laboratorty Immunology, 3rd Ed. (American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1986)].
일단 본 발명의 cDNA가 클로닝되면, 광범위한 종류의 발현 시스템(예를 들어, 숙주와 발현 벡터의 조합)을 사용하여 본 발명의 단백질을 생산할 수 있다. 가능한 형태의 숙주 세포에는 세균, 효모, 곤충, 포유류 등의 세포가 포함되며 이에 제한되지는 않는다. 발현 시스템을 선택하고, 이로써 단백질 생성을 최적화하는데에는 (1) 발현될 단백질의 특성, 예를 들어 단백질이 일부 숙주 유기체에 대해 유독할 수 있거나, 숙주 프로테아제에 의한 분해에 민감할 수 있거나, 일부 숙주에서 불활성 형태로 또는 불용성 형으로 발현될 수 있는 지의 여부, (2) 목적 단백질에 상응하는 mRNA의 특성, 예를 들어 mRNA가 자체의 작용성 수명을 현저히 감소시키는, 숙주 엔도뉴클레아제에 대해 특히 민감한 서열을 함유할 수 있거나, mRNA가 출방 코돈 또는 리보점 결합부위를 은폐시킴으로써, 일부 숙주에서 해독의 개시를 억제시키는 2차 구조를 형성할 수 있는 지의 유무, (3) 암호화 영역을 플랭킹하는 3'- 및 5'-영역내의 숙주-양립성 발현-조절 서열(이러한 서열에는 프로모터, 5'- 및 3'-보호서열, 리보좀 결합부위, 전사 종결자, 인핸서, 폴리아데닐레이트 첨가 부위, 캡 부위, 인트론-스플라이싱 부위 등이 포함된다)의 선별, 이용 가능성, 및 배치, (4) 단백질이 숙주세포에 의해 프로쎄싱될 수 있는 분비-시그날 서열을 함유하거나, 숙주의 내인성 시그날 서열을 암호화하는 발현-조절 서열이 성숙한 단백질을 암호화하는 영역에 스플라이싱되어야 하는지의 여부, (5) 숙주의 형질감염 또는 형질전환의 이용 가능한 양식 및 효율, 및 일시적인 발현 또는 안정한 발현이 요구되는 지의 여부, (6) 단백질을 발현시키는데 요구되는 숙주 배양 시스템의 규모 및 비용, (7) 해독후 변형이 요구되는지 및 어떠한 유형이 요구되는지, 예를 들어, 목적화하는 당화의 범위 및 종류가 선택에 영향을 미칠 수 있는지의 여부, (8) 발현된 단백질이 수주 세포의 단백질 및 기타 물질 및/또는 배양배지로부터 용이하게 분리될 수 있는지의 여부, [예를 들어, 일부 경우에 있어서는 나중의 정제 단계에 도움을 주기 위해 특별한 시그날 서열을 갖는 융합 단백질을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다(참조문헌: Sassenfeld et al., Biotechnology, January 1984)], (9) 선택된 숙주 내 특정 벡터의 안정성 및 복제수[참조문헌: Hofschneider et al., eds. Gene colning in Organi는 other than E. coli Springer Verlag, Berlin, 1982)] 및 (10) 본 분야의 전문가에게 공지된 인자 등을 포함하여, 다수의 인자를 고려하고 균형을 맞추는 과정이 포함된다.
전술한 인자로 미루어보아 특이적 발현 시스템을 선택 및/ 또는 변형시키기 위한 지침을 제공하는 다수의 연구결과가 이용될 수 있다[참조문헌: de Boer and shepard, Strategies for Optimizing Foreign Gene Expression in Escherichia colipsg. 205-247, in Kroon, ed. Genes: Structure and Expression(John Wiley Sons, New York, 1983), review several E.coli expression systems; Kucherlapati et al., Critical Revviews in Biochemistry, Vol. 16, Issue 4, pgs. 349-379 (1984), and Banerji et al., Genetic Engineering, Vol. 5, pgs. 19-31 (1983) review methods for trassfecting and transforming mammlian cells; Reznifoff and Gold, eds., Maximizing Gene Expression (Butteworths, Boston, 1986) review selected topics in gene expression in E. coli, yeast, and mammalian cells; and Thilly, Mammalian, Cell Technology (Butteworths, Boston, 1986) reviewsmammalian expression systems].
이와 마찬가지로, 특이적 cDNA를 연결시키고/시키거나 조작되기 위한 기술 및 조건 및 본 발명에 사용하기 적합한 발현벡터를 생성시키고/거나 변형시키기 위한 발현 조절 서열을 기술하고 있는 다수의 연구 결과도 이용될 수 있다[참조문헌: Maniatis et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982); Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. Ⅰ and Ⅱ (IRL Press, Oxford, 1985), and Perbal, A Practical Guide to Molecualr Cloning (John Wiley Sons, N.Y., 1984)].
본 발명에 적합한 발현시스템에는 문헌[참조: Itakuta 및 Riggs의 미합중국 특허 제4,704,362호(세균의 발현), Clark등의 미합중국 특허 제4,675,285호 및 Hamer의 미합중국 특허 제4,599,308호(포유동물의 발현), 및 Kurjan 등의 미합중국 특허 제4,546,082호(효모 발현)]에 기술된 시스템들이 포함된다. 따라서 상기 특허문헌은 본원에 참조로 이용되었다.
SV40-기본 벡터, 예를 들어 pcD 벡터가 사용되는 겨우, 바람직한 숙주는 COS7세포주이다[참조문헌: Gluzman, Cell, Vol. 23, pgs. 175-782 (1981), ATCC 기탁번호 제CRL 1651].
본 발명의 가용성 FcRⅢ는 ITP 치료용의 약제학적 조성물로서 투여된다. 이러한 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 중에서 유효량의 FcRⅢ를 함유한다. 약제학적 담체는 본 발명의 조성물을 환자에 투여하기에 적합한 양립성, 무독성 물질일 수 있다. 일반적으로 이러한 약제의 비경구 투여에 유용한 조성물은 공지되어 있다[참조문헌: Remington's Pharmaceutical Science, 15th Ed., Mack Publishing Company, Easton, PA 1980]. 또 다른 방법으로, 본 발명의 조성물은 이식성 약제 수송 시스템에 의해 환자의 체내로 도입될 수 있다[참조문헌: Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., Vol. 24, pgs. 199-236 (1984)].
비경구 투여시, 가용성 FcRⅢ는 약제학적 담체와 함께 주사 가능한 형태(액제, 현탁제, 유제)의 단위 용량으로 제형화될 것이다. 이러한 담체는 본질적으로 무독성이고 비-치료성이다. 이러한 담체의 예는 통상적인 생리식염수, 링게르 용액, 덱스트로스 용액 및 한크(Hank) 용액이다. 비휘발성 오일 및 에틸 올리에이트 같은 비수성 담체도 사용될 수 있다. 바람직한 담체는 5% 덱스트로스/생리식염수이다. 담체는 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질과 같은 소량의 첨가제, 예를 들어 완충제 및 방부제를 함유할 수 있다. 가용성 FcRⅢ는 약 5 내지 30mg/ml, 및 바람직하게는 약 10 내지 20mg/ml 범위의 농도로 응집물 및 기타 단백질을 실질적으로 함유하지 않는 정제된 형태로 바람직하게 제형화된다.
ITP와 관련한 혈소판 감소증을 완화시키기에 유효한 양의 가용성 FcRⅢ를 환자에 전달하기 위한 투여 처방의 선택은 가용성 FcRⅢ의 혈청 전환율, 면역장애와 관련된 경쟁적 내인성 FcRⅢ의 혈청 수준, 가용성 FcRⅢ의 가능한 면역원성 등을 포함하는, 몇몇 인자에 의해서 좌우된다. 바람직하게는, 투여 처방은 부작용은 허용 가능한 수준이면서, 환자에게 전달되는 가용성 FcRⅢ의 양을 극대화한다. 따라서, 전달되는 가용성 FcRⅢ의 양은 부분적으로는 사용되는 특정의 가용성 FcRⅢ 및 치료하고자 하는 질환의 중증도에 좌우된다. 적절한 용량을 선택하기 위한 지침은 가용성 FcRⅢ와 대략 동일한 크기의 폴리펩타이드인 항체 및 항체 단편의 치료적 용도에 관한 문헌에 밝혀져 있다[참조문헌: Bach et al., chapter 22, in Ferrone et al., eds., Handbook of Monoclonal Antibodies (Noges Publications, Park Ridge, NJ, 1985); and Russell, pgs. 303-357, and Smith et al., pgs 365-389, in Haber et al., eds, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy (Raven Press, New York, 1977)]. 바람직하게는, 용량은 1일에 약 1 내지 20mg/kg, 더욱 바람직하게는 1일에 약 1 내지 10mg/kg의 범위이다.
[실시예]
하기 실시예에서는 본 발명을 설명한다. 벡터, 숙주 및 시약의 농도, 온도 및 기타 변수의 값은 단지 본 발명의 적용을 예시하기 위한 것이며 이로써 본 발명이 제한되지는 않는다.
[실시예1]
사람 FcRⅢ를 발현하는 안정한 포유동물 세포 형질전환체의 작제
바람직하게는, FcRⅢ를 안정하게 발현할 수 있는 표유동물 세포주는 숙주 포유동물 세포를 선별 마커를 함유하는 벡터와 숙주 양립성 프로모터 및 FcRⅢ cDNA 삽입물을 함유하는 벡터로 동시 형질감염시킴으로써 생성된다. pcD(SR)-GP5의 경우, 적합한 숙주에는 중국산 햄스터 난소세포, COS 원숭이 세포, 및 티미딘키타제 결손 돌연변이체(tk )L 세포(ATCC 기탁번호 제CCL 1.3호)와 같은 마우스 L세포가 포함된다. 선별 마커는 FcRⅢ 유전자가 숙주 게놈내로 완전히 통합되도록 하는 높은 확률을 갖는 숙주 세포를 선별할 수 있게 한다. 전형적으로, 형질감염 용액중의 pcD(SR)-GP5 대 마커-함유 벡터의 비는 약10:1이다. 즉, 마커 유전자가 숙주 게놈내로 통합되면, pcD(SR)-GP5도 고농도로 통합될 가능성이 많다 선별마커는 또한 목적 형질전환체의 배양물이 복귀돌연변이체 세포에 의해 과도하게 생장되는 것을 예방하는 수단을 제공한다.
tk 마우스 L세포를 pcD(SR)-GP5, 및 SV40 초기 프로모터에 조절하에 있는 티미딘 키나제 유전자를 함유하는 pSV2 플라스미드인 pSV2tk로 동시감염시킨다. pSV2 플라스미드는 문헌[참조: Mulligan et al., Science, Vol. 209, pgs. 1422-1427 (1980), and by Subramani et al., Mol. Cell. Bioll., Vol. 1, pgs. 854-864 (1981)]에 기술되어 있고 ATCC에 기탁되어 있다(ATCC 기탁번호 제37146호). 두 플라스미드 모두 이.콜라이, 예를 들어 균주 HB101(ATCC 기탁번호 제33694호) 중에서 증폭되고, 세슘 클로라이드 평형 원심분리에 의해 정제된다. 10% 태아 소 혈청을 함유하는 10ml의 둘베코 변형 이글 배지(DME) 중의 약 1×10 개의 tk L 세포 현탁액을 팔콘(Falcon) 3003 디쉬중에 넣고 5% 이산화탄소 기체 배양기중 37℃에서 20시간 동안 배양한 후, 이 배지를 10% 태아 소 혈청을 함유하는 10ml의 새로운 DME로 교체한다. 배양물을 추가로 4시간 더 배양한다. 배양한 후, 0.5ml의 용액 A(50mM Hepes, 280mM NaCl, 1.5mM 나트륨 포스페이스 완충액, pH 7.22) 및 0.5ml의 용액 B (2M CaCl, 10μg pcD(SR)-GP5, 1μg pSV2tk)를 배양배지에 가하고, 배양물을 5% CO대기 중에 37℃에서 24시간 배양한 후, 세포를 HAT가 함유된 선별배지(Sigma Chemical Co., St. Louis. MO) 중에 넣는다. 2주후 생존하는 콜로니를 제한 희석에 의해 아클로닝하고, 클론이 FcRⅢ를 발현했는지에 대해 검정한다.
[실시예2]
면역 복합체의 혈청 수준을 측정하기 위한 막-결합된 FcRⅢ를 발현하는 안정한 L세포 형질 전환체의 사용
본 발명의 Fc RⅢ를 발현하는 안정하게 형질 전환된 포유동물 세포는 면역 복합체에 대한 검정에 있어서 래지 세포를 대신할 수 있다[참조문헌: Theofilopoulos et al., chapter 28, Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3rd Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1986].
사람 IgG에 대한 항혈청은 토끼내에서 제조되고, IgG 분획은 암모늄 설페이트 침전에 이어 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(DEAE-셀룰로스 52; Whatman Chemical Separation Ltd., Maidstone, England)상에서 분획화함으로써 분리한다. 시판되고 있는 항혈청도 또한 사용할 수 있다. 항혈청의 IgG 분획을 5mg/ml가 되게하며, 1ml를 I로 표시한다. 요오드화 및 투석한 후, 항혈청을 인산염-완충된 생리식염수(PBS)로써 1mg/ml가 되게 희석하여 약 3×105cpm/μg의 특이활성을 수득한다. FcRⅢ cDNA로 형질전환시킨 세포를 배양한지 72시간 후에 하베스트(harvest)하고, 200μI 배지중의 2×10 개 세포의 분량을 1.5ml 플라스틱 엡펜도르프 원추형 튜브(참조문헌: Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, N.Y., catalog no. 22-36-411-1)중에 넣는다. 1ml의 스핀너(Spinner) 배지(Ca 및 Mg 를 함유하지 않은 이글 최소 배지)를 각 튜브에 가하고, 세포를 800xg에서 8분간 원심분리시킨다. 상등액을 흡인하고, 세포 펠렛을 50μI의 스핀너 배지 중에 재현탁시킨다. 시험할 혈청을 0.15M NaCl(생리식염수) 중에서 4배로 희석하고, 25μI를 형질전환된 세포에 가한다. 5 내지 10분마다 손으로 부드럽게 진탕시키면서 37℃에서 45분간 항온처리한 후에, 세포를 스핀너 배지로 3회 세척한다. 최종 세척후, 세포를 5 내지 10분마다 부드럽게 진탕시키면서, 1ι당 10g의 사람 혈청 알부민(HSA)을 함유하는 스핀너 배지로 희석시킨 I-표지된 토끼 안티-사람 IgG와 4℃에서 30분간 반응시킨다. 항온처리 후, 세포를 3회 세척하고, 상등액을 완전히 흡인시킨후, 감마 계수기로 세포 펠렛의 방사능을 측정한다. 모든 검정은 2회씩 수행한다. 절대 계수, 주입율, 또는 항체의 μg으로 나타낸 흡수량은, 다양한 양의 응집된 사람 IgG(AHG)를 함유하는 정상인 혈청(보체 공급원)과 항온처리된 세포에 의한 방사능 항체 흡수의 표준 곡선을 의미한다. 혈청중의 면역 복합체의 양은 희석인자에 대해 보정한 AHG의 양이며 혈청 1ml당 AHG의 μg으로 나타낸다. 가용성 AHG는생리 식염수 1ml당 6.5mg의 콘(Chon) 분획Ⅱ 또는 분리된 사람 IgG의 용액으로부터 형성시키며, 63℃에서 30분간 가열한 후 원심분리(1,500xg, 15분)하여 불용성의 큰 응집물을 제거시킨다. 이어서 상등액을 왼충액으로 희석시켜 최종 농도가 약1.6mg/ml가 되게 한다. 이러한 제조물의 일부(0.5ml)를 -70℃에서 보관하며 1개월간 사용할 수 있다.
방사능 항체 흡수의 표준 곡선은 다음과 같이 작도한다. 50μI 분량의 AHG(80μg의 단백질)를 식염수 중에서 연속 희석시킨다(11×2 희석). 계속해서, 새로 수득하거나 -70℃에서 보관한 50μI의 정상인 혈청(보체 공급원) 2배 희석액을, AHG의 각 희석액에 가하여 조심스럽게 혼합하고, 37℃에서 30분간 항온처리한다. 이어서, 25μI의 각 혼합물을 2×10 개 세포에 이중으로 가하고(20μg 내지 약 20ng의 AHG를 함유하는 혈청의 4배 최종 희석액); 혼합물을 항온처리, 세척 및 방사능 표지된 항체와 반응시킨다. 이어서 시험 혈청으로 방사능을 계수한다. 참조 곡선 중에서 보체 공급원으로 사용된, 정상인 혈청의 25μI의 4배 희석액으로 항온처리한 세포에 의한 방사능 항체 흡수의 기준치(백그라운드)도 설정될 수 있다.
최근에 면역학자들이 국제연합 원조 하에 IgG 응집물의 표준제제 및 파상풍 톡소이드-사람 안티-파상풍 톡소이드 면역 복합체의 표준 체제가 개발되었으며 스위스 적십자 수혈 서비스를 통해 구입할 수 있게 되었다[참조문헌: Nydegger et al., Clin. Exp. Immunol., Vol. 59, pgs. 502-509 (1984)].
[실시예3]
가용성 사람 FcRⅢ의 작제
가용성 FcRⅢ는 pcD(SR)-GP5의 Fcγ RⅢ cDNA 삽입물의 부위-특이적 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이 유발법을 사용하여 작제한다. pcD(SR)-GP5의 완전한 cDNA 삽입물을 2.4kb BamHI 단편으로서 Bluescript KS 플라스미드(Stratagene, San Diego, CA) 내에 아클로닝시키고 이어서 일-본쇄 DNA를 제조한다.
TAA 정지코돈 및 BamHI 부위(제2도에 굵은 활자로 나타낸 돌연변이를 가짐)를 암호화하는 합성 올리고뉴클레오티드(최저 크기 약18개 뉴클레오티드)를 DNA 폴리머라제I 거대 단편(Amersham, Arlington Heights, IL)을 사용하여 상보쇄 합성을 위한 프라이머로 사용한다. FcRⅢ cDNA에 의해 암호화된 주 영역에 대하여 상대적인 정지코돈 및 BamHI 부위의 위치를 제2도에 나타냈으며; 여기서, S는 시그날 펩타이드를 암호화하는 영역을 나타내며, EC는 FcRⅢ의 세포의 도메인을 암호화 하는 영역을 나타내며, H는 FcRIII의 소수성 영역, 또는 트랜스막 영역, 도메인을 암호화하는 영역을 나타내며, C는 세포질 도메인을 암호화하는 영역을 나타낸다. 제2도에 표시된 바와 같이 정지 코돈을 도입함으로써 세포질 영역 및 트랜스막 도메인 모두가 결핍되어 있는 돌연변이체 FcRⅢ가 생성된다; 이는 변형된 DNA 서열을 가지며 sFcRⅢ로 나타낸 바와 같이 가용성이다. 돌연변이체를 DNA 서열 분석에 의해 확인한 후, pcD(SR)벡터의 BamHI 부위에 아클로닝시키며, 이.콜라이 중에서 증폭시키고, 전기투공법으로 COS7세포 내에 형질 감염시킨다. 형질 감염시키기 하루 전날, 약 (1.5 내지 2.0)×10 개 COS7 원숭이 세포를 6% 태아 소 혈청 및 2mM 글루타민을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DME) 중의 각각의 100mm 평판상에 접종(seeding)한다. 형질 감염을 수행하기 위하여, 세포를 트립신 처리로써 수거하고 계수하며, 무혈청 DME 중에서 2회 세척하며, 무혈청 DME중 1ml당 (1 내지 7)×10 개 세포가 되게 현탁시킨다. DNA를 25μg/ml이 되게 가하고 이 혼합물을 실온에서 10분간 방치시킨후, 0.8ml를 Bio Rad(Richmond, CA)Gene Pulser가 장치된 0.4cm 멸균 큐벳 중에서 250 및 960μF에서 펄스를 가한다. 펄스를 가한 후, 세포를 10분간 정치시키고 이어서 6% 태아 소 혈청 함유 DME 중의 100mm 평판 1개당 (1.5 내지 2.0)×10 개 세포를 플레이팅 한다. 상등액을 하베스트하여 72시간후에 가용성 FcRⅢ에 대해 검정한다.
COS7 세포 상등액중의 가용성 FcRⅢ를 겔 전기영동으로 더 분석하고 면역침전시킨다. 대조실험으로 실험 1, 및 6개의 실제 실험, 실험 2 내지 7을 수행하였다. 실험 1, 3 및 6 각각은 가용성 FcRⅢ cDNA를 함유하는 pcD로 형질감염시킨 COS7 세포의 배양 상등액에서 수득된 단백질을 포함하였다. 실험 1로부터의 단백질은 비-특이적인 마우스 IgG항체로 면역침전시켰고: 실험 3으로부터의 단백질은 사람 IgG로 면역침전시켰으며, 아마도 항체의 Fc 부분과 가용성 FcRⅢ과의 결합에 의해 침전되었으리라 추축되며; 실험 6으로부터의 단백질은 FcRⅢ의 세포외 도메인에 대해 특이적인 모노클로날 항체3G8로 면역침전시킨다. 가용성 FcRⅢ는 약 40kd에서의 광역 밴드에 해당한다. 실험 4 및 7은 가용성 FcRⅢ cDNA를 함유하는 pcD로 형질감염시키고 튜니카마이신 존재하에 항온처리시킨 COS7 세포의 세포 상등액으로부터 수득된 단백질을 함유한다. 튜니카마이신은 단백질에 대한 N-연결된 탄수화물의 해독 후 결합을 억제시킨다. 튜니카마이신은 40kd 밴드의 명백한 이질성의 특징을 측정하기 위한 시도에서 적용되었다. 튜니카마이신은 가용성 FcRⅢ의 탈당화와 일치하는, 저분자량의 두 밴드의 출현을 야기시켰다. 튜니카마이신은 문헌[참조: Martens et al., PNAS 84:809-813 (1987)]에 기술된 바와 같이 배양액에 가했다. 실험 2 및 5는 각각 형질감염 방법에 플라스미드 DNA가 사용되지 않은 것을 제외하고는, 실험 3과 4 및 실험 6과 7의 COS 세포에서와 같이 동일한 조작을 가한 COS7세포의 배양 상등액으로부터의 단백질을 함유한다.
[실시예4]
천연 킬러 세포로부터 변형체 사람 FcRⅢ의 분리
pcD(SR) 발현 벡터를 사용하여 사람 천연 킬러(NK) 세포주에서 추출한 mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 작제한다. 무작위-프라이밍된 DNA 표지화에 의해 31P로 방사능 표지시킨, pcD(SR)-GP5의 cDNA 삽입물로부터 작제한 탐침(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 사용하여 라이브러리를 선별한다. 사람 IgG 결합 활성을 나타내는 클론 pcD(SR)-NL10을 수득한다. pcD(SR)-NL10의 cDNA 삽입물의 서열은 제3도에 설명되어 있다. 이 FcRⅢ의 아미노산 서열과 pcD(SRa-GP5에 의해 암호화된 아미노산 서열이 매유 유사하며, 세포외 도메인 내에서 단지 6개의 아미노산만이 상이하다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 전술한 양태애 대한 기술은 설명 및 기술할 목적으로 제시되었으며, 이로써 본 발명이 기술된 정확한 형태로 제한되지 않으며, 전술한 설명에 비추어봐서 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있음을 명백하게 알 수 있다. 본 발명의 양태는 본 발명의 원리를 가장 잘 설명하기 위해 선택되고 기술되었으며 이로써 본 분야의 전문가가 이를 실제로 적용하여 다양한 양태로 및 고려되는 특정 용도에 적합하도록 변형시켜 본 발명을 가장 잘 이용할 수 있다. 본 발명의 범위는 본원에 첨부된 특허청구의 범위로 한정된다.
본 출원인은 pcD(SR)-GP5를 ATCC에 기탁하였다(Rockville, MD, USA, 기탁번67707), 본 기탁은 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약; 및 또한 35 U.S.C 122 및 37 C.F.F 1.14에 의거하여 미합중국 특허 및 상표 커미셔너가 이용할 수 있고 기탁의 지속을 요하는 미합중국 특허의 허여시에 공인들이 이용할 수 있게됨을 보장하는, 특허 목적의 배양기탁에 대한 ATCC 협정하에 제공된 조건하에 이루어졌다. 기탁 균주의 입수가능성은 특허법에 따라 정부당국하에 부여된 권리에 위반하여 본 발명을 수행하기 위한 라이센스로 간주되어서는 안된다.

Claims (30)

  1. (1) 서열식(Ⅰ), 서열식(Ⅱ) 및 FcγRⅢ의 세포외 도메인인 이의 단편으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 갖거나, (2) 상기(1)의 서열로부터 1개의 아미노산이 결실되거나 하기와 같은 아미노산 치환으로 1개 또는 2개의 아미노산이 치환되거나 또는 1개의 아미노산이 결실되고 1개 또는 2개 아미노산이 치환되고 사람 IgG의 Fc 부분에 대한 결합능을 보유하는 서열을 갖는, 사람 FcγRⅢ 단백질 이외의 단백질이 함유되지 않은 분리된 사람 FcγRⅢ 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 단백질이 FcγRⅢ의 세포외 도메인 단편인 분리된 단백질
  3. 제1항에 있어서, 아미노산 서열식(Ⅰ)을 갖는 분리된 단백질.
  4. 서열식 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)로 이루어진 그룹 중에서 선택되 가용성인 사람 Fcγ수용체 Ⅲ 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, 핵산 서열이 아미노산 서열식(Ⅰ)의Fcγ수용체 Ⅲ 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  6. 제4항에 있어서, 핵산 서열이 아미노산 서열식(Ⅱ)의Fcγ수용체 Ⅲ 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  7. 제1항의 사람 FcγRⅢ 단백질을 약제학적 담체와 함께 함유하는, 면역 혈소판 감소성 자반병(ITP)의 치료에 유용한 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 담체가 염수, 링거 용액, 덱스트로즈 용액 및 행크 용액으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 약제학적 조성물.
  9. 서열식(Ⅱ) 및 FcγRⅢ의 세포외 도메인인 이의 단편으로 이루어진 그룹중에서 선택된, 사람 FcγRⅢ 단백질 이외의 단백질이 함유되지 않는 분리된 사람 FcγRⅢ 단백질
  10. 폴라스미드 pcD(SRα)-GP5(ATCC No. 67707)의 FcγRⅢ-암호화 삽입물 또는 FcγRⅢ 단백질의 세포외 도메인인 이의 단편으로 암호화되는 서열을 갖는, 사람 FcγRⅢ 단백질 이외의 단백질이 함유되지 않는 분리된 사람 Fcγ RⅢ 단백질
  11. 제1항에 있어서, 서열식(Ⅰ)의 아미노산 서열을 갖는 분리된 사람 FcγRⅢ 단백질.
  12. 제4항에 따른 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
  13. 제12항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 제13항에 따른 숙주 세포를 발현을 유도하기에 충분한 조건하에서 배양한 후 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하여, 가용성인 사람 Fcγ수용체 Ⅲ단백질을 제조하는 방법
  15. 가용성 또는 막 결합된 형태의 천연 발생 사람 Fcτ수용체 Ⅲ단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, 천연 발생 서열을 갖는 핵산 분자.
  17. 제15항에 있어서, pcD(SRα)-GP5(ATCC No. 67707)에 포함된 서열을 갖는 핵산 분자.
  18. 제15항에 있어서, 제1도의 뉴클레오티드 72번 내지 635번 또는 제3도의 뉴클레오티드 제145번 내지 708번의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  19. 제15항에 따른 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
  20. 제19항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 제20항에 따른 숙주 세포를 발현을 유도하기에 충분한 조건하에서 배양한 후 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하여, 가용성인 사람 Fcγ수용체 Ⅲ단백질을 제조하는 방법.
  22. 서열식(Ⅰ)의 서열로부터 0 내지 2개의 아미노산이 치환되거나 0 내지 1개의 아미노산이 결실되거나 또는 0 내지 2개의 아미노산이 치환되고 0 내지 1개의 아미노산이 결실된 아미노산 서열을 갖는, 사람 IgG에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  23. 제22항에 따른 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
  24. 제23항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제24항에 따른 숙주 세포를 발현을 유도하기에 충분한 조건하에서 배양한 후 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하여, 가용성인 사람 Fcγ수용체 Ⅲ단백질을 제조하는 방법.
  26. 서열식(Ⅱ)의 서열로부터 0 내지 2개의 아미노산이 치환되거나 0 내지 1개의 아미노산이 결실되거나 또는 0 내지 2개의 아미노산이 치환되고 0 내지 1개의 아미노산이 결실된 아미노산 서열을 갖는, 사람 IgG에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  27. 제26항에 따른 핵산분자를 포함하는 발현 벡터.
  28. 제27항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  29. 제28항에 따른 숙주 세포를 발현을 유도하기에 충분한 조건하에서 배양한 후 발현된 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하여, 가용성인 사람 Fcγ수용체 Ⅲ단백질을 제조하는 방법.
  30. 제1항에 따른 서열식(Ⅰ) 또는 서열식(Ⅱ)의 아미노산 서열을 갖는 세포외 도메인과 트랜스막 및 세포질 도메인으로 이루어진 막-결합된 사람 FcγRⅢ 단백질.
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