ES2223061T3 - Moleculas ctla4 mutantes y uso de las mismas. - Google Patents
Moleculas ctla4 mutantes y uso de las mismas.Info
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Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA MOLECULAS MUTANTES CTLA4 COMO LIGANTES PARA EL ANTIGENO B7. SE PROPORCIONAN METODOS PARA EXPRESAR LAS MOLECULAS MUTANTES CTLA4 COMO MOLECULAS SOLUBLES, FUNCIONALES, PARA PREPARAR LAS PROTEINAS DE FUSION MUTANTES CTLA4, Y PARA USAR ESTAS MOLECULAS SOLUBLES PARA REGULAR LAS INTERACCIONES DE LA CELULA T Y LAS RESPUESTAS INMUNES TRANSMITIDAS POR TALES INTERACCIONES.
Description
Moléculas CTLA4 mutantes y usos de las
mismas.
La presente invención se refiere a la expresión
de moléculas CTLA4 mutantes y de procedimientos para regular las
interacciones celulares usando las moléculas CTLA4 mutantes.
Los acontecimientos centrales que conducen a una
respuesta inmune específica ante un antígeno implican la asociación
íntima de los linfocitos T con las células presentadoras de
antígeno (CPA). Con objeto de que los linfocitos T organicen con
éxito las respuestas inmunes mediadas por células o por anticuerpos
ante un estímulo antigénico, se requieren distintas señales de
activación desde las CPA. Se produce una señal específica para el
antígeno cuando el receptor antigénico de los linfocitos T se une
con los péptidos antigénicos presentados por las moléculas del
complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) en la superficie de las
CPA. Sin embargo, este evento aislado no es suficiente para
estimular la proliferación de los linfocitos T y, por sí mismo,
puede conducir a una inactivación clonal o a una anergia (Schwartz,
R. H. (1990) Science 248: 1349-1356).
Para que se produzca una respuesta inmune efectiva las CPA también
deben suministrar una segunda señal coestimuladora específica no
antigénica a los linfocitos T (Freeman y col., (J. Inmunol.
143(8): 2714-2722 (1989)).
El CTLA4 es un receptor de superficie de los
linfocitos T que se asocia con el contrarreceptor B7, a saber,
B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86),
expresados sobre las células presentadoras de antígeno (Hatchcock y
col., "Comparative Analysis of B7-1 and
B7-2 Co-Stimulatory Ligands:
Expression and Function" 1994 Journal of Experimental
Medicine, 180(2): 631-40). Esta
asociación establece la base molecular de una importante vía de
coestimulación para los linfocitos T, cuya función primaria es
inducir la producción y proliferación de citoquinas en los
linfocitos T tras la exposición al antígeno (Linsley y col., J.
Exp. Med. 173: 721-730 (1991)). Los datos de
confirmación han mostrado que una forma de realización del CTLA4, a
saber, el CTLA4Ig, es un potente inhibidor de respuestas inmunes
in vitro mediante la inhibición de las interacciones CD28/B7,
evitando así la proliferación de linfocitos T e induciendo una
falta de respuesta específica al antígeno (Blazar y col., "In
vivo Blockade of CD28/ CTLA4: B7/BB1 Interaction UIT
CTLA4-Ig Reduces Letal Murine
Graft-Versus-Host Disease Across the
Major Histocompatibilty Complex Barrier in Mice", Blood,
15 de junio de 1994, 83(12):3815-25).
La naturaleza de estas señales coestimuladoras ha
sido objeto de intensos esfuerzos de investigación, cuyos objetivos
no han sido únicamente comprender el sistema inmune, sino también
desarrollar agentes terapéuticos que pudieran inhibir el suministro
de señales coestimuladoras, manipulando así además las respuestas
inmunes. Las moléculas CTLA4 mutantes de la invención han sido
desarrolladas para lograr estos objetivos.
La presente invención describe moléculas CTLA4
que han sido mutadas con objeto de influir en su capacidad de unirse
a los ligandos B7. Estas mutaciones están localizadas en el dominio
extracelular del CTLA4. Específicamente, las mutaciones están
producidas en la posición de la primera fracción de tirosina dentro
del motivo MYPPPY del dominio extracelular del CTLA4. Demostramos
que los mutantes con fenilalanina o triptófano en esta posición
tienen la capacidad de unirse a B7-1 (CD80) pero no
se unen a B7-2 (CD86).
Adicionalmente, se proporcionan procedimientos
para elaborar y usar las moléculas CTLA4 mutantes de la
invención.
La Figura 1 es un gráfico que muestra la
alineación de la secuencia de los miembros de las familias CD28 y
CTLA4. Las secuencias de los CD28 humana (H), de ratón (M), de rata
(R) y de pollo (Ch) están alineadas con los CTLA4 humano y de
ratón. Los residuos están numerados desde el
N-terminal de la proteína madura, con los péptidos
de señalización y los dominios transmembrana subrayados y las
regiones análogas a CDR destacadas. Las zonas oscurecidas destacan
la completa conservación de los residuos, mientras que las zonas
aclaradas destacan las sustituciones conservativas de aminoácidos en
todos los miembros de la familia (SEQ ID N^{os}
1-6).
La Figura 2 es un gráfico lineal que muestra los
mutantes CTLA4Ig y CD28Ig unidos al B7-1.
La Figura 3 es un mapa esquemático de las
proteínas de fusión CTLA4/CD28Ig híbridas. Las zonas claras
representan la secuencia del CD28; las zonas oscuras representan la
secuencia del CTLA4; las zonas rayadas representan el comienzo de
la Fc de IgG (véase también la Tabla I).
La Figura 4 es un gráfico lineal que muestra que
las proteínas de fusión CTLA4/CD28Ig híbridas se unen con alta
afinidad a las células CHO B7-1.
La Figura 5 es un gráfico lineal que muestra que
las proteínas de fusión CTLA4/CD28Ig híbridas se unen con alta
afinidad a las células CHO B7-1.
La Figura 6 es un modelo molecular del dominio
extracelular monomérico del CTLA4Ig de tipo v.
La Figura 7 es un gráfico de barras comparativo
de la capacidad del CTLA4Ig natural (w. t.) y de las moléculas
mutantes de unirse a células CHO que expresan bien el CD80 o bien el
CD86. La molécula natural se denomina MYPPPY, la secuencia del
motivo que se produce de forma natural. Los mutantes individuales
se denominan del mismo modo. La letra símbolo de los aminoácidos
sustituidos en la segunda posición de este hexapéptido indica la
mutación específica.
La Figura 8 es una comparación entre la capacidad
de unión natural (w. t.) y mutante usando diferentes concentraciones
de estas proteínas de fusión CTLA4Ig. Según se describe en la Figura
7, los mutantes se indican mediante sus respectivas secuencias de
motivos.
La Figura 9 es un estudio de competencia de
anticuerpos con la línea celular LCL 816. Esta figura compara la
unión de la proteína CTLA4Ig natural y mutante al CD80 o al CD86 en
presencia de diferentes concentraciones de anticuerpos
anti-CD80 o anti-CD86. Según se
describe en la Figura 7, las proteínas específicas se indican
mediante sus respectivas secuencias de motivos.
Según se usan en esta solicitud, las siguientes
palabras o frases tienen los significados especificados.
Según se usa en la presente invención, una
"interacción de inhibición de B7" significa la interferencia en
la unión de los antígenos B7 con sus ligandos, tales como CD28 y/o
CTLA4, obstruyendo así la interacción entre los linfocitos T y
B.
Según se usa en la presente invención, una
"molécula unida a B7" significa cualquier molécula que se una
con uno cualquiera o ambos de los antígenos B7.
Según se usa en la presente invención, una
"molécula reactiva con el antígeno CD80" significa cualquier
molécula que reconozca y se una al CD80.
Según se usa en la presente invención, una
"molécula reactiva con el antígeno CD86" significa cualquier
molécula que reconozca y se una al CD86.
Según se usa en la presente invención, una
"molécula no CTLA4" significa cualquier molécula que puede
unirse o fijarse al dominio extracelular del CTLA4 y no interfiere
en la unión del CTLA4 con su objetivo. Estas moléculas incluyen una
etiqueta polipeptídica, una cola de inmunoglobulina (Ig), una
proteína biológica o químicamente activa, tal como el producto del
gen E7 del papilomavirus, el antígeno p97 asociado a melanoma y la
proteína de envoltura del VIH, o una secuencia de aminoácidos que
hace soluble y activa la porción extracelular del CTLA4 o formas
mutágenas de las mismas.
Con objeto de que la invención descrita en la
presente invención pueda comprenderse de una manera más completa, se
establece la siguiente descripción.
La invención proporciona moléculas CTLA4 mutantes
reactivas con el antígeno CD80, en las que en el dominio
extracelular del CTLA4, la primera tirosina del motivo aminoacídico
MYPPPY se ha sustituido por fenilalanina o triptófano. Las moléculas
CTLA4 mutantes pueden ser ejemplificadas de muchas formas, siendo la
única limitación que mantengan su capacidad de unirse al CD80.
En una realización de la invención, la molécula
CTLA4 mutante es una molécula CTLA4 mutante funcional y soluble. El
dominio extracelular del CTLA4 es un ejemplo de una molécula CTLA4
mutante soluble. En un ejemplo, la molécula CTLA4 mutante soluble se
une al antígeno CD80 pero no se une al antígeno CD86.
En otra realización de la invención, la molécula
CTLA4 mutante soluble tiene el dominio extracelular del CTLA4
mutágeno fijado a una molécula no CTLA4 (también denominadas
proteínas de fusión mutantes CTLA4), tal como una etiqueta
polipeptídica. Otras realizaciones de moléculas CTLA4 solubles
incluyen aquéllas que tienen el dominio extracelular del CTLA4
mutágeno fusionado o fijado a una porción de una proteína biológica
o químicamente activa, tal como el producto del gen E7 del
papilomavirus, el antígeno p97 asociado a melanoma y la proteína de
envoltura del VIH.
De acuerdo con la práctica de esta invención, las
moléculas CTLA4 mutantes y homólogas de la invención pueden tener
otras sustituciones de aminoácidos y conservar aún la propiedad
funcional de las moléculas CTLA4 mutantes, a saber, la molécula con
dichas sustituciones aún se unirá al antígeno CD80. Estas
sustituciones de aminoácidos incluyen, pero no se limitan
necesariamente, sustituciones de aminoácidos conocidas en la
materia como "conservadoras".
Por ejemplo, un principio bien establecido de la
química proteica es que ciertas sustituciones de aminoácidos,
denominadas "sustituciones conservativas de aminoácidos",
pueden realizarse frecuentemente en una proteína sin alterar ni la
conformación ni la función de la proteína. Tales cambios incluyen la
sustitución de cualquier isoleucina (I), valina (V) y leucina (L)
por otro cualquiera de estos aminoácidos hidrófobos; ácido
aspártico (D) por ácido glutámico (E) y viceversa; glutamina (Q) por
asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y
viceversa. Otras sustituciones también pueden considerarse
conservadoras, dependiendo del entorno del aminoácido en particular
y de su papel en la estructura tridimensional de la proteína. Por
ejemplo, glicina (G) y alanina (A) pueden ser frecuentemente
intercambiables, así como alanina y valina (V).
La metionina (M), que es relativamente hidrófoba,
puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina, y a
veces con valina. Lisina (K) y arginina (R) son frecuentemente
intercambiables en localizaciones en las que la característica
significativa del residuo de aminoácido es su carga, y los
diferentes pK de estos dos residuos de aminoácidos no son
significativos. Aún pueden considerarse "conservadores" otros
cambios en entornos particulares.
Las técnicas para la clonación y la expresión de
las secuencias de ADN que codifican para las secuencias de
aminoácidos correspondientes a las moléculas CTLA4 mutantes, por
ejemplo, síntesis de oligonucleótidos, PCR, células transformantes,
construcción de vectores, sistemas de expresión y similares, están
bien establecidas en la materia, y la mayoría de los practicantes
están familiarizados con los materiales fuente estándar para
condiciones y procedimientos específicos. Sin embargo, se
proporcionan los siguientes párrafos por conveniencia y explicación
de las modificaciones de las técnicas estándar donde sea necesario,
y puede servir como directriz.
Se prepararon constructos correspondientes a
moléculas CTLA4 mutantes de la presente invención según describen
Linsley y col., J. Exp. Med. 173: 721-730
(1991), incorporado como referencia en la presente invención.
Alternativamente, pueden prepararse clones de ADNc a partir del ARN
obtenido a partir de células que expresen el antígeno B7 y el
receptor CD28, sobre la base del conocimiento de las secuencias
publicadas para estas proteínas (Aruffo y Seed, Proc. Natl.
Acad. Sci. 84: 8573-8577 (1987), y Freeman y
col., "Murine B7-2, an Alternative CTLA4
Counter-Receptor that Co-Stimulates
T-cell Proliferation and Interleukin 2
Production" (1993), Journal of Experimental Medicine
178(6): 2185-92) usando procedimientos
estándar.
Las moléculas CTLA4 mutantes formadas por
secuencias de ADN que codifican para aminoácidos correspondientes al
dominio extracelular de CTLA4 mutágeno y a las regiones bisagra, CH2
y CH3 de la IgC\gamma1 humana, se construyeron mediante unión de
los fragmentos de la PCR. El ADNc que codifica las secuencias de
aminoácidos se amplifica usando la técnica de la reacción en cadena
de la polimerasa ("PCR") (patentes de EE.UU. n^{os} 4.683.195
y 4.683.202 de Mullis y col., y Mullis & Faloona, Methods
Enzymol. 154: 335-350 (1987)). Los polipéptidos
de fusión CTLA4Ig mutantes se obtuvieron con un ADN que codifica
secuencias de aminoácidos desde aproximadamente la posición 1 hasta
aproximadamente la posición 125 del dominio extracelular del CTLA4 y
correspondiente a las regiones bisagra, CH2 y CH3 de la
IgC\gamma1.
El ADNc de la PCR, realizado a partir del ARN
celular total de varias líneas celulares de leucemia humana, se
cribó usando como cebadores oligonucleótidos a partir de la
secuencia publicada del gen CTLA4 (Dariavach y col., supra).
Del ADNc ensayado, las células H38 (una línea de leucemia asociada
al HTLV-II) proporcionaron el mejor rendimiento de
productos en la PCR con el tamaño esperado. Dado que no se
identificó un péptido de señalización para CTLA4 en el gen CTLA4, el
N terminal de la secuencia predicha del CTLA4 se unió al péptido de
señalización de la oncostatina M (Malik y col., Molec. And Cell.
Biol. 9: 2847 (1989)) en dos etapas, usando oligonucleótidos.
El producto de la reacción de la PCR se unió con el ADNc que
codifica las secuencias de aminoácidos correspondientes a las
regiones bisagra, CH2 y CH3 de la IgC\gamma1, en un vector de
expresión, tal como CDM8 o \piLN.
Para obtener un ADN que codifique el CTLA4 humano
completo, se obtuvo, mediante PCR, un ADNc que codifica para los
dominios transmembrana y citoplasmático del CTLA4, a partir de
células H38, y se unió a un fragmento obtenido a partir de CTLA4Ig
según se describió anteriormente, que codifica para el péptido de
señalización de la oncostatina M unido al N terminal del CTLA4,
usando cebadores oligonucleótidos según se describe en los Ejemplos,
infra. Los fragmentos de la PCR se unieron dentro del
plásmido CDM8, dando como resultado un plásmido de expresión que
codifica para el gen completo del CTLA4, y denominado OMCTLA4.
Para producir mutaciones en regiones específicas
de la secuencia CTLA4 se realizó una mutagénesis dirigida sobre el
vector \piLN, que contenía la forma quimérica soluble de CTLA4
(CTLA4Ig) en la que el dominio extracelular del CTLA4 estaba unido
genéticamente con las regiones bisagra y constante de una cadena
pesada de una IgG humana (Linsley y col., J. Exp. Med. 173:
721-730 (1991)). Los mutantes CTLA4Ig dirigidos se
prepararon codificando la mutación deseada en cebadores
oligonucleótidos imbricados y produciendo los mutantes mediante PCR
(Ho y col., 1989, supra) usando el plásmido constructo
\piLN CTLA4Ig como molde.
Con objeto de producir series globales de
mutantes que se dirigieron al dominio extracelular, se cambió el
codón de la primera tirosina en el motivo MYPPPY, con objeto de
producir nuevos codones que codificasen cada uno de los otros
diecinueve aminoácidos. Dado que este motivo parece ser crucial para
las interacciones CTLA4-ligando B7, todas las
moléculas de CTLA4 que contienen estas mutaciones tendrán una
capacidad alterada para unirse a los antígenos B7.
Para producir grandes cantidades de ADN clonado,
los vectores que contenían el ADN del CTLA4 mutante de la invención
se transformaron en células hospedadoras adecuadas, tales como la
línea celular bacteriana de la cepa MC1061/p3 de E. coli
(Invitrogen Corp., San Diego, CA) usando procedimientos estándar, y
las colonias se criban para encontrar los plásmidos adecuados.
Los clones que contienen el ADN del CTLA4 mutante
obtenidos según se describe anteriormente se transfectaron entonces
en células hospedadoras adecuadas para su expresión. Dependiendo de
la célula hospedadora usada, la trasfección se realiza usando
técnicas estándar adecuadas para dichas células. Por ejemplo, la
transfección en células de mamífero se consigue usando transfección
mediada por DEAE-dextrano, coprecipitación en
CaPO_{4}, lipofección, electroporación o fusión de protoplastos,
y otros procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo: fusión
de lisozima o fusión de eritrocito, raspadura, captación directa,
choque osmótico o de sacarosa, microinyección directa,
microinyección indirecta, tal como mediante técnicas mediadas por
eritrocitos, y/o sometiendo a las células hospedadoras a corrientes
eléctricas. La anterior lista de técnicas de transfección no se
considera exhaustiva, dado que sin duda se desarrollarán otros
procedimientos para introducir información genética en células.
Se prefiere la expresión en cultivos de células
hospedadoras eucariotas procedentes de organismos pluricelulares
(Tissue Cultures, Academic Press, Cruz y Patterson, Eds.
(1973)). Estos sistemas tienen la ventaja adicional de la capacidad
de empalmar intrones, y así pueden usarse directamente para expresar
fragmentos genómicos. Algunas líneas celulares hospedadoras útiles
incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), de riñón de mono
(COS), VERO y HeLa. En la presente invención, son preferibles las
líneas celulares que expresan de forma estable los constructos de
fusión.
Los vectores de expresión para dichas células
incluyen generalmente secuencias promotoras y de control compatibles
con células de mamíferos, tales como, por ejemplo, el promotor CMV
(vector CDM8) y el virus del sarcoma aviar (ASV) (vector \piLN).
Otros promotores tempranos y tardíos usados habitualmente incluyen
los del virus 40 de simios (SV 40) (Fiers y col., Nature
273: 113 (1973)), u otros promotores víricos, tales como los
procedentes del polioma, del adenovirus 2 y del virus del papiloma
bovino. También puede usarse el promotor controlable hMTII (Karin y
col., Nature 299: 797-802 (1982)). Los
aspectos generales de las transformaciones de los sistemas de
hospedadores celulares mamíferos han sido descritos por Axel
(patente de EE.UU. nº 4.399.216, concedida el 16 de agosto de
1983). Ahora parece que las regiones "incrementadoras" son
importantes para optimizar la expresión; estas son generalmente
secuencias que se encuentran secuencia arriba o secuencia debajo de
la región del promotor en regiones no codificantes de ADN. Los
orígenes de replicación pueden obtenerse, si se necesitan, a partir
de fuentes víricas. Sin embargo, la integración en el cromosoma es
un mecanismo habitual para la replicación del ADN en eucariotas.
Aunque las células hospedadoras preferibles para
la expresión de los constructos de fusión incluyen células
eucariotas tales como células COS o CHO, pueden usarse otros
microbios eucariotas como hospedadores. Las cepas de laboratorio de
Saccharomyces cerevisiae y levadura panadera son las más
usadas, aunque pueden usarse otras cepas tales como
Schizosaccharomyces pombe. Pueden usarse vectores que
empleen, por ejemplo, el origen de replicación 2 \mu de Broach,
Meth. Enz. 101: 307 (1983), u otros orígenes de replicación
compatibles con las levaduras (por ejemplo, Stinchcomb y col.,
Nature 282: 39 (1979)); Tschempe y col., Gene 10: 157
(1980); y Clarke y col., Meth. Enz. 101: 300 (1983)). Las
secuencias de control para los vectores de levaduras incluyen
promotores para la síntesis de enzimas glucolíticas (Hess y col.,
J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland y col.,
Biochemistry 17: 4900 (1978)). Algunos promotores adicionales
conocidos en la materia incluyen el promotor CMV proporcionado en
el vector CDM8 (Toyama y Okayama, FEBS 268:
217-221 (1990); el promotor para la
3-fosfogliceratocinasa (Hitzeman y col., J. Biol.
Chem. 255: 2073 (1980)), y aquellos para otras enzimas
glucolíticas. Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de
una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento,
son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el
isocitocromo C, la fosfatasa ácida, enzimas degradativas
relacionadas con el metabolismo del nitrógeno y enzimas
responsables de la utilización de maltosa y galactosa. También se
cree que son deseables secuencias de terminación en el extremo 3'
de las secuencias codificantes. Dichos terminadores se encuentran
en la región 3' no traducida subsiguiente a las secuencias
codificantes en genes derivados de levaduras.
Alternativamente, pueden usarse células
procariotas como hospedadores de expresión. Los procariotas están
representados más frecuentemente por cepas de E. coli; sin
embargo, también pueden usarse otras cepas microbianas. Las
secuencias procariotas de control usadas habitualmente que se
definen en la presente invención e incluyen promotores para la
iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto
con las secuencias del sitio de fijación de los ribosomas, incluyen
promotores tan comúnmente usados como los sistemas promotores de la
beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (lac)
(Chang y col., Nature 198: 1056 (1977)), el sistema promotor
del triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucleic Acid Res. 8:
4057 (1980)) y el promotor P_{L} derivado de lambda y el sitio de
fijación de los ribosomas del gen N (Shimatake y col.,
Nature 292: 128 (1981)).
Las secuencias de nucleótidos que codifican para
las moléculas CTLA4 mutantes pueden ser expresadas en una variedad
de sistemas, según se describe a continuación. El ADNc puede ser
cortado por las enzimas de restricción adecuadas y unido en
vectores de expresión procariotas o eucariotas adecuados para dicha
expresión. La expresión de las moléculas CTLA4 mutantes como
proteínas de fusión permite la formación de dímeros de estas
proteínas.
La expresión del receptor CTLA4 mutante de la
invención se consigue transfectando una línea celular, tal como las
células COS, y detectando la expresión mediante la unión de las
células de CTLA4 transfectadas a un ligando para el receptor de
CTLA4, por ejemplo, ensayando la unión de las células a la proteína
de fusión B7Ig. La expresión de la proteína de fusión CTLA4Ig
mutante de la invención se consigue transfectando una línea
celular, tal como las células COS, y detectando la expresión
ensayando la unión de las proteínas de fusión CTLA4Ig mutantes a las
células que expresan el ligando adecuado.
Las secuencias de los constructos resultantes se
confirman mediante secuenciación del ADN usando procedimientos
conocidos, por ejemplo, según describen Sanger y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU. 74: 5463 (1977), según describen
adicionalmente Messing y col., Nucleic Acid Res. 9: 309
(1981), o mediante el procedimiento de Maxam y col., Methods
Enzymol. 65: 499 (1980)).
Los fragmentos de ADN adecuados de las moléculas
CTLA4 mutantes y las proteínas asociadas o etiquetas (por ejemplo,
moléculas biológica o químicamente activas tales como ovoalbúmina,
p97, E7 y la envoltura gp120) pueden aislarse a partir del ADNc
mediante PCR ((patentes de EE.UU. n^{os} 4.683.195 y 4.683.202 de
Mullis y col. y Mullis & Faloona, Methods Enzymol. 154:
335-350 (1987)).
El ADN para las proteínas de fusión del CTLA4
puede prepararse uniendo el ADN del CTLA4 con el de varias proteínas
etiqueta. En ensayos ELISA y FACS, la unión y la expresión de las
moléculas CTLA4 mutantes solubles se detectaron usando anticuerpos
dirigidos contra la etiqueta, por ejemplo, ovoalbúmina, envoltura
gp120, HPV E7 y p97.
La secuencia de ADN del gen de la ovoalbúmina es
conocida (Schweers y col., J. Biol.. Chem. (1990) 265(13):
7590-5); la secuencia de ADN del oncogen del
papilomavirus E7 es conocida (Tindle y col., J. Gen. Vir. (1990)
71: 1347-54; la secuencia de ADN del antígeno
p97 asociado a melanoma es conocida (Kahn y col., J. Immunol.
(1991) 146(9): 3235-41); la secuencia de ADN
de la envoltura gp120 es conocida (Wain-Hobson y
col., "Nucleotide sequence of AIDS virus LAV", Cell (1985)
40: 9-17; Ratner y col., "Complete
nucleotide sequence of the AIDS virus HTLV3", Nature 313:
277-284 (1985)). Las identidad de los genes
resultantes para cada una de las moléculas solubles (es decir, las
proteínas de fusión) puede confirmarse mediante secuenciación del
ADN.
El ADNc de las proteínas de fusión puede ser
expresado tanto en líneas celulares de mamíferos (cos, transfección
DEAE-dextrano) como de insectos (transfección en
baculovirus) (Jones y col., Nature (1986) 523: 346). Los
sobrenadantes de las líneas celulares transfectadas se recogieron,
se ensayaron, y las proteínas de fusión se purificaron entonces
mediante cromatografía de afinidad.
El ADN que codifica para la secuencia de
aminoácidos correspondiente a los dominios extracelulares de CTLA4,
incluyendo los codones para una secuencia de señalización, tal como
la de la oncostatina M, en células capaces de un procesamiento
adecuado, se une con el ADN que codifica para la secuencia de
aminoácidos correspondiente al dominio Fc de una proteína dímera
natural. La purificación de los productos de estas proteínas de
fusión tras su secreción desde las células se facilita por tanto
usando anticuerpos reactivos con la porción
anti-inmunoglobulina de las proteínas de fusión.
Cuando se secreta al medio, el producto de las proteínas de fusión
se recupera usando técnicas de purificación de proteínas estándar,
por ejemplo, mediante su aplicación en columnas de proteína A.
Las proteínas CTLA4 que tienen sustituciones de
aminoácidos específicos en la posición de la primera tirosina del
motivo MYPPPY tienen capacidades de unión únicas. Los mutantes que
se producen por la sustitución de esta tirosina con fenilalanina o
con triptófano tienen la capacidad de discriminar entre los
antígenos B7. Específicamente, estas moléculas mutantes se unirán al
antígeno B7-1 (CD80) pero no al antígeno
B7-2 (CD86). Por lo tanto, estas moléculas mutantes
pueden usarse para distinguir entre estos dos antígenos. Además,
estos mutantes pueden usarse para afectar de forma diferente a los
procesos biológicos que están mediados por los diferentes antígenos
B7.
La molécula CTLA4 mutante y/o fragmentos de la
misma pueden usarse para reaccionar con células B7 positivas, tales
como los linfocitos B, para regular las respuestas inmunes mediadas
por las interacciones de los linfocitos T con las células positivas
del antígeno B7, o in vitro para perfilar leucocitos, de
forma que se definan las etapas de maduración de los linfocitos B
y/o las enfermedades relacionadas con los linfocitos B (Yokochi y
col., J. Immuno. 128(2): 823). La inmunotinción de
superficie de los leucocitos se consigue mediante tecnología de
inmunofluorescencia o procedimientos inmunoenzimáticos, pero también
son posibles otros medios de detección.
Las moléculas CTLA4 mutantes solubles y/o los
fragmentos y derivados de estas proteínas también pueden usarse para
reaccionar con células B7 positivas, incluyendo linfocitos B, para
regular las respuestas inmunes mediadas por linfocitos T
dependientes de respuestas de linfocitos B. El término
"fragmento", según se usa en la presente invención, significa
una porción de la secuencia de aminoácidos que codifica para la
proteína denominada "CTLA4", capaz de unirse al B7. Un
fragmento de la molécula CTLA4 mutante soluble que puede usarse es
un polipéptido con una secuencia de aminoácidos correspondiente a
alguna porción de la secuencia de aminoácidos correspondiente al
receptor CTLA4 usado para obtener la proteína CTLA4 soluble según se
describe en la presente invención.
En una realización, las moléculas CTLA4 mutantes
pueden ser introducidas en un vehículo farmacéutico adecuado in
vivo, es decir, administradas a un sujeto para el tratamiento
de estados patológicos tales como enfermedades del sistema inmune o
cáncer (Pearson y col., "Transplantation Tolerance Induced by
CTLA4-Ig" Transplantation, 27 de junio de
1994, 57(12): 1701-6; Bolling y col., "The
Effect of Combinations Cyclosporine and CTLA4-Ig
Therapy on Cardiac Allograft Survival", Journal of Surgical
Research, 1994, 57(1): 60-4).
Se espera que la introducción de moléculas CTLA4
mutantes in vivo dé como resultado una interferencia con las
interacciones de los linfocitos T con otras células, tales como los
linfocitos B, como resultado de la unión del ligando a células B7
positivas. El impedimento de las interacciones de los linfocitos T
normales puede dar como resultado una actividad disminuida de los
linfocitos T, por ejemplo, una disminución en la proliferación de
linfocitos T. Además, se espera que la administración de proteínas
de fusión mutantes in vivo dé como resultado una regulación
de los niveles in vivo de citocinas, incluyendo, pero no
limitándose a, interleucinas, por ejemplo, interleucina
("IL")-2, IL-3,
IL-4, IL-6, IL-8,
factores de crecimiento, incluyendo el factor de crecimiento tumoral
("TGF"), los factores estimulantes de colonias ("CSF"),
interferones ("IFN") y el factor de necrosis tumoral
("TNF"), para estimular los efectos deseados en un sujeto. Por
ejemplo, cuando la proteína de fusión se introduce in vivo,
puede inhibir la producción de citocinas, lo que contribuye al
crecimiento maligno de, por ejemplo, células tumorales. La proteína
de fusión también puede inhibir la proliferación de virus
dependientes de la activación de los linfocitos T, tales como el
virus que causa el SIDA, el HTLV1.
En algunas circunstancias, según se ha mencionado
anteriormente, el efecto de la administración de la molécula CTLA4
mutante o sus fragmentos in vivo es inhibidor, resultante de
la inhibición, por parte de la proteína de fusión, de la inducción
de CTLA4 y CD28 resultantes del contacto de los linfocitos
T/linfocitos B. Por ejemplo, la molécula CTLA4 mutante puede
inhibir la proliferación de los linfocitos T. La introducción de la
molécula CTLA4 mutante in vivo producirá, pues, efectos
sobre las respuestas inmunes mediadas tanto por linfocitos T como
por linfocitos B. La proteína de fusión puede administrarse también
a un sujeto en combinación con la introducción de citocinas u otros
reactivos terapéuticos.
En una realización adicional de la invención se
usan otros reactivos, incluyendo derivados reactivos con la molécula
CTLA4 mutante, para regular las interacciones de los linfocitos T.
Por ejemplo, pueden cribarse anticuerpos y/o fragmentos de
anticuerpos reactivos con el receptor CTLA4 para identificar
aquellos capaces de inhibir la unión de la molécula CTLA4 mutante al
antígeno B7-1. Los anticuerpos o los fragmentos de
anticuerpos, tales como los fragmentos Fab o F(ab')_{2},
pueden entonces usarse para reaccionar con los linfocitos T, por
ejemplo, para inhibir la proliferación de los linfocitos T.
En otra realización, la molécula CTLA4 mutante
puede usarse para identificar compuestos adicionales capaces de
regular la interacción entre CTLA4 o CD28 y los antígenos B7. Tales
compuestos pueden incluir pequeñas moléculas naturales que pueden
usarse para reaccionar con los linfocitos B y/o los linfocitos T.
Por ejemplo, pueden ensayarse caldos de fermentación para evaluar
la capacidad de inhibir las interacciones CTLA4/B7. Además, pueden
usarse los derivados de la proteína de fusión CTLA4Ig mutante, según
se describieron anteriormente, para regular la proliferación de
linfocitos T. Por ejemplo, los fragmentos o los derivados pueden
usarse para inhibir la proliferación de linfocitos T en la
enfermedad del injerto contra el hospedador que acompaña a los
alotransplantes de médula ósea.
La vía de proliferación de linfocitos T mediada
por CD28 es resistente a la ciclosporina, en contraste con la
proliferación conducida por el complejo receptor celular CD3/Ti
(June y col., Mol. Cell. Biol. 7: 4472-4481
(1987)). La ciclosporina es relativamente ineficaz como tratamiento
de la enfermedad del injerto contra el hospedador (Storb,
Blood 68: 119-125 (1986)). Se cree que la
enfermedad del injerto contra el hospedador está mediada por
linfocitos T que expresan el antígeno CD28 (Storb y Thomas,
Immunol. Rev. 88: 215-238 (1985)). Así, las
moléculas CTLA4 mutantes pueden ser útiles aisladamente o en
combinación con inmunosupresores, tales como la ciclosporina, para
inhibir la proliferación de linfocitos T en la enfermedad del
injerto contra el hospedador, y para tratar otros estados
patológicos tales como autoinmunidad, rechazo de transplantes,
enfermedades infecciosas y neoplasias.
Las moléculas CTLA4 mutantes descritas en la
presente invención puede formularse en una variedad de formas de
dosificación que incluyen, pero no se limitan a, disoluciones o
suspensiones líquidas, comprimidos, píldoras, polvos, supositorios,
microcápsulas o microvesículas poliméricas, liposomas y
disoluciones inyectables o infusibles. La forma preferible depende
del modo de administración y de la aplicación terapéutica.
El modo de administración más eficaz y el régimen
de dosificación de las moléculas de la presente invención depende de
la gravedad y el curso de la enfermedad, de la salud del sujeto y de
la respuesta al tratamiento y la valoración del médico tratante.
Consecuentemente, las dosis de las moléculas deberían ajustarse al
sujeto individual.
La interrelación entre las dosis para animales de
diversos tamaños y especies y para el hombre, basada en mg/m^{2}
de área superficial, la describe Freireich, E. J., y col.,
(Quantitative Comparison of Toxicity of Anticancer Agents in Mouse,
Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man. Cancer Chemother., Rep., 50, nº
4, 219-244, mayo de 1966).
Los ajustes en el régimen de dosificación deben
realizarse para optimizar la respuesta inhibitoria del crecimiento.
Las dosis pueden dividirse y administrarse diariamente, o puede
reducirse la dosis proporcionalmente dependiendo de la situación.
Por ejemplo, pueden administrarse diariamente varias dosis divididas
o puede reducirse la dosis proporcionalmente, según indique la
situación terapéutica específica.
De acuerdo con la práctica de la invención, una
cantidad eficaz para tratar un sujeto puede estar entre
aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del
sujeto. También, la cantidad eficaz puede ser una cantidad entre
aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del
sujeto.
Se espera que las moléculas CTLA4 mutantes de la
invención sean útiles in vivo como inhibidores de la
actividad de los linfocitos T sobre inhibidores no específicos tales
como la ciclosporina y los glucoesteroides.
El antígeno B7-1 (CD80) expresado
sobre linfocitos B activados y células de otras líneas celulares, y
el receptor de CTLA4 expresado sobre los linfocitos T, pueden unirse
directamente el uno con el otro, y esta interacción puede mediar la
interacción célula a célula. El antígeno B7-2 (CD86)
expresado sobre linfocitos B activados y células de otras líneas
celulares, y el receptor CD28 expresado sobre los linfocitos T,
pueden unirse directamente el uno con el otro, y esta interacción
puede mediar la interacción célula a célula. Aunque el
B7-1 tiene una mayor especificidad por CTLA4 y el
B7-2 tiene una mayor especificidad por CD28, hay
una cierta cantidad de reactividad cruzada entre estos ligandos
(Kuchroo y col., Cell, 80: 707-718
(1995)).
Las interacciones entre estos ligandos inducen
directamente la activación de las vías en los linfocitos T,
conduciendo a la producción de citocinas, la proliferación de
linfocitos T y la diferenciación de linfocitos B en células
productoras de inmunoglobulinas. La activación de linfocitos B que
se produce puede causar una expresión aumentada del antígeno B7 y
una estimulación adicional del CD28, conduciendo a un estado de
inflamación crónica, tal como en las enfermedades autoinmunes, el
rechazo de aloinjertos, la enfermedad del injerto contra el
hospedador o reacciones alérgicas crónicas. La inhibición de esta
reacción puede ser eficaz para evitar la producción de citocinas en
los linfocitos T, y evitar o revertir así reacciones
inflamatorias.
Previamente se ha mostrado que las moléculas
CTLA4 solubles son un potente inhibidor de las funciones de los
linfocitos in vitro, requiriendo la interacción entre los
linfocitos T y B (véanse los documentos
EP-A-0 682 039 y US 609 914). Esto
indica la importancia de las interacciones entre los antígenos B7 y
sus contrarreceptores, CTLA4 y/o CD28.
Datos recientes sugieren que las moléculas
B7-1 y B7-2 activan de forma
diferente distintos subconjuntos de linfocitos T. Específicamente,
estos antígenos están relacionados con la diferenciación de los
linfocitos CD4 T cooperadores, que tras su estimulación se
diferencian en dos subpoblaciones distintas (denominadas Th1 y Th2),
produciendo cada una su propio conjunto de citocinas y mediando
funciones efectoras diferentes. Significativamente, estos diferentes
subconjuntos parecen jugar papeles específicos en numerosas
patologías clínicas (Cohen, J. Science 262, 175-176
(1993)) y Simon y col., P.N.A.S. 91, 8562-8566
(1994)). Influenciando las funciones efectoras de estos subconjuntos
de linfocitos T, las moléculas CTLA4 mutantes pueden evitar o
revertir estos tipos de patologías.
En condiciones en las que las interacciones
linfocitos T/linfocitos B se producen como resultado del contacto
entre linfocitos T y linfocitos B, la unión de las moléculas CTLA4
mutantes introducidas para reaccionar con las células antígeno B7
positivas, por ejemplo, linfocitos B, puede interferir, es decir,
inhibir las interacciones linfocitos T/ linfocitos B, dando como
resultado una regulación de las respuestas inmunes. Debido a este
exclusivo efecto inhibidor, se espera que las moléculas CTLA4
mutantes sean útiles in vivo como inhibidores de la
actividad de los linfocitos T sobre inhibidores no específicos tales
como la ciclosporina y los glucoesteroides.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar la presente invención y para ayudar al experto habitual a
elaborar y usar la misma. Los ejemplos no pretenden en modo alguno
limitar, por lo demás, el alcance de la invención.
Mediante mutagénesis específica y homóloga, hemos
identificado regiones en CTLA4Ig que son necesarias para su alta
afinidad de unión al B7-1. La siguiente es una
descripción de cómo elaborar proteínas de fusión híbridas CTLA4/CD28
solubles que se unen al B7.
Anticuerpos monoclonales (AcMc). Se
prepararon y caracterizaron AcMc murinos específicos para CTLA4
según se describió previamente (Linsley y col., J. Ex. Med., (1992)
176: 1595-1604). El anticuerpo 9.3
(anti-CD28) se ha descrito previamente (Hansen y
col., Immunogenetics 10: 247-260 (1980)).
Cultivo celular. La preparación de células
CHO B7-1 positivas transfectadas de forma estable se
ha descrito previamente (Linsley y col., en J. Exp. Med.
173: 721-730 (1991); P. S. Linsley y col., J. Exp.
Med. 174: 561
(1991)).
(1991)).
Las células fueron mantenidas en DMEM
complementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%, prolina 0,2 mM y
metotrexato 1 \muM. Las células COS se hicieron crecer en DMEM
complementado con SBF al 10%. El CTLA4Ig se preparó en células CHO
según se describió previamente (Ejemplo 2 del documento de EE.UU.
con nº de serie 08/228.208, publicado con el documento
EP-A-0 682 039).
Plásmidos de expresión mutantes dirigidos
CTLA4Ig y CD28Ig. La mutagénesis dirigida se realizó en un
vector que codificaba una forma quimérica soluble del CTLA4
(CTLA4Ig) en la que el dominio extracelular del CTLA4 estaba unido
genéticamente a las regiones bisagra y constante de una cadena
pesada de una IgG humana (Linsley y col., J. Exp. Med. 173:
721-730 (1991)). Los mutantes CTLA4Ig dirigidos se
prepararon codificando la mutación deseada en cebadores
oligonucléotidos imbricados y produciendo los mutantes mediante PCR
(Ho y col., 1989, supra.) usando el plásmido constructo
CTLA4Ig como molde.
Se prepararon seis mutantes que codificaban
sustituciones de alanina en el hexapéptido altamente conservado
98MYPPPY103 formando parte del dominio putativo de tipo CDR3 (Figura
1) (Ho y col., 1989, supra.). Estos mutantes se describen en
la Tabla II. Además, también se prepararon dos mutantes que
codificaban los residuos P103A e Y104A (MYPPAY (SEQ ID Nº 7) y
MYPPPA (SEQ ID Nº 8), respectivamente) a partir del hexapéptido
99MYPPPY104 del CD28Ig, usando el CD28Ig como molde, mediante el
mismo procedimiento. Estos mutantes también se describen en la Tabla
II.
Los cebadores requeridos para las reacciones de
PCR, pero no para introducir las mutaciones, incluyeron (1) un
cebador hacia delante CDM8 (CDM8FP) que codifica una secuencia
complementaria secuencia más arriba del sitio de restricción HindIII
en el extremo 5' de la región de relleno del CDM8, y (2) un cebador
inverso (CDM8RP) que codifica una secuencia complementaria secuencia
abajo del sitio XbaI en el extremo 3' de la región de relleno del
CDM8.
Estos cebadores codificaban para las siguientes
secuencias:
CDM8FP: 5'-AATACGACTCACTATAGG
(SEQ ID Nº 9)
CDM8RP: 5'-CACCACACTGTATTAACC
(SEQ ID Nº 10)
Las condiciones de la PCR consistieron en 6 min a
94ºC seguido de 25 ciclos de 1 min a 94ºC, 2 min a 55ºC y 3 min a
72ºC. Se usaron la polimerasa Taq y las condiciones de reacción
sugeridas por el proveedor (Perkin Elmer Cetus, Emeryville, CA). Los
productos de la PCR se digirieron con HindIII y XbaI y se unieron
al vector de expresión HindIII/XbaI-cut CDM8.
Para confirmar que se habían insertado las
mutaciones deseadas y para verificar la ausencia de mutaciones
secundarias, cada proteína de fusión CTLA4Ig mutante (un ejemplo de
una proteína de fusión mutante CTLA4 soluble) se secuenció mediante
la reacción didesoxi de terminación/extensión de la cadena con
reactivos Sequenasa usados según las recomendaciones del fabricante
(United States Biochemical Corp., Cleveland, OH).
Los plásmidos se transfectaron en células COS
(Aruffo y col., Cell 61: 1303 (1990)) y se usó medio
condicionado como fuente para las proteínas de fusión Ig mutantes
resultantes.
Plásmidos de expresión híbridos
CTLA4/CD28Ig. Se prepararon plásmidos de cribado híbridos
CTLA4/CD28Ig que codificaban para los constructos HS2, HS4,
HS4-A, HS4-B y HS5 (Figura 3 y Tabla
I) mediante PCR usando cebadores oligonucleótidos imbricados
diseñados para introducir las secuencias del CTLA4 en CD28Ig y al
mismo tiempo eliminar la región equivalente del CD28. También se
usaron los mismos cebadores CDM8 para PCR hacia delante e inverso
descritos anteriormente.
La siguiente es una lista de las proteínas de
fusión CTLA4/CD28 híbridas que se elaboraron.
| Denominación | Esqueleto | Modificaciones |
| HS1 | CDTLA4 | 1-24 DE CD28 |
| 97-125 DE CD28 | ||
| HS2 | CD28 | 1-22 DE CTLA4 |
| 96-125 DE CTLA4 | ||
| HS3 | CDTLA4 | 96-125 DE CD28 |
| HS4 | CD28 | 96-123 DE CTLA4 |
| HS4A | CD28 | 96-113 DE CTLA4 |
| HS4B | CD28 | 114-123 DE CTLA4 |
| HS5 | CD28 | 25-32 DE CTLA4 |
| HS6 | CDTLA4 | 25-32 DE CD28 |
| HS7 | CD28 | 96-123 DE CTLA4 |
| 25-32 DE CTLA4 |
(Continuación)
| Denominación | Esqueleto | Modificaciones |
| HS8 | CD28 | 25-32 DE CTLA4 |
| 96-113 DE CTLA4 | ||
| HS9 | CD28 | 25-32 DE CTLA4 |
| 114-123 DE CTLA4 | ||
| HS10 | CD28 | 96-123 DE CTLA4 |
| 51-58 DE CTLA4 | ||
| HS11 | CD28 | 25-32 DE CTLA4 |
| 51-58 DE CTLA4 | ||
| 96-123 DE CTLA4 | ||
| HS12 | CD28 | 51-58 DE CTLA4 |
| 96-113 DE CTLA4 | ||
| HS13 | CD28 | 25-32 DE CTLA4 |
| 51-58 DE CTLA4 | ||
| 96-113 DE CTLA4 | ||
| HS14 | CD28 | 51-58 DE CTLA4 |
Cada constructo de ADNc estaba relacionado
genéticamente con el ADNc que codifica para las regiones bisagra y
constante de una IgG1 humana, con objeto de elaborar quimeras
solubles.
Se preparó un híbrido HS6 de una forma similar a
la descrita anteriormente, salvo porque la región del tipo CDR1 del
CTLA4Ig se sustituyó por la región equivalente del CD28Ig.
Se prepararon los constructos HS7, HS8 y HS9
sustituyendo un fragmento 5' de 350 pares de bases HindIII/HpaI del
HS4, HS4-A y HS4-B, respectivamente,
por el fragmento equivalente de ADNc digerido de forma similar a
partir del HS5, introduciendo así el bucle de tipo CDR1 del CTLA4 en
estos híbridos que ya contenían la región del CTLA4 del tipo
CDR3.
Los constructos HS10-HS13 son
mutantes de dominio homólogo que se prepararon introduciendo el
bucle de tipo CDR2 del CTLA4Ig en mutantes homólogos previamente
construidos. Esto se realizó imbricando la mutagénesis por PCR,
mediante la cual se diseñaron cebadores para introducir las
secuencias del CTLA4 de tipo CDR2 en moldes homólogos, eliminando al
mismo tiempo de la molécula la región equivalente del CD28 del tipo
CDR2.
Consecuentemente, el HS4 sirvió como molde para
elaborar el HS10; el HS7 sirvió como molde para elaborar el HS11; el
HS4-A sirvió como molde para elaborar el HS12; y el
HS8 sirvió como molde para elaborar el HS13 (Figura 3 y Tabla I).
También se usaron en estas construcciones los cebadores CDM8
descritos anteriormente.
El constructo híbrido HS14 se preparó
sustituyendo el bucle de tipo CDR2 del CD28 por el bucle equivalente
de CTLA4Ig (Figura 3 y Tabla I).
En la mutagénesis de imbricación por PCR,
idéntica a la descrita para otros mutantes, se usaron cebadores
oligonucleótidos diseñados para introducir estos cambios.
Se realizaron reacciones de PCR y de subclonación
en CDM8 según se describió anteriormente. De nuevo, todos los
mutantes fueron secuenciados mediante la reacción didesoxi de
terminación/extensión de la cadena.
Los plásmidos que codificaban para cada uno de
los mutantes fueron transfectados a células COS, y las proteínas de
fusión Ig solubles resultantes se cuantificaron en medio de cultivo
y se visualizaron mediante inmunotransferencia Western, según se
describe en las secciones siguientes.
Cuantificación de las proteínas de fusión Ig
resultantes en medio de cultivo. Las proteínas de fusión
mutantes solubles se cuantificaron en un enzimoinmunoensayo mediante
la determinación de la cantidad de Ig presente en medio de cultivo
de células COS sin suero.
Se recubrieron las placas de microtitulación
(Immulon2; Dynatech Labs., Chantilly, VA) con 0,5 \mug/ml de
anti-IgG humana de cabra (Jackson Immunoresearch
Labs., West Chester, PA) durante 16-24 h a 4ºC. Los
pocillos se inhibieron durante 1 h con diluyente de muestra (Genetic
Systems, Seattle, WA) y después se lavaron con PBS que contenía un
0,05% de Tween 20 (PBS-Tw).
Se añadió el medio de cultivo de células COS que
contenía las proteínas de fusión a varias diluciones, y se incubó
durante 1 h a 22ºC. También se añadieron concentraciones conocidas
de CTLA4Ig en pocillos diferentes de cada microplaca para obtener
una curva estándar.
Tras el lavado, se añadió
anti-IgG humana de cabra conjugada con peroxidasa de
rábano picante (HRP) (Tago, Burlingame, CA) diluida a 1:12.000, y se
incubó durante 1 h a 22ºC. Entonces los pocillos se lavaron y se
incubaron con sustrato de
3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Genetic
Systems) durante 15 min antes de detener la reacción mediante la
adición de H_{2}SO_{4} 1N. Se midió la densidad óptica a dos
longitudes de onda, 450 y 630 nm, con un lector de microplacas
(Genetic Systems).
Se determinó la concentración de la proteína de
fusión Ig mutante por comparación con una curva estándar de
concentraciones conocidas de CTLA4Ig.
Análisis por inmunoprecipitación e
inmunotransferencia Western. Las proteínas de fusión
CTLA4/CD28Ig híbridas presentes en el medio de cultivo fueron
adsorbidas sobre Sepharosa-A de proteínas mediante
incubación hasta el día siguiente a 4ºC. Las bolitas se lavaron con
PBS que contenía un 0,1% de Nonidet-P40 (NP40), y
después se añadió tampón de muestra de SDS-PAGE y la
proteína eludía se cargó en un gel de
poliacrilamida-SDS.
Se realizó una inmunotransferencia Western de la
proteína sobre nitrocelulosa mediante procedimientos estándar.
Entonces las membranas de nitrocelulosa se inhibieron con PBS que
contenía un 0,1% de NP40 y un 1% de leche en polvo desnatada
seca.
Tras el lavado con PBS-Tw, las
membranas se incubaron con anti-IgG humana de cabra
conjugada con fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim, Indianápolis,
IN) diluida a 1:1.000 y se incubaron durante 1 h a 22ºC. Entonces se
lavaron los transferidos y se revelaron usando procedimientos
estándar.
Enzimoinmunoensayo de las células CHO B7
positivas. Mediante un enzimoinmunoensayo se determinó la
capacidad de las proteínas de fusión CTLA4Ig mutantes y de las
proteínas de fusión CTLA4/CD28Ig híbridas de unirse al
B7-1 expresado de forma estable en células CHO.
Se sembraron placas de microtitulación de 96
pocillos de fondo redondo tratadas con cultivo tisular (Corning,
Corning, NY) con células CHO B7 positivas a 10^{3}
células/pocillo. Dos días después, las células confluentes se
fijaron en etanol al 95% durante 15 min.
Tras lavar con PBS-Tw se
añadieron las proteínas de fusión Ig mutantes a varias
concentraciones, y se incubaron durante 1 h a 4ºC. Tras el lavado,
se añadió anti-IgG humana de cabra conjugada con HRP
(Tago) diluida a 1:10.000, y se incubó durante 1 h a 22ºC.
Entonces se lavaron los pocillos y se añadió
sustrato TMB como antes, y se dejó reaccionar durante 30 min antes
de detener la reacción con H_{2}SO_{4} 1N.
La absorbancia de los pocillos se midió a 450
nm.
Ensayo de unión de la proteína de fusión
CD28Ig mutante dirigida. Se ensayó la capacidad de unión de las
proteínas de fusión CD28Ig mutantes dirigidas al
B7-1 mediante un enzimoinmunoensayo indirecto.
Los pocillos de las placas ELISA se recubrieron
con una proteína de fusión quimérica que contenía el dominio
extracelular del B7-1 humano unido a la región Fc de
la IgG1 de ratón, a 5 \mug/ml durante 16 h a 4ºC. Los pocillos se
inhibieron durante 1 h con diluyente de muestra (Genetic Systems) y
después se lavaron con PBS-Tw. Se añadieron medios
de cultivo COS que contenían concentraciones conocidas de proteína
de fusión mutante, a varias concentraciones, y se incubaron durante
1 h a 22ºC.
También se añadieron concentraciones conocidas de
CD28Ig a pocillos diferentes de cada placa. Tras el lavado, se
añadió anti-IgG humana de cabra conjugada con HRP
(Tago) diluida a 1:10.000, y se incubaron durante 1 h a 22ºC. Se
añadió sustrato TMB y se leyeron las densidades ópticas según se
describió para la cuantificación de proteínas de fusión Ig en medios
de cultivo.
Unión de AcMc a proteínas de fusión Ig. Se
evaluó la capacidad de los AcMc anti- CTLA4 y de los AcMc
anti-CD28 9.3 de unirse a las proteínas de fusión
CTLA4/CD28Ig híbridas y a las proteínas de fusión CTLA4Ig mutantes
mediante un enzimoinmunoensayo.
Se recubrieron microplacas de titulación (Immulon
2) con 0,5 \mug/ml de anti-IgG humana de cabra
(Jackson) durante 16-24 h a 4ºC. Las placas se
inhibieron durante 1 h con diluyente de muestra (Genetic Systems),
se lavaron con PBS-Tw y después se incubaron con las
proteínas de fusión Ig durante 1 h a 22ºC. Tras el lavado, los
pocillos se incubaron con AcMc a 1 \mug/ml durante 1 h a 22ºC.
Tras un lavado adicional, se añadió
anti-Ig humana de cabra conjugada con HRP (Tago)
diluida a 1:10.000, y se incubaron durante 1 h a 22ºC. Se añadió
sustrato TMB y se midió la densidad óptica según se describió
anteriormente.
Modelo molecular del CTLA4. Se generó un
modelo tridimensional aproximado del dominio extracelular del CTLA4
basado en la conservación de los residuos consensuados de los
dominios de IGSF del tipo variable.
Usando dichos residuos consensuados de IGSF como
"puntos de anclaje" para la alineación de secuencias, los
residuos del CTLA4 se asignaron a las hebras A, B, C, C', C'', D,
E, F, G de un pliegue variable de Ig (Williams/Barclay, 1988,
supra.) y de las regiones conectoras en bucle (Figura 6).
El modelo del CTLA4 se construyó (InsightII,
Discover, Molecular Modeling and Mechanics Programs,
respectivamente, Biosym Technologies, Inc., San Diego, CA) usando la
cadena pesada variable de HyHEL-5 (Sheriff y col.,
1967 PNAS 84: 8075-8079) como estructura
molde. Las sustituciones de la cadena lateral y las conformaciones
en bucle se aproximaron usando una búsqueda conformacional
(Bruccoleri y col., 1988 335: 564-568).
Se ensayaron diversas versiones del modelo con
asignaciones modificadas de algunos de los residuos a hebras \beta
o bucles, usando análisis de perfil en 3D (Lüthy y col., 1992,
Nature 336: 83-85) con objeto de mejorar la
alineación inicial de la secuencia de la región extracelular del
CTLA4 con un pliegue variable de IGSF.
Construcción y actividad de unión de las
proteínas de fusión CTLA4Ig y CD28Ig mutantes. En la Figura 1 se
muestra una alineación de la secuencia de varios homólogos de CD28 y
CTLA4. En la Figura 1, las secuencias de CD28 humano (H), de ratón
(M), de rata (R) y de pollo (Ch) están alineadas con el CTLA4 humano
y de ratón. Los residuos están numerados desde el N terminal de la
proteína madura con los péptidos de señalización y los dominios
transmembrana subrayados, y las regiones análogas al CDR anotadas.
Las zonas oscurecidas destacan la completa conservación de los
residuos, mientras que las zonas aclaradas destacan las
sustituciones conservadoras de aminoácidos en todos los miembros de
la familia.
Las regiones de conservación de la secuencia
están dispersas a lo largo de los dominios extracelulares de estas
proteínas, siendo la conservación más rigurosa la observada en el
hexapéptido MYPPPY (SEQ ID Nº 11), motivo localizado en el bucle de
tipo CDR3 tanto de CTLA4 como de CD28 (Figura 1). Esto sugiere un
papel probable de esta región en la interacción con un antígeno B7,
por ejemplo, B7-1 y B7-2.
Para ensayar esta posibilidad, se introdujeron
mutaciones dirigidas por cribado de alanina en esta región del
CTLA4Ig usando mutagénesis dirigida por cebadores oligonucleótidos
de PCR, dando así como resultado proteínas de fusión CTLA4Ig
mutantes. De forma similar, se introdujeron dos mutaciones de
alanina en el motivo MYPPPY del CD28Ig, dando así como resultado
proteínas de fusión CD28Ig mutantes.
Todos los constructos de ADNc fueron secuenciados
para confirmar las mutaciones deseadas antes de la transfección a
células COS. Las concentraciones de proteínas de fusión Ig mutantes
en cultivos de células COS sin suero se determinaron mediante un
ensayo de cuantificación de Ig.
Entonces se determinó la capacidad de cada
proteína de fusión CTLA4Ig mutante de unirse al B7-1
expresado en células CHO transfectadas de forma estable, mediante un
inmunoensayo de unión celular indirecto. La unión de las proteínas
de fusión CD28Ig mutantes al B7-1 se evaluó mediante
un enzimoinmunoensayo indirecto. Cada uno de estos ensayos se
describen en Materiales y Procedimientos.
La mutagénesis de cada residuo del motivo MYPPPY
del CTLA4Ig a Ala tuvo un profundo efecto sobre la unión al
B7-1, según se muestra en la Figura 2. La Figura 2
muestra que las mutaciones en el motivo MYPPPY de CTLA4Ig y CD28Ig
alteran la unión al B7-1. Las proteínas de fusión Ig
mutantes dirigidas se produjeron en células COS transfectadas
temporalmente, se cuantificaron y se ensayaron para evaluar su
capacidad de unirse al B7-1.
En la Figura 2, las cuantificaciones de la
proteínas de fusión se repitieron al menos dos veces con
determinaciones por duplicado. Específicamente, la Figura 2 muestra
que los mutantes CTLA4Ig se unen a células CHO transfectadas de
forma estable, fijadas en etanol, B7-1 positivas,
crecidas hasta confluir en placas de cultivo de tejido ELISA. Los
datos de unión se expresan como la media de los pocillos por
duplicado, y son representativos de al menos dos experimentos.
Los mutantes Y99A y P101A se unen al
B7-1 pero con una capacidad considerablemente
reducida en relación con el CTLA4Ig natural. Por el contrario, los
mutantes M98A, P100A, P102A e Y103A mostraron una pérdida de unión
casi completa. Adicionalmente, los mutantes del MYPPPY de CD28Ig
P103A e Y104A no mostraron una unión detectable al
B7-1 inmovilizado en pocillos de placas ELISA
(Figura 2).
Las células CHO transfectadas con
B7-1 que se incubaron con proteínas de fusión
CTLA4Ig mutantes, etiquetaron con anti-FITC humana y
ensayaron usando un FACSCAN, mostrando resultados equivalentes.
Estos resultados muestran claramente un papel crítico del motivo
MYPPPY en la unión tanto de CTLA4Ig como de CD28Ig a
B7-1.
Caracterización de las proteínas de fusión
CTLA4/CD28Ig híbridas. Dado que el motivo MYPPPY es común tanto
a CTLA4Ig como a CD28Ig, por sí mismo no podía ser responsable de
las diferencias observadas en la unión al B7-1
apreciadas con CTLA4Ig y CD28Ig. Se evaluó la contribución de
residuos no tan bien conservados a la unión de alta afinidad al
B7-1 usando una serie de mutantes homólogos.
Las tres regiones de tipo CDR de CD28 se
sustituyeron en varias combinaciones por regiones equivalentes del
dominio extracelular del CTLA4 (Figura 3 y Tabla I). La Figura 3 es
un mapa de las proteínas de fusión CTLA4/CD28Ig mutantes que muestra
el % de actividad de unión células CHO B7-1
positivas relativo al CTLA4Ig. Los residuos de cisteína conservados
(C) se muestran en las posiciones 22, 93 y 121, respectivamente
(numeración del CTLA4). También se muestra la posición del motivo
MYPPPY. Las zonas claras representan la secuencia del CD28; las
zonas oscuras representan la secuencia del CTLA4; las zonas
sombreadas representan el comienzo de la Fc de IgG (véase también la
Tabla I). El porcentaje de las actividades de unión se determinó
comparando las curvas de unión (Figuras 4/5) relativas a CTLA4Ig, y
hallando la concentración de mutante requerida para dar la misma
D.O. a la encontrada para CTLA4Ig. La proporción entre la
concentración de proteína mutante y de CTLA4Ig a una D.O. en
particular se expresó entonces como % de actividad de unión. Se
tomaron al menos dos lecturas A450 de la parte lineal de la curva de
unión de CTLA4Ig, y se determinó el % de actividad de unión
media.
Se prepararon un total de 14 constructos de ADNc
híbrido, se secuenciaron y se transfectaron a células COS. Se
determinaron las concentraciones de proteínas de fusión Ig en medios
de cultivo sin suero, y se compararon sus movilidades
electroforéticas mediante SDS-PAGE, incluyendo un
análisis por inmunotransferencia Western.
En condiciones reductoras, cada proteína
quimérica migró con una masa molecular relativa que variaba entre la
del CTLA4Ig (Mr-50 KDa) y la del CD28Ig
(Mr-70 KDa), dependiendo del tamaño de la región
intercambiada.
En condiciones no reductoras, las proteínas
migraron principalmente entre 100-140 KDa, indicando
que estas proteínas de fusión existían como dímeros unidos por
disulfuro, a pesar de la mutagénesis de los residuos de cisteína en
la región bisagra de Fc.
Dado que se cree que cuatro de los cinco residuos
de cisteína conservados en CTLA4 y CD28 están implicados en puentes
de disulfuro intracatenarios, la dimerización de las proteínas de
fusión fue por tanto más probablemente atribuible al quinto residuo
de cisteína conservado en la posición 121 de CTLA4 (posición 123 de
CD28).
Unión de las proteínas de fusión CTLA4/CD28Ig
híbridas al B7-1. Se ensayó la capacidad de las
proteínas de fusión híbridas de unirse al B7-1
mediante el mismo inmunoensayo de unión celular indirecto usado para
ensayar las proteínas de fusión CTLA4Ig y CD28Ig mutantes
específicas.
En estas condiciones, la unión entre CD28Ig y
B7-1 apenas es detectable (Figuras 4/5). Sin
embargo, la sustitución de los residuos 97 a 125 (la región
extendida de tipo CDR3) de CD28 por los correspondientes residuos de
CTLA4 dio como resultado un aumento de aproximadamente dos órdenes y
medio de magnitud en la unión del análogo de CD28Ig al
B7-1 (Figuras 4/5). Las Figuras 4/5 muestran que las
proteínas de fusión CTLA4/CD28Ig mutantes muestran una implicación
de las regiones análogas a CDR en la unión de alta afinidad a
células CHO B7-1. Los mutantes se ensayaron según se
describe en la figura 2. Los datos se expresan como la media de los
pocillos por duplicado, y son representativos de al menos tres
experimentos. A partir de estas curvas se determinó el % de
actividad de unión relativa al CTLA4Ig según se explica y muestra en
la Figura 3.
La unión al B7-1 de este
constructo, denominado HS4 (Figura 3), es aproximadamente cinco
veces menos que el CTLA4Ig natural. El híbrido HS2, que incluye
residuos N-terminal adicionales de CTLA4
(aminoácidos 1-22), no mejoró la capacidad de la
molécula híbrida de unirse el B7-1 relativa a
HS4.
El constructo HS6, que respresenta la secuencia
CTLA4Ig salvo porque contiene la región de tipo CDR1 de CD28
(residuos 25-32), se unió de forma similar. Sin
embargo, la inclusión adicional de la región de tipo CDR1 de CTLA4
(residuos 25-32) en el constructo HS4 (denominado
HS7) mostró una unión aún más mejorada, de forma que la afinidad de
unión es de aproximadamente el 44% de CTLA4Ig (Figura 3).
Por el contrario, la inclusión de la región de
tipo CDR2 de CTLA4 (residuos 51-58) en HS4
(constructo HS10) no aumentó más la unión (Figura 3). Se encontró un
resultado similar para el constructo HS11, que tenía las tres
secuencias de regiones de tipo CDR de CTLA4Ig incluidas en CD28Ig.
El híbrido HS5, que contenía sólo el dominio de tipo CDR1 de CTLA4,
se unió a un nivel muy bajo.
El híbrido CTLA4/CD28Ig HS4-A
codificaba los residuos de CTLA4Ig 96-113 en la
región C-terminal extendida de tipo CDR3; nueve
residuos derivados de CTLA4 menos que HS4 (Figura 3 y Tabla I). El
HS4-A se une a células CHO B7-1 peor
que el HS4 (Figuras 3 y 5). Sin embargo, la adición del bucle de
tipo CDR1 de CTLA4 (híbrido HS8) aumentó la unión a
B7-1 desde aproximadamente el 2% hasta casi el 60%
de la unión del tipo natural.
Por otro lado, la adición del bucle de tipo CDR2
de CTLA4 en HS4-A (HS12) no aumentó la unión
relativa a HS4-A; ni tampoco la adición de las tres
secuencias de regiones de tipo CDR de CTLA4Ig (HS13, Figura 3).
Otro híbrido, llamado HS4-B,
codificaba la región de tipo CDR3 de CD28, incluyendo el motivo
MYPPPY seguido de los residuos de CTLA4 114-122
(Tabla I y Figura 3).
Los HS4-B y HS4-A
mostraron una unión similar a B7-1. Sin embargo, al
contrario que HS4-A, la inclusión del bucle de tipo
CDR1 de CTLA4 en HS4-B (HS9) no mejoró la unión
(Figura 3), sugiriendo que los residuos inmediatamente adyacentes al
motivo MYPPPY de CTLA4Ig eran importantes determinantes de la unión
de alta afinidad.
Unión de anticuerpos monoclonales a proteínas
de fusión CTLA4/CD28Ig híbridas. Se examinó la integridad
estructural de cada proteína de fusión híbrida evaluando su
capacidad para unir AcMc específicos para CTLA4 ó CD28 en un
enzimoinmunoensayo. Los AcMc 7F8, 11D4 y 10A8, específicos para
CTLA4, inhibieron la unión del ligando (Linsley y col., (1992)
supra.).
Estos anticuerpos se unieron a cada una de las
proteínas de fusión CTLA4Ig mutantes excepto 11D4, que no pudo
unirse a P100A y P102A (Tabla II). Dado que 7F8 y 10A8 se unen a
estas mutantes, la ausencia de unión de 11D4 puede atribuirse
probablemente a una mutagénesis que altera el epítopo reconocido por
11D4.
Por el contrario, cada anticuerpo no pudo unirse
a ninguna de las proteínas de fusión híbridas cribadas homólogas
excepto 7F8, que se unió a HS6, y 11D4, que se unió débilmente a
HS8. Dado que muchas de estas proteínas de fusión híbridas homólogas
eran, hasta cierto punto, capaces de unirse a B7-1,
es probable que la ausencia de unión por parte de los anticuerpos
fuera debida a una alteración de los epítopos conformacionales
formados por secuencias espacialmente adyacentes pero no
lineales.
El AcMc 9.3 específico para CD28 (Linsley y col.,
(1992) supra.) no pudo unirse a ninguna de las proteínas de
fusión CD28 mutantes dirigidas, pero se unió a las proteínas de
fusión híbridas HS4, HS4-A, HS7 y HS8. Se observó
una unión más débil con HS2. No se observó unión con los constructos
HS5 y HS6.
Modelo de CTLA4. La Figura 6 muestra una
representación esquemática del modelo de CTLA4. En la Figura 1 se
muestra la asignación de residuos de CTLA4 a regiones de tipo CDR.
El modelo de CTLA4 sugiere la presencia de un puente de disulfuro
adicional (no Ig) entre los residuos Cys49 y Cys67, que apoya la
similitud entre CTLA4 y el pliegue variable de Ig.
Los dos posibles sitios de glucosilación unidos
por N en el mapa de CTLA4 de posiciones expuestas disueltas de las
regiones del esqueleto de la hebra \beta de Ig. El análisis del
perfil en 3D indicó que la secuencia de CTLA4 es compatible en
conjunto con un pliegue en V de Ig, a pesar de estar más lejanamente
relacionados.
El residuo Val115 representa el último residuo
del dominio de tipo CTLA4Ig. La conformación de la región entre la
Val115 y la Cys121 próxima a la membrana, que se cree que forma el
homodímero de CTLA4, es altamente variable en la familia de CD28. La
imagen que surge es que los miembros de la familia de CD28 utilizan
principalmente residuos en dos o tres regiones de tipo CDR para
unirse al B7-1.
El motivo MYPPPY representa un armazón conservado
para la unión, que parece estar aumentado por su extensión
C-terminal y que está modulado específicamente por
la región altamente variable del tipo de tipo CDR1. Las regiones de
tipo CDR3 y CDR1 son espacialmente contiguas en pliegues variables
de Ig. La región de tipo CDR2 está espacialmente distante y no
contribuye significativamente, en el caso de la familia de CD28, a
la unión al B7-1.
Mediante mutagénesis específica hemos
identificado una posición de aminoácido en CTLA4 que juega un papel
crucial en la capacidad de esta molécula de unirse tanto al CD80
como al CD86. Además, hemos identificado 2 sustituciones de
aminoácidos en esta posición que producen moléculas de CTLA4Ig
mutantes que tienen la capacidad de unirse al CD80 de una forma
similar a la molécula natural, pero que han perdido la capacidad de
unirse al CD86. La siguiente es una descripción de cómo elaborar
proteínas de fusión CTLA4 solubles que se unen al CD80 pero no al
CD86.
Anticuerpos monoclonales (AcMc). Los
anticuerpos monoclonales murinos específicos para CD80 y CD86 se han
descrito previamente (Kuchroo y col., Cell, vol. 80,
707-718, (1995)).
Cultivo celular. La preparación de células
CHO B7-1 positivas (CD80) transfectadas de forma
estable se ha descrito previamente (Linsley y col., en J. Exp.
Med. 173: 721-730 (1991); P. S. Linsley y col.,
J. Exp. Med. 174: 561 (1991)). La preparación de células
B7-2 transfectadas de forma estable (CD86) se ha
descrito previamente (Freeman y col., J. Exp. Med. 178: 2185
(1993); PCT WO95/06738). La preparación de células LCL se ha
descrito previamente (Wiss-Coray y col., en
European Journal of Immunology 23(12),
3350-3357 (1993)).
Las células fueron mantenidas en DMEM
complementado con suero bovino fetal (SBF) al 10%, prolina 0,2 mM y
metotrexato 1 \muM. Las células COS se hicieron crecer en DMEM
complementado con SBF al 10%. El CTLA4Ig se preparó en células CHO
según se describió previamente (véase la solicitud parental,
documento de EE.UU. con nº de serie 08/228.208, Ejemplo 2, y
documento EP-A-0 682 039).
Plásmidos de expresión mutantes dirigidos
CTLA4Ig. La mutagénesis dirigida se realizó en un vector que
codificaba una forma quimérica soluble del CTLA4 (CTLA4Ig) en la que
el dominio extracelular del CTLA4 estaba unido genéticamente a las
regiones bisagra y constante de una cadena pesada de una IgG humana
(Linsley y col., J. Exp. Med. 173: 721-730
(1991)). Los mutantes CTLA4Ig dirigidos se prepararon codificando la
mutación deseada en cebadores oligonucléotidos imbricados y
produciendo los mutantes mediante PCR (Ho y col., 1989,
supra.) usando el plásmido constructo \piLN CTLA4Ig como
molde (véase la solicitud parental, documento de EE.UU. con nº de
serie 08/228.208, Ejemplo 1, y documento
EP-A-0 682 039).
Se prepararon dieciocho mutantes que codificaban
sustituciones de aminoácidos en la posición de la primera tirosina
del motivo altamente conservado MYPPPY de CTLA4 (Figura 1) (Ho y
col., 1989, supra.). Esta serie de mutantes se produjo
manipulando el codón en esta posición, con objeto de producir nuevos
codones que codificaran para cada uno de los veinte aminoácidos
excepto la cisteína.
Los cebadores necesarios para las reacciones de
PCR, pero no para introducir las mutaciones, incluyeron (1) un
cebador hacia delante \piLN (\piLNIgFP) que codifica una
secuencia complementaria secuencia arriba del sitio de restricción
SacI en el extremo 5' de la secuencia \piLN del CTLA4Ig, y (2) un
cebador inverso (\piLNIgRP) que codifica una secuencia
complementaria secuencia abajo del sitio XbaI en el extremo 3' de la
región que codifica para la inmunoglobulina.
Estos cebadores codificaban para las siguientes
secuencias:
\piLNIgFP:
5'-TGCAAGGTGGAGCTCATGTTCCCACCGCCATAC (SEQ ID Nº
12)
\piLNIgRP:
5'-GCGCTCGACTCTAGAAGCATCCTCGTG (SEQ ID Nº 13)
Las condiciones de la PCR consistieron en 6 min a
94ºC seguido de 30 ciclos de 1 min a 94ºC, 2 min a 55ºC y 3 min a
72ºC. Se usaron la polimerasa Taq y las condiciones de reacción
sugeridas por el proveedor (Perkin Elmer Cetus, Emeryville, CA). Los
productos de la PCR se digirieron con SacI y XbaI y se unieron al
vector de expresión SacI/XbaI-cut \piLN de
CTLA4Ig.
Para confirmar que se habían insertado las
mutaciones deseadas y para verificar la ausencia de mutaciones
secundarias, cada proteína de fusión CTLA4Ig mutante (un ejemplo de
una proteína de fusión mutante CTLA4 soluble) se secuenció mediante
la reacción didesoxi de terminación/extensión de la cadena con
reactivos Sequenasa usados según las recomendaciones del fabricante
(United States Biochemical Corp., Cleveland, OH).
Los plásmidos que codificaban para cada uno de
los mutantes se transfectaron en células COS (Aruffo y col.,
Cell 61: 1303 (1990)) y se usó medio condicionado como
fuente para las proteínas de fusión mutantes Ig resultantes.
Cuantificación de las proteínas de fusión Ig
resultantes en medio de cultivo. Las proteínas de fusión
mutantes solubles se cuantifiaron mediante análisis FACS según se
describió previamente (véase la solicitud parental, documento de
EE.UU. con nº de serie 08/228.208, Ejemplo 1, y documento
EP-A-0 682 039).
Unión de las proteínas de fusión CTLA4Ig en
presencia de AcMc anti-CD80 o
anti-CD86. Los estudios de unión que implicaban
a las proteínas CTLA4Ig y a las moléculas competidoras utilizaron
los procedimientos previamente descritos (véase la solicitud
parental, documento de EE.UU. con nº de serie 08/228.208, Ejemplo
4, y documento EP-A-0 682 039).
Purificación de las proteínas de fusión
Ig. Las proteínas de fusión Ig se purificaron según se describió
anteriormente (véase la solicitud parental, documento de EE.UU. con
nº de serie 08/228.208, Ejemplo 1, y documento
EP-A-0 682 039).
Actividad de unión de las proteínas de fusión
CTLA4Ig mutantes. Se produjeron proteínas de fusión Ig mutantes
dirigidas en células COS transfectadas temporalmente, se
cuantificaron y se ensayó su capacidad de unirse al CD80 o al
CD86.
Se determinó la capacidad de cada proteína de
fusión CTLA4Ig mutante para unirse al CD80 o al CD86 expresados en
células CHO transfectadas de forma estable incubando estas células
con las diferentes proteínas de fusión CTLA4Ig mutantes, marcando
las proteínas mutantes con anti-FITC humano, y
ensayándolas mediante FACSCAN según se describió anteriormente.
La tinción de valoración de las células CHO que
expresan bien el CD80 o bien el CD86 muestra que la mutagénesis del
primer residuo de tirosina en el motivo MYPPPY del CTLA4Ig tiene un
profundo efecto sobre la unión tanto al CD80 como al CD86. La Figura
7 muestra que cada sustitución de aminoácido en esta posición
produce un perfil de unión único. Además, esta figura muestra que
las sustituciones con fenilalanina y triptófano en esta posición
producen mutantes que son capaces de unirse al CD80 de una forma
análoga a la molécula natural, pero que son incapaces de unirse al
CD86.
La Figura 8 ilustra adicionalmente las
características únicas de las dos moléculas mutantes, en las que la
primera tirosina del motivo MYPPPY ha sido sustituida bien por
fenilalanina o bien por triptófano. Los análisis FACS sobre un
amplio intervalo de concentraciones diferentes muestran que estos
dos mutantes se unen al CD80 de una forma análoga a la molécula
natural, pero son totalmente incapaces de unirse al CD86.
Estas observaciones son coherentes con los
estudios que implican a las líneas celulares que expresan de forma
natural los antígenos CD80 y CD86. La Figura 9 muestra que la
mutante de fenilalanina se une al CD80 endógeno que está expresado
en la superficie de la línea celular LCL 816. Esta especificidad
del mutante para la molécula de CD80 se demuestra en estudios de
competencia en los que su unión es inhibida por anticuerpos
monoclonales que son específicos para CD80. Además, los anticuerpos
específicos para CD86 no tienen ningún efecto sobre la capacidad de
esta molécula de unirse a esta línea celular.
Estos datos demuestran claramente que la primera
tirosina del motivo MYPPPY del CTLA4Ig juega un papel crítico en la
capacidad de esta molécula para unirse tanto a CD80 como a CD86.
Además, estos resultados muestran que las sustituciones que cambian
el residuo en esta posición bien por fenilalanina o bien por
triptófano producen mutantes que conservan la capacidad de unirse al
CD80 pero que pierden la capacidad de unirse al CD86.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La unión de los anticuerpos se valoró a partir de
la observada para la proteína natural (+++) hasta por encima del
fondo (+) y sin unión detectable (-).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Linsley, Peter S.
\hskip3.9cmLedbetter, Jeffrey A.
\hskip3.9cmPeach, Robert
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Moléculas CTLA4 mutantes y usos de las mismas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Merchant & Gould
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11150, Santa Monica Blvd., Suite 400
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Los Ángeles
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- C.P.: 90025
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS / MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Patentin Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD
\vskip0.800000\baselineskip
- ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/228.208
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 de abril de 1994
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACION ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Adriano, Sarah B.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.470
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/ EXPEDIENTE 30436.30USI1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 310-445-1140
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 310-445-9031
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 234 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 234 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº2
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 225 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº3
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 225 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº4
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 223 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº5
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 226 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Tyr Pro Pro Ala Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Tyr Pro Pro Pro Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATACGACTC ACTATAGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACCACACTG TATTAACC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Tyr Pro Pro Pro Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCAAGGTGG AGCTCATGTT CCCACCGCCA TAC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID nº13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCTCGACT CTAGAAGCAT CCTCGTG
\hfill27
Claims (21)
1. Una molécula CTLA4 mutante reactiva con el
antígeno CD80, en la que en un dominio extracelular del CTLA4, la
primera tirosina del motivo aminoacídico MYPPPY es sustituida por
fenilalanina o triptófano.
2. La molécula de CTLA4 mutante de la
reivindicación 1, que es funcional y soluble.
3. La molécula de CTLA4 mutante de la
reivindicación 1 ó 2, que se une al antígeno CD80 pero no al
antígeno CD86.
4. La molécula de CTLA4 mutante de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el dominio extracelular
está unido a una molécula no CTLA4.
5. La molécula de CTLA4 mutante de la
reivindicación 4, en la que la molécula no CTLA4 es al menos una
porción de una molécula de inmunoglobulina.
6. La molécula de CTLA4 mutante de la
reivindicación 1, en la que la molécula es una molécula de fusión
CTLA4Ig mutante con una primera secuencia aminoacídica que contiene
residuos de aminoácidos correspondientes al dominio extracelular de
la molécula de CTLA4 mutante, y una segunda secuencia aminoacídica
que contiene residuos de aminoácidos correspondientes a la regiones
bisagra, CH2 y CH3, de la inmunoglobulina C\gamma1.
7. La molécula de CTLA4 mutante de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6, que es una proteína purificada.
8. Una molécula de ácido nucleico que codifica
para la molécula de CTLA4 mutante de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
9. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 8, en la que el ácido nucleico es ADN.
10. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 9, en la que el ADN es ADNc.
11. Un plásmido que codifica para la molécula de
ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.
12. Un sistema vector hospedador que comprende el
plásmido de la reivindicación 11 transfectado en una célula
hospedadora eucariota compatible.
13. El sistema vector hospedador de la
reivindicación 12, en el que la célula hospedadora eucariota
compatible es una célula de ovario de hámster chino.
14. Un procedimiento para producir la molécula de
CTLA4 mutante de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que
comprende el crecimiento del sistema vector hospedador de las
reivindicaciones 12 ó 13, de forma que se produzca la molécula de
CTLA4 mutante en el hospedador, y la recuperación de la molécula de
CTLA4 mutante así producida.
15. La molécula de CTLA4 mutante de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para su uso en terapia.
16. Un procedimiento in vitro para regular
una respuesta inmune mediante la inhibición de una interacción del
CD80 con los linfocitos, que comprende la puesta en contacto de una
célula CD80 positiva con una molécula de CTLA4 mutante de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para interferir con la
reacción del antígeno CD80 endógeno con los linfocitos.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que los linfocitos son linfocitos T.
18. El procedimiento de la reivindicación 16 ó
17, en el que la respuesta inmune es una respuesta de linfocitos B
que da como resultado la inhibición de la producción de anticuerpos,
o una respuesta de linfocitos T que da como resultado una inhibición
de la inmunidad celular o una inhibición de la proliferación de
linfocitos.
19. El uso de la molécula de CTLA4 mutante de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para preparar una
composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad del
sistema inmune.
20. El uso de la reivindicación 19, en el que la
enfermedad del sistema inmune está mediada por interacciones de los
linfocitos T con células CD80 positivas.
21. El uso de la reivindicación 19, en el que la
enfermedad del sistema inmune se elige del grupo formado por
enfermedades autoinmunes, rechazo de aloinjertos, enfermedad del
injerto contra el hospedador y reacciones alérgicas crónicas.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US505058 | 1995-07-21 | ||
| US08/505,058 US5773253A (en) | 1993-01-22 | 1995-07-21 | MYPPPY variants of CTL A4 and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2223061T3 true ES2223061T3 (es) | 2005-02-16 |
Family
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