ES2311634T3 - Procedimientos y composiciones para evaluar la respuesta a un tratamiento de anticuerpo. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro de evaluación de la respuesta de un sujeto a un tratamiento de anticuerpo terapéutico, en el que dicho anticuerpo es una IgG1 o IgG3 eliminadora de células diana, comprendiendo el procedimiento determinar in vitro el residuo aminoácido en la posición 158 de un receptor FcgammaRIIIa tal como se representa en la proteína madura de la figura 3 de dicho sujeto, siendo indicativa de una respuesta inferior a dicho tratamiento una fenilalanina en la posición 158.
Description
Procedimientos y composiciones para evaluar la
respuesta a un tratamiento de anticuerpo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento in vitro para evaluar la respuesta de un
sujeto frente a un tratamiento de anticuerpo terapéutico, en el que
dicho anticuerpo es un IgG1 o IgG3 eliminador de células diana,
comprendiendo el procedimiento determinar in vitro el
residuo aminoácido en la posición 158 de un receptor
Fc\gammaRIIIa tal como se representa en la proteína madura de la
figura 3 de dicho sujeto, siendo indicativa una fenilalanina en la
posición 158 de una menor respuesta a dicho tratamiento.
La invención puede utilizarse para pacientes con
tumores malignos, particularmente el linfoma, y resulta adecuada
para seleccionar los mejores respondedores y/o para ajustar el
protocolo o estado de tratamiento para los malos respondedores.
Diversas estrategias terapéuticas en el ser
humano se basan en la utilización de anticuerpos terapéuticos. Lo
expuesto anteriormente incluye, por ejemplo, la utilización de
anticuerpos terapéuticos desarrollados para eliminar células diana,
particularmente células enfermas, tales como células infectadas por
virus, células tumorales u otras células patogénicas, incluyendo
células inmunocompetentes alogénicas. Dichos anticuerpos
típicamente son anticuerpos monoclonales, de especie IgG,
típicamente IgG1 e IgG3. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos
recombinantes y anticuerpos humanizados, comprendiendo dominios
funcionales de diversas especies, origen o especificidad. Un
ejemplo particular de dichos anticuerpos terapéuticos es el
rituximab (Mabthera®, Rituxan®), que es un anticuerpo monoclonal
antiCD20IgG1 quimérico construido con regiones constantes
\gamma_{1} y \kappa unidas a dominios variables murinosl.
Durante unos cuantos años, el rituximab ha modificado
considerablemente la estrategia terapéutica contra los tumores
malignos linfoproliferativos B, particularmente los linfomas no de
Hodgkin (NHL). Entre otros ejemplos de anticuerpos IgG1 humanizados
intactos se incluyen alemtuzumab (Campath-1H®), que
se utiliza en el tratamiento de los tumores malignos de células B, o
el trastuzumab (Herceptin®), que se utiliza en el tratamiento del
cáncer de mama. Se dan a conocer otros ejemplos de anticuerpos
terapéuticos en desarrollo en la técnica.
Aunque dichos anticuerpos representan un nuevo
enfoque eficiente en la terapia humana, particularmente para el
tratamiento de tumores, no siempre muestran una eficacia
contundente y su utilización podría mejorarse mediante la evaluación
de la respuesta de los sujetos a los mismos. Por ejemplo, aunque el
rituximab, solo o en combinación con quimioterapia, ha mostrado
resultar efectivo en el tratamiento de NHL tanto de grado
bajo-intermedio^{2-8} como de
grado elevado^{6,9}, el 30% a 50% de los pacientes con NHL de
grado bajo no presentan respuesta clínica al rituximab 4,5. Se ha
sugerido que el nivel de expresión de CD20 en las células de
linfoma^{2}, la presencia de una carga tumoral elevada en el
momento del tratamiento^{6} o concentraciones séricas reducidas de
tiruximab^{2} podrían explicar la falta de eficacia de
éste en algunos pacientes. Sin embargo, las causas resales del fallo del tratamiento siguen sin conocerse con exactitud.
éste en algunos pacientes. Sin embargo, las causas resales del fallo del tratamiento siguen sin conocerse con exactitud.
La disponibilidad de procedimientos que
permitiesen la evaluación de la respuesta del paciente al
tratamiento de anticuerpos mejoraría mucho la eficacia terapéutica
de estos productos. Sin embargo, el modo de acción preciso in
vivo de dichos anticuerpos terapéuticos no ha sido documentado
claramente. En efecto, aunque los estudios in vitro sugieren
diversos modos de acción posibles del rituximab (citotoxicidad
mediada por células dependiente de anticuerpos
(ADCC)^{10,11}, citotoxicidad dependiente del
complemento^{10,12,13} señalización directa que conduce a la
apoptosis^{14,15}, etc.), no se ha documentado en el ser humano
de manera clara la acción de estos anticuerpos eliminadores de
células diana. Además, aunque la ADCC es un mecanismo efector
importante en la erradicación de los patógenos intracelulares y las
células tumorales, sigue siendo controvertido el papel de una
ADCC^{12,13}.
El documento WO nº 01/12848 da a conocer un
procedimiento para determinar la tendencia de un individuo a
desarrollar artritis reumatoide (RA) y/o la gravedad de la misma
(página 1, líneas 26 a 29). D1 se refiere a anticuerpos cultivados
contra Fc\gammaR únicamente para la utilización de los mismos en
la determinación de una predisposición o la gravedad de RA en un
individuo (ver la página 2, líneas 23 a 31; página 6, líneas 22 a
26; reivindicación 9) o en el tratamiento de la RA (página 2, líneas
28 a 31; reivindicación 10). D1 indica que el procedimiento puede
utilizarse para identificar sujetos que son susceptibles a la forma
grave de RA, de manera que puedan recibir una terapia adecuada
(página 5, línea 15; página 6, línea 2). D1 indica asimismo un
procedimiento para identificar un paciente que responde a un
programa de terapia específico. Sin embargo, el programa de terapia
específico no se especifica y no se da a conocer la correlación
entre la eficacia y la presencia o ausencia de un alelo
específico.
Colombat (Blood 97:101-106,
2001) da a conocer un procedimiento para tratar un sujeto con un
IgG1 eliminador de células diana, el rituximab (Resumen).
La presente invención propone a continuación
procedimientos y composiciones para evaluar la respuesta
terapéutica de un sujeto a un anticuerpo terapéutico. Asimismo, la
invención propone procedimientos para seleccionar pacientes que
presentan el mejor perfil de respuesta al tratamiento terapéutico
de anticuerpos. Asimismo la invención se refiere a procedimientos
para tratar pacientes con anticuerpos terapéuticos, comprendiendo
una etapa previa de evaluación de la respuesta del paciente.
Asimismo, la invención se refiere a composiciones y kits adecuados
para llevar a cabo la invención. La invención también podría
utilizarse en ensayos clínicos o en contextos experimentales, para
evaluar o realizar un seguimiento de la respuesta de un sujeto, o
para verificar el modo de acción de un anticuerpo.
La invención se basa, en parte, en la
demostración de una correlación entre el genotipo de un sujeto y la
capacidad del mismo de responder al tratamiento terapéutico de
anticuerpos. Más específicamente, la invención demuestra que el
genotipo del receptor Fc\gammaRIIIa se correlaciona directamente
con la respuesta del sujeto al tratamiento terapéutico de
anticuerpos.
Tres clases de Fc\gammaR (Fc\gammaRI,
Fc\gammaRII y Fc\gammaRIII) y sus subclases se encuentran
codificadas por ocho genes en el ser humano, la totalidad de los
cuales se localiza en el brazo largo del cromosoma 1. Algunos de
estos genes muestran un polimorfismo alélico funcional que genera
alotipos con diferentes propiedades de receptor. Estos polimorfismos
han sido identificados como factores genéticos que incrementan la
susceptibilidad a enfermedades autoinmunológicas o
infecciosas^{l9-21}. Uno de estos factores
genéticos es un dimorfismo génico en FCGR3A, que codifica
Fc\gammaRIIIa con una fenilalanina (F) o una valina (V) en la
posición aminoácida 158^{22,23}. Este residuo interacciona
directamente con la región bisagra inferior de IgG1, tal como ha
sido demostrado recientemente mediante la cocristalización de
IgG1-Fc\gammaRIII^{24}. Se ha demostrado
claramente que la IgG1 humana se une más fuertemente a las células
asesinas naturales (NK) homocigóticas para
Fc\gammaRIIIa-158V, que a las células NK
homocigóticas para Fc\gammaRIIIa-158F o
heterocigóticas^{22,23}.
Los presentes inventores se propusieron evaluar
una posible correlación entre el genotipo FCGR3A y una respuesta
del paciente al tratamiento terapéutico de anticuerpos in
vivo. La presente invención en parte surge del descubrimiento
inesperado de que existe una correlación muy fuerte entre dicho
genotipo y dicho perfil de respuesta, siendo indicativa la
presencia de un residuo valina en la posición 158 de una tasa de
respuesta elevada. Más específicamente, se llevó a cabo el
genotipado de FCGR3A en pacientes con NHL folicular previamente no
tratada que habían recibido rituximab solo, una situación
particular en la que la tasa de respuesta es muy elevada^{5}. Se
determinó asimismo FCGR2A-131 H/R como control,
debido a que este gen se colocaliza con FCGR3A en el cromosoma 1q22
y codifica el receptor Fc\gammaRIIa de macrófagos.
Se determinó el genotipo FCGR3A158V/F en 47
pacientes que habían recibido rituximab para un linfoma no de
Hodgkin folicular previamente no tratado. Se evaluaron las
respuestas clínicas y moleculares a los dos meses (M2) y tras un año
(M12). Se definió la respuesta molecular positiva como la
desaparición de la reorganización del gen BCL2-J
tanto en sangre periférica como en médula ósea. El 21% de los
pacientes eran homocigóticos FCGR3A-158V, mientras
que 34% y 45% de los pacientes eran homocigóticos
FCGR3A-158F y heterocigóticos (portadores de
FCGR3A-158F). Las tasas de respuesta objetivas en
M2 y en M12 fueron de 100% y 90% en pacientes homocigóticos
FCGR3A-158V en comparación con 65% (p=0,02) y 51%
(p=0,03) en portadores de FCGR3A-158F. Se observó
una respuesta molecular positiva en M12 en 5/6 de los pacientes
homocigóticos FCGR3A-158V, comparado con 5/16 en los
pacientes portadores de FCGR3A-158F (p=0,04).
Además, se confirmó que el genotipo homocigótico
FCGR3A-158V era el único parámetro asociado con las
respuestas clínica y molecular en análisis multivariante y también
se encontraba asociado con una tasa menor de progresión de la
enfermedad (p=0,05).
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, la
presente invención establece, por primera vez, una asociación entre
el genotipo FCGR3A y las respuestas clínica y molecular a los
anticuerpos terapéuticos. De esta manera, la invención proporciona
un primer marcador único que puede utilizarse para realizar el
seguimiento, evaluar o seleccionar una respuesta del paciente. De
esta manera, la presente invención introduce nuevos enfoques
farmacéuticos en el control de pacientes con tumores malignos,
infecciones víricas u otras enfermedades relacionados con la
presencia de células patológicas en un sujeto, particularmente el
linfoma no de Hodgkin.
El objetivo de la presente invención se refiere
a un procedimiento in vitro para evaluar la respuesta de un
sujeto a un tratamiento terapéutico de anticuerpos, en el que dicho
anticuerpo es una IgG1 o IgG3 eliminadora de células diana,
comprendiendo el procedimiento determinar in vitro el
residuo aminoácido en la posición 158 de un receptor Fc\gammaRIIIa
tal como se representa en la proteína madura de la figura 3 de dicho
sujeto, siendo indicativa una fenilalanina en la posición 158 de
una menor repuesta a dicho tratamiento.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "anticuerpo o anticuerpos terapéuticos" designa más
específicamente cualquier anticuerpo que funciona eliminando
células diana en un paciente. Entre los ejemplos específicos de
dichas células diana se incluyen células tumorales, células
infectadas por virus, células alogénicas, células inmunocompetentes
patológicas (por ejemplo linfocitos B, linfocitos T, células
presentadoras de antígeno, etc.) implicadas en alergias,
enfermedades autoinmunológicas, reacciones alogénicas, etc. o
incluso células sanas (por ejemplo células endoteliales en una
estrategia terapéutica antiangiogénica). Las células diana más
preferidas en el contexto de la presente invención son células
tumorales y células infectadas por virus. Los anticuerpos
terapéuticos pueden, por ejemplo, mediar en un efecto citotóxico o
una tisis celular, particularmente mediante citotoxicidad mediada
por células dependiente de anticuerpos (ADCC). La ADCC requiere
receptores de leucocitos para la parte Fc de IgG (Fc\gammaR), la
función de la cual es unir los antígenos sensibilizados por IgG a
células citotóxicas que portan Fc\gammaR y desencadenar la
maquinaria de activación celular. Aunque este mecanismo de acción
no se ha observado in vivo en el ser humano, podría explicar
la eficacia de dichos anticuerpos terapéuticos eliminadores de
células diana. Los anticuerpos terapéuticos pueden ser monoclonales
o, preferentemente, monoclonales. Pueden ser producidos por
hibridomas o por células recombinantes manipuladas para expresar
los dominios variables y constantes deseados. Los anticuerpos
pueden ser anticuerpos de cadena única u otros derivados de
anticuerpo que conserven la especificidad de antígeno y la región
bisagra inferior o una variante de la misma. Estos pueden ser
anticuerpos polifuncionales, anticuerpos recombinantes, ScFv,
anticuerpos humanizados o variantes de los mismos. Los anticuerpos
terapéuticos son específicos de antígenos superficiales, por
ejemplo los antígenos membranales. Los anticuerpos terapéuticos más
preferidos son específicos de antígenos tumorales (por ejemplo
moléculas específicamente expresadas por células tumorales), tales
como CD20, CD52, ErbB2 (o HER2/Neu), CD33, CD22, CD25,
MUC-1, CEA, KDR, \alphaV\betae, etc.,
particularmente antígenos de linfoma (por ejemplo CD20). Los
anticuerpos terapéuticos preferentemente son IgG1 o IgG3, más
preferentemente IgG1.
Son ejemplos típicos de anticuerpos terapéuticos
de la presente invención, rituximab, alemtuzumab y trastuzumab.
Estos anticuerpos pueden utilizarse de acuerdo con protocolos
clínicos que han sido autorizados para la utilización en sujetos
humanos. Entre los ejemplos específicos adicionales de anticuerpos
terapéuticos se incluyen, por ejemplo, epratuzumab, basiliximab,
daclizumab, cetuximab, labetuzumab, sevirumab, tuvurimab,
palivizumab, infliximab, ornalizumab, efalizumab, natalizumab,
clenoliximab, etc., tal como aparecen en la tabla siguiente:
En el contexto de la presente invención, un
sujeto o paciente incluye cualquier sujeto o paciente mamífero, más
preferentemente un sujeto o paciente humano.
Según la invención, la expresión "gen
FCGR3A" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico
codificante de un polipéptido Fc\gammaRIIIa en un sujeto. Esta
expresión incluye, en particular, ADN genómico, ADNc, ARN
(pre-ARNr, ARN mensajero, etc.), etc., o cualquier
ácido nucleico sintético que comprende la totalidad o parte de la
secuencia de los mismos. El ácido nucleico sintético incluye ADNc,
preparado a partir de ARNs, y que contiene por lo menos una parte
de una secuencia del ADN genómico de FCGR3A tal como, por ejemplo,
uno o más intrones o una parte que contiene una o más mutaciones.
Más preferentemente, la expresión "gen FCGR3A" se refiere a ADN
genómico, ADNc o ARNm, típicamente ADN genómico o ARNm. El gen
FCGR3A es preferentemente un gen o ácido nucleico FCGRIIIA humano,
es decir, comprende la secuencia de un ácido nucleico codificante
de la totalidad o parte de un polipéptido Fc\gammaRIIIa que
presenta la secuencia del polipéptido Fc\gammaRIIIa humano.
Dichos ácidos nucleicos pueden aislarse o preparase de acuerdo con
técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden aislarse a partir de
bibliotecas o bancos génicos mediante técnicas de hibridación.
También pueden sintetizarse genéticamente o químicamente. La
organización genética de un gen FCGRIIIa humano se ilustra en la
figura 2. La secuencia de aminoácidos de Fc\gammaRIIIa humano se
encuentra representada en la figura 3. La posición aminoácida 158 se
numera a partir del residuo 1 de la proteína madura. Corresponde al
residuo 176 de la preproteína que presenta un péptido de señal. La
secuencia de un gen FCGR3A de tipo salvaje se encuentra
representada en la figura 4 (ver también el número de acceso GenBank
AL590385 o NM_000569 para la secuencia parcial).
En el contexto de la presente invención, una
porción o parte se refiere a por lo menos 3 nucleótidos (por
ejemplo un codón), preferentemente por lo menos 9 nucleótidos,
todavía más preferentemente por lo menos 15 nucleótidos, y puede
contener hasta 1.000 nucleótidos. Dicha porción puede obtenerse
mediante cualquier técnica bien conocida en la técnica, por ejemplo
corte enzimático y/o químico, síntesis química o una combinación de
las mismas. La secuencia de una porción de un gen FCGR3A codificante
de la posición aminoácida 158 se encuentra representada a
continuación, en aras de la claridad:
Tal como se ha indicado anteriormente, la
invención comprende un procedimiento para determinar in
vitro el genotipo FCGR3A158 de dicho sujeto. Lo expuesto
anteriormente comprende más particularmente determinar la naturaleza
del residuo aminoácido presente (o codificado) en la posición 158
del polipéptido Fc\gammaRIIIa.
El genotipado del gen FCGR3A o del polipéptido
correspondiente en dicho sujeto puede conseguirse mediante diversas
técnicas, comprendiendo el análisis de las moléculas de ácido
nucleico codificantes o el polipéptido codificado. El análisis puede
comprender la secuenciación, migración, electroforesis, técnicas
inmunológicas, amplificaciones, digestiones específicas o
hibridaciones, etc.
En una forma de realización particular,
determinar el residuo aminoácido presente en la posición 158 del
receptor Fc\gammaRIIIa comprende una etapa de secuenciación del
gen o ARN del receptor FCGR3A o una parte de los mismos que
comprende los nucleótidos codificantes del residuo aminoácido
158.
En otra forma de realización particular,
determinar el residuo aminoácido en la posición 158 del receptor
Fr\gammaRIIIa comprende una etapa de amplificación del gen o ARN
del receptor FCGR3A o una parte de los mismos que comprenden los
nucleótidos codificantes del residuo aminoácido 158. La
amplificación puede llevarse a cabo mediante reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), tal como PCR simple, PCR-RT o
PCR anidada, por ejemplo, utilizando procedimientos y cebadores
convencionales.
A este respecto, los cebadores de amplificación
para la utilización en la presente invención más preferentemente
contienen menos de aproximadamente 50 nucleótidos, todavía más
preferentemente menos de 30 nucleótidos, típicamente menos de
aproximadamente 25 ó 20 nucleótidos. Además, los cebadores
preferidos habitualmente contienen por lo menos 5, preferentemente
por lo menos 8 nucleótidos, para garantizar la especificidad. La
secuencia del cebador puede prepararse basándose en la secuencia del
gen FCGR3A, preferentemente para permitir la complementariedad
completa con el mismo. La sonda puede marcarse utilizando cualquier
técnica conocida, tal como radioactividad, fluorescencia,
enzimática, química, etc. Este marcaje puede utilizar, por ejemplo,
fósforo 32, biotina (16-dUTP), dioxigenina
(11-dUTP). Debe entenderse que la presente
invención no se encuentra limitada a ninguna técnica particular de
detección o de marcaje. Los cebadores pueden comprender además
sitios de restricción para introducir sitios de restricción
específicos de alelo en los ácidos nucleicos amplificados, tal como
se da a conocer posteriormente.
Son ejemplos específicos de dichos cebadores de
amplificación, por ejemplo, las secuencias SEC ID nº 1 a 4.
\newpage
Debe apreciarse que el experto en la materia
podrá diseñar otros cebadores, tales como cualquier fragmento del
gen FCGR3A, para la utilización en la etapa de amplificación y
especialmente un par de cebadores que comprenden una secuencia
forward y una secuencia reversa, en las que dichos cebadores de
dicho par se hibridan con una región de un gen FCGR3A y permiten la
amplificación de por lo menos una porción del gen FCGR3A que
contiene el codón 158. En una forma de realización preferida, cada
par de cebadores comprende por lo menos un cebador que es
complementario y se solapa con el codón 158 y permite discriminar
entre 158V (gtt) y 158F (ttt). El experto en la materia también
puede ajustar las condiciones de amplificación basándose en los
conocimientos generales comunes y las directrices contenidas en la
memoria.
En una forma de realización particular, el
procedimiento de la presente invención comprende una amplificación
por PCR de una porción del ARNm o ADNg de FCGR3a con cebadores
oligonucleótidos específicos, en la célula o en la muestra
biológica, comprendiendo dicha porción el codón 158, y un análisis
directo o indirecto de los productos de PCR, por ejemplo mediante
electroforesis, particularmente la electroforesis en gradiente de
gel desnaturalizante (DGGE).
En otra forma de realización particular,
determinar el residuo aminoácido en la posición 158 del receptor
Fc\gammaRIIIa comprende una etapa de digestión con un enzima de
restricción específica de alelo. Lo expuesto anteriormente puede
llevarse a cabo mediante la utilización de enzimas de restricción
que cortan la secuencia codificante de un alela particular (por
ejemplo el alelo 158V) y que no cortan el otro alelo (por ejemplo el
alelo 158F, o viceversa). En el caso de que dichos sitios de
restricción específicos de alelo no se encuentren presentes
naturalmente en la secuencia, pueden introducirse en la misma
artificialmente, mediante la amplificación del ácido nucleico con
cebadores de amplificación específicos de alelo que contienen dicho
sitio en la secuencia de los mismos. Tras la amplificación, puede
llevarse a cabo la determinación de la presencia de un alelo
mediante el análisis de los productos de digestión, por ejemplo
mediante electroforesis. Esta técnica también permite discriminar
sujetos que son homocigóticos o heterocigóticos para el alelo
seleccionado.
Entre los ejemplos de cebadores de amplificación
específicos de alelo se incluye, por ejemplo, la secuencia SEC ID
nº 3. La secuencia SEC ID nº 3 introduce los primeros 3 nucleótidos
del sitio NlaIII (5'-CATG-3'). El
corte se produce tras G. Este cebador comprende 1 bases que no se
hibridan con FCGR3A, que extienden el cebador con el fin de
facilitar el análisis de electroforesis de los productos de
amplificación, y 21 bases que se hibridan a FCGR3A, excepto por el
nucleótido 31 (A), que crea el sitio de restricción.
En otra forma de realización particular,
determinar el residuo aminoácido en la posición 158 del receptor
Fc\gammaRIIIa comprende una etapa de hibridación del gen o ARN del
receptor FCGR3A o una parte de los mismos que comprende los
nucleótidos codificantes del residuo aminoácido 158, con una sonda
de ácidos nucleicos específica para el genotipo valina o
fenilalanina, y determinar la presente o ausencia de híbridos.
Se debe apreciar que los procedimientos
anteriores pueden utilizarse solos o en diversas combinaciones.
Además, pueden utilizarse otras técnicas conocidas por el experto
en la materia, así como determinar el genotipo de FCGR3A158, tal
como cualquier procedimiento que utiliza la amplificación (por
ejemplo PCR), cebadores específicos, sondas específicas, migración,
etc., típicamente ensayos de PCR-RT cuantitativa,
LCR (reacción en cadena de ligasa), TMA (amplificación mediada por
la transcripción), PCE (inmunoensayo amplificado por enzima) y ADNb
(amplificación de señal de ADN ramificado).
En una forma de realización preferida de la
presente invención, determinar el residuo aminoácido en la posición
158 del receptor Fc\gammaRIIIa comprende:
- -
- obtener ADN genómico a partir de una muestra biológica,
- -
- amplificar el gen de receptor Fc\gammaRIIIa o una parte del mismo que comprende los nucleótidos codificantes del residuo aminoácido 158, y
- -
- determinar el residuo aminoácido en la posición 158 de dicho gen de receptor Fc\gammaRIIIa.
La amplificación puede conseguirse con cualquier
técnica específica, tal como PCR, incluyendo la PCR anidada,
utilizando cebadores específicos, tal como se ha descrito
anteriormente. En una forma de realización más preferida, la
determinación del residuo aminoácido en la posición 158 se lleva a
cabo mediante digestión con enzima de restricción específica de
alelo. En este caso, el procedimiento comprende:
- -
- obtener ADN genómico a partir de una muestra biológica,
- -
- amplificar el gen de receptor Fc\gammaRIIIa o una parte del mismo que comprende los nucleótidos codificantes del residuo aminoácido 158,
- -
- introducir un sitio de restricción específico de alelo,
- -
- digerir los ácidos nucleicos con el enzima específico para dicho sitio de restricción y,
- -
- analizar los productos de digestión, es decir, mediante electroforesis, siendo indicativa de la presencia del alelo la presencia de productos de digestión.
En otra forma de realización particular, el
genotipo se determina mediante un procedimiento que comprende:
extracción del ARN total (o mensajero) a partir de una célula o
muestra biológica o líquido biológico in vitro o ex
vivo, opcionalmente síntesis de ADNc, amplificación por (PCR)
con cebadores oligonucleótidos específicos de FCGR3A y análisis de
los productos de PCR.
El procedimiento de la presente invención
también puede comprender determinar el residuo aminoácido en la
posición 158 del receptor Fc\gammaRIIIa directamente mediante
secuenciación del polipéptido receptor Fc\gammaRIIIa o una parte
del mismo que comprende el residuo aminoácido 158 o mediante la
utilización de reactivos específicos para cada alelo del
polipéptido Fc\gammaRIIIa. Lo expuesto anteriormente puede
determinarse mediante cualquier técnica adecuada conocida por el
experto en la materia, incluyendo mediante inmunoensayo (ELISA,
EIA, RIA, etc.). Este puede llevarse a cabo utilizando cualquier
reactivo de afinidad específico de un polipéptido
Fc\gammaRIIIA158, más preferentemente cualquier anticuerpo o
fragmento o derivado del mismo. En una forma de realización
particular, el polipéptido Fc\gammaRIIIal58 se detecta con un
anticuerpo antiFc\gammaRIIIa158 (o un fragmento del mismo) que
discrimina entre Fc\gammaRIIlal58V y Fc\gammaRIIIal58F, más
preferentemente un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo (o reactivo
de afinidad) puede marcarse mediante cualquier procedimiento
adecuado (radioactividad, fluorescencia, enzimática, química,
etc.). Alternativamente, los complejos inmunológicos de anticuerpo
Fc\gammaRIIIal58 pueden revelarse (y/o cuantificarse) utilizando
un segundo reactivo (por ejemplo anticuerpo) marcado, que se une al
anticuerpo antiFc\gammaRIIIa158, por ejemplo.
Los procedimientos mencionados anteriormente se
basan en el genotipado de FCGR3A158 en una muestra biológica del
sujeto. La muestra biológica puede ser cualquier muestra que
contiene un gen FCGR3A o el polipéptido correspondiente,
particularmente sangre, médula ósea, nódulo linfático o un líquido,
particularmente sangre u orina, que contiene un gen o polipéptido
FCGR3A158. Además, debido a que el gen FCGR3A158 se encuentra
generalmente presente dentro de las células, tejidos o líquidos
mencionados anteriormente, el procedimiento de la presente invención
habitualmente utiliza una muestra tratada para que el gen o
polipéptido se encuentre disponible para la detección o el
análisis. El tratamiento puede comprender cualquier técnica
convencional de fijación, tisis celular (mecánica o química o
física) o cualquier otro procedimiento convencional utilizado en
inmunohistología o biología, por ejemplo.
El procedimiento resulta particularmente
adecuado para determinar la respuesta de un sujeto frente a un
tratamiento de anticuerpos terapéuticos antitumorales. A este
respecto, en una forma de realización particular, el sujeto presenta
un tumor y el tratamiento de anticuerpos terapéuticos presenta como
objetivo reducir la carga tumoral, particularmente eliminar las
células tumorales. Más preferentemente, el tumor es un linfoma, tal
como, más preferentemente, un linfoma B, particularmente un NHL. Tal
como se ha indicado anteriormente, el anticuerpo es un IgG1 o un
IgG3, particularmente un antiCD20IgG1 o IgG3, más preferentemente
un anticuerpo humanizado, por ejemplo el rituximab.
Se dan a conocer otros aspectos y ventajas de la
presente invención en los ejemplos siguientes, que deben
considerarse ilustrativos y no limitativos del alcance de la
presente solicitud.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Estimaciones ajustadas de
Kaplan-Meier de supervivencia libre de progresión
tras el tratamiento de rituximab según el genotipo
Fc\gammaR3a-158V/F (p=0,05).
Figura 2: organización genética del gen FCGR3A
humano.
Figura 3: secuencias de aminoácidos de
Fc\gammaRIIIal58F humano (SEC ID nº 7).
Figura 4: secuencia de ácidos nucleicos de
FCGR3A158F humana (SEC ID nº 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha informado del diseño de los ensayos
clínicos, los criterios de elegibilidad y la evaluación de criterio
de valoración anteriormente^{5}. En breve, los pacientes podían
ser seleccionados para su inclusión en el presente estudio si
presentaban previamente NHL folicular CD20-positiva
no tratada según la clasificación REAL^{26}. Se requirió que los
pacientes se presentasen con enfermedad de estadio II a IV según la
clasificación de Ann-Arbor y por lo menos un sitio
de enfermedad medible. Se requirió que todos los pacientes
presentasen una carga tumoral reducida según los criterios
GELF^{27}. Se administró un total de cuatro dosis de 375
mg/m^{2} de rituximab (Roche, Neuilly, Francia) mediante infusión
intravenosa (días 1, 8, 15, 22). El control de la infusión y los
sucesos adversos ya han sido informados^{5}. El protocolo de
estudio fue aprobado por un comité de ética, y todos los pacientes
proporcionaron su consentimiento bien informados.
\newpage
La evaluación de línea base incluyó el examen
clínico, radiografías torácicas, tomografía computerizada (CT) de
tórax, abdomen y pelvis, y biopsia unilateral de médula ósea. La
respuesta fue evaluada por un panel independiente de radiólogos que
revisaron todos los escaneos de CT de los pacientes incluidos. El
criterio de eficacia primaria fue la tasa de respuesta objetiva, es
decir, la proporción de pacientes que alcanzaron la remisión
completa (CR), CR no confirmada (CRu) o la respuesta parcial (PR)
según los criterios recientemente propuestos por un comité
internacional de expertos^{28}. La respuesta clínica se evaluó en
los días 50 y 78. Únicamente se consideró la respuesta máxima y ese
punto temporal de evaluación se denominó M2. Se evaluaron todos los
pacientes en M2 y la reaparición de células de linfoma en la médula
ósea en M12 se consideró "progresivo"; los pacientes en PCR
con biopsia negativa de la médula ósea en M2 y biopsia positiva en
M12 se consideraron en PR.
El análisis molecular de la reorganización del
gen BCL2-JH se llevó a cabo mediante PCR, tal como
se ha descrito anteriormente5, en un nódulo linfático obtenido en
el diagnóstico y tanto en sangre periférica como en médula ósea en
el diagnóstico, M2 y M12.
De los 50 pacientes incluidos en el ensayo
clínico, se excluyó un paciente tras el análisis histológico y no
se encontraba disponible ADN de dos otros pacientes. Por lo tanto,
se encontraban disponibles cuarenta y siete pacientes para el
análisis del genotipo FCGR3A. Todas las muestras se analizaron en
el mismo laboratorio y se extrajo ADN utilizando procedimientos
estándares, incluyendo precauciones para evitar la contaminación
cruzada. Se aisló ADN de sangre periférica (n=43), médula ósea (n=3)
o nódulo linfático (n=1). El genotipado del polimorfismo
FCGR3A-158V/F se llevó a cabo tal como describen
Koene et al.^{22} mediante una PCR anidada, seguido de una
digestión con enzima de restricción específico de alelo.
Brevemente, se utilizaron dos cebadores específicos de FCGR3A
(5'-ATATT
TACAGAATGGCACAGG3', SEC ID nº 1; 5'-GACTTGGTACCCAGGTTGAA-3', SEC ID nº 2) (Eurobio, Les Ulis, Francia) para amplificar un fragmento de 1,2 kb que contenía el sitio polimórfico. El ensayo de PCR se llevó a cabo con 1,25 \mug de ADN genómico, 200 ng de cada cebador, 200 \mumoles/l de cada dNTP (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania) y 1 U de Taq ADN polimerasa (Promega, Charbonniére, Francia) según recomendación del fabricante. Esta primera PCR constaba de 10 minutos a 95ºC, seguida de 35 ciclos (consistente cada uno de 3 etapas de 95ºC de 1 minuto, 57ºC de 1,5 minutos, 72ºC de 1,5 minutos) y 8 minutos de 72ºC para conseguir la extensión completa. La segunda PCR utilizó los cebadores (5'-ATCAGATTCGATCCTACTTCTGCAGGGGGCAT-3', SEC ID nº 3; 5'-ACGTGCT
GAGCTTGAGTGATGGTGATGTTCAC-3', SEC ID nº 4) (Eurobio) amplificando un fragmento de 94 pb y creando un sitio de restricción NiaIII únicamente en el alelo FCGR3A-158V. Esta PCR anidada se llevó a cabo con 1 \mul del ADN amplificado, 150 ng de cada cebador, 200 \mumoles/l de cada dNTP y 1 U de Taq ADN polimerasa. El primer ciclo constaba de 5 minutos a 95ºC, seguido de 35 ciclos (consistente cada uno de 3 etapas a 95ºC durante 1 minuto, 64ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto) y 9,5 minutos a 72ºC para completar la extensión. A continuación, se digirió el ADN amplificado (10 \mul) con 10 U de NiaIII (New England Biolabs, Hitchin, Inglaterra) durante 12 horas a 37ºC y se separó mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8%. Tras teñir con bromuro de etidio, las bandas de ADN se visualizaron con luz UV. Para los pacientes homocigóticos para FCGR3A-158F, sólo resultaba visible una banda no digerida (94 pb). Se observaron tres bandas (94 pb, 61 pb y 33 pb) en individuos heterocigóticos, mientras que para los pacientes homocigóticos para GCGR3A-158V, únicamente se obtuvieron dos bandas digeridas (61 pb y 33 pb).
TACAGAATGGCACAGG3', SEC ID nº 1; 5'-GACTTGGTACCCAGGTTGAA-3', SEC ID nº 2) (Eurobio, Les Ulis, Francia) para amplificar un fragmento de 1,2 kb que contenía el sitio polimórfico. El ensayo de PCR se llevó a cabo con 1,25 \mug de ADN genómico, 200 ng de cada cebador, 200 \mumoles/l de cada dNTP (MBI Fermentas, Vilnius, Lituania) y 1 U de Taq ADN polimerasa (Promega, Charbonniére, Francia) según recomendación del fabricante. Esta primera PCR constaba de 10 minutos a 95ºC, seguida de 35 ciclos (consistente cada uno de 3 etapas de 95ºC de 1 minuto, 57ºC de 1,5 minutos, 72ºC de 1,5 minutos) y 8 minutos de 72ºC para conseguir la extensión completa. La segunda PCR utilizó los cebadores (5'-ATCAGATTCGATCCTACTTCTGCAGGGGGCAT-3', SEC ID nº 3; 5'-ACGTGCT
GAGCTTGAGTGATGGTGATGTTCAC-3', SEC ID nº 4) (Eurobio) amplificando un fragmento de 94 pb y creando un sitio de restricción NiaIII únicamente en el alelo FCGR3A-158V. Esta PCR anidada se llevó a cabo con 1 \mul del ADN amplificado, 150 ng de cada cebador, 200 \mumoles/l de cada dNTP y 1 U de Taq ADN polimerasa. El primer ciclo constaba de 5 minutos a 95ºC, seguido de 35 ciclos (consistente cada uno de 3 etapas a 95ºC durante 1 minuto, 64ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 1 minuto) y 9,5 minutos a 72ºC para completar la extensión. A continuación, se digirió el ADN amplificado (10 \mul) con 10 U de NiaIII (New England Biolabs, Hitchin, Inglaterra) durante 12 horas a 37ºC y se separó mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8%. Tras teñir con bromuro de etidio, las bandas de ADN se visualizaron con luz UV. Para los pacientes homocigóticos para FCGR3A-158F, sólo resultaba visible una banda no digerida (94 pb). Se observaron tres bandas (94 pb, 61 pb y 33 pb) en individuos heterocigóticos, mientras que para los pacientes homocigóticos para GCGR3A-158V, únicamente se obtuvieron dos bandas digeridas (61 pb y 33 pb).
El genotipado de FCGR2A-131H/R
se llevó a cabo mediante PCR seguido de una digestión con enzima de
restricción específico de alelo de acuerdo con Liang et
a.^{28}. El cebador sentido
(5'-GGAAAATCCCAGAAATTCTCGC-3', SEC
ID nº 5) (Eurobio) se modificó para crear un sitio de restricción
BstUl en el caso del alelo R, mientras que se modificó el cebador
antisentido
(5'-CAACAGCCTGACTACCTATTACGCGGG-3',
SEC ID nº 6) (Eurobio) para llevar a cabo un segundo sitio de
restricción BstUl que sirvió como control interno. La amplificación
por PCR se llevó a cabo en una reacción de 50 \mul con 1,25
\mug de ADN genómico, 170 ng de cada cebador, 200 \mumoles/l de
cada dNTP, 0,5 U de Taq ADN polimerasa y el tampón del fabricante.
El primer ciclo consistió de 3 minutos a 94ºC seguido de 35 ciclos
(consistiendo cada uno de 3 etapas a 94ºC durante 15 segundos, 55ºC
durante 30 segundos y 72ºC durante 40 segundos) y 7 minutos a 72ºC
para completar la extensión. El ADN amplificado (7 \mul) se
digirió a continuación con 20 U de BstUl (New England Biolabs)
durante 12 horas a 60ºC. Se llevó a cabo un análisis adicional tal
como se ha descrito para el genotipado de FCGR3A. Los alelos
FCGR2A-131H y -131R se visualizaron como fragmentos
de ADN de 337 pb y 316 pb, respectivamente.
Se compararon las características clínicas y
biológicas, así como las respuestas clínicas y moleculares de los
pacientes en los diferentes grupos genotípicos, utilizando una
prueba de Chi cuadrado o mediante la prueba exacta de Fisher, cuando
resultaba apropiado. Se utilizó un análisis de regresión logística
que incluía: sexo, edad (> o \leq60 años), número de sitios
extranodales implicados (\geq o <2), implicación de la médula
ósea, estado de reorganización de BCL2-JH en el
momento del diagnóstico y el genotipo FCGR3A para identificar
variables prognósticas independientes que influían sobre las
respuestas clínicas y moleculares. Se calculó la supervivencia libre
de progresión siguiendo el procedimiento de Kaplan y Meier^{29} y
se midió desde el inicio del tratamiento hasta la
progresión/recaída o la muerte. La comparación de la supervivencia
libre de progresión con el genotipo FCGR3A se llevó a cabo
utilizando la prueba de log-rango. Se consideró que
si P<0,05, el resultado era estadísticamente significativo.
De los 49 pacientes sometidos a ensayo para la
presencia de polimorfismo FCGR3A-158V/F, 10 (20%) y
17 (35%) eran homocigóticos para FCGR3A-158V y
FCGR3A-158F, respectivamente, y 22 (45%) eran
heterocigóticos. Los tres grupos no eran diferentes en términos de
sexo, estadio de la enfermedad, implicación de la médula ósea,
número de sitios extranodales implicados o presencia de
reorganización de BCL2- JH en sangre periférica y en la médula ósea
en el momento del diagnóstico (Tabla 1). No se observó diferencia
al comparar los pacientes homocigóticos para
FCGR3A-158V con los portadores de
FCGR3A-158F (pacientes homocigóticos y
heterocigóticos para FCGR3A-158F) o al comparar
pacientes homocigóticos para FCGR3A-158F con
portadores de FCGR3A-158V (pacientes homocigóticos y
heterocigóticos para FCGR3A- 158V). La tasa de respuesta objetiva en
M2 fue del 100% (CR+CRu=40%), 70% (CR+CRu=29%) y 64% (CR+CRu=18%)
en pacientes homocigóticos para FCGR3A-158V,
homocigóticos para FCGR3A-158F y heterocigóticos,
respectivamente (p=0,09). Se observó una diferencia significativa
en la tasa de respuesta objetiva entre los pacientes homocigóticos
para FCGR3A-158V y los portadores de
FCGR3A-158F, con 67% (CR+CRu=23%) de tasa de
respuesta objetiva para este último grupo (riesgo relativo=1,5; IC
del 95%, 1,2 a 1,9, p=0,03) (Tabla 2). No se observó diferencia
entre los pacientes homocigóticos para FCGR3A-158F
y los portadores de FCGR3A-158V. En M12, la tasa de
respuesta objetiva era de 90% (CR+CRu=70%), 59% (CR+CRu=35%) y 45%
(CR+CRu=32%) en pacientes homocigóticos para
FCGR3A-158V, homocigóticos para
FCGR3A-158F y heterocigóticos, respectivamente
(p=0,06). La diferencia en la tasa de respuesta objetiva todavía se
encontraba presente un año después del tratamiento entre el grupo
homocigótico par FCGR3A-158F y los portadores de
FCGR3A-158F, con tasa de respuesta objetiva de 51%
(CR+CRu=33%) para este último grupo (riesgo relativo=1,7, IC al
95%, 1,2 a 2,5, p=0,03). El análisis de regresión logística demostró
que el genotipo homocigótico para FCGR3A-158V era
el único factor predictivo para la respuesta clínica tanto en M2
(p=0,02) como en M12 (p=0,01). La supervivencia libre de progresión
a los 3 años (mediana de seguimiento 35 meses; 31 a 41) (figura 1)
era 56% en pacientes homocigóticos para FCGR3A-158V
y 35% en portadores de FCGR3A-158F (ns). De los 45
pacientes analizados para el polimorfismo
FCGR2A-131H/R, 9 (20%) y 13 (29%) eran
homocigóticos para FCGR2A-131R y para
FCGR2A-131H, respectivamente, mientras que 23 (51%)
eran heterocigóticos. No se observó diferencia en las
características en el momento de la inclusión o respuesta clínica
al tratamiento de rituximab para estos tres grupos o para pacientes
homocigóticos para FCGR2A-131H y para portadores de
FCGR2A-131R, o para pacientes homocigóticos para
FCGR2A-131R y portadores
FCGR2A-131H (datos no representados).
En el momento del diagnóstico, se detectó una
reorganización de BCL2-JH tanto en sangre
periférica como en médula ósea en 30 (64%) pacientes, permitiendo el
seguimiento posterior. SE analizaron veinticinco pacientes (seis
pacientes homocigóticos para FCGR3A-158V y 19
portadores de FCGR3A-158F) y 23 pacientes (seis
pacientes homocigóticos para FCGR3A-158V y 17
portadores de FCGR3A-158F) para la reorganización
de BCL2-JH tanto en sangre periférica como en médula
ósea en M2 y en M12 (Tabla 3). En M2, se observó una eliminación de
la reorganización de BCL2-JH en 3/6 de los
pacientes homocigóticos para FCGR3A-158V y en 5/19
de los portadores de FCGR3A-158F (ns). En
contraste, la tasa de eliminación de la reorganización de
BCL2-JH en M12 era más alta (5/6) en los pacientes
homocigóticos para FCGR3A-158V que en los
portadores FCGR3A-158F (5/17) (riesgo relativo=2,8,
IC al 95%, 1,2 a 6,4, p=0,03). El análisis de regresión logística
demostró que el genotipo homocigótico FCGR3A-158V
era el único factor asociado a una mayor probabilidad de mostrar
eliminación de reorganización de BCL2-JH en M12
(p=0,04). El único paciente homocigótico para
FCGR3A-158V que todavía presentaba reorganización de
BCL2-JH en sangre periférica y médula ósea en M12
se encontraba en CR 23 meses después del tratamiento de rituximab.
En contraste, las respuestas moleculares en M2 y en M12 no
resultaron influidas por el polimorfismo
FCGR2A-131H/4 (datos no mostrados).
Debido a la utilización creciente de rituximab
en los tumores malignos linfoproliferativos de células B, se
requiere una mejor comprensión de los fallos de tratamiento y del
modo de acción del rituximab. A este respecto, los presentes
inventores genotiparon FCGR3A en pacientes de NHL folicular con
características clínicas y de laboratorio bien definidas y tratados
con rituximab solo^{5}. En particular, todos los pacientes
incluidos en este estudio presentaron una NHL de baja carga tumoral
y un análisis molecular de BCL2-JH en el momento
del diagnóstico y durante el seguimiento. Las frecuencias alélicas
de FCGR3A en esta población eran similar a las de una población
caucasiana general^{23,24}. Los resultados de los presentes
inventores muestran una asociación entre el genotipo FCGR3A y la
respuesta al rituximab. En efecto, los pacientes homocigóticos para
FCGR3A-158V, que representan un quinto de la
población, presentaron una mayor probabilidad de experimentar una
respuesta clínica, con tasas de respuesta objetiva de 100% y 90% en
M2 y M12, respectivamente. Además, cinco de los seis pacientes
homocigóticos para FCGR3A-158V analizados para la
reorganización de BCL2-JH mostraron una respuesta
molecular en M12, en comparación con 5 de 17 portadores de
FCGR3A-158F. La homocigosidad para
FCGR3A-158V era el único factor asociado a las
respuestas clínicas y moleculares. Sin embargo, estas respuestas
clínicas y moleculares todavía resultaban insuficientes para
mejorar significativamente la supervivencia libre de progresión en
pacientes homocigóticos para FCGR3A-158V.
La presente invención es el primer informe de un
factor predictivo genético fácilmente evaluable para las respuestas
tanto clínicas como moleculares al rituximab. Sin embargo, la
asociación genética no demuestra que el modo de acción del rituximab
implique Fc\gammaRIIIa. La asociación observada entre el genotipo
FCGR3A y la respuesta al rituximab podría deberse a otro
polimorfismo genético en desequilibrio de ligamiento. Estos
polimorfismos pudieron localizarse en FCGR3A mismo, al igual que el
polimorfismo trialélico FCGR3A-48L/H/R^{31} o en
otros genes codificantes de Fc\gammaR, debido a que FCGR3A se
encuentra localizado en el brazo largo del cromosoma 1, que incluye
los tres genes FCGR2 y FCGR3B^{32}. Se ha informado de un
desequilibrio de ligamiento entre FCGR2A y FCGR3B^{33}. Sin
embargo, el hecho de que el polimorfismo
FCGR2A-131H/R no se encontrase asociado a una mejor
respuesta al rituximab apoya fuertemente el hecho de que un gen muy
próximo a FCGR3A o FCGR3A mismo se encuentre directamente
implicado.
Varios estudios in vitro argumentan a
favor de la implicación directa del polimorfismo
FCGR3A-158V/F. En primer lugar, Koene et
al.^{23} han demostrado que las diferencias de las que se ha
informado anteriormente en la unión de IgG entre las tres isoformas
Fc\gammaRIIIa-48L/H/R^{31} son una consecuencia
del polimorfismo Fc\gammaRIIIa-158V/F ligado, y
varios grupos han demostrado que las células NK de individuos
homocigóticos para el alotipo FCGR3A-158V presentan
una afinidad mayor para IgG1 acomplejada humana y que resultan más
citotóxicas hacia dianas sensibilizadas por IgG1^{23,24,34}. Los
presentes resultados de los inventores establecen que los pacientes
homocigóticos para FCGR3A-158V presentan una mejor
respuesta al rituximab, lo que probablemente se debe a una mejor
unión in vivo de IgG1 humana quimérica a Fc\gammaRIIIa. En
segundo lugar, la ADCC mediada por células NK y por macrófagos es
uno de los mecanismos desencadenados por los anticuerpos antiCD20
in vitro^{8,11,12}, así como en modelos
murinos^{17-19} in vivo, y la apoptosis
mediada por rituximab resulta amplificada por las células que
expresan Fr\gammaR^{15,16}. De entre la totalidad de
Fc\gammaR, Fc\gammaRIIIa es el único receptor compartido por
células NK y macrófagos. De esta manera, los presentes inventores
presuponen que los pacientes FCGR3A-158V muestran
una mejor respuesta al rituximab debido a que presentan una mejor
actividad de ADCC frente a las células de linfoma. El hecho de que
más del 50% de los portadores FCGR3A-158F presenten,
sin embargo, una respuesta clínica al rituximab podría explicarse
por una actividad ADCC menor aunque todavía suficiente, o más
probablemente, por otros mecanismos que actúan in vivo, tales
como la citotoxicidad dependiente del complemento, citotoxicidad
mediada por células dependiente del complemento^{11,13,14} y/o
apoptosis^{15,16}. De esta manera, la ADCC podría ser considerada
un mecanismo adicional en la respuesta al rituximab que resulta
particularmente efectiva en-los pacientes
homocigóticos para FCGR3A-158V.
Los estudios in vitro sugieren un efecto
de "dosis génica" con un nivel de unión de IgG a células NK de
donantes heterocigóticos para FCGR3A intermedio entre el observado
en células NK de homocigóticos para FCGR3A-158V y
para FCGR3A-158F^{23}. Sin embargo, la respuesta
clínica de los pacientes heterocigóticos aparentemente es similar a
la de los pacientes homocigóticos para FCGR3A-158F.
Se requieren estudios adicionales con grupos más grandes de
pacientes para concluir que no existe un efecto de "dosis
génica" in vivo.
Debido a que Fc\gammaRIIIa se encuentra
fuertemente asociada a una mejor respuesta al rituximab, necesita
considerarse durante el desarrollo de nuevos fármacos dirigidos al
antígeno CD20. Por ejemplo, podría resultar posible utilizar
rituximab manipulado para tratar los pacientes portadores de
FCGR3A-158F con linfomas de células B. En efecto,
mediante la modificación de diversos residuos en la región bisagra
inferior de IgG1, Shields et al. recientemente han obtenido
mutantes de IgG1 que se unen más fuertemente a
Fc\gammaRIIIa-158F que a 1gG134 nativo.
Conjuntamente, dichos resultados permiten
plantear nuevas estrategias terapéuticas contra los trastornos
linfoproliferativos B basadas en la determinación previa del
genotipo FCGR3A de los pacientes. Debido a que este polimorfismo
presenta la misma distribución en diversas poblaciones étnicas,
incluyendo negros y japoneses, dicha estrategia podría aplicarse en
todo el mundo^{23,35,36}. Además, dicho enfoque farmacogenético
también podría aplicarse a otros anticuerpos IgG1 humanizados
intactos utilizados en el tratamiento de tumores malignos de
células B, tales como Campath-1 H, o los utilizados
en el tratamiento de otros tumores malignos, tales como el
trastuzumab (Herceptin®). Todavía más generalmente, este enfoque
podría aplicarse a otros anticuerpos terapéuticos (IgG1) intactos
(humanizados) desarrollados para eliminar células diana.
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(Tabla pasa a página
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<110> CHRU de Tours
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<120> Procedimientos y composiciones para
evaluar la respuesta al tratamiento de anticuerpo
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<130> B0095WO
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<140>
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<141>
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<160> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: FCGR3A cebador específico
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipatatttacag aatggcacag g
\hfill21
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: FCGR3A cebador específico
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgacttggtac ccaggttgaa
\hfill20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de amplificación
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcagattcg atcctacttc tgcagggggc at
\hfill32
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<210> 4
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador de amplificación
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<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgtgctgag cttgagtgat ggtgatgttc ac
\hfill32
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador sentido de amplificación
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipggaaaatccc agaaattctc gc
\hfill22
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<210> 6
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador antisentido de amplificación
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipcaacagcctg actacctatt acgcggg
\hfill27
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<210> 7
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<211> 254
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de aminoácidos de humano FCGR3A158F.
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<400> 7
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<211> 22685
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de ácidos nucleicos de humano FCGR3A158F.'
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<400> 8
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Claims (16)
1. Procedimiento in vitro de evaluación
de la respuesta de un sujeto a un tratamiento de anticuerpo
terapéutico, en el que dicho anticuerpo es una IgG1 o IgG3
eliminadora de células diana, comprendiendo el procedimiento
determinar in vitro el residuo aminoácido en la posición 158
de un receptor Fc\gammaRIIIa tal como se representa en la
proteína madura de la figura 3 de dicho sujeto, siendo indicativa de
una respuesta inferior a dicho tratamiento una fenilalanina en la
posición 158.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la determinación del residuo aminoácido en la posición 158
del receptor Fc\gammaRIIIa comprende una etapa de secuenciación
del gen o ARN del receptor Fc\gammaRIIIa o de una parte del mismo
que comprende los nucleótidos codificantes del residuo aminoácido
158.
3. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que la determinación del residuo
aminoácido en la posición 158 del receptor Fc\gammaRIIIa comprende
una etapa de amplificación del gen o ARN del receptor
Fc\gammaRIIIa o de una parte del mismo que comprende los
nucleótidos codificantes del residuo aminoácido 158.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que la amplificación se lleva a cabo mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), tal como PCR, PCR-RT
o PCR anidada.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la determinación del residuo
aminoácido en la posición 158 del receptor Fc\gammaRIIIa comprende
una etapa de digestión con enzima de restricción específico de
alelo.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la determinación del residuo
aminoácido en la posición 158 del receptor Fc\gammaRIIIa comprende
una etapa de hibridación del gen o ARN del receptor Fc\gammaRIIIa
o de una parte del mismo que comprende los nucleótidos codificantes
del residuo aminoácido 158, con una sonda de ácidos nucleicos
específica para el genotipo valina o fenilalanina.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la determinación del residuo
aminoácido en la posición 158 del receptor Fc\gammaRIIIa
comprende:
- -
- obtener ADN genómico a partir de una muestra biológica,
- -
- amplificar el gen del receptor Fc\gammaRIIIa o de una parte del mismo que comprende los nucleótidos codificantes del residuo aminoácido 158, y
- -
- determinar el residuo aminoácido en la posición 158 de dicho gen del receptor Fc\gammaRIIIa.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la determinación del residuo
aminoácido en la posición 158 del receptor Fc\gammaRIIIa
comprende:
- -
- obtener ADN genómico a partir de una muestra biológica,
- -
- amplificar el gen del receptor Fc\gammaRIIIa o una parte del mismo que comprende los nucleótidos codificantes del residuo aminoácido 158,
- -
- introducir un sitio de restricción específico de alelo,
- -
- digerir los ácidos nucleicos con el enzima específico para dicho sitio de restricción y,
- -
- analizar los productos de digestión, por ejemplo mediante electroforesis, siendo indicativa la presencia de productos de digestión de la presencia del alelo.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la determinación del residuo
aminoácido en la posición 158 del receptor Fc\gammaRIIIa
comprende: la extracción del ARN total (o mensajero) de una célula
o muestra biológica o líquido biológico in vitro o ex
vivo, opcionalmente la síntesis de ADNc, la amplificación (por
PCR) con cebadores oligonucleótidos de FCGRIIIa específicos y el
análisis de los productos de PCR.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la determinación del residuo aminoácido en la posición 158
del receptor Fc\gammaRIIIa comprende una etapa de secuenciación
del polipéptido receptor Fc\gammaRIIIa o de una parte del mismo
que comprende el residuo aminoácido 158.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el sujeto es un sujeto
humano.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que el sujeto presenta un tumor, una infección vírica, o un
estado de enfermedad asociada a las células inmunocompetentes
alogénicas o patológicas.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el sujeto presenta un tumor y el tratamiento de anticuerpo
terapéutico está destinado a reducir la carga tumoral.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el tumor es un linfoma, particularmente un NHL.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo es una
IgG1.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que el anticuerpo es un anticuerpo antiCD20, particularmente el
rituximab.
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