CN108330180A - 一种对fcgr3a位点进行基因型检测的方法及试剂盒 - Google Patents

一种对fcgr3a位点进行基因型检测的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法及试剂盒，本发明涉及分子生物学和医学领域，本发明针对人类基因组DNA中FCGR3A基因的SNP位点的基因型，即FCGR3A基因rs396991，预测利妥昔单抗疗效。设计特异性引物和探针，与带有特定报告基因的MagPlex‑TAG磁珠进行杂交反应，通过显色反应在luminex200仪器上进行检测，通过对信号值的读取判读各个SNP位点的碱基型别进行判定。本发明的有益效果在于：本发明针对FCGR3A(rs396991)位点设计特异引物和探针及报告探针，可检测该基因位点SNP型别，本发明提供的检测试剂盒可以灵敏、快速低检测，可为类风湿关节炎、银屑病关节炎等其他疾病患者使用利妥昔单抗治疗的疗效预测提供可靠的实验证据，指导临床治疗选择。

Description

一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种用于对 FCGR3A位点进行基因型检测的方法及试剂盒。
背景技术
FCGR在免疫调节、介导ADCC、维胞内吞、吞噬作用以及释放炎症因子和抗原免递方面起着重要作用。FCGR分为3类：FCGR1(CD64)、FCGR2(CD32)及FCGR3 (CD16)，毎一亚型被定位在染色体长臂相同区域的特定基因编码，有几种不间的基因型：包括FCGR1A、FCGR1B、FCGR1C、FCGR2A、FCGR2B1、FCGR2B2,FCGR2B3、 FCGR2C、FCCR3A和FCGR3B。单核苷酸多态性(SNP)即指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，一般认为SNP与点突变的区别在于SNP出现頻率高于1％。一个基因编码区的SNP经常导致氨基酸的改变，进而影响蛋白的功能，有研究显示，FCGR3A的SNP与单克降抗体的疗效具有相关性。
利妥昔单抗是一种作用于人类CD20的人鼠嵌合单克隆抗体，由于CD20要表现于B淋巴细细表面，因此来治疗CD20阳性的B细胞相关疾病。利妥托单抗也具有ADCC效应，因此FCGR多态性也可用来預测利妥昔单抗疗效，研究发现，类风湿关节炎患者FCGR3A(rs396991)位点，AA/AC基因型的患者治疗应答比 CC基因型弱。
因此，利用FCGR3A(rs396991)位点进行基因型检测，预测类风湿关节炎、银屑病患者及其他患者使用利妥昔单抗后治疗应答的疗效作用，利于患者的精准用药。
发明内容
本发明针对人类基因组DNA中FCGR3A基因的SNP位点的基因型，即FCGR3A 基因rs396991，预测利妥昔单抗疗效。设计特异性引物和探针，与带有特定报告基因的MagPlex-TAG磁珠进行杂交反应，通过显色反应在luminex 200仪器上进行检测，通过对信号值的读取判读各个SNP位点的碱基型别进行判定。
一种用于对FCGR3A位点进行基因型检测的试剂盒，所述的试剂盒包括如下序列的引物：
进一步的，所述的试剂盒包括如下序列的特异探针：
进一步的，所述的试剂盒还包括如下序列的报告探针：TTGGGAGTAA AAATGTGTCT。
一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法，所述的方法包括如下步骤：首先进行PCR反应，实现扩增；再进行多重OLA反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。
PCR反应体系如下：2x qiagen Hotstar MM 5ul,primer mix 1ul，DNA 样本2ul，灭菌水2ul；反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒， 60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。
多重OLA反应如下：配制2xOLA master mix，将OLA master mix与PCR反应产物混合，混匀后进行连接反应。
配制2xOLA master mix包括有：10x Taq Ligase buffer 2ul,40,000U/ml 的TaqDNA Ligase 0.25ul，野生型探针mix 1ul,突变型探针mix 2ul，去离子水4.75ul。
连接反应条件如下：96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min；4℃维持。
一种杂交反应程序如下：选择相应报告探针磁珠，并重悬，将磁珠混合，并稀释最多至100u颗/ul，用2X Tm hybridization buffer，混合后加入磁珠混合物至每孔中，添加1-5ul OLA reaction和25ul dH2O至每个孔，进行PCR 反应：96℃90s，37℃30min，吸走上清，用1x Tm hybridization buffer，重悬磁珠，再次吸走上清；再用1x Tm hybridizationbuffer，重悬磁珠，吸走上清；用包含2-8ug/ml SAPE的1x Tm hybridization buffer，重悬磁珠，在37℃温育15min，在37℃中，加入50ul反应产物至LUMINEX中分析。
另一种杂交反应程序如下：1.选择磁珠，并重悬；2.将磁珠混合并稀释至 100u颗/ul，用2X Tm hybridization buffer，振荡混合；3.加入磁珠至每孔中；4.添加样品至每孔中；5.进行PCR反应：PCR反应：96℃90s，37℃30min； 6.准备6ug/ml SAPE在1xhybridization buffer；7.添加100ul SAPEmix，混匀；8.37℃温育15min；9.加入100ul至37℃的luminex中分析。
本发明的有益效果在于：本发明针对FCGR3A(rs396991)位点设计特异引物和探针及报告探针，可检测该基因位点SNP型别，本发明提供的检测试剂盒可以灵敏、快速低检测，可为类风湿关节炎、银屑病关节炎等其他疾病患者使用利妥昔单抗治疗的疗效预测提供可靠的实验证据，指导临床治疗选择。
具体实施方式
实施例1
本发明提供一种对FCGR3A位点进行基因型检测的试剂盒，，所述的试剂盒包括如下序列的引物：
如下序列的特异探针：
如下序列的报告探针：ttgggagtaa aaatgtgtct。
实施例2
下面提供一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法，在PCR反应管进行 PCR反应，反应的体系为总体积10μl，包含2x qiagen Hotstar MM 5ul,primer mix 1ul，DNA样本2ul,灭菌水2ul。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95℃、15min，进行30 个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。
多重OLA反应：配制2xOLA master mix：10x Taq Ligase buffer 2ul,Taq DNALigase(40,000U/ml)0.25ul，野生型探针mix(100nM each)1ul,突变型探针mix(2.5uMeach)2ul，去离子水4.75ul。将OLA master mix与反应产物混合：2xOLA master mix 10ul,扩增的PCR产物5ul,灭菌去离子水5ul。上下吹打混匀，盖上反应管，进行在ABI9700型PCR扩增仪上连接反应。96℃2min,30 个循环的94℃15s,37℃1min；4℃维持。
杂交反应-洗涤程序：选择相应报告探针的MagPlex-TAG磁珠，并重悬，将每种磁珠混合，并稀释至100u颗/ul，用2X Tm hybridization buffer，振荡混合20s。加入25ul磁珠混合物至每孔中(应该提供2500颗珠子/每种反应)。添加1-5ul OLA reaction和25ul dH2O至每个孔，调整H2O的体积，使总体积接近50ul。盖上盖子，进行PCR反应：96℃90s，37℃30min。放于磁力板中 30s-60s，使磁珠吸住，小心吸走上清，别吸走磁珠。用1x Tmhybridization buffer 75ul，重悬MagPlex-TAG磁珠，吸磁30-60s，小心吸走上清，别吸走磁珠。重复用1x Tm hybridization buffer 75ul，重悬MagPlex-TAG磁珠，吸磁 30-60s，小心吸走上清。用75ul 1x Tm hybridization buffer(包含2-8ug/ml SAPE)，重悬磁珠，在37℃温育15min。在37℃中，加入50ul反应产物至LUMINEX 中分析。
杂交反应-不洗涤程序：1.选择合适的MagPlex-TAG磁珠，并重悬，2.将每种磁珠混合，并稀释至100u颗/ul，用2X Tm hybridization buffer，振荡混合20s。3.加入20ul磁珠混合物至每孔中。(应该提供2500颗珠子/每种反应) 4.添加5uL样品至每孔中；5.关上盖子，进行PCR反应。PCR反应：96℃90s， 37℃30min。6.准备6ug/ml SAPE在1x hybridizationbuffer。7.添加100ul SAPEmix，轻柔混匀。8.37℃温育15min。9.加入100ul至37℃的luminex中分析。
结果分析
通过质粒及水对照，获得背景信号，检测样本结果时，减去背景后，数值大于200即为阳性反应,如下表所示：
序列表
<110> 和康医疗
<120> 一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法及试剂盒
<130> PJ1710630.06
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列("")
<400> 1
ggtgttcaag gaggaagac 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列("")
<400> 2
gtgcgtgtaa gaatcaggaa 20
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列("")
<400> 3
aactttctct ctctattctt attttacttc tgcagggggc ttt 43
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列("")
<400> 4
cactacacat ttatcataac aaattacttc tgcagggggc ttg 43
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列("")
<400> 5
ttgggagtaa aaatgtgtct 20

Claims (10)

1.一种对FCGR3A位点进行基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下序列的引物：
2.如权利要求1所述的一种对FCGR3A位点进行基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下序列的特异探针：
3.如权利要求1所述的一种对FCGR3A位点进行基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括如下序列的报告探针：ttgggagtaa aaatgtgtct。
4.一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：首先进行PCR反应，实现扩增；再进行多重OLA反应，标记和连接；然后进行杂交反应，最后进行基因型的分析。
5.如权利要求4所述的一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法，其特征在于，PCR反应体系如下：2x qiagen Hotstar MM 5ul,primer mix 1ul，DNA样本2ul，灭菌水2ul；反应条件为95℃、15min，进行30个循环的94℃,30秒，60℃,30秒，72℃,30秒；72℃、7分钟，4℃维持。
6.如权利要求4所述的一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法，其特征在于，多重OLA反应如下：配制2xOLA master mix，将OLA master mix与PCR反应产物混合，混匀后进行连接反应。
7.如权利要求6所述的一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法，其特征在于，配制2xOLA master mix包括有：10x Taq Ligase buffer 2ul,40,000U/ml的Taq DNA Ligase0.25ul，野生型探针mix 1ul,突变型探针mix 2ul，去离子水4.75ul。
8.如权利要求6所述的一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法，其特征在于，连接反应条件如下：96℃2min,30个循环的94℃15s,37℃1min；4℃维持。
9.如权利要求4所述的一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法，其特征在于，杂交反应程序如下：选择相应报告探针磁珠，并重悬，将磁珠混合，并稀释最多至100u颗/ul，用2XTm hybridization buffer，混合后加入磁珠混合物至每孔中，添加1-5ul OLA reaction和25ul dH2O至每个孔，进行PCR反应：96℃90s，37℃30min，吸走上清，用1x Tmhybridization buffer，重悬磁珠，再次吸走上清；再用1x Tm hybridization buffer，重悬磁珠，吸走上清；用包含2-8ug/ml SAPE的1x Tm hybridization buffer，重悬磁珠，在37℃温育15min，在37℃中，加入50ul反应产物至LUMINEX中分析。
10.如权利要求4所述的一种对FCGR3A位点进行基因型检测的方法，其特征在于，杂交反应程序如下：1.选择磁珠，并重悬；2.将磁珠混合并稀释至100u颗/ul，用2X Tmhybridization buffer，振荡混合；3.加入磁珠至每孔中；4.添加样品至每孔中；5.进行PCR反应：PCR反应：96℃90s，37℃30min；6.准备6ug/ml SAPE在1x hybridization buffer；7.添加100ul SAPEmix，混匀；8.37℃温育15min；9.加入100ul至37℃的luminex中分析。
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